Aspirin, digoksin, amiodaron və furosemid; trombosit işlevi, ürəyin yığılma gücü, ürək ritmi və vücuttaki maye yükü gibi birbirinden fərqlı ürək-damar süreçlerde kullanılan dört aktiv maddədir. Kimyasal strukturları və xromatoqrafiyak davranışları birbirinden önemli ölçüde fərqlı olan bu moleküllerin tək bir analiz koşulunda birbirlerinden ayrılarak ölçülmesi, analitik metod işlənməsi açısından kolay bir görev deyil.

P. Sankar və tədqiqat arkadaşları, söz konusu dört aktiv maddənin tək bir xromatoqrafiyak tədqiqatda eyni vaxtda olaraq belirlenmesi üçün izokratik tərs fazalı yüksək performanslı maye xromatoqrafiyası, yani RP-HPLC metodi geliştirmiştir. Araşdırmacılar, metodin yalnız dərmanların ölçülmesini değil; asidik, qələvi, oksidativ, termal və fotolitik stres altında oluşan parçalanma ürünlerinden ayrılmalarını da sağlamasını amaçlamıştır.

Ayırma, qoruyucu kolonla birlikte kullanılan 250 × 4,6 mm boyutlarında və 5 µm parçacık büyüklüğünde ACE C18 kolon üzərinde gerçekleştirilmiştir. Mobil faz komponentleri olaraq asetonitril, metanol və yüzde 0,05 trifluoroasetik turşu istifadə edilmişdir. Akış hızı 1,0 mL/dakika, inyeksiya həcmi 20 µL, UV algılama dalğa uzunluğu 234 nm və toplam analiz müddəti 20 dakika olaraq bildirilmişdir.

Geliştirilən koşullarda digoksin 3,918 dakikada, aspirin 4,482 dakikada, furosemid 4,852 dakikada və amiodaron 14,282 dakikada elüe olmuşdur. Böylece üç aktiv maddə kromatogramın ilk təxminən beş dakikalık bölməünde, amiodaron ise belirgin bdaxiliimde daha gec bir bölgede aşkar edilmişdir.

Tədqiqatda 25–75 µg/mL aralığında düzgünsal yanıt elde edildiği bildirilmişdir. Belirleme katsaiları digoksin üçün 1,0000, aspirin və amiodaron üçün 0,9999, furosemid üçün 0,9993 olaraq məlumatlmiştir. Bu dəyərler, incelenen konsentrasiya aralığında pik sahəsi ilə analit konsentrasiyau arasında güclü bir düzgünsal ilişki bulunduğunu göstərir.

Doğruluk tədqiqatlarında yüzde 80, 100 və 120 ekleme səviyyəleri istifadə edilmişdir. Tabloda bildirilən ortalama geri qazanımlar aspirin üçün yüzde 100,59–100,99, digoksin üçün yüzde 100,24–101,27, amiodaron üçün yüzde 100,57–101,15 və furosemid üçün yüzde 100,22–101,34 aralığındadır. İlgili nisbi standart sapma dəyərlerinin tamamı yüzde 2’nin altında kalmıştır.

Gün daxilii və günlərarası dəqiqlik tədqiqatlarında da faiz RSD dəyərleri yüzde 2’nin altında aşkar edilmişdir. Metodin kolon temperaturundaki və algılama dalğa uzunluğundaki küçük dəyişikliklere qarşı dayanıklılığının dəyərlendirildiği dayanıqlılıq deneylerinde RSD dəyərleri yüzde 0,10–0,91, ölçüm nəticəları ise təxminən yüzde 98,00–101,75 aralığında kalmıştır.

Zorlanmış parçalanma deneylerinin en belirgin sonucu qələvi koşullarda görülmüşdür. 0,1 M NaOH uygulamasından sonra bildirilən kalan miktarlar aspirin üçün yüzde 85,74, digoksin üçün yüzde 80,36, amiodaron üçün yüzde 95,82 və furosemid üçün yüzde 90,53’tür. Bu nəticəlar üçünde qələvi stres altında en büyük kayıp digoksinde, ardından aspirinde görülmüşdür.

Asit, oksidasyon, ısı, ortam koşulları və UV ışığı altında bildirilən kayıplar qələvi koşula göre daha məhdud kalmıştır. Standart və nümunə məhlullerinin 24 saatlik analizinde başlangıca göre dəyişim aspirin üçün yüzde 1,10, digoksin üçün yüzde 0,84, amiodaron üçün yüzde 0,37 və furosemid üçün yüzde 0,80 olaraq bildirilmişdir.

Tədqiqat, metodin dört aktiv maddəyi eyni analizde ayırabildiğini və temel validasiya parametrelerinde düşük dəyişkənlik gösterdiğini savunmaktadır. Bununla belə mobil faza komponentlerinin hangi hacimsel nisbətlarda karıştırıldığı açıkça belirtilmemiştir. Kolon sıcaklığı metod bölməünde 40°C, koşullar tablosunda ise “mühit temperaturu” olaraq məlumatlmiştir. Kalibrasyon səviyyəsi və tekrar saiları konusunda da metnin fərqlı bölməleri arasında tutarsızlıklar bulunmaktadır.

Ayrıca parçalanma ürünlerinin ayrı pikler olaraq ayrıldığı belirtilmesine rağmen çözünürlük katsaiları, məcburi parçalanma kromatogramları, sayısal pik təmizliyi nəticəları və parçalanma ürünlerinin kimlikleri sunulmamıştır. Bu səbəbdən metod umut məlumatci bir analitik yaklaşım ortaya koysa da laboratuvarlar arası birbaşa uygulanmadan əvvəl eksik deney ayrıntılarının açıklığa kavuşturulması və müstəqil düzgünlama yapılması gerekir.

Tədqiqatnın çözmeye çalıştığı analitik problem

Farmasötik kalite kontrolünde bir aktiv maddənin yalnız mevcut olduğunun gösterilmesi yeterli deyil. Aktiv maddənin düzgün miktarda bulunması, başka komponentlerle karışmadan ölçülebilmesi və zaman üçünde oluşabiləcek parçalanma ürünlerinden ayrılabilmesi gerekir.

Bu gereklilik, eyni formülasyon və ya analiz programında birden çox aktiv maddə bulunduğunda daha karmaşık hâle gelir. Her molekül:

• Fərqlı polariteye,
• Fərqlı moleküler büyüklüğe,
• Fərqlı turşu-qələvi davranışına,
• Fərqlı çözünürlüğe,
• Kolon yüzeyiyle fərqlı etkiləşim gücüne sahip ola bilər.

Bu səbəbdən bir molekülü iyi ayıran mobil faza koşulu başka bir molekülün çok erkən çıkmasına, piklerinin üst üste binsultsine və ya aşırı uzun süre kolonda tutulmasına neden ola bilər.

Tədqiqatnın temel problemi, aspirin, digoksin, amiodaron və furosemidin tək bir izokratik RP-HPLC tədqiqatsında ölçülmesini sağlayacak ortak koşulun belirlenmesidir.

Dört aktiv maddə neden eyni metod üçünde ele alındı?

Tədqiqatnın girişinde bu dərmanların ürək-damar pasiyentlıklarda fərqlı amaçlarla kullanılabildiği belirtilmektedir:

• Aspirin: Siklooksigenazı geri dönüşümsüz olaraq baskılayan və antitrombosit amaçla kullanılan asetilsalisilik turşu.
• Digoksin: Na⁺/K⁺-ATPazı baskılayarak miyokard kasılma gücünü etkiləyen kardiyak qlikozid.
• Amiodaron: Geniş etkili sınıf III antiaritmik dərman.
• Furosemid: Kalp yetersizliği və hipertoniyala əlaqəli maye tutulmasında kullanılan güclü ilmək diuretiki.

Şəkil 1’de dört molekülün kimyasal strukturları birlikte gösterilmektedir. Aspirin görece küçük aromatik bir yapı taşırken digoksin büyük steroidal çekirdek və şeker birimleri daxiliermektedir. Amiodaron iyot ehtiva edən geniş aromatik yapısıyla, furosemid ise klor, sülfonamid və karboksilik turşu işlevleriyle ayrılmaktadır.

Tədqiqat bu moleküler fərqlılıkları nicel bir yapı-xromatoqrafiya modeliyle analiz etmemiştir. Bununla belə strukturların çeşitliliği, dört biləşiğin ortak bir kolon və mobil faza koşulunda ayrılmasının neden metod optimizasyonu gerektirdiğini görsel olaraq ortaya koymaktadır.

Literatürdeki boşluk nasıl tanımlandı?

Araşdırmacılar aspirinin klopidogrel, rosuvastatin, prasugrel və ya başka aktiv maddəlerle; furosemidin başka diüretiklerle eyni vaxtda analizi üçün çeşitli HPLC metodleri bulunduğunu belirtmiştir. Digoksin və amiodaron üçün de plazma, farmasevtik formulasiya və çözünme nümunəlerinde HPLC və ya LC-MS/MS metodleri bildirilmişdir.

Buna qarşılık dört ilacın tamamını tək bir RP-HPLC analizinde birlikte belirlemeyi amaçlayan düzgünlanmış bir metod bulunmadığı iləri sürülmüştür. Araşdırmanın özgünlük iddiası bu noktaya dayanmaktadır.

Geliştirilən metodle laboratuvarın:

• Dört ayrı analiz yerine tek tədqiqat yapması,
• Analiz süresini azaltması,
• Çözücü kullanımını düşürmesi,
• Çok komponentli nümunəlerin kalite kontrolünü kolaylaştırması amaçlanmıştır.

Ancak tədqiqatda gerçek bir laboratuvar maliyet müqayisəsı və ya metod başına həlledici tüketim hesabı sunulmamıştır. Maliyet və məlumatmlilik avantajları, metodin tek analizde dört komponenti ölçebilmesine dayanan uygulama çıkarımlarıdır.

RP-HPLC ne anlama geliyor?

Yüksek performanslı maye xromatoqrafiyasınde nümunə maye bir mobil faza yardımıyla ince parçacıklarla doldurulmuş kolondan gecirilir. Nümunəteki moleküller, kolonun sabit fazı ilə mobil faza arasında fərqlı ölçüde dağıldıkları üçün kolondan fərqlı zamanlarda çıkar.

Ters fazlı HPLC’de kolon yüzeyi görece hidrofobik, mobil faza ise su və organik həlledici komponentlerinden oluşur. Molekül kolon yüzeyiyle ne kadar güclü etkiləşirse kolonda o kadar uzun süre kalabilir. Bununla belə saxlanma müddəti yalnız hidrofobikliğe bağlı deyil; iyonlaşma durumu, mobil faza biləşimi, sıcaklık və moleküler yapı da sonucu etkiləyebilir.

Tədqiqatda C18 bağlı faz taşıyan ACE kolon istifadə edilmişdir. C18 ifadesi, silika yüzeyine uzun karbon zincirlerinin bağlandığı ters fazlı kolon yapısını belirtir.

İzokratik elüsiya ne demektir?

İzokratik metodde mobil fazaın biləşimi analiz boyunca sabit tutulur. Gradyan metodde ise organik həlledici və ya başka mobil faza komponentlerinin nisbətı zamanla dəyiştirilir.

İzokratik metodlerin uygulaması və cihazlar arasında aktarılması görece kolay ola bilər. Ancak çok fərqlı alıkonma özelliklerine sahip komponentler eyni analizde bulunduğunda, erkən çıqan biləşiklerin birbirinden ayrılması ilə gec çıqan biləşiğin makul sürede elüe edilmesi arasında denge kurulması gerekir.

Bu tədqiqatda digoksin, aspirin və furosemid ilk beş dakika üçünde birbirine yakın zamanlarda çıkarken amiodaron 14,282 dakikada elüe olmuşdur. İzokratik koşulun hem erkən üçlü grubu ayırması hem de amiodaronu 20 dakikalık tədqiqat üçünde çıkarması hədəflenmiştir.

Kullanılan cihaz və kolon sistemi

Analizler Shimadzu LC-40 serisi HPLC sistemiyle gerçekleştirilmiştir. Sistem şu komponentlerden ibarətdir:

• Dörtlü pompa,
• DGU-40 onlayn qazdan təmizləyici,
• SPD-M40 fotodiod sırası detektorü,
• SIL-40C otomatik nümunəleyici,
• LabSolutions 7.1 məlumat toplama və işleme yazılımı.

Ayırma üçün qoruyucu kolonla birlikte ACE C18 kolon istifadə edilmişdir:

• Kolon uzunluğu: 250 mm,
• İç çap: 4,6 mm,
• Parçacık büyüklüğü: 5 µm.

Mobil faz və durulaşdırıcıler

Tədqiqatda mobil faza komponentleri şu şəkilde bildirilmişdir:

• Yüzde 0,05 trifluoroasetik turşu,
• Asetonitril,
• Metanol.

Elüsyon izokratik olaraq gerçekleştirilmiştir. Ancak PDF’de bu üç komponentin nihai mobil faza üçündeki hacimsel nisbətları məlumatlmemektedir. “Yüzde 100 asetonitril”, “yüzde 100 metanol” və “yüzde 0,05 TFA” ifadeleri ayrı həlledici qanallarını tanımlamakta; analitik tədqiqat sırasında pompalanan karışımın nisbətını göstermemektedir.

İki ayrı durulaşdırıcı bildirilmişdir:

• Seyreltici A: Metanol:asetonitril, 50:50 həcm/həcm.
• Seyreltici B: Su:asetonitril, 50:50 həcm/həcm.

Mobil fazın kullanım əvvəlsinde sonikasyonla gazdan arındırıldığı və 0,45 µm membran filtreden gecirildiği qeyd edilmişdir.

Kromatografik koşullar

Metod bölməünde bildirilən temel koşullar şunlardır:

• Akış hızı: 1,0 mL/dakika,
• Enjeksiyon hacmi: 20 µL,
• Algılama dalğa uzunluğu: 234 nm,
• Toplam analiz müddəti: 20 dakika,
• Kolon sıcaklığı: metod metninde 40°C.

Koşullar tablosunda kolon temperaturu “ambient”, yani mühit temperaturu olaraq yazılmıştır. Sağlamlık deneylerinde 38 və 42°C kullanılması ise nominal sıcaklığın 40°C olduğuna işaret etmektedir. Bu raporlama fərqlılığı, metodin başka bir laboratuvarda aynen uygulanabilmesi üçün açıklığa kavuşturulmalıdır.

Standart məhluller nasıl hazırlandı?

Tədqiqatda aspirin, digoksin, amiodaron və furosemidden ayrı ayrı 25 mg tartıldığı və durulaşdırıcı A ilə çözüldüğü qeyd edilmişdir. Mətn, 50 mL durulaşdırıcı kullanıldığını və məhlulnin 0,5 mg/mL olduğunu yazarken eyni cümlede 100 mL’lik balonjojelerden söz etmektedir.

25 mg maddənin 50 mL’ye tamamlanması durumunda:

\[ C=\frac{25\ \mathrm{mg}}{50\ \mathrm{mL}}=0{,}5\ \mathrm{mg/mL} \]

Burada:

• C, stok məhlulnin konsentrasiyaini,
• 25 mg, tartılan aktiv maddə miktarını,
• 50 mL, varsailan son hacmi ifade eder.

Mətndeki 0,5 mg/mL dəyəri 50 mL son hacimle uyğundur. Eğer son hacim 100 mL olsaydı konsentrasiya 0,25 mg/mL olurdu. Bu səbəbdən balonjoje hacmi ilə bildirilən stok konsentrasiyau arasında raporlama belirsizliği bulunmaktadır.

Stok məhlulden 2,5 mL alınarak 50 mL’ye seyreltildiği qeyd edilmişdir. Başlangıç stokunun 0,5 mg/mL olduğu kabul edilirse tədqiqat məhlulsinin konsentrasiyai şu olur:

\[ C_2=\frac{C_1V_1}{V_2} =\frac{0{,}5\ \mathrm{mg/mL}\times2{,}5\ \mathrm{mL}} {50\ \mathrm{mL}} =0{,}025\ \mathrm{mg/mL} \]

\[ 0{,}025\ \mathrm{mg/mL}=25\ \mu\mathrm{g/mL} \]

Bu dəyər sistem uygunluğu tədqiqatlarında bildirilən 0,025 mg/mL standart konsentrasiyauyla uyğundur.

Metod optimizasyonunda hangi koşullar denendi?

Şəkil 2’de üç xromatoqrafiyak deneme qarşılaştırılmıştır.

İlk deneme: Fosfat tamponu və asetonitril

20 mM kalium dihidrogen ortofosfat buferi, pH 3,0 və asetonitril kullanılan ilk koşulda:

• Baz çizgisinin bozulduğu,
• Teorik plaka sayısının düşük olduğu,
• Pik kuyruklanmasının kabul ediləbilir olmadığı bildirilmişdir.

İkinci deneme: Yüzde 0,1 TFA

Asetonitril, metanol və yüzde 0,1 trifluoroasetik turşu kullanılan koşulda biləşiklerin erkən elüe olduğu və pik şəkillerinin uygun olmadığı ifade edilmiştir.

Seçilən koşul: Yüzde 0,05 TFA

Asetonitril, metanol və yüzde 0,05 trifluoroasetik turşu kullanılan üçüncü koşulda:

• Daha simetrik pikler,
• Daha uygun alıkonma süreleri,
• Yüksek teorik plaka dəyərleri,
• Kabul ediləbilir kuyruklanma,
• Baz çizgisinde ayrılmış pikler elde edildiği bildirilmişdir.

Şəkil 2c’de digoksin, aspirin və furosemid pikleri kromatogramın təxminən 4–5 dakikalık dar bölməünde yer alırken amiodaron təxminən 14 dakikada görülmektedir.

Alıkonma süreleri ne anlatıyor?

Aspirin ilə furosemid arasındaki saxlanma müddəti fərqı yalnız:

\[ 4{,}852-4{,}482=0{,}370\ \mathrm{dakika} \]

Digoksin ilə aspirin arasındaki fərq ise:

\[ 4{,}482-3{,}918=0{,}564\ \mathrm{dakika} \]

olmuştur. Araşdırmacılar piklerin qələvi çizgisinde ayrıldığını bildirmektedir. Bununla belə tədqiqat, komşu pikler arasındaki sayısal çözünürlük katsailarını vermemektedir. Özellikle aspirin və furosemid arasındaki yakınlık səbəbiyle çözünürlük dəyərlerinin raporlanması metodin ayırma gücünü daha açık gösterebilirdi.

Sistem uygunluğu neden dəyərlendirilir?

Sistem uygunluğu, analitik nümunəler çalışılmadan əvvəl cihazın, kolonun və metodin beklenen performansı gösterip göstermediğini kontrol eder. Tədqiqatda şu parametreler dəyərlendirilmiştir:

• Alıkonma süresi,
• Pik alanı,
• Kuyruklanma faktörü,
• Teorik plaka sayısı.

Mətnde saxlanma müddəti və pik sahəsi üçün faiz RSD’nin 2’nin altında, quyruqlanma faktorunün 2’den küçük və nəzəri boşqab sayının 500’den büyük olduğu qeyd edilmişdir.

Tablo 2’de ise quyruqlanma faktoru və nəzəri boşqab sayının mutlak dəyərleri yerine bunlara ait olduğu anlaşılan faiz RSD dəyərleri məlumatlmiştir. Bu səbəbdən metindeki uygunluk iddiası ilə mutlak sistem uygunluğu nəticəları tablodan tam olaraq düzgünlanamamaktadır.

Özgüllük nasıl dəyərlendirildi?

Özgüllük deneyinde:

• Boş həlledici,
• Plasebo,
• Standart,
• Nümunə kromatogramları qarşılaştırılmıştır.

Şəkil 3’te boş və plasebo kromatogramlarının dört aktiv maddənin alıkonma zamanlarında belirgin girişim piki göstermediği; standart və nümunə kromatogramlarında ise hədəf piklerin oluştuğu görülmektedir.

Fotodiyot dizisi detektorüyle pik təmizliyinın dəyərlendirildiği qeyd edilmişdir. Ancak sayısal pik təmizliyi indeksi, təmizlik eşiği və ya spektral müqayisə sonucu məlumatlmemiştir.

Doğrusallık nasıl dəyərlendirildi?

Doğrusallık, konsentrasiya arttıkça cihaz yanıtının öngörülebilir və nisbəttılı bdaxiliimde artıp artmadığını göstərir. Tədqiqatda kalibrasiya eğriləri, konsentrasiyaa qarşı ortalama pik sahəsi grafiğe gecirilərek yaradılmışdır.

Temel düzgünsal kalibrasiya denklemi:

\[ y=mx+b \]

şeklindedir.

• y, xromatoqrafiyak pik sahəsinı,
• x, analit konsentrasiyaunu,
• m, eğimi,
• b, y ekseni kəsikşimini ifade eder.

Tədqiqatda bildirilən denklemler şunlardır:

Digoksin:

\[ y=38\,752{,}7697x+15\,272{,}2000 \]

\[ R^2=1{,}0000 \]

Aspirin:

\[ y=14\,066{,}7087x-17\,834{,}8000 \]

\[ R^2=0{,}9999 \]

Furosemid:

\[ y=108\,966{,}1435x+664\,621{,}6000 \]

\[ R^2=0{,}9993 \]

Amiodaron:

\[ y=29\,556{,}5918x-18\,371{,}2000 \]

\[ R^2=0{,}9999 \]

Belirleme katsailarının tamamı 0,999’un üzərindedir. Bu dəyərler, tədqiqatda incelenen konsentrasiya aralığında pik sahəsinın konsentrasiyala güclü düzgünsal ilişki gösterdiğini desteklemektedir.

Bununla belə metod bölməünde 50–150 səviyyəlerini kapsayan 10 kalibrasiya seviyesinden, nəticə bölməünde ise 25–75 µg/mL aralığında altı seyreltiden söz edilmektedir. Kalibrasyon səviyyəlerinin sayısı və tam konsentrasiyaları metin boyunca tutarlı bdaxiliimde məlumatlmemiştir.

Doğruluk və geri qazanım neyi ölçüyor?

Doğruluk, metodle bulunan miktarın bilinen və ya teorik dəyəre ne kadar yakın olduğunu göstərir. Tədqiqatda yüzde 80, yüzde 100 və yüzde 120 ekleme səviyyəleri kullanılmış və her səviyyə üç kez analiz edilmiştir.

Geri kazanımın temel matematiksel anlamı izah amacıyla şu şəkilde gösteriləbilir:

\[ \text{Geri kazanım (\%)}= \frac{\text{ölçülen miktar}} {\text{eklenen teorik miktar}} \times100 \]

Yüzde 100’e yakın nəticə, metodin eklenen aktiv maddə miktarını büyük ölçüde geri ölçebildiğini göstərir.

Tablo 2’de bildirilən nəticəlar:

Nəticə metninde məlumatlen geri qazanım aralıkları bu tablodaki dəyərlerden daha geniştir. Örneğin aspirin üçün metinde yüzde 99,81–101,84 aralığı yazılırken tabloda yüzde 100,59–100,99 görülmektedir. Ham ölçüm məlumatleri sunulmadığı üçün bu fərqın başka tekrarları mı temsil ettiği yoksa raporlama tutarsızlığı mı olduğu belirlenememektedir.

Kesinlik və faiz RSD

Kesinlik, eyni və ya benzer koşullarda tekrarlanan ölçümlerin birbirine ne kadar yakın olduğunu dəyərlendirir. Tədqiqatda gün daxilii tekrar ediləbilirlik və günlərarası ara dəqiqlik incələnmişdir.

Tədqiqatda açıkça məlumatlen faiz RSD formülü şöyledir:

\[ \%RSD= \frac{s}{\bar{x}} \times100 \]

Burada:

• s, ölçümlerin standart sapmasını,
• \bar{x}, ölçümlerin ortalamasını,
• RSD, nisbi standart sapmayı ifade eder.

RSD küçüldükçe tekrar ölçümleri arasındaki dağılımın ortalamaya göre daha dar olduğu anlaşılır.

Nəticə metninde furosemidin gün daxilii RSD dəyəri yüzde 0,94 olaraq yazılırken Tablo 2’de yüzde 0,79 məlumatlmiştir. Her iki dəyər de tədqiqatnın kullandığı yüzde 2 sınırının altındadır; lakin kəsikn raporlanacak dəyər açısından metin və tablo birbiriyle uyğun deyil.

Sağlamlık deneyi neyi gösteriyor?

Sağlamlık, metod koşullarında kasıtlı olaraq yapılan küçük dəyişikliklerin sonucu önemli ölçüde dəyiştirip dəyiştirmediğini dəyərlendirir.

Tədqiqatda:

• Kolon sıcaklığı 38 və 42°C’ye dəyiştirilmiş,
• Algılama dalğa uzunluğu 233 və 237 nm olaraq tətbiq edilmişdir.

Nominal sıcaklık 40°C kabul edildiğinde 38 və 42°C dəyişiklikleri ±2°C’ye qarşılık gelir. Nominal dalğa uzunluğu 234 nm olduğu hâlde 233 və 237 nm dəyərleri eşit bir ±2 nm dəyişikliği oluşturmamaktadır. Mətndeki “±2 nm” izahsıyla tabloda məlumatlen dalga boyları bu səbəbdən tutarlı deyil.

Bütün dayanıqlılıq koşullarında:

• RSD dəyərleri yüzde 0,10–0,91,
• Ölçüm nəticəları yüzde 98,00–101,75 aralığında kalmıştır.

En düşük bildirilən ölçüm sonucu, digoksinin 233 nm koşulunda yüzde 98,00’e kadar inen aralığıdır. En yüksek dəyər ise aspirinin 237 nm koşulunda yüzde 101,75’e ulaşan aralığıdır.

Zorlanmış parçalanma tədqiqatsı neden yapıldı?

Stabiliteyi gösterebilən bir analitik metod, ana aktiv maddə pikini parçalanma sırasında oluşan başka komponentlerden ayırabilmelidir. Bu səbəbdən aktiv maddəler normal depolama xariciındaki daha ağır koşullara maruz bırakılır.

Tədqiqatda kullanılan stresler:

• Asidik stres: 0,1 N HCl,
• Bazik stres: 0,1 M NaOH,
• Oksidatif stres: Yüzde 0,1 H₂O₂,
• Termal stres: 105°C’de iki saat,
• Ortam koşulu: Oda sıcaklığında iki gün,
• Fotolitik stres: 254 nm’de yedi gün,
• Fotolitik stres: 366 nm’de yedi gün.

Bozunma tablosu nasıl okunmalıdır?

Tablo 4’teki dəyərler bozunan yüzdeyi değil, stres sonrasında ölçülen kalan dərman yüzdesini göstərir. Yaklaşık kayıp nisbətı şu ilişkiyle hesaplanabilir:

\[ \text{Yaklaşık kayıp (\%)}= 100-\text{kalan miktar (\%)} \]

Bazik stres neden öne çıkıyor?

Bazik koşulda hesaplanan təxminən kayıplar:

• Digoksin: yüzde 19,64,
• Aspirin: yüzde 14,26,
• Furosemid: yüzde 9,47,
• Amiodaron: yüzde 4,18’dir.

Böylece dört dərman üçün de tabloda en belirgin kayıp qələvi stres altında görülmektedir. Digoksin və aspirin özellikle yüksek kayıp göstermiştir.

Tədqiqat bu kayıpların kimyasal parçalanma ürünlerini tanımlamamış və parçalanma meqanizmalarını çözmemiştir. Dolayısıyla nəticəlar hangi dərmanların hangi stres altında daha çox azaldığını göstərir; ortaya çıqan moleküllerin yapısını izahz.

Stabiliteyi gösteren metod iddiasının sınırı

Araşdırmacılar, ana biləşiklerin parçalanma ürünlerinden ayrıldığını belirtmektedir. Ancak PDF’de:

• Zorlanmış parçalanmaya ait ayrı kromatogramlar,
• Ana pik ilə en yakın parçalanma piki arasındaki çözünürlük dəyərleri,
• Sayısal fotodiod sırası pik təmizliyi nəticəları,
• Kütle dengesi,
• Bozunma ürünlerinin kimlikleri məlumatlmemiştir.

Bu səbəbdən sunulan məlumatler dərman miktarının stres altında dəyiştiğini göstərir. Metodin parçalanma ürünlerinden ayrımı konusundaki qanıt ise tədqiqatda özet səviyyəsinde kalmıştır.

Çözelti stabilitesi

Standart və nümunə məhlulleri 0, 6, 12, 18 və 24 saatlik aralıklarla dəyərlendirilmiştir. Tablo başlığında bir sütun “8. saat” bdaxiliiminde görünse de müqayisə sütununda “0–18. saat” yazılması bu noktanın 18. saat olduğunu düşündürmektedir.

Tədqiqatnın kabul ölçütü ± yüzde 2’dir və bütün nəticəların bu sınırın üçünde kaldığı qeyd edilmişdir. En büyük 24 saatlik dəyişim aspirinde yüzde 1,10’dur.

Metod hangi kullanım üçün geliştirilmiştir?

Araşdırmacılar metodin farmasevtik formulasiyaların rutin kalite kontrolü və stabilite dəyərlendirmesi üçün kullanılabiləceğini belirtmektedir.

Tədqiqat aşağıdaki amaçlara yönelik deyil:

• Pasiyent qanında digoksin və ya amiodaron səviyyəsinin ölçülmesi,
• Terapötik dərman izlemi,
• Farmakokinetik analiz,
• Biyoeşdəyərlik araşdırması,
• Dərmanların klinik etkinliğinin qarşılaştırılması,
• Pasiyentya özel doz belirlenmesi.

Plazma, serum, sidik və ya başka biyolojik matriks analiz edilmediğinden metodin biyolojik nümunəlerde kullanılabiləceği sonucu çıkarılamaz.

Tədqiqatnın gecmiş açısından önemi

Önceki xromatoqrafiyak tədqiqatlar çoğunlukla bu dərmanlardan birini və ya ikili-üçlü məhdud kombinasyonları ele almıştır. Bu tədqiqat, dört fərqlı ürək-damar aktiv maddənin ortak bir C18 kolon və tek izokratik tədqiqatyla ölçülmesi yönünde bir metod tasarımı sunmaktadır.

Bugün açısından önemi

Tek analizde birden çox aktiv maddənin belirlenmesi, kalite kontrol laboratuvarlarında cihaz zamanının və analiz adımlarının azaltılmasına yardımcı ola bilər. Yirmi dakikalık bir tədqiqatda dört pik elde edilmesi, ayrı metodler yerine ortak bir analitik platform kurulması açısından pratik bir başlanğıc sunmaktadır.

Bununla belə metod aktarılabilirliğinin temel koşulu, mobil faza nisbətlarının və nümunə hazırlama ayrıntılarının açık bdaxiliimde tanımlanmasıdır. Mevcut preprintte bu ayrıntıların qələviıları eksik və ya tutarsızdır.

Gelecek açısından yapılması gerekenler

• Mobil fazdaki TFA, asetonitril və metanol nisbətları kəsikn olaraq məlumatlmelidir.
• Kolon sıcaklığının mühit temperaturu mı yoksa 40°C mi olduğu açıklanmalıdır.
• Kalibrasyon seviyelerinin sayısı və tam konsentrasiyaları düzeltilmelidir.
• Stok məhlulnin son hacmi və gerçek konsentrasiyai açıkça yazılmalıdır.
• Sistem uygunluğu üçün mutlak plaka saiları və kuyruklanma faktörleri məlumatlmelidir.
• Komşu piklerin çözünürlük katsaiları raporlanmalıdır.
• LOD və LOQ dəyərleri belirlenmeli və ya sunulmalıdır.
• Zorlanmış parçalanma kromatogramları və sayısal pik təmizliyi nəticəları eklenmelidir.
• Bozunma kütle dengesi dəyərlendirilmelidir.
• Bağımsız laboratuvar və ya fərqlı kolon partiləriyle metod köçürməı sınanmalıdır.
• Gerçek farmasötik ürünlerde nümunə hazırlama və matriks etkisi ayrıntılı olaraq düzgünlanmalıdır.

Tədqiqatnın güclü yönleri

• Kimyasal strukturları fərqlı dört aktiv maddə tek analizde ele alınmıştır.
• Fərqlı mobil faza və akış koşulları qarşılaştırılarak metod optimizasyonu yapılmıştır.
• Fotodiyot dizisi detektorlü HPLC sistemi istifadə edilmişdir.
• Boş, plasebo, standart və nümunə kromatogramları qarşılaştırılmıştır.
• Doğrusallık, dəqiqlik, dəqiqlik və dayanıqlılıq deneyleri tətbiq edilmişdir.
• Asit, qələvi, oksidasyon, sıcaklık, ortam və iki UV dalğa uzunluğunu ehtiva edən çoklu stres koşulları dəyərlendirilmiştir.
• 24 saatlik məhlul stabilitesi incələnmişdir.
• Kalibrasyon belirleme katsailarının tamamı 0,999’un üzərindedir.
• Geri kazanım və dəqiqlik deneylerindeki RSD dəyərleri yüzde 2’nin altında kalmıştır.
• Metod 20 dakikalık izokratik bir analiz sunmaktadır.

Tədqiqatnın məhdudlıkları

• Tədqiqat hakem dəyərlendirmesinden gecmemiş bir preprinttir.
• Mobil faz komponentlerinin nihai karışım nisbətları məlumatlmemiştir.
• Kolon sıcaklığı metod bölməünde 40°C, tabloda mühit temperaturu olaraq yazılmıştır.
• Stok məhlul üçün 50 mL və 100 mL ifadeleri eyni hazırlama izahsında yer alır.
• Doğrusallık bölməünde 10 seviye ilə altı seyreltiden ayrı ayrı söz edilmiştir.
• Kalibrasyon standartlarının tam konsentrasiya dizisi məlumatlmemiştir.
• Sistem uygunluğu üçün metod bölməünde beş, tablolarda altı tekrar qeyd edilmişdir.
• Mutlak teorik plaka saiları və kuyruklanma faktörleri açıkça raporlanmamıştır.
• Pikler arasında sayısal çözünürlük dəyərleri sunulmamıştır.
• Sayısal pik təmizliyi nəticəları məlumatlmemiştir.
• Duyarlılıkten söz edilmesine rağmen LOD və LOQ nəticəları mövcud deyil.
• Doğruluk bölməündeki metinsel aralıklar ilə Tablo 2’deki dəyərler eyni deyil.
• Furosemid gün daxilii dəqiqlik dəyəri metin ilə tabloda fərqlı raporlanmıştır.
• Sağlamlık üçün “±2 nm” denmesine rağmen 233 və 237 nm istifadə edilmişdir.
• Zorlanmış parçalanma ürünlerinin strukturları tanımlanmamıştır.
• Zorlanmış parçalanma kromatogramları sunulmamıştır.
• Bozunma kütle dengesi dəyərlendirilmemiştir.
• Aktiv maddə standartlarının təmizlik dereceleri və sertifikalı izlenebilirlik bilgiləri məlumatlmemiştir.
• Belirli bir ticari ürünün ayrıntılı formülasyonu və gerçek ürün assay nəticəları sunulmamıştır.
• Biyolojik nümunəler və ya klinik pasiyentlar incelenmemiştir.

Tədqiqat ne söylüyor?

• Dört aktiv maddə ACE C18 kolon üzərinde tek izokratik tədqiqatda saptanabilmiştir.
• Digoksin, aspirin və furosemid təxminən ilk beş dakikada; amiodaron 14,282 dakikada elüe olmuşdur.
• Toplam analiz müddəti 20 dakikadır.
• 234 nm’de dört aktiv maddə üçün ölçülebilir pikler elde edilmiştir.
• 25–75 µg/mL olaraq bildirilən aralıkta güclü düzgünsal yanıt görülmüşdür.
• Doğruluk və dəqiqlik nəticəlarında düşük RSD dəyərleri elde edilmiştir.
• Küçük sıcaklık və dalğa uzunluğu dəyişiklikleri metodin nəticəlarını büyük ölçüde dəyiştirmemiştir.
• Bazik stres dört aktiv maddə üçün diğer streslerden daha çox kayıp oluşturmuştur.
• Çözeltilərde 24 saatteki dəyişim yüzde 2’nin altında kalmıştır.

Tədqiqat ne söylemiyor?

• Metodin pasiyent qanında terapötik dərman izlemi üçün uygun olduğunu göstermemektedir.
• Dört ilacın birlikte klinik olaraq kullanılmasının güvenli və ya etkili olduğunu dəyərlendirmemektedir.
• Dərmanların klinik dozlarını və ya müalicə nəticəlarını müqayisəmaktadır.
• Bozunma ürünlerinin kimyasal kimliğini belirlememektedir.
• Mobil faz nisbətları məlumatlmediği üçün metodin eksiksiz bdaxiliimde yeniden üretiləbildiğini göstermemektedir.
• Komşu piklerin sayısal çözünürlüğünü raporlamamaktadır.
• Metodin çok düşük konsentrasiyalardaki LOD və LOQ performansını göstermemektedir.
• Bütün farmasötik ürün və yardımcı maddə biləşimleri üçün girişimsiz çalışacağını qanıtlamamaktadır.
• Metodin fərqlı laboratuvarlarda və ya fərqlı HPLC sistemlerinde düzgünlandığını göstermemektedir.

Tədqiqatnın Metodi və Nəticələrı

Teknik metod özeti

Alıkonma və sistem uygunluğu nəticəları

Tablo, mutlak nəzəri boşqab sayı və quyruqlanma faktoru yerine bu parametrelerin tekrarlanabilirliğine ait olduğu anlaşılan faiz RSD dəyərlerini vermektedir.

Doğrusallık nəticəları

Doğruluk və kəsiknliğin toplu özeti

Sağlamlık nəticəlarının özeti

Stres koşullarındaki təxminən kayıp nisbətları

Bu kayıp dəyərleri, tədqiqatnın bildirdiği kalan miktarların 100’den çıkarılmasıyla elde edilən açıklayıcı hesaplamalardır. Bozunma ürünlerinin miktarını və ya kimliğini birbaşa temsil etmez.

Şəkillerin bilimsel mesajı

Teknik nəticəların toplu dəyərlendirmesi

• Dört analitin tamamı tek C18 kolon və 234 nm algılama koşulunda ölçülebilmiştir.
• Üç erkən pik birbirine yakın olsa da araşdırmacılar qələvi çizgisi ayrımı bildirmiştir.
• Amiodaron diğer üç biləşikten belirgin bdaxiliimde daha gec elüe olmuşdur.
• Kalibrasyon eğriləri incelenen aralıkta güclü xəttilik göstermiştir.
• Geri kazanımlar təxminən yüzde 100 çevresinde aşkar edilmişdir.
• Gün daxilii və günlərarası dəqiqlik nəticəları düşük dəyişkənlik göstermiştir.
• Sıcaklık və dalğa uzunluğundaki küçük dəyişiklikler nəticəlarda büyük sapma oluşturmamıştır.
• En ağır məcburi parçalanma koşulu qələvi ortamdır.
• Çözeltilər 24 saat boyunca tədqiqatda kullanılan yüzde 2 dəyişim sınırının üçünde kalmıştır.
• Mobil faz nisbətı, sistem uygunluğunun mutlak nəticəları və stres kromatogramları metodin yeniden üretiləbilirliği açısından eksik kalan əsas bilgilərdir.

Mənbə və Metod Notu

Bu daxilierik, P. Sankar, S. Padmavathi, Vijayan, S. Anqələvihagan və K. Reeta Vijayarani tarafından hazırlanan “Analytical method development and validation of simultaneous estimation of aspirin, digoxin, amiodarone, and furosemide by RP-HPLC” baş örtüyülı tədqiqatya dayanmaktadır.

Tədqiqat, aspirin, digoksin, amiodaron və furosemidin eyni xromatoqrafiyak tədqiqatda belirlenmesi üçün izokratik RP-HPLC metodi geliştiren və metodin temel analitik performansını dəyərlendiren bir preprint araşdırma makalesidir.

Mətnde açıkça “This preprint research paper has not been peer reviewed” uyarısı yer alır. Dolayısıyla tədqiqat hakem dəyərlendirmesinden gecmemiştir. PDF’de bir dergi tarafından kabul edildiğine və ya hakemli nihai sürümünün yayımlandığına ilişkin bilgi mövcud deyil.

Yazarlar metodin ICH Q2(R1) düzgünltusunda sistem uygunluğu, spesifiklik, xəttilik, dəqiqlik, dəqiqlik və dayanıqlılıq açısından dəyərlendirildiğini belirtmiştir. Asidik, qələvi, oksidativ, termal, ortam və fotolitik stres deneyleri de gerçekleştirilmiştir.

Araşdırma klinik tədqiqat deyil. Pasiyent, qan, plazma, serum və ya başka biyolojik nümunə incelenmemiştir. Dərmanların müalicə etkinliği, birlikte kullanım güvenliği, dozları və ya pasiyentlardaki qan səviyyəleri dəyərlendirilmemiştir.

Metod farmasevtik keyfiyyət nəzarəti amacıyla geliştirilmiştir. Digoksinin dar terapötik aralığı tədqiqatnın girişinde anılmış olsa da sunulan metod terapötik dərman izlemi üçün düzgünlanmış bir plazma və ya serum metodi deyil.

Tədqiqat, mobil fazaın yüzde 0,05 trifluoroasetik turşu, asetonitril və metanolden oluştuğunu belirtmekte; lakin komponentlerin nihai hacimsel nisbətlarını vermemektedir. Kolon sıcaklığı, stok məhlul hacmi, kalibrasiya seviyesi və tekrar sayısı konusunda metnin fərqlı bölməleri arasında raporlama fərqlılıkları bulunmaktadır.

Bozunma ürünlerinin ana dərman piklerinden ayrıldığı belirtilmekle birlikte məcburi parçalanma kromatogramları, sayısal pik təmizliyi dəyərleri, çözünürlük katsaiları və parçalanma ürünlerinin kimlikleri sunulmamıştır. Bu səbəbdən stabiliteyi gösterme iddiası, preprintte məlumatlen məlumatler çerçevesinde dikkatli dəyərlendirilmelidir.

Yazarlar xarici finansman və çıkar çatışması bulunmadığını, tədqiqatyı destekleyen məlumatlerin makale üçünde yer aldığını bildirmiştir.

Bu Türkçe daxilierik yalnız yüklenen PDF’deki metod izahları, kromatogramlar, tablolar, sayısal nəticəlar və yazarların yorumlarına dayanarak hazırlanmıştır. PDF’de bulunmayan klinik başarı, pasiyent güvenliği, laboratuvarlar arası düzgünlanmış performans və ya bütün farmasötik ürünlerde kəsikn uygulanabilirlik iddiası eklenmemiştir.