Pankreatik duktal adenokarsinomun (pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC) erken evrede serumdan saptanmasını araştıran çalışmada, karbonhidrat antijeni 19-9 (CA19-9) düzeyini ölçmek için Signal-Enhanced Lateral Flow Immunoassay (SELFI) adı verilen sinyali güçlendirilmiş bir lateral akış immünoassayı geliştirildi. Sistem, silika nanoparçacığı üzerine çok sayıda altın nanoparçacığının yerleştirildiği SiO₂@Au@Au nanoproblarındaki nanometre ölçekli boşlukların oluşturduğu plazmonik “hotspot” bölgelerinden yararlanıyor. SELFI, CA19-9 analizini yaklaşık 15 dakikada tamamladı ve çalışmada 0.012 U mL⁻¹ saptama sınırına ulaştı. Klinik serum değerlendirmesinde erken evre PDAC ile sağlıklı kontrolleri ayırmada ortalama ROC-AUC değeri SELFI için 0.862, ELISA için 0.854 ve klasik LFIA için 0.550 bulundu. Bununla birlikte çalışma tek merkezde yürütüldü, bütün katılımcılar Güney Koreliydi ve araştırma gerçek yaşamda nüfus taramasına dayalı bağımsız bir klinik doğrulama çalışması değildi.

SELFI'nin temel yeniliği, CA19-9 için yeni bir biyobelirteç keşfetmekten çok mevcut CA19-9 sinyalini daha güçlü ve daha düşük konsantrasyonlarda okunabilir hâle getiren bir nanoprob mimarisi geliştirmesidir. Altın nanoparçacıkları arasındaki boşluk küçüldükçe elektromanyetik alan yoğunluğu arttı; belirli nanometre aralıklarında oluşan plazmonik hotspot bölgeleri görünür ışık sönümünü ve dolayısıyla nitroselüloz membran üzerindeki kolorimetrik kontrastı güçlendirdi.

Analitik model deneylerinde SELFI test çizgisindeki sinyal 15 dakika civarında doygunluğa ulaştı. Aynı çalışmada ELISA işlemi için 285 dakika gerekti. SELFI'de CA19-9 konsantrasyonu 1 U mL⁻¹ iken ölçülen kolorimetrik sinyal yoğunluğu 24.67, 200 U mL⁻¹ iken 73.17 olurken; tek altın nanoparçacığı kullanan klasik LFIA'da aynı aralıkta sinyal 6.59'dan 11.76'ya yükseldi. Çalışmada SELFI'nin yalnız CA19-9 için değil, model kalibrasyon deneylerinde PSA ve ICAM-1 için de klasik LFIA'dan daha güçlü analitik sinyal eğilimi gösterdiği bildirildi; ancak bu ek deneyler söz konusu biyobelirteçlerle farklı hastalıkların klinik tanısının doğrulandığı anlamına gelmemektedir.

Klinik açıdan en dikkat çekici sonuç erken evre PDAC grubunda ortaya çıktı. Sağlıklı kontrollerle erken evre hastalar karşılaştırıldığında SELFI'nin ortalama AUC değeri 0.862, ELISA'nın 0.854'tü ve çalışmanın tekrarlamalı istatistiksel analizinde fark için P < 0.0001 bulundu. Buna karşın ileri evre PDAC ile sağlıklı kontroller karşılaştırıldığında SELFI ve ELISA neredeyse aynı performansı gösterdi: AUC değerleri sırasıyla 0.925 ve 0.926 idi ve aralarındaki fark anlamlı değildi (P = 0.3363). Dolayısıyla sonuçlar SELFI'nin özellikle erken evre örneklerinde umut verici bir ayrım gücü gösterdiğini desteklemekte, fakat yöntemin klinik tarama standardı hâline geldiğini veya bağımsız popülasyonlarda doğrulandığını göstermemektedir.

Türkiye açısından ne ifade ediyor?

Çalışmadaki 150 katılımcının tamamı Güney Koreliydi ve örnekler tek bir üçüncü basamak hastanede toplandı. Bu nedenle SELFI için bildirilen AUC değerleri, CA19-9 dağılımları veya ileride kullanılabilecek tanısal eşik değerleri Türkiye'deki hasta ve sağlıklı popülasyonlara doğrudan aktarılamaz. Türkiye'de kullanılabilirliğin değerlendirilebilmesi için yerel ve bağımsız hasta kohortlarında, farklı klinik merkezleri içeren doğrulama çalışmalarına; testin analitik standardizasyonuna ve önceden belirlenmiş tanı eşiklerinin sınanmasına ihtiyaç vardır. Bu çalışma Türkiye'deki rutin klinik kullanımı kanıtlamamakta, ancak hızlı ve yüksek sinyalli lateral akış tabanlı CA19-9 ölçümünün araştırılabileceği teknik bir platform ortaya koymaktadır.

Araştırmanın temel problemi nedir?

Araştırmanın çıkış noktası, pankreatik duktal adenokarsinomun erken evrede saptanmasının güç olmasıdır. Çalışma yeni bir PDAC biyobelirteci keşfetmek yerine, serumda kullanılan CA19-9 biyobelirtecini daha hızlı ve daha hassas biçimde ölçebilecek bir analiz sistemi geliştirmeye odaklandı.

Lateral akış immünoassayları kısa analiz süresi ve basit çalışma prensibi nedeniyle avantajlı olmakla birlikte, klasik sistemlerde kullanılan yaklaşık 20 nm'lik tekil altın nanoparçacıklarının oluşturduğu renk sinyalinin düşük hedef konsantrasyonlarında yetersiz kalabilmesi temel teknik sorunlardan biridir. Araştırmacılar bu problemi, tek bir altın nanoparçacığının renk üretimini güçlendirmek yerine çok sayıda altın nanoparçacığını bir silika çekirdeği üzerinde kontrollü nanoboşluklarla bir araya getirerek çözmeye çalıştı.

SELFI nasıl çalışıyor?

SELFI'de kullanılan temel nanoprob SiO₂@Au@Au yapısıdır. Silika nanoparçacığı taşıyıcı çekirdek görevi görür; yüzeyindeki altın nanoparçacıkları birbirlerine nanometre ölçeğinde yaklaşır. Altın nanoparçacıkları arasındaki bu dar bölgelerde lokalize yüzey plazmon rezonansı nedeniyle güçlü elektromanyetik alan bölgeleri, yani plasmonik hotspot'lar oluşur.

Çalışmanın mekanizma açıklamasına göre yerel elektrik alanın güçlenmesi nanoparçacıkların absorpsiyon kesitini artırır. Daha fazla gelen ışığın absorbe edilmesi, beyaz nitroselüloz membran üzerinde nanoprobu daha koyu ve yüksek kontrastlı hâle getirir. Böylece aynı hedef konsantrasyonunda klasik tekil AuNP tabanlı LFIA'ya göre daha yüksek kolorimetrik sinyal elde edilir.

Test sırasında CA19-9, nanoprob üzerindeki algılama antikoru ile test çizgisindeki yakalama antikoru arasında immünolojik olarak tutulur. Test çizgisinde biriken SiO₂@Au@Au nanoprobları koyu renkli bir sinyal oluşturur. Bu sinyal fotoğraflandıktan sonra ImageJ ile nicel olarak değerlendirilmiş ve kalibrasyon eğrileri yardımıyla CA19-9 konsantrasyonuna dönüştürülmüştür.

Nanoboşluk neden önemli?

Araştırmacılar nanoprob tasarımını önce üç boyutlu dalga optiği simülasyonlarıyla inceledi. Simülasyon modelinde 168 nm çapında bir SiO₂ nanoparçacığının yüzeyine 270 AuNP eşit biçimde dağıtıldı. Altın nanoparçacıkları arasındaki boşluk mesafesi G_Au için 10, 8, 6, 4, 2 ve 1 nm durumları analiz edildi. Görünür bölgeyi kapsayan 400–800 nm dalga boyu aralığında TE-polarize elektromanyetik dalgalar kullanıldı ve nanoyapının su içinde bulunduğu kabul edildi.

Simülasyonda AuNP'ler arasındaki boşluk küçüldükçe yüzeydeki elektrik alan güçlendi. Özellikle G_Au 6 nm'nin altına indiğinde nanoparçacıklar arasında belirgin hotspot bölgeleri ortaya çıktı. Absorpsiyon, saçılma ve ekstinksiyon kesitleri de elektrik alan güçlendikçe arttı.

Araştırmacılar artışın yalnızca altın nanoparçacıklarının çapının büyümesinden kaynaklanıp kaynaklanmadığını ayrıca test etti. En büyük AuNP çapında, birleştirilmiş nanoyapı içindeki AuNP'nin absorpsiyon kesiti silika yüzeyindeki izole tek bir AuNP'den yaklaşık 2.65 kat daha yüksekti. Sabit AuNP çapında boşluk mesafesinin azaltılması da hotspot oluşumunda daha güçlü değişim meydana getirdi. Bu bulgular, sinyal güçlenmesinin temel belirleyicisinin yalnız parçacık çapı değil, parçacıklar arasındaki nanoboşluğun oluşturduğu plazmonik etkileşim olduğunu destekledi.

Nanoproblar nasıl üretildi ve doğrulandı?

Deneysel aşamada araştırmacılar yaklaşık 145 nm çapındaki SiO₂ nanoparçacıklarını modifiye Stöber yöntemiyle hazırladı. Silika yüzeyi APTES ile aminlendi; 3–5 nm çapında altın nanoseed'ler hazırlanıp silika yüzeyine bağlandı ve daha sonra seed-mediated growth yöntemiyle AuNP'ler büyütüldü.

Altın öncülü ve askorbik asit ekleme çevrimlerinin sayısı değiştirilerek SiO₂@Au@Au₁, SiO₂@Au@Au₃, SiO₂@Au@Au₅, SiO₂@Au@Au₇, SiO₂@Au@Au₉ ve SiO₂@Au@Au₁₁ yapıları üretildi. Cs-STEM görüntülerinden belirlenen ortalama AuNP-AuNP boşlukları sırasıyla 9.55, 7.63, 5.89, 3.53, 1.33 ve 1.20 nm idi.

Görünür ışık ekstinksiyonu boşluk mesafesi azaldıkça arttı. En gelişmiş SiO₂@Au@Au₁₁ yapısında maksimum ekstinksiyon 0.426 olarak ölçülürken, aynı yapıdan silika çekirdek uzaklaştırılarak elde edilen tekil AuNP'lerde 0.120 ve 3–5 nm altın nanoseed'lerde 0.031 ölçüldü. Araştırmacılar bu karşılaştırmayı nanoboşluk kaynaklı lokalize yüzey plazmon rezonansı etkisinin deneysel göstergesi olarak yorumladı.

SiO₂@Au@Au₁₁ nanoprobunun maksimum görünür ışık ekstinksiyonu, çalışmada karşılaştırılan 200 nm AuNP'lere göre yaklaşık 58 kat, klasik LFIA'da kullanılan 20 nm AuNP'lere göre ise yaklaşık 1.439 kat daha yüksek bulundu. Nitroselüloz membran üzerindeki kolorimetrik sinyal deneyleri de aynı yönde sonuç verdi.

CA19-9 analizi ne kadar hızlı?

SELFI test çizgisinin renk yoğunluğu 1, 2, 5, 10, 15, 30 ve 60 dakikalık geliştirme sürelerinde izlendi. Sinyal ilk dakikalarda hızla arttı ve yaklaşık 15 dakikadan sonra ImageJ ölçümlerinde doygunluğa yaklaştı. Araştırmacılar bu nedenle sonraki ölçümlerde 15 dakikalık analiz süresini kullandı. Çalışmada karşılaştırılan ELISA prosedürünün toplam analiz süresi ise 285 dakika olarak verildi.

0–200 U mL⁻¹ CA19-9 aralığındaki model deneylerinde SELFI test çizgisi 5 U mL⁻¹ üzerindeki konsantrasyonlarda çıplak gözle seçilebilir hâle gelirken, klasik LFIA'da 100 U mL⁻¹'ye kadar görünür test çizgisi elde edilmedi ve 100 U mL⁻¹'de dahi sinyal zayıftı.

Saptama sınırı neydi?

SELFI için bildirilen CA19-9 saptama sınırı (limit of detection, LOD) 0.012 U mL⁻¹, ticari ELISA için 0.3 U mL⁻¹ idi. Araştırma sonuç bölümünde klasik 20 nm AuNP tabanlı LFIA için LOD 121.477 U mL⁻¹ olarak verildi ve SELFI'nin LOD değerinin bunun 10.123 kat altında olduğu belirtildi.

Kaynak içi tutarsızlık notu: Çalışmanın Discussion bölümünde klasik LFIA için aynı LOD değeri 12.477 U mL⁻¹ olarak yazılmıştır. Buna karşılık Results bölümünde 121.477 U mL⁻¹ değeri yer almakta ve bildirilen 10.123 katlık fark 121.477 U mL⁻¹ değeriyle uyumludur. Bu nedenle kaynak içindeki iki farklı sayı burada sessizce tek bir değere dönüştürülmemiştir.

Klinik serum örnekleri ne gösterdi?

Klinik değerlendirmede toplam 150 serum örneği kullanıldı: 50 sağlıklı kontrol, 40 erken evre/resektabl PDAC ve 60 ileri evre/lokal ileri veya metastatik PDAC. CA19-9 düzeyleri SELFI, klasik LFIA ve ELISA ile değerlendirildi.

ROC analizinde her grup içindeki örneklerin %90'ı rastgele seçildi ve bu işlem 100 kez tekrarlandı. Böylece tek bir örnek bölünmesine bağlı sonuç yerine 100 ROC eğrisi ve 100 AUC değeri oluşturuldu.

Erken evre PDAC ile sağlıklı kontroller karşılaştırıldığında SELFI'nin ortalama AUC değeri 0.862 (%95 CI: 0.841–0.888), ELISA'nın 0.854 (%95 CI: 0.834–0.881) ve klasik LFIA'nın 0.550 (%95 CI: 0.528–0.556) idi. SELFI ile ELISA arasındaki AUC dağılımlarının karşılaştırılmasında P < 0.0001 bildirildi.

İleri evre PDAC ile sağlıklı kontrollerde SELFI AUC değeri 0.925 (%95 CI: 0.914–0.949), ELISA değeri 0.926 (%95 CI: 0.917–0.940) ve LFIA değeri 0.692 (%95 CI: 0.676–0.713) idi. Bu durumda SELFI ile ELISA arasındaki fark anlamlı değildi (P = 0.3363).

Tüm 150 örnek birlikte değerlendirildiğinde SELFI için AUC 0.899 (%95 CI: 0.884–0.919), ELISA için 0.896 (%95 CI: 0.885–0.913) ve LFIA için 0.634 (%95 CI: 0.619–0.647) bulundu. SELFI ile ELISA karşılaştırması için P = 0.0142 bildirildi.

Kaynak içi ikinci tutarsızlık: Discussion bölümünde toplam örnekler tartışılırken “0.896 vs. 0.899” sıralaması, cümlenin SELFI'nin ELISA'dan yüksek olduğu yönündeki anlatımıyla ters düşmektedir. Tablo 1 ve Şekil 4'te değerler açık biçimde ELISA = 0.896 ve SELFI = 0.899 olarak verildiğinden, burada tablo ve şekil değerleri korunmuş; Discussion'daki sıra hatası ayrıca belirtilmiştir.

Şekiller ne anlatıyor?

Şekil 1, PDAC hücrelerinden serum CA19-9 ölçümüne uzanan biyolojik bağlamı, SiO₂@Au@Au nanoproblarındaki nanoboşlukları, SELFI test şeridinin çalışma mantığını ve ELISA ile analiz süresi karşılaştırmasını birlikte gösteriyor. Aynı şekil plazmonik hotspot güçlendikçe test sinyalinin de artacağı temel tasarım hipotezini görselleştiriyor.

Şekil 2, sayısal elektromanyetik simülasyon ile deneysel nanoyapı karakterizasyonunu birbirine bağlıyor. Simülasyonda boşluk mesafesi azaldıkça hotspot yoğunluğu artarken Cs-STEM görüntülerinde deneysel olarak üretilen SiO₂@Au@Au serisinin boşluklarının 9.55 nm'den 1.20 nm'ye kadar azaltılabildiği görülüyor. Ekstinksiyon spektrumları ve membran sinyal ölçümleri bu morfolojik değişimin optik çıktıya yansıdığını gösteriyor.

Şekil 3, SELFI'nin yaklaşık 15 dakikada sinyal doygunluğuna ulaşmasını, CA19-9 konsantrasyonuna karşı SELFI ve LFIA sinyal eğrilerini ve CA19-9, PSA ile ICAM-1 kalibrasyon sonuçlarını sunuyor. Şeklin analiz süresi–LOD karşılaştırması SELFI'nin çalışmada değerlendirilen sistemler arasında hızlı analiz ile düşük saptama sınırını aynı platformda birleştirmeyi hedeflediğini gösteriyor.

Şekil 4 ise 150 klinik serum örneğinin %90'lık tekrar örneklemeleriyle oluşturulan ROC analizini gösteriyor. Erken evre grupta SELFI eğrisi ELISA'nın biraz üzerinde, klasik LFIA'nın ise belirgin biçimde üzerinde yer alıyor. İleri evre grupta SELFI ve ELISA eğrileri birbirine oldukça yakın.

Çalışmanın desteklediği sonuçlar

• SiO₂@Au@Au nanoyapılarındaki küçük AuNP-AuNP boşlukları, plazmonik hotspot oluşumu ve güçlü optik ekstinksiyon ile ilişkilidir.
• SiO₂@Au@Au₁₁ nanoprobları klasik tekil AuNP'lerden daha güçlü kolorimetrik sinyal üretmiştir.
• SELFI, çalışmanın deney koşullarında CA19-9 ölçümünü yaklaşık 15 dakikada gerçekleştirmiştir.
• SELFI için bildirilen CA19-9 LOD değeri 0.012 U mL⁻¹'dir.
• Çalışmadaki Güney Koreli serum kohortunda SELFI, erken evre PDAC ile sağlıklı kontrolleri ayırmada AUC 0.862 göstermiştir.
• Klasik 20 nm AuNP-LFIA'nın klinik ayırım performansı SELFI ve ELISA'dan düşük bulunmuştur.
• PSA ve ICAM-1 model kalibrasyonlarında da SELFI'nin klasik LFIA'ya göre daha yüksek analitik sinyal eğilimi gösterdiği bildirilmiştir.

Çalışmanın desteklemediği veya henüz kanıtlamadığı sonuçlar

• SELFI'nin genel nüfusta pankreas kanseri taraması için hazır olduğu gösterilmemiştir.
• Bağımsız çok merkezli veya uluslararası bir klinik doğrulama yapılmamıştır.
• Türk popülasyonunda tanısal performans değerlendirilmemiştir.
• Çalışmada SELFI için klinik kullanıma aktarılabilecek nihai ve bağımsız doğrulanmış bir tanı eşik değeri oluşturulmamıştır.
• Testin erken tanı sayesinde sağkalımı veya tedavi sonuçlarını iyileştirdiği gösterilmemiştir.
• CA19-9'un biyolojik sınırlılıkları ortadan kaldırılmış değildir; araştırmacılar Lewis-negatif olgulardaki olası yanlış sınıflandırmayı gelecekte ek biyobelirteçlerle azaltmayı planlamaktadır.
• PSA ve ICAM-1 model deneyleri SELFI'nin bu biyobelirteçlerle ilişkili hastalıklarda klinik tanı performansını kanıtlamamaktadır.
• Çalışmanın mevcut sonuçları farklı etnik, coğrafi ve klinik popülasyonlara doğrudan genellenemez.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Çalışma tasarımı ve klinik örneklem

Çalışmada insan serum örneklerinin kullanımı için Seoul National University Bundang Hospital Human Bioresource Center tarafından etik onay alındı. Kurumsal etik kurul numarası X-2011-651-903 olarak bildirildi ve bütün katılımcılardan örneklerinin bilimsel araştırma ve yayın amacıyla kullanılmasına yönelik yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Hasta bilgileri analiz öncesinde anonimleştirildi ve kimlikten arındırıldı.

Sağlıklı kontroller yaş ve cinsiyet açısından kanser gruplarıyla propensity matching yöntemiyle eşleştirildi ve gruplar arasında bu değişkenler açısından istatistiksel olarak anlamlı fark bildirilmedi. Tüm katılımcılar Uzak Doğu Asyalı ve Güney Koreliydi. Tümör yerleşimi erken ve ileri evre gruplar arasında anlamlı biçimde farklı değildi; pankreas başı tümörleri olguların yaklaşık %46'sını oluşturdu. Medyan tümör boyutu rezektabl grupta 2.2 cm, ileri evre grupta 3.8 cm idi.

Çalışmanın örneklem büyüklüğü önceden yapılan istatistiksel güç hesabıyla belirlenmedi; mevcut klinik örneklerin erişilebilirliğine göre oluşturuldu. Toplanan klinik örneklerin tamamı analize dâhil edildi. Deneyler randomize edilmedi ve araştırmacılar grup atamalarına veya sonuç değerlendirmesine kör değildi. Çalışma daha sonra post-hoc güç analizi gerçekleştirdi.

Sayısal nanoyapı simülasyonu

Optik simülasyonlar COMSOL Multiphysics 5.4 ile gerçekleştirildi. 400–800 nm dalga boyu aralığında TE-polarize elektromanyetik dalga uygulandı. Altının dalga boyuna bağlı kırılma indisi için çalışmada belirtilen Werner veri tabanı kullanıldı. Arka alan modellemesinde x ve y yönlerinde periyodik sınır koşulları ve z yönünde portlar, saçılan alan modellemesinde x, y ve z yönlerinde perfectly matched layer koşulları uygulandı.

Modelde 168 nm çapında SiO₂ küresi üzerinde 270 AuNP bulunuyordu. G_Au boşluk mesafeleri 10, 8, 6, 4, 2 ve 1 nm olarak değiştirildi. Silika çekirdek çapı ve AuNP sayısı sabit tutulduğu için boşluk küçüldükçe AuNP çapı arttı.

SiO2@Au@Au nanoprob üretimi

Yaklaşık 145 nm SiO₂ nanoparçacıkları modifiye Stöber yöntemi kullanılarak hazırlandı. Silika yüzeyi APTES ile aminlendi. 3–5 nm Au nanoseed'leri NaBH₄ kullanılarak hazırlandı ve SiO₂-NH₂ yüzeyine bağlandı.

SiO₂@Au yapılarının üzerine AuNP büyütmek için 0.2 mg SiO₂@Au, 9.8 mL %2 PVP çözeltisine eklendi. Karıştırma sırasında her beş dakikada bir 20 μL 10 mM HAuCl₄ ve 40 μL 10 mM askorbik asit eklendi. Enjeksiyon çevrim sayısı 1, 3, 5, 7, 9 veya 11 olarak değiştirilerek farklı nanoboşluklara sahip yapılar üretildi.

Antikor konjugasyonu ve test şeridi

SiO₂@Au@Au₁₁ nanoproblarının yüzeyine önce 11-mercaptoundecanoic acid (11-MUA) ile karboksilik asit grubu eklendi. Karboksil grupları EDC ve sulfo-NHS ile aktive edildi ve CA19-9 monoklonal algılama antikoru A46400 nanoproba bağlandı.

SELFI ve klasik LFIA şeritlerinde nitroselüloz membran üzerindeki kontrol çizgisine 1 mg mL⁻¹ goat anti-mouse IgG, test çizgisine 1 mg mL⁻¹ anti-CA19-9 yakalama antikoru uygulandı. Test ve kontrol çizgileri arasındaki mesafe 4.0 mm, dağıtım debisi 1.9 μL cm⁻¹ idi. Membranlar en az iki saat kurutuldu ve şeritler 4 mm genişlikte kesildi.

SELFI model analizi

Model CA19-9 testinde geliştirme karışımı 3 μL CA19-9 örneği, 5 μL SiO₂@Au@Au₁₁ nanoprob süspansiyonu ve 25 μL %0.5 PBST olmak üzere toplam 33 μL hacimden oluşturuldu. Şerit 15 dakika geliştirildi ve test çizgisi fotoğraflandıktan sonra renk yoğunluğu ImageJ ile ölçüldü.

Kalibrasyon için 0, 0.0037, 0.037, 0.37, 3.7, 37, 370, 3700 ve 37000 U mL⁻¹ CA19-9 standartları kullanıldı. Benzer işlem PSA ve ICAM-1 için de hedefe özgü standart ve antikorlarla tekrarlandı.

SELFI ve LFIA kalibrasyon denklemleri

SELFI için CA19-9 kalibrasyon eğrisi çalışmada aşağıdaki sigmoid fonksiyonla verilmiştir:

\[ \mathrm{Signal\ intensity} = 83.84+ \frac{14.75-83.84} {1+\left(\frac{\mathrm{Concentration}}{20.62}\right)^{0.85}} \]

Tek AuNP tabanlı klasik LFIA için:

\[ \mathrm{Signal\ intensity} = 31.13+ \frac{6.45-31.13} {1+\left(\frac{\mathrm{Concentration}}{689.82}\right)^{1.26}} \]

Çalışmada kullanılan genel sigmoid kalibrasyon modeli:

\[ \mathrm{Signal\ intensity} = A_2+ \frac{A_1-A_2} {1+\left(\frac{\mathrm{Concentration}}{X_0}\right)^p} \]

Burada \(X_0\), \(A_1\), \(A_2\) ve \(p\), çalışmanın sigmoid kalibrasyon eğrisi parametreleridir. Konsantrasyonu sinyal yoğunluğundan hesaplamak için denklem şu biçime dönüştürülmüştür:

\[ \mathrm{Concentration} = X_0 \times \left( \frac{A_1-\mathrm{Signal\ intensity}} {\mathrm{Signal\ intensity}-A_2} \right)^{1/p} \]

Saptama sınırına karşılık gelen sinyal ise:

\[ I_{\mathrm{LOD}} = I_{\mathrm{Blank}} + 3\sigma_{\mathrm{Blank}} \]

şeklinde hesaplandı. Burada \(I_{\mathrm{Blank}}\) boş örneğin sinyal yoğunluğunu, \(\sigma_{\mathrm{Blank}}\) ise boş örnek sinyalinin standart sapmasını ifade etmektedir. Elde edilen \(I_{\mathrm{LOD}}\) değeri ters kalibrasyon denklemine yerleştirilerek biyobelirteç konsantrasyonu cinsinden LOD hesaplandı.

Klinik serum analizi

Serum örnekleri SELFI ve LFIA analizi öncesinde %0.5 PBST ile 10 kat seyreltildi. Her örnekten 3 μL kullanıldı ve sonraki işlem model testteki prosedürle aynı şekilde yürütüldü. CA19-9 konsantrasyonu test çizgisinin sinyal yoğunluğu ile kalibrasyon eğrisinden hesaplandı.

ELISA ölçümleri üretici protokolüne göre gerçekleştirildi. Serum örnekleri ikili tekrarlarla ölçüldü; dört kat seyreltmeden başlayarak 200 kata kadar seyreltilmiş örnekler kullanıldı ve konsantrasyonlar dört parametreli lojistik regresyon eğrisinden hesaplandı.

İstatistiksel analiz

ROC ve AUC hesaplamaları araştırmacıların hazırladığı R kodu ve pROC kütüphanesiyle yapıldı. Toplam 150 örneğin her grubundan %10'u rastgele dışarıda bırakılarak orijinal örneklerin %90'ı, yani 135 örnek analiz edildi. Bu işlemde yaklaşık 45 sağlıklı kontrol, 36 erken evre PDAC ve 54 ileri evre PDAC örneği kullanıldı.

Rastgele alt örnekleme işlemi sabit bir random seed ile 100 kez tekrarlandı. Böylece 100 ROC eğrisi ve 100 AUC değeri elde edildi. SELFI ve ELISA için ortalama ROC eğrileri doğrusal interpolasyonla hesaplandı; LFIA eğrisi gözlenen minimum ve maksimum sinyal değerlerinden türetilen ayrık karar eşikleriyle oluşturuldu. Ortalama AUC ve %95 güven aralıkları 100 tekrardan hesaplandı.

AUC dağılımlarının karşılaştırılmasında iki yönlü Student's t-testi kullanıldı. Erken evre PDAC + sağlıklı kontrol karşılaştırmasında ELISA–SELFI için P < 0.0001, tüm PDAC örneklerinin değerlendirilmesinde P = 0.0142 ve ileri evre PDAC + sağlıklı kontrol karşılaştırmasında P = 0.3363 bildirildi. Klasik LFIA ile SELFI arasındaki karşılaştırmaların tümünde P < 0.0001 bulundu.

Araştırmanın temel metodolojik sınırları

• Örneklem büyüklüğü önceden yapılan güç analizine göre belirlenmedi; klinik örnek erişilebilirliği esas alındı.
• Çalışma tek merkezlidir.
• 150 katılımcının tamamı Güney Korelidir.
• Deneyler randomize edilmemiştir.
• Araştırmacılar deney gruplarına ve sonuç değerlendirmesine kör değildir.
• Cinsiyete özgü tanısal alt analiz için çalışma yeterli güce sahip değildir ve böyle bir analiz yapılmamıştır.
• Mevcut veri için post-hoc güç analizi yapılmış olsa da bu, önceden planlanmış örneklem büyüklüğü hesabının yerine geçmez.
• SELFI için bağımsız dış kohortta önceden belirlenmiş klinik cutoff doğrulaması yapılmamıştır.
• Araştırmacılar daha geniş etnik ve coğrafi kohortları, standart sinyal analizini, optimum cutoff belirlenmesini ve Lewis-negatif olgular için ek biyobelirteçleri gelecekteki çalışmalar arasında göstermektedir.

Kaynak ve Yöntem Notu

Yazarlar

Sohyeon Jang, Minsup Shin, Jiseok Han, Han-Joo Bae, Yuna Youn, Hye-Seong Cho, Kwanghee Yoo, Jun-Sik Chu, Jaehyun An, Geunhyeong An, Hyejin Chang, Jin-Hyeok Hwang, Jaehi Kim, Jihwan Song, Jong-chan Lee, Luke P. Lee ve Bong-Hyun Jun.

Eş katkı: Sohyeon Jang, Minsup Shin ve Jiseok Han çalışmaya eşit katkıda bulunmuştur.

Sorumlu yazarlar: Jaehi Kim, Jihwan Song, Jong-chan Lee, Luke P. Lee ve Bong-Hyun Jun.

Kurumlar

1. Department of Bioscience and Biotechnology, Konkuk University, Seoul, Republic of Korea.
2. Department of Mechanical Engineering, Hanbat National University, Daejeon, Republic of Korea.
3. Department of Internal Medicine, Seoul National University Bundang Hospital, Seongnam, Republic of Korea.
4. Company of BioSquare, Hwaseong, Republic of Korea.
5. Division of Science Education, Kangwon National University, Chuncheon, Republic of Korea.
6. College of Medicine, Seoul National University, Seoul, Republic of Korea.
7. Harvard Medical School; Department of Medicine, Brigham and Women’s Hospital, Boston, Massachusetts, USA.
8. Department of Bioengineering, University of California, Berkeley, California, USA.
9. Department of Electrical Engineering and Computer Science, University of California, Berkeley, California, USA.
10. Korea Biomedical Institute for Global Health Research and Technology (K-BIGHEART), Pohang University of Science and Technology (POSTECH), Pohang, Republic of Korea.

Finansman

Kaynakta çalışma; Republic of Korea Ministry of Science and ICT tarafından desteklenen NRF-2022R1A2C2012883, Bio & Medical Technology Development Program kapsamında 2021M3C1C3097211 ve Korean government (MSIT) tarafından finanse edilen National Research Foundation of Korea desteği RS-2023-00222910 ile ilişkilendirilmiştir. Çalışma popülasyonu bölümünde ayrıca BRIDGE Convergence R&D programı kapsamındaki “Development of Early Detection Technology for Pancreatic Cancer via Liquid Biopsy Using Fiber Optic-Based Raman Spectroscopy and Artificial Intelligence System” projesi ve NRF-2021M3C1C3097204 proje numarası belirtilmektedir.

Veri ve kod erişilebilirliği

İşlenmiş nicel veriler, test çıktıları ve ROC/istatistik analizinde kullanılan veriler çalışmanın ek tabloları ve kaynak veri dosyalarıyla sunulmuştur. İnsan serum örneklerine ait bireysel klinik veriler etik ve hukuki gizlilik sınırlamaları nedeniyle herkese açık değildir ve Seoul National University Bundang Hospital Human Bioresource Center bünyesinde kontrollü erişim altında tutulmaktadır.

Çalışmada kullanılan kodun GitHub üzerinde JKim-45/SELFI deposunda bulunduğu ve Zenodo üzerinde 10.5281/zenodo.17958691 DOI'siyle arşivlendiği belirtilmiştir.

Yazar katkıları

S.J., M.S., J.K. ve B.-H.J. deneyleri tasarladı. S.J., M.S., J.H., H.-J.B., Y.Y., H.-S.C., K.Y., J.-S.C., J.A., G.A. ve J.K. deney ve analizleri gerçekleştirdi. J.K. istatistiksel analiz için özel R kodlarını geliştirdi. S.J., M.S., J.H., Y.Y., J.K., J.-C.L. ve B.-H.J. makaleyi yazdı. S.J., M.S., J.H., H.C., J.-H.H., J.K., J.S., J.-C.L., L.P.L. ve B.-H.J. metnin revizyonunda görev aldı. L.P.L. ve B.-H.J. genel süreci denetledi. Kaynakta bütün yazarların nihai sürümü onayladığı bildirilmektedir.

Çıkar çatışması

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması bulunmadığını beyan etmiştir.

Lisans ve görsel kullanım notu

Makale CC BY-NC-ND 4.0 lisansıyla yayımlanmıştır. Lisans türetilmiş veya uyarlanmış materyalin paylaşılmasına izin vermediği için kaynak makaledeki özgün Şekil 1–4 bu Verianla içeriğinde kopyalanmamış, Türkçeleştirilerek yeniden çizilmemiş veya uyarlanmış görsel olarak kullanılmamıştır. Makaledeki Verianla Live bileşeni yalnız çalışmanın yayımladığı sayısal AUC değerlerini bağımsız bir HTML veri tablosunda sunmaktadır.

Kaynak içi tutarsızlık notu

Kaynakta klasik tek AuNP-LFIA'nın CA19-9 LOD değeri Results bölümünde 121.477 U mL⁻¹, Discussion bölümünde ise 12.477 U mL⁻¹ olarak yazılmıştır. Çalışmanın aynı yerde bildirdiği 10.123 katlık SELFI/LFIA LOD farkı 121.477 U mL⁻¹ değeriyle uyumludur; buna rağmen kaynakta bulunan 12.477 değeri sessizce silinmemiş ve tutarsızlık açıkça kayda geçirilmiştir.

Discussion bölümündeki toplam örneklem AUC anlatımında da 0.896 ve 0.899 değerlerinin sıralaması cümlenin öznesiyle uyumsuz görünmektedir. Tablo 1 ve Şekil 4, ELISA için 0.896 ve SELFI için 0.899 değerlerini açıkça vermektedir. Verianla makalesindeki karşılaştırmalı tablo bu doğrudan tablo/şekil değerlerini esas alırken kaynak içindeki anlatım tutarsızlığını ayrıca belirtmektedir.

Bilimsel yorum sınırı

Bu çalışma bir nanobiyosensör ve tanısal assay geliştirme araştırmasıdır ve klinik serum örnekleriyle başlangıç düzeyinde tanısal performans değerlendirmesi içermektedir. Sonuçlar SELFI'nin mevcut kohortta CA19-9'u hızlı ve düşük analitik saptama sınırıyla ölçebildiğini ve özellikle erken evre PDAC/sağlıklı kontrol karşılaştırmasında güçlü AUC gösterdiğini desteklemektedir. Bununla birlikte çalışma tek merkezli ve tek coğrafi/etnik popülasyona dayalıdır; randomizasyon veya körleme uygulanmamıştır, örneklem büyüklüğü önceden güç analiziyle belirlenmemiştir ve bağımsız dış doğrulama yapılmamıştır. Bu nedenle çalışma, SELFI'nin rutin klinik tarama veya tanı standardı hâline geldiği sonucunu desteklememektedir.

Bu Verianla içeriğinin bilimsel anlatımı yüklenen çalışmanın yöntem, sonuç, tablo, şekil ve tartışma bölümlerine dayanmaktadır. Dış kaynaklar yalnız çalışmanın güncel bibliyografik yayın kimliğini doğrulamak için kullanılmış; ana bilimsel anlatıya dışarıdan yeni deneysel sonuç, klinik veri veya mekanizma eklenmemiştir.