Karides kabuğu kitosanı–kolajen tip I–hidroksiapatit kompozit iskelesi, Litopenaeus vannamei kabuklarından çıkarılan kitosanın kolajen tip I (COL I) ve hidroksiapatit (HAP) ile birleştirilip liyofilizasyonla üç boyutlu gözenekli yapıya dönüştürüldüğü bir kemik doku mühendisliği biyomalzemesidir. Çalışma, karides kabuğundan elde edilen kitosanla hazırlanan bu iskelenin kimyasal yapısını, gözenek morfolojisini, porozitesini, şişme davranışını, degradasyonunu, basma dayanımını ve MG-63 osteoblast-benzeri hücreleriyle in vitro sitouyumluluğunu, ticari kitosan kullanılarak aynı yaklaşımla hazırlanan kontrol iskeleyle karşılaştırmaktadır.

Karides kabuklarından kitosan; deproteinizasyon, demineralizasyon ve deasetilasyon basamaklarıyla elde edilmiştir. Kitosan verimi %22,37 ± 1,25, FTIR ile hesaplanan deasetilasyon derecesi %77,22'dir. Ticari kitosan için deasetilasyon derecesi %69,87 olarak raporlanmıştır. İzole kitosanın FTIR bantlarının ticari kitosanla benzer fonksiyonel gruplar göstermesi, araştırmacılar tarafından kitosanın başarıyla elde edildiğini destekleyen kimyasal kanıt olarak değerlendirilmiştir.

Hidroksiapatit, kitosan ve tip I kolajen sırasıyla nihai 175, 50 ve 25 µg/mL konsantrasyonlarında bir araya getirilmiş; karışım pH 7'ye nötralize edilmiş, silikon kalıba dökülmüş, −80 °C'de 24 saat dondurulmuş ve ardından 24 saat liyofilize edilmiştir. Çapraz bağlayıcı kullanılmamıştır. Oluşan yapı kirli beyaz, süngerimsi ve üç boyutlu bir kompozit iskele olarak tanımlanmıştır.

Karides kabuğu kitosanlı iskele 24 saatte %278,55 ± 36,49 şişme ve dört haftada %41,87 ± 7,27 degradasyon göstermiştir. Ticari kitosan kontrolünde karşılık gelen değerler %931,76 ± 45,64 ve %47,37 ± 2,03'tür. Karides kabuğu iskelelerinin basma dayanımı 0,991 ± 0,01 MPa, ticari kontrolün 0,97 ± 0,01 MPa olarak ölçülmüştür. MG-63 hücreleri iskele üzerinde tutunmuş; MTT/formazan absorbansı 24 saatten 144 saate doğru yükselmiştir.

Bu sonuçlar in vitro malzeme karakterizasyonu ve hücre kültürü sonuçlarıdır. Çalışma, iskelenin canlı organizmada kemik oluşturduğunu, bir kemik defektini iyileştirdiğini veya insanlarda güvenli ve etkili bir implant olduğunu göstermemektedir. Kaynağın “osteoconductivity” ve kemik rejenerasyonu potansiyeline ilişkin ifadeleri bu deneylerin sağladığı aday biyomalzeme düzeyinde değerlendirilmelidir.

Biyomimetik Kitosan–Kolajen–Hidroksiapatit İskelesi Nedir?

Biyomimetik kitosan–kolajen–hidroksiapatit iskelesi, doğal kemiğin organik ve mineral bileşenlerinden bazılarını taklit etmek amacıyla kitosan, tip I kolajen ve hidroksiapatiti üç boyutlu gözenekli bir yapıda birleştiren kompozit bir doku mühendisliği materyalidir; bu çalışmada kitosan deniz ürünleri atığı olan Litopenaeus vannamei karides kabuklarından elde edilmiştir.

İskele veya scaffold ne demektir?

Doku mühendisliğinde scaffold veya iskele, hücrelerin tutunabileceği, çoğalabileceği ve çevresinde yeni hücre dışı matriks oluşturabileceği üç boyutlu destek yapısıdır. İskele doğrudan “yeni kemik” değildir. İdeal durumda biyolojik doku oluşurken geçici fiziksel ve biyokimyasal destek sağlaması ve uygun hızda parçalanması beklenir.

Neden kitosan kullanıldı?

Kitosan, kitinin deasetilasyonu sonucunda elde edilen polisakkarit bir biyopolimerdir. Kabuklu deniz canlılarının dış iskeletlerindeki kitin kitosan üretiminde hammadde olarak kullanılabilir. Kitosan β(1→4) glikozidik bağlarla birbirine bağlanan D-glukozamin birimlerini ve değişen miktarlarda N-asetil-D-glukozamin birimlerini içerir.

Kaynak kitosanı biyobozunabilirlik, biyouyumluluk, antibakteriyel özellik ve gözenekli yapı oluşturabilme potansiyeli nedeniyle doku mühendisliği açısından değerli bir polimer olarak ele almaktadır.

Neden tip I kolajen kullanıldı?

Tip I kolajen (COL I), kemiğin organik hücre dışı matriksinin temel bileşenlerinden biridir. Kaynak, kolajen üzerindeki arginin–glisin–aspartik asit yani RGD motiflerinin hücre integrinleriyle etkileşime girebilmesini hücre tutunmasını destekleyen özelliklerden biri olarak açıklamaktadır.

Bu çalışmada kolajen yalnız mekanik bir dolgu maddesi olarak değil, hücrelerin tanıyabileceği biyokimyasal bir matriks bileşeni olarak kompozite eklenmiştir.

Neden hidroksiapatit kullanıldı?

Hidroksiapatit (HAP), kemiğin mineral fazıyla ilişkili kalsiyum fosfat bazlı bir apatittir. Çalışmada kitosan–kolajen sistemine mineral bileşen kazandırmak, kemiğin kompozit yapısına daha yakın bir biyomimetik ortam oluşturmak ve iskele yapısının osteoblastlarla etkileşimini desteklemek amacıyla kullanılmıştır.

Neden üç bileşen birlikte kullanıldı?

Kitosan gözenekli biyopolimer matrisi, COL I hücrelerle etkileşebilen organik matriks bileşenini ve HAP mineral fazı temsil eder. Bu üçlü yapı doğal kemiğin tüm özelliklerini yeniden oluşturmaz; ancak polimerik, protein ve mineral bileşenleri aynı iskelede birleştirerek biyomimetik bir yaklaşım oluşturur.

Çalışmanın kontrol grubu nedir?

Kontrol iskelesinde karides kabuğundan elde edilen kitosan yerine ticari orta molekül ağırlıklı kitosan kullanılmıştır. HAP, COL I ve iskele üretim yaklaşımı aynı tutulmuştur. Böylece araştırmacılar kitosan kaynağının kompozit iskelenin fizikokimyasal özellikleri üzerindeki etkisini karşılaştırmayı amaçlamıştır.

Çapraz bağlayıcı neden önemli bir ayrıntıdır?

Kaynak, kompozit iskelenin herhangi bir kimyasal çapraz bağlayıcı kullanılmadan üretildiğini özellikle vurgulamaktadır. Yapı; bileşenlerin karıştırılması, dondurulması ve liyofilizasyonuyla elde edilmiştir. Bu özellik çalışmanın üretim yaklaşımının temel noktalarından biridir.

Deasetilasyon Derecesi Neyi İfade Eder?

Deasetilasyon derecesi (degree of deacetylation, DD), kitin/kitosan zincirindeki asetillenmiş birimlerin ne ölçüde deasetillenerek serbest amino grupları taşıyan glukozamin birimlerine dönüştüğünü ifade eden yüzdedir; bu çalışmada FTIR'deki 1320 ve 1420 cm⁻¹ absorbans bantlarının oranı kullanılarak karides kabuğu kitosanı için %77,22 ve ticari kitosan için %69,87 hesaplanmıştır.

Çalışmada kullanılan DD denklemi PDF'de şu biçimde verilmiştir:

\[ DD(\%)= 100- \left( \frac{A_{1320}}{A_{1420}}-0.3822 \right) \times \frac{1}{0.03133} \]

Burada \(A_{1320}\), FTIR spektrumundaki 1320 cm⁻¹ bandının absorbansını; \(A_{1420}\), 1420 cm⁻¹ referans bandının absorbansını temsil eder. Kaynak 1320 cm⁻¹ bandını asetillenmiş amin/amid fonksiyonuyla ilişkilendirmekte, 1420 cm⁻¹ bandını DD hesabı için referans olarak kullanmaktadır.

DD'nin yüksek olması, polimer zincirinde daha yüksek oranda deasetillenmiş amino grubu bulunduğunu ifade eder. Ancak DD tek başına iskelenin şişmesini veya degradasyonunu belirlemez; saflık, artık mineraller, protein kalıntıları, polimer yapısı ve enzime erişilebilirlik gibi diğer özellikler de etkili olabilir.

Kaynağın DD yorumunda neden dikkat gerekiyor?

Kaynak deney sonucunda karides kabuğu kitosanının DD değerini %77,22, ticari kitosanın DD değerini %69,87 olarak vermektedir. Buna rağmen özet bölümünde karides kabuğu iskelesindeki düşük şişme ve yavaş degradasyonun olası nedenlerinden biri “daha düşük deasetilasyon derecesi” olarak yazılmıştır.

Bu iki ifade doğrudan birbiriyle uyumlu değildir. Ölçülen DD değerlerine göre karides kabuğu kitosanının DD'si ticari kitosandan daha düşüktür denemez. Tartışma bölümünde yazarların daha açık biçimde vurguladığı olası nedenler düşük saflık, artık mineraller, heterojen yapı ve hidrolitik enzime daha düşük erişilebilirliktir.

Kitosan ekstraksiyonunun üç aşaması

Kaynak metni deproteinizasyonda protein kaybını %57,04 ± 8,73 olarak bildirmektedir. Demineralizasyon sırasında HCl'nin CaCO₃ ve Ca₃(PO₄)₂ gibi mineralleri uzaklaştırdığı; deasetilasyon sırasında ise kitindeki asetamit gruplarının uzaklaştırılarak amino gruplarının oluştuğu açıklanmaktadır.

Kitosan verimi

Karides kabuğundan elde edilen kitosanın verimi kaynakta %22,37 ± 1,25 olarak raporlanmıştır. Elde edilen kitosan kirli beyaz toz görünümündedir.

FTIR kitosanın elde edildiğini nasıl destekledi?

Ekstre edilen kitosan ile ticari kitosanın FTIR spektrumlarında benzer karakteristik bant desenleri gözlenmiştir. Kaynak başlıca bantları şöyle yorumlamaktadır:

FTIR spektrum benzerliği, araştırmacılar tarafından izole biyomalzemenin kitosan olduğunun doğrulanması olarak değerlendirilmiştir.

Kompozit iskele nasıl üretildi?

İlk olarak 1,75 g hidroksiapatit %2 fosforik asit içinde çözülmüş ve manyetik karıştırıcıyla karıştırılmıştır. Daha sonra 0,5 g kitosan 10 mL asetik asit içinde çözülmüş ve HAP çözeltisine eklenmiştir. Bu karışım, 10 mL asetik asit içindeki 0,25 g sığır kaynaklı kolajen çözeltisiyle birleştirilmiştir.

Karışım NaOH ile pH 7'ye nötralize edilmiş ve demineralize su eklenerek nihai HAP, kitosan ve kolajen konsantrasyonları sırasıyla 175, 50 ve 25 µg/mL olacak şekilde ayarlanmıştır.

Hazırlanan çözelti silikon kalıba dökülmüş, −80 °C'de 24 saat dondurulmuş ve ardından artık çözücülerin uzaklaştırılması ve gözenekli yapının elde edilmesi amacıyla 24 saat liyofilize edilmiştir.

Liyofilizasyon nedir?

Liyofilizasyon veya dondurarak kurutma, önceden dondurulmuş bir örnekteki çözücünün düşük basınç altında uzaklaştırılmasına dayanan kurutma yaklaşımıdır. Bu çalışmada ana bilimsel işlevi, dökülmüş kompozit karışımından üç boyutlu süngerimsi ve gözenekli bir katı iskele üretmektir.

Kompozit FTIR ne gösterdi?

Kompozit iskele FTIR spektrumunda 3500–3300 cm⁻¹ bölgesindeki geniş bant N–H ve O–H gerilmeleriyle ilişkilendirilmiştir. 1651, 1588 ve 1416–1250 cm⁻¹ bölgeleri C=O, amid I ve C–N titreşimleriyle; 1537 cm⁻¹ N–H bükülmesiyle ilişkilendirilmiştir.

Hidroksiapatitle ilişkili fosfat grupları için kaynak 1029 cm⁻¹'de belirgin güçlü bir bant, hidrojen fosfat için 875 cm⁻¹ ve karbonat grupları için 1407 cm⁻¹ bandı bildirmiştir.

Kolajen I'e özgü bazı amid A ve amid B bantlarının ise kitosanın N–H ve O–H bantlarıyla örtüştüğü için açık biçimde seçilemediği belirtilmiştir. Bu nedenle kaynak FTIR sonucunu “kolajenin bütün karakteristik bantları ayrı ayrı gösterildi” şeklinde sunmamaktadır.

EDS hangi elementleri gösterdi?

Kaynak, özellikle Ca ve P piklerini kompozitteki hidroksiapatit/mineral bileşenle uyumlu olarak değerlendirmektedir.

Şişme, Degradasyon ve Basma Dayanımı Sonuçları Birlikte Nasıl Yorumlanmalıdır?

Karides kabuğu kitosanlı iskele ticari kitosanlı kontrol iskelesine göre çok daha az su almış ve ilk haftalarda daha yavaş degradasyon göstermiş, buna karşılık iki iskelenin ölçülen basma dayanımları birbirine çok yakın kalmıştır; ancak yaklaşık 1 MPa'lık dayanım değerleri kaynağın kendi verdiği 2–12 MPa kansellöz kemik aralığının altındadır ve bu nedenle mekanik yeterlilik iddiası sınırlı tutulmalıdır.

Gözenek morfolojisi

SEM görüntülerinde hem ticari hem karides kabuğu kitosanlı iskelelerde düzensiz biçimli, açık ve birbirine bağlı gözenek ağı görülmüştür. Gerçek SEM görüntüleri çalışmanın deneysel kanıtı olduğu için burada yapay SEM görüntüsü oluşturulmamıştır.

Gözenek çapları

Gözenek çapı ImageJ kullanılarak beş tekrar üzerinden değerlendirilmiştir. Geniş standart sapmalar, özellikle düzensiz gözenek geometrisinin dağılımı genişlettiğini göstermektedir.

Porozite nasıl hesaplandı?

Kuru kompozit önce \(W_0\) olarak tartılmış, %100 etanol içine tamamen daldırılmış, dış yüzeydeki fazla etanol uzaklaştırılmış ve yeniden \(W_1\) olarak tartılmıştır. Her grup beş tekrar halinde değerlendirilmiştir.

Kaynak porozite denklemini:

\[ \mathrm{Porozite}(\%)= \frac{W_1-W_0}{\rho\times V}\times100 \]

şeklinde vermektedir.

\(W_0\) kuru kompozit kütlesi, \(W_1\) etanol emdirildikten sonraki kütledir. Kaynak paragrafında \(\rho\) ve \(V\) sembollerinin anlamı ayrıca açık biçimde tanımlanmamaktadır; bu nedenle Verianla bu iki sembole kaynakta bulunmayan kesin bir tanım eklememektedir.

Porozite değerlerinde kaynak metin–şekil uyuşmazlığı

Kaynak metni poroziteyi sırasıyla ticari ve karides kabuğu kitosanlı iskele için %61,85 ± 2,61 ve %64,71 ± 0,77 olarak yazmaktadır. Buna karşılık kaynak Şekil 3f'deki çubukların yüksekliği ve “Commercial / Shrimp” lejantı görsel olarak ticari iskelenin daha yüksek, karides iskelesinin daha düşük poroziteye sahip olduğunu göstermektedir.

Makale bu farkı açıklamadığından hangi grubun hangi kesin yüzdeye ait olduğu konusunda kaynak metni ile şekil arasında tutarsızlık bulunmaktadır. Değerlerin grupları Verianla tarafından sessizce ters çevrilmemiştir.

Şişme oranı formülü

\[ \mathrm{Şişme\ oranı}(\%)= \frac{W_1-W_0}{W_0}\times100 \]

Burada \(W_0\) başlangıç numune kütlesi, \(W_1\) belirli inkübasyon süresinden sonra PBS emmiş numunenin kütlesidir. Pozitif fark, iskelenin sıvı alarak başlangıç kütlesinin üzerine çıktığını gösterir.

Şişme deneyi nasıl yapıldı?

İskeleler pH 7,4 PBS içinde 37 °C'de tutulmuş ve 1, 3, 6, 12 ve 24 saatlerde ölçülmüştür.

Ticari kitosanlı iskelenin su alımı bütün ölçüm zamanlarında karides kabuğu kitosanlı iskeleden çok daha yüksek görünmektedir. Kaynak, iki iskelenin porozite ve gözenek çaplarında belirgin bir fark olmadığını belirterek düşük şişmeyi karides kabuğu kitosanındaki artık mineral/protein gibi safsızlıklarla ilişkilendirmektedir.

Ancak kaynakta bu karşılaştırmalar için kullanılan istatistiksel test ve p değerleri açık biçimde raporlanmamıştır. Bu nedenle “significant/no significant difference” ifadeleri ayrıntılı istatistiksel doğrulama olarak yeniden üretilemez.

Şişme zaman noktalarında kaynak açıklama farkı

Sonuç metni şişme değerlerini 1, 3, 6, 12 ve 24 saat için verir. Kaynak Şekil 4 açıklamasında ise grafik zamanları “0, 1, 4, 6, 12 ve 24 saat” olarak yazılmıştır. Bu 3 saat / 4 saat farkı kaynak tarafından açıklanmamıştır.

Degradasyon nasıl değerlendirildi?

Kuru iskeleler \(W_0\) olarak tartılmış ve PBS içinde 37 °C'de 1, 2, 3 ve 4 hafta tutulmuştur. İnkübasyon sonrasında numuneler çıkarılmış, fırında kurutulmuş ve \(W_1\) olarak yeniden tartılmıştır.

Kaynak PDF'de degradasyon denklemi şu şekilde basılmıştır:

\[ \mathrm{Degradasyon\ oranı}(\%)= \frac{W_1-W_0}{W_0}\times100 \]

Kaynak formül uyarısı: Metinde \(W_0\) başlangıç kuru kütlesi, \(W_1\) degradasyondan sonraki kuru kütle olarak tanımlanmaktadır. Materyal kütle kaybettiğinde \(W_1<W_0\) olacağından basılı denklem negatif bir yüzde verir. Buna karşılık kaynak bütün degradasyon sonuçlarını pozitif yüzdeler halinde raporlamaktadır. Dolayısıyla basılı denklem ile sonuçların işaret yönü arasında kaynak içi bir uyumsuzluk vardır. Verianla formülü kafadan ters çevirmemiştir.

Karides kabuğu kitosanlı iskele ilk üç haftada ticari kontrole göre belirgin biçimde daha yavaş kütle kaybı göstermiştir. Dördüncü haftada iki değer birbirine yaklaşmış fakat karides iskelesinin raporlanan degradasyonu yine daha düşüktür.

Kaynak bu davranışı karides kabuğundan izole edilen kitosanın daha düşük saflığı, heterojen yapısı, artık mineralleri ve hidrolitik enzime daha düşük erişilebilirliğiyle ilişkilendirmektedir. Çalışmanın kendi degradasyon deneyi yalnız PBS içindedir; lizozim içeren enzimatik degradasyon deneyi yapılmamıştır.

Basma dayanımı nasıl hesaplandı?

RT1-1225 A&D Company Universal Testing Machine kullanılmıştır. Kaynak numunelerin dikdörtgen şekilli olduğunu ve “length-to-diameter ratio 2:1” ifadesini kullanmaktadır. Dikdörtgen numune için “diameter” teriminin geometrik tanımı ayrıca açıklanmamıştır.

Kaynak ayrıca numunelerin “2,5 kN pressure” ile sıkıştırıldığını yazmaktadır. kN bir basınç değil kuvvet birimidir; makalenin verdiği basma dayanımı denklemi de kuvvetin alana bölünmesine dayanmaktadır:

\[ \sigma_c= \frac{F_c}{A} \]

Burada \(F_c\) basma yükü/kuvvetini ve \(A\) yükün uygulandığı kesit alanını temsil eder. Sonuç MPa cinsinden verilmiştir.

Basma dayanımı kemikle karşılaştırıldığında ne oluyor?

Kaynak kortikal kemik için 100–230 MPa, kansellöz kemik için 2–12 MPa referans aralıklarını vermektedir. İki iskelenin yaklaşık 0,97–0,991 MPa dayanımı hem kortikal kemikten çok düşüktür hem de kaynakta verilen 2 MPa kansellöz kemik alt sınırının altındadır.

Buna rağmen kaynak bir cümlede değerlerin “cancellous bone range (2–12 MPa)” içine düştüğünü ve trabeküler kemik uygulamalarına uygunluk önerdiğini yazmaktadır. Sayısal değerler bu cümleyi desteklememektedir. Nitekim hemen sonraki cümlede yazarlar iskelelerin mekanik dayanımının kemik doku mühendisliği kriterlerini karşılamadığını belirtmektedir.

Bu nedenle Verianla sonucu “mekanik olarak kansellöz kemikle eşdeğer” şeklinde sunmaz. Daha doğru ifade, iki deneysel iskelenin birbirine çok yakın yaklaşık 1 MPa basma dayanımı gösterdiği ancak kaynağın kendi verdiği kemik referans aralıklarının altında kaldığıdır.

MG-63 Hücre Sonuçları Kemik Rejenerasyonunu Kanıtlar mı?

Hayır. MG-63 hücrelerinin iskele üzerinde tutunması, metabolik MTT sinyalinin zamanla yükselmesi ve SEM'de hücre/ECM benzeri yapıların görülmesi iskelenin in vitro sitouyumluluğunu ve osteoblast-benzeri hücreleri destekleme potansiyelini gösterir; ancak gerçek kemik oluşumu, osteointegrasyon, vaskülarizasyon, in vivo kemik defekti iyileşmesi veya klinik etkinliği kanıtlamaz.

MG-63 nedir?

MG-63, osteoblast-benzeri özellikleri nedeniyle kemik biyomalzemelerinin hücre kültürü değerlendirmelerinde kullanılan insan kaynaklı bir hücre hattıdır. Bu çalışmada hücre–iskele etkileşimini in vitro değerlendirmek amacıyla kullanılmıştır.

Hücre deneyinin koşulları

Kaynağa göre \(5\times10^5\) MG-63 hücresi, daha önce %5 Pluronic F127 ile 30 dakika kaplanmış 24 kuyulu plakadaki kompozit üzerine ekilmiştir. Altı saatlik tutunma döneminin ardından kompozitler yeni besiyeri içeren yeni 24 kuyulu plakaya aktarılmıştır.

Yöntem bölümü hücrelerin daha sonra 96 saat kültüre edildiğini belirtmektedir. MTT değerlendirmesinde tetrazolyum tuzu eklenmiş, hücreler 37 °C'de bir saat daha inkübe edilmiş ve absorbans 450 nm'de Perkin Elmer çoklu plaka okuyucusuyla ölçülmüştür.

SEM için numuneler %4 paraformaldehitle fikse edilmiş ve %70–100 kademeli etanol serisiyle dehidrate edilmiştir.

MTT testi neyi ölçer?

MTT testi, metabolik olarak aktif hücrelerin tetrazolyum bileşiğini renkli formazan ürününe dönüştürmesine dayanan dolaylı bir hücre canlılığı/metabolik aktivite ölçümüdür. Absorbansın yükselmesi aynı deney sistemi içinde daha yüksek formazan oluşumuyla uyumludur; ancak absorbans tek başına doğrudan hücre sayısı, kemik oluşumu veya osteojenik farklılaşma ölçümü değildir.

Şekil 5 açıklamasına göre MTT verisi n=4'tür. Absorbans 24 saatten 144 saate doğru yükselmektedir ve kaynak bunu hücre tutunması/proliferasyonunun desteklendiği yönünde yorumlamaktadır.

MTT zamanlarında kaynak içi fark

Yöntem bölümü hücrelerin 96 saat kültüre edildiğini yazmasına rağmen sonuçlar 144 saate kadar veri raporlamaktadır. Ayrıca Şekil 5 açıklaması 24, 48 ve 144 saatleri saymakta, fakat metinde ve grafikte 96 saat değeri de bulunmaktadır. Kaynak bu farkları açıklamamıştır.

SEM'deki hücre görüntüsü ne gösterdi?

Kaynak, hücre ekiminden dört gün sonra SEM ile iskele üzerinde MG-63 hücrelerini ve hücre dışı matriks lifleri olarak yorumlanan yapıları göstermektedir. Araştırmacılar hücrelerin kolajendeki RGD motifleri ile integrin reseptörleri üzerinden etkileşebileceğini ve hücre dışı matriks salgılayarak iskele ağını yeniden şekillendirebileceğini tartışmaktadır.

Bu SEM görüntüsü deneysel gözlem olduğu için Verianla tarafından yapay olarak yeniden üretilmemiştir.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Çalışmanın deneysel tasarımı

Karidesin kaynağı

Litopenaeus vannamei örnekleri Ocak 2023'te Yogyakarta'daki yerel bir pazardan alınmış ve Universitas Gadjah Mada, Faculty of Biology, Laboratory of Animal Systematics tarafından N.46/BI/SH/III/2023 numarasıyla doğrulanmıştır.

SEM ve gözenek ölçümü

İskele morfolojisi JEOL JSM7100F taramalı elektron mikroskobuyla incelenmiştir. Numuneler kesilmiş, karbon bant kullanılarak alüminyum stub üzerine monte edilmiş ve görüntüler 50× ve 250× büyütmede alınmıştır.

Gözenek boyutları ImageJ kullanılarak beş tekrar üzerinden analiz edilmiştir. Aynı cihazda EDS kullanılarak element bileşimi değerlendirilmiştir.

Şişme ile porozite aynı şey midir?

Hayır. Porozite, iskele hacmi içinde boşlukların ne kadar yer kapladığıyla ilişkili yapısal bir özelliktir. Şişme ise malzemenin PBS gibi sıvıyı emdiğinde başlangıç kuru kütlesine göre ne kadar sıvı aldığıyla ilgilidir.

İki iskele benzer gözenek yapısına sahip olsa bile polimerin kimyasal saflığı, hidrofilikliği ve matriks bileşimi nedeniyle sıvı alımı farklı olabilir. Kaynak karides kabuğu iskelesindeki düşük şişmeyi bu çerçevede tartışmaktadır.

Daha yavaş degradasyon iyi midir?

Tek başına “iyi” veya “kötü” değildir. Doku mühendisliği iskelesinin yeterince uzun süre yapısal destek sağlaması ancak yeni doku oluşurken uygun hızda parçalanması beklenir. Çok hızlı degradasyon yapısal desteği erken kaybettirebilir; aşırı yavaş degradasyon ise kalıcı yabancı materyal sorunları yaratabilir.

Bu çalışma yalnız dört haftalık PBS inkübasyonu sağlamaktadır. Canlı dokudaki enzimler, bağışıklık sistemi, mekanik yükleme ve diğer biyolojik süreçler bulunmadığından in vivo degradasyon hızı bu deneyden doğrudan çıkarılamaz.

Çalışmanın güçlü yönleri

• Deniz ürünü atığı olan karides kabuğunun kitosan kaynağı olarak değerlendirilmesi.
• Karides kitosanının ticari kitosanla aynı kompozit üretim yaklaşımında karşılaştırılması.
• Kimyasal, morfolojik, fiziksel, mekanik ve hücresel özelliklerin aynı çalışma içinde birlikte değerlendirilmesi.
• Çapraz bağlayıcı kullanılmadan basit dondurma–liyofilizasyon yaklaşımının uygulanması.
• Gözenek çapı, porozite, şişme, degradasyon ve basma dayanımı gibi farklı iskele performans boyutlarının ölçülmesi.
• MG-63 hücreleriyle in vitro tutunma ve metabolik aktivite değerlendirmesinin eklenmesi.

Çalışmanın desteklediği sonuçlar

• Karides kabuğundan kitosan elde edilmiş ve FTIR spektrumu ticari kitosanın karakteristik yapısıyla uyum göstermiştir.
• Karides kabuğu kitosanının raporlanan DD değeri %77,22'dir.
• Kitosan, COL I ve HAP çapraz bağlayıcı kullanılmadan liyofilize üç boyutlu kompozit iskeleye dönüştürülebilmiştir.
• SEM, iskelelerde açık ve birbirine bağlı gözenekli mikro yapı göstermiştir.
• EDS, karides kabuğu kompozitinde O, Ca, C ve P varlığını göstermiştir.
• Karides kabuğu kitosanlı iskele ticari kontrole kıyasla daha düşük şişme ve daha yavaş PBS degradasyonu göstermiştir.
• Karides ve ticari iskelelerin ölçülen basma dayanımları birbirine yakındır.
• MG-63 MTT absorbansı zamanla yükselmiş ve SEM'de iskele üzerinde hücrelerle uyumlu yapılar gözlenmiştir.

Çalışmanın doğrudan desteklemediği sonuçlar

• İskelenin canlı organizmada kemik defektini iyileştirdiği gösterilmemiştir.
• İnsanlarda güvenli veya etkili bir kemik grefti olduğu gösterilmemiştir.
• Gerçek in vivo osteointegrasyon ölçülmemiştir.
• Yeni damar oluşumu veya vaskülarizasyon değerlendirilmemiştir.
• Uzun dönem biyobozunma ölçülmemiştir.
• Bağışıklık veya inflamatuvar yanıt değerlendirilmemiştir.
• MTT absorbansı doğrudan yeni kemik miktarını ölçmez.
• MG-63 hücre tutunması tek başına gerçek osteokondüksiyon veya kemik rejenerasyonu kanıtı değildir.
• Yaklaşık 1 MPa basma dayanımının yük taşıyan kemik uygulamaları için yeterli olduğu gösterilmemiştir.
• Kaynağın kendi verdiği 2–12 MPa kansellöz kemik aralığına göre yaklaşık 1 MPa'lık iskeleler bu aralığın altında kalmaktadır.

Çalışmanın temel sınırlılıkları

Birinci sınır, biyolojik değerlendirmenin yalnız MG-63 osteoblast-benzeri hücre hattı ve in vitro testlerle yapılmasıdır. Hayvan modeli veya gerçek kemik defekti kullanılmamıştır.

İkinci sınır, mekanik dayanımın yaklaşık 1 MPa düzeyinde olmasıdır. Kaynağın verdiği kemik referans aralıklarıyla karşılaştırıldığında bu değer düşük kalmaktadır.

Üçüncü sınır, karides kabuğu kitosanında kalan safsızlıkların düşük şişme ve degradasyonla ilişkilendirilmesine rağmen artık protein/mineral miktarlarının tümünün ayrıntılı nicel saflık analiziyle ortaya konmamasıdır.

Dördüncü sınır, çalışmada kullanılan bazı istatistiksel “significant/no significant difference” ifadeleri için test adı, p değeri ve anlamlılık eşiğinin açık biçimde raporlanmamış olmasıdır.

Beşinci sınır, kaynak içindeki bazı formül, şekil ve sayı tutarsızlıklarıdır: degradasyon denklemindeki işaret yönü, porozite metin–grafik sırası, iç gözenek belirsizlik değerinin bozuk basımı, basma dayanımı–kansellöz kemik aralığı karşılaştırması ve MTT zaman noktaları bunların başlıcalarıdır.

Kaynak ve Yöntem Notu

Özgün çalışma: Biomimetic Scaffold of Chitosan from Litopenaeus vannamei Shrimp Shells Incorporated with Collagen and Hydroxyapatite for Bone Tissue Regeneration

Yazarlar: Cheryn Ivana; Hendrik Satria Dwi Putra; Nyoman Bayu Wisnu Kencana; Agustina Setiawati.

Sorumlu yazar: Agustina Setiawati.

Sorumlu yazar e-postası: nina@usd.ac.id

Kurum: Department of Pharmaceutical Biology, Faculty of Pharmacy, Sanata Dharma University, Yogyakarta, Indonesia.

Dergi: Advanced Pharmaceutical Bulletin.

Cilt / sayı: 16 / 1.

Sayfalar: 52–61.

DOI: 10.34172/apb.025.45909.

Kaynak türü: Original Article; laboratuvar temelli biyomalzeme geliştirme ve in vitro hücre kültürü çalışması.

Alınma tarihi: 4 Haziran 2025.

Revizyon tarihi: 19 Eylül 2025.

Kabul tarihi: 17 Aralık 2025.

Elektronik yayın tarihi: PDF makale geçmişinde 21 Aralık 2025.

Sayı bibliyografisi: Advanced Pharmaceutical Bulletin 2026;16(1):52–61. Elektronik yayın tarihi ile dergi sayı yılı farklıdır ve ikisi ayrı tutulmuştur.

Yayınevi: TUOMS PRESS, Tabriz University of Medical Sciences.

Hakemlik: Advanced Pharmaceutical Bulletin resmî olarak hakemli, multidisipliner açık erişimli bir dergidir.

Lisans: Creative Commons Attribution — CC BY. PDF, kaynak ve yazarlar belirtildiği sürece kullanım, dağıtım ve çoğaltmaya izin verildiğini açıkça belirtmektedir.

Etik onay: Ethics Committee of the Faculty of Health Sciences, Respati University, Yogyakarta; onay numarası 051/FIKES/PL/III/2023.

Finansman: Çalışma sorumlu yazar tarafından kendi kaynaklarıyla finanse edilmiş ve herhangi bir kuruluş tarafından dış mali destek almamıştır.

Çıkar çatışması: Yazarlar potansiyel çıkar çatışması bildirmemiştir.

Veri erişilebilirliği: Ana PDF'de ayrı bir Data Availability bölümü bulunmamaktadır.

Ek dosya: Kaynak Figure S1 olarak SEM-EDS spektrumunu ve Table S1 olarak EDS spektrum analiz sonuçlarını ek materyal olarak belirtmektedir.

Eşit katkı: Kaynakta eşit katkı veya eş birinci yazarlık beyanı bulunmamaktadır.

Yazar katkıları: Kavramsallaştırma: Agustina Setiawati. Veri kürasyonu: Agustina Setiawati. Formal analiz: Agustina Setiawati, Cheryn Ivana, Nyoman Bayu Wisnu Kencana. Finansman edinimi: Agustina Setiawati. Araştırma: Agustina Setiawati. Yöntem: Cheryn Ivana, Hendrik Satria Dwi Putra, Nyoman Bayu Wisnu Kencana. Proje yönetimi: Hendrik Satria Dwi Putra, Nyoman Bayu Wisnu Kencana. Kaynaklar: Agustina Setiawati. Yazılım: Cheryn Ivana, Hendrik Satria Dwi Putra. Süpervizyon: Agustina Setiawati. Doğrulama: Agustina Setiawati. Görselleştirme: Hendrik Satria Dwi Putra. İlk taslak: Cheryn Ivana, Agustina Setiawati. Gözden geçirme ve düzenleme: Agustina Setiawati.

Kaynak içi tutarlılık notu 1 — deasetilasyon derecesi: Karides kabuğu kitosanı DD=%77,22 ve ticari kitosan DD=%69,87 olarak ölçülmüştür. Özet buna rağmen karides iskelesindeki düşük şişme ve degradasyonu “daha düşük DD” ile ilişkilendirmektedir. Ölçülen değerler bu ifadeyi desteklememektedir.

Kaynak içi tutarlılık notu 2 — degradasyon denklemi: Kaynak \(W_0\)'ı başlangıç kuru kütlesi, \(W_1\)'i degradasyon sonrası kuru kütle olarak tanımlarken denklemi \((W_1-W_0)/W_0\times100\) olarak basmaktadır. Pozitif kütle kaybı sonuçlarıyla formülün işaret yönü uyumlu değildir.

Kaynak içi tutarlılık notu 3 — iç gözenek çapı: Karides kabuğu iskelesinin iç gözenek çapı metinde 107,56 µm olarak verilirken standart sapma “32.32.72 µm” biçiminde bozuk basılmıştır. Verianla bu değeri tahmin ederek düzeltmemiştir.

Kaynak içi tutarlılık notu 4 — porozite: Metin ticari ve karides iskeleleri için sırasıyla %61,85 ± 2,61 ve %64,71 ± 0,77 yazarken Şekil 3f'nin çubuk/lejant düzeni görsel olarak ters gruplamayı göstermektedir.

Kaynak içi tutarlılık notu 5 — basma dayanımı: Kaynak değerleri 0,97 ve 0,991 MPa iken aynı paragrafta kansellöz kemik aralığı 2–12 MPa olarak verilmektedir. Bu nedenle iskele değerlerinin 2–12 MPa aralığında olduğu şeklindeki cümle sayısal olarak uyumlu değildir. Kaynak hemen ardından mekanik dayanımın kemik doku mühendisliği kriterlerini karşılamadığını da belirtmektedir.

Kaynak içi tutarlılık notu 6 — MTT zamanı: Yöntem 96 saat kültürden söz ederken sonuçlar 144 saate kadar veri içerir. Şekil 5 açıklaması ise 24, 48 ve 144 saatleri saymasına rağmen sonuç metni ve grafik 96 saat değerini de içerir.

Kaynak içi tutarlılık notu 7 — şişme/degradasyon şekil açıklaması: Şekil 4 açıklamasındaki bazı zaman noktaları sonuç metnindeki 1, 3, 6, 12, 24 saatlik şişme ve 1, 2, 3, 4 haftalık degradasyon serileriyle tam olarak uyuşmamaktadır.

İstatistik notu: Gözenek çapı ve porozite ölçümlerinde n=5, basma dayanımında n=3, Şekil 5 MTT değerlendirmesinde n=4 bilgisi bulunmaktadır. Ancak ana PDF'de ayrı bir istatistiksel analiz bölümü, kullanılan hipotez testi, p değeri veya anlamlılık eşiği raporlanmamaktadır. Bu nedenle metindeki “significant” ifadeleri ayrıntılı istatistiksel kanıt olarak genişletilmemiştir.

Temel biyolojik sınır: Çalışma in vitro MG-63 hücre kültürüne dayanır. Hayvan modeli, insan deneyi veya gerçek kemik defekti implantasyonu yapılmamıştır.

Osteokondüksiyon sınırı: Kaynak hücre tutunması ve proliferasyon sonuçlarını osteokondüktif potansiyelle ilişkilendirmektedir; ancak yeni kemiğin iskele yüzeyinde in vivo büyümesi doğrudan ölçülmemiştir.

Mekanik sınır: Yaklaşık 1 MPa'lık basma dayanımı kaynağın kendi verdiği 2–12 MPa kansellöz kemik aralığının altında kalmaktadır; sonuç yük taşıyan klinik kemik grefti yeterliliği olarak yorumlanmamalıdır.