Karides qabığı xitozanı–tip I kollagen–hidroksiapatit kompozit iskələsi, Litopenaeus vannamei qabıqlarından çıxarılan xitozanın tip I kollagen (COL I) və hidroksiapatit (HAP) ilə birləşdirilib liyofilizasiya yolu ilə üçölçülü məsaməli quruluşa çevrildiyi sümük toxuması mühəndisliyi biomaterialıdır. Tədqiqat karides qabığından əldə edilən xitozanla hazırlanmış bu iskələnin kimyəvi quruluşunu, məsamə morfologiyasını, porozluğunu, şişmə davranışını, deqradasiyasını, sıxılma möhkəmliyini və MG-63 osteoblastabənzər hüceyrələrlə in vitro sitouyğunluğunu, kommersiya xitozanından eyni yanaşma ilə hazırlanmış nəzarət iskələsi ilə müqayisə edir.

Karides qabıqlarından xitozan deproteinizasiya, demineralizasiya və deasetilasiya mərhələləri ilə əldə edilmişdir. Xitozan çıxımı %22,37 ± 1,25, FTIR ilə hesablanan deasetilasiya dərəcəsi %77,22-dir. Kommersiya xitozanı üçün deasetilasiya dərəcəsi %69,87 olaraq bildirilmişdir. İzolyasiya edilmiş xitozanın FTIR zolaqlarının kommersiya xitozanı ilə oxşar funksional qruplar göstərməsi tədqiqatçılar tərəfindən xitozanın uğurla əldə edilməsini dəstəkləyən kimyəvi sübut kimi qiymətləndirilmişdir.

Hidroksiapatit, xitozan və tip I kollagen müvafiq olaraq yekun 175, 50 və 25 µg/mL konsentrasiyalarında birləşdirilmiş; qarışıq pH 7-yə neytrallaşdırılmış, silikon qəlibə tökülmüş, −80 °C-də 24 saat dondurulmuş və sonra 24 saat liyofilizə edilmişdir. Çarpaz bağlayıcı istifadə edilməmişdir. Yaranmış quruluş kirli ağ rəngli, süngərəbənzər və üçölçülü kompozit iskələ kimi təsvir edilmişdir.

Karides qabığı xitozanlı iskələ 24 saatda %278,55 ± 36,49 şişmə və dörd həftədə %41,87 ± 7,27 deqradasiya göstərmişdir. Kommersiya xitozanı nəzarətində müvafiq dəyərlər %931,76 ± 45,64 və %47,37 ± 2,03 olmuşdur. Karides qabığı iskələlərinin sıxılma möhkəmliyi 0,991 ± 0,01 MPa, kommersiya nəzarətinin isə 0,97 ± 0,01 MPa ölçülmüşdür. MG-63 hüceyrələri iskələ üzərində yapışmış; MTT/formazan absorbansı 24 saatdan 144 saata doğru yüksəlmişdir.

Bu nəticələr in vitro material xarakterizasiyası və hüceyrə kulturası nəticələridir. Tədqiqat iskələnin canlı orqanizmdə sümük yaratdığını, sümük defektini sağaltdığını və ya insanlarda təhlükəsiz və effektiv implant olduğunu göstərmir. Mənbənin “osteoconductivity” və sümük regenerasiyası potensialına dair ifadələri bu təcrübələrin təmin etdiyi namizəd biomaterial səviyyəsində qiymətləndirilməlidir.

Biomimetik Xitozan–Kollagen–Hidroksiapatit İskələsi Nədir?

Biomimetik xitozan–kollagen–hidroksiapatit iskələsi təbii sümüyün üzvi və mineral komponentlərindən bəzilərini təqlid etmək məqsədilə xitozanı, tip I kollageni və hidroksiapatiti üçölçülü məsaməli quruluşda birləşdirən kompozit toxuma mühəndisliyi materialıdır; bu tədqiqatda xitozan dəniz məhsulu tullantısı olan Litopenaeus vannamei karides qabıqlarından əldə edilmişdir.

İskələ və ya scaffold nə deməkdir?

Toxuma mühəndisliyində scaffold və ya iskələ hüceyrələrin yapışa, çoxala və ətrafında yeni hüceyrəxarici matriks yarada bildiyi üçölçülü dəstək quruluşudur. İskələ birbaşa “yeni sümük” deyil. İdeal halda bioloji toxuma yaranarkən müvəqqəti fiziki və biokimyəvi dəstək verməsi və uyğun sürətlə parçalanması gözlənilir.

Niyə xitozan istifadə edildi?

Xitozan, xitinin deasetilasiyası nəticəsində alınan polisaxarid biopolimerdir. Qabıqlı dəniz canlılarının xarici skeletlərindəki xitin xitozan istehsalında xammal kimi istifadə oluna bilər. Xitozan β(1→4) qlikozid rabitələri ilə bir-birinə bağlanan D-qlükozamin vahidlərini və dəyişən miqdarda N-asetil-D-qlükozamin vahidlərini ehtiva edir.

Mənbə xitozanı bioloji parçalanma qabiliyyəti, biouyğunluq, antibakterial xüsusiyyət və məsaməli quruluş yaratmaq potensialına görə toxuma mühəndisliyi baxımından dəyərli polimer kimi nəzərdən keçirir.

Niyə tip I kollagen istifadə edildi?

Tip I kollagen (COL I) sümüyün üzvi hüceyrəxarici matriksinin əsas komponentlərindən biridir. Mənbə kollagen üzərindəki arginin–qlisin–aspartik turşu, yəni RGD motivlərinin hüceyrə inteqrinləri ilə qarşılıqlı təsirə girməsini hüceyrə yapışmasını dəstəkləyən xüsusiyyətlərdən biri kimi izah edir.

Bu tədqiqatda kollagen yalnız mexaniki doldurucu kimi deyil, hüceyrələrin tanıya bildiyi biokimyəvi matriks komponenti kimi kompozitə əlavə edilmişdir.

Niyə hidroksiapatit istifadə edildi?

Hidroksiapatit (HAP) sümüyün mineral fazası ilə əlaqəli kalsium-fosfat əsaslı apatittir. Tədqiqatda xitozan–kollagen sisteminə mineral komponent qazandırmaq, sümüyün kompozit quruluşuna daha yaxın biomimetik mühit yaratmaq və iskələ quruluşunun osteoblastlarla qarşılıqlı təsirini dəstəkləmək məqsədilə istifadə edilmişdir.

Niyə üç komponent birlikdə istifadə edildi?

Xitozan məsaməli biopolimer matriksi, COL I hüceyrələrlə qarşılıqlı təsir göstərə bilən üzvi matriks komponentini, HAP isə mineral fazanı təmsil edir. Bu üçlü quruluş təbii sümüyün bütün xüsusiyyətlərini yenidən yaratmır; lakin polimer, zülal və mineral komponentləri eyni iskələdə birləşdirərək biomimetik yanaşma yaradır.

Tədqiqatın nəzarət qrupu nədir?

Nəzarət iskələsində karides qabığından əldə edilən xitozan əvəzinə kommersiya orta molekulyar çəkili xitozan istifadə edilmişdir. HAP, COL I və iskələ istehsalı yanaşması eyni saxlanmışdır. Beləliklə, tədqiqatçılar xitozan mənbəyinin kompozit iskələnin fiziki-kimyəvi xüsusiyyətlərinə təsirini müqayisə etməyi məqsəd qoymuşlar.

Çarpaz bağlayıcı niyə mühüm detaldır?

Mənbə kompozit iskələnin heç bir kimyəvi çarpaz bağlayıcı istifadə edilmədən istehsal edildiyini xüsusi vurğulayır. Quruluş komponentlərin qarışdırılması, dondurulması və liyofilizasiyası ilə əldə edilmişdir. Bu xüsusiyyət tədqiqatın istehsal yanaşmasının əsas məqamlarından biridir.

Deasetilasiya Dərəcəsi Nəyi İfadə Edir?

Deasetilasiya dərəcəsi (degree of deacetylation, DD), xitin/xitozan zəncirində asetilləşmiş vahidlərin nə dərəcədə deasetilləşərək sərbəst amin qrupları daşıyan qlükozamin vahidlərinə çevrildiyini ifadə edən faizdir; bu tədqiqatda FTIR-dəki 1320 və 1420 cm⁻¹ absorbans zolaqlarının nisbətindən istifadə etməklə karides qabığı xitozanı üçün %77,22, kommersiya xitozanı üçün isə %69,87 hesablanmışdır.

Tədqiqatda istifadə olunan DD tənliyi PDF-də aşağıdakı formada verilmişdir:

\[ DD(\%)= 100- \left( \frac{A_{1320}}{A_{1420}}-0.3822 \right) \times \frac{1}{0.03133} \]

Burada \(A_{1320}\), FTIR spektrindəki 1320 cm⁻¹ zolağının absorbansını; \(A_{1420}\), 1420 cm⁻¹ istinad zolağının absorbansını təmsil edir. Mənbə 1320 cm⁻¹ zolağını asetilləşmiş amin/amid funksiyası ilə əlaqələndirir, 1420 cm⁻¹ zolağından isə DD hesabı üçün istinad kimi istifadə edir.

DD-nin yüksək olması polimer zəncirində daha yüksək nisbətdə deasetilləşmiş amin qrupunun olduğunu göstərir. Lakin DD təkbaşına iskələnin şişməsini və ya deqradasiyasını müəyyən etmir; saflıq, qalıq minerallar, zülal qalıqları, polimer quruluşu və fermentə əlçatanlıq kimi digər xüsusiyyətlər də təsir göstərə bilər.

Mənbənin DD şərhində niyə ehtiyatlı olmaq lazımdır?

Mənbə təcrübə nəticəsində karides qabığı xitozanının DD dəyərini %77,22, kommersiya xitozanının DD dəyərini isə %69,87 kimi verir. Buna baxmayaraq, xülasə bölməsində karides qabığı iskələsindəki aşağı şişmə və yavaş deqradasiyanın mümkün səbəblərindən biri “daha aşağı deasetilasiya dərəcəsi” kimi yazılmışdır.

Bu iki ifadə birbaşa bir-biri ilə uyğun deyil. Ölçülmüş DD dəyərlərinə görə karides qabığı xitozanının DD-si kommersiya xitozanından daha aşağıdır demək olmaz. Müzakirə bölməsində müəlliflərin daha açıq şəkildə vurğuladığı mümkün səbəblər aşağı saflıq, qalıq minerallar, heterogen quruluş və hidrolitik fermentə daha aşağı əlçatanlıqdır.

Xitozan ekstraksiyasının üç mərhələsi

Mənbə mətni deproteinizasiya zamanı zülal itkisini %57,04 ± 8,73 olaraq bildirir. Demineralizasiya zamanı HCl-in CaCO₃ və Ca₃(PO₄)₂ kimi mineralları uzaqlaşdırdığı; deasetilasiya zamanı isə xitindəki asetamid qruplarının uzaqlaşdırılaraq amin qruplarının yarandığı izah edilir.

Xitozan çıxımı

Karides qabığından əldə edilən xitozanın çıxımı mənbədə %22,37 ± 1,25 olaraq bildirilmişdir. Alınan xitozan kirli ağ toz görünüşündədir.

FTIR xitozanın əldə edildiyini necə dəstəklədi?

Ekstraksiya edilmiş xitozan ilə kommersiya xitozanının FTIR spektrlərində oxşar xarakterik zolaq nümunələri müşahidə edilmişdir. Mənbə əsas zolaqları belə şərh edir:

FTIR spektr oxşarlığı tədqiqatçılar tərəfindən izolyasiya edilmiş biomaterialın xitozan olduğunun təsdiqi kimi qiymətləndirilmişdir.

Kompozit iskələ necə istehsal edildi?

Əvvəlcə 1,75 g hidroksiapatit %2 fosfor turşusunda həll edilmiş və maqnit qarışdırıcı ilə qarışdırılmışdır. Sonra 0,5 g xitozan 10 mL sirkə turşusunda həll edilərək HAP məhluluna əlavə edilmişdir. Bu qarışıq 10 mL sirkə turşusundakı 0,25 g mal-qara mənşəli kollagen məhlulu ilə birləşdirilmişdir.

Qarışıq NaOH ilə pH 7-yə neytrallaşdırılmış və demineralizə olunmuş su əlavə edilərək yekun HAP, xitozan və kollagen konsentrasiyaları müvafiq olaraq 175, 50 və 25 µg/mL olacaq şəkildə tənzimlənmişdir.

Hazırlanan məhlul silikon qəlibə tökülmüş, −80 °C-də 24 saat dondurulmuş və sonra qalıq həlledicilərin uzaqlaşdırılması və məsaməli quruluşun əldə edilməsi məqsədilə 24 saat liyofilizə edilmişdir.

Liyofilizasiya nədir?

Liyofilizasiya və ya donduraraq qurutma əvvəlcədən dondurulmuş nümunədəki həlledicinin aşağı təzyiq altında uzaqlaşdırılmasına əsaslanan qurutma yanaşmasıdır. Bu tədqiqatda onun əsas elmi funksiyası tökülmüş kompozit qarışıqdan üçölçülü süngərəbənzər və məsaməli bərk iskələ yaratmaqdır.

Kompozit FTIR nə göstərdi?

Kompozit iskələnin FTIR spektrində 3500–3300 cm⁻¹ bölgəsindəki geniş zolaq N–H və O–H gərilmələri ilə əlaqələndirilmişdir. 1651, 1588 və 1416–1250 cm⁻¹ bölgələri C=O, amid I və C–N vibrasiyaları ilə; 1537 cm⁻¹ isə N–H əyilməsi ilə əlaqələndirilmişdir.

Hidroksiapatitlə əlaqəli fosfat qrupları üçün mənbə 1029 cm⁻¹-də aydın güclü zolaq, hidrogen-fosfat üçün 875 cm⁻¹ və karbonat qrupları üçün 1407 cm⁻¹ zolağı bildirmişdir.

Tip I kollagenə xas bəzi amid A və amid B zolaqlarının xitozanın N–H və O–H zolaqları ilə üst-üstə düşdüyü üçün aydın şəkildə seçilə bilmədiyi qeyd edilmişdir. Buna görə mənbə FTIR nəticəsini “kollagenin bütün xarakterik zolaqları ayrı-ayrılıqda göstərildi” şəklində təqdim etmir.

EDS hansı elementləri göstərdi?

Mənbə xüsusilə Ca və P piklərini kompozitdəki hidroksiapatit/mineral komponentlə uyğun kimi qiymətləndirir.

Şişmə, Deqradasiya və Sıxılma Möhkəmliyi Nəticələri Birlikdə Necə Şərh Edilməlidir?

Karides qabığı xitozanlı iskələ kommersiya xitozanlı nəzarət iskələsinə nisbətən xeyli az su qəbul etmiş və ilk həftələrdə daha yavaş deqradasiya göstərmiş, bununla yanaşı iki iskələnin ölçülmüş sıxılma möhkəmlikləri bir-birinə çox yaxın qalmışdır; lakin təxminən 1 MPa-lıq möhkəmlik dəyərləri mənbənin özünün verdiyi 2–12 MPa kansellöz sümük aralığından aşağıdır və buna görə mexaniki yetərlilik iddiası məhdud saxlanmalıdır.

Məsamə morfologiyası

SEM görüntülərində həm kommersiya, həm də karides qabığı xitozanlı iskələlərdə qeyri-müntəzəm formalı, açıq və bir-biri ilə əlaqəli məsamə şəbəkəsi görülmüşdür. Həqiqi SEM görüntüləri tədqiqatın eksperimental sübutu olduğu üçün burada süni SEM görüntüsü yaradılmamışdır.

Məsamə diametrləri

Məsamə diametri ImageJ istifadə edilərək beş təkrar əsasında qiymətləndirilmişdir. Geniş standart yayınmalar, xüsusilə qeyri-müntəzəm məsamə həndəsəsinin paylanmanı genişləndirdiyini göstərir.

Porozluq necə hesablandı?

Quru kompozit əvvəlcə \(W_0\) kimi çəkilmiş, %100 etanolun içinə tam batırılmış, xarici səthdəki artıq etanol uzaqlaşdırılmış və yenidən \(W_1\) kimi çəkilmişdir. Hər qrup beş təkrar şəklində qiymətləndirilmişdir.

Mənbə porozluq tənliyini:

\[ \mathrm{Porozite}(\%)= \frac{W_1-W_0}{\rho\times V}\times100 \]

şəklində verir.

\(W_0\) quru kompozitin kütləsi, \(W_1\) isə etanol hopdurulduqdan sonrakı kütlədir. Mənbə paraqrafında \(\rho\) və \(V\) simvollarının mənası ayrıca aydın şəkildə müəyyən edilməmişdir; buna görə Verianla bu iki simvola mənbədə olmayan dəqiq tərif əlavə etmir.

Porozluq dəyərlərində mənbə mətni–şəkil uyğunsuzluğu

Mənbə mətni porozluğu müvafiq olaraq kommersiya və karides qabığı xitozanlı iskələ üçün %61,85 ± 2,61 və %64,71 ± 0,77 kimi yazır. Buna qarşılıq, mənbə Şəkil 3f-dəki sütunların hündürlüyü və “Commercial / Shrimp” əfsanəsi vizual olaraq kommersiya iskələsinin daha yüksək, karides iskələsinin isə daha aşağı porozluğa malik olduğunu göstərir.

Məqalə bu fərqi izah etmədiyi üçün hansı qrupun hansı dəqiq faizə aid olduğu barədə mənbə mətni ilə şəkil arasında uyğunsuzluq vardır. Dəyərlərin qrupları Verianla tərəfindən səssizcə tərsinə çevrilməmişdir.

Şişmə nisbəti formulu

\[ \mathrm{Şişme\ oranı}(\%)= \frac{W_1-W_0}{W_0}\times100 \]

Burada \(W_0\) ilkin nümunə kütləsi, \(W_1\) müəyyən inkubasiya müddətindən sonra PBS hopdurmuş nümunənin kütləsidir. Müsbət fərq iskələnin maye qəbul edərək başlanğıc kütləsini keçdiyini göstərir.

Şişmə təcrübəsi necə aparıldı?

İskələlər pH 7,4 PBS içində 37 °C-də saxlanmış və 1, 3, 6, 12 və 24 saatlarda ölçülmüşdür.

Kommersiya xitozanlı iskələnin su qəbulunun bütün ölçmə vaxtlarında karides qabığı xitozanlı iskələdən xeyli yüksək olduğu görünür. Mənbə iki iskələnin porozluq və məsamə diametrlərində nəzərəçarpan fərq olmadığını qeyd edərək aşağı şişməni karides qabığı xitozanındakı qalıq mineral/zülal kimi çirklərlə əlaqələndirir.

Lakin mənbədə bu müqayisələr üçün istifadə olunan statistik test və p dəyərləri aydın şəkildə bildirilmir. Buna görə “significant/no significant difference” ifadələri ətraflı statistik təsdiq kimi yenidən təqdim edilə bilməz.

Şişmə vaxt nöqtələrində mənbə izahı fərqi

Nəticələr mətni şişmə dəyərlərini 1, 3, 6, 12 və 24 saat üçün verir. Mənbə Şəkil 4 izahında isə qrafik vaxtları “0, 1, 4, 6, 12 və 24 saat” kimi yazılmışdır. Bu 3 saat / 4 saat fərqi mənbə tərəfindən izah edilməmişdir.

Deqradasiya necə qiymətləndirildi?

Quru iskələlər \(W_0\) kimi çəkilmiş və PBS içində 37 °C-də 1, 2, 3 və 4 həftə saxlanmışdır. İnkubasiyadan sonra nümunələr çıxarılmış, sobada qurudulmuş və \(W_1\) kimi yenidən çəkilmişdir.

Mənbə PDF-də deqradasiya tənliyi aşağıdakı şəkildə çap edilmişdir:

\[ \mathrm{Degradasyon\ oranı}(\%)= \frac{W_1-W_0}{W_0}\times100 \]

Mənbə formul xəbərdarlığı: Mətndə \(W_0\) ilkin quru kütlə, \(W_1\) isə deqradasiyadan sonrakı quru kütlə kimi müəyyən edilir. Material kütlə itirdikdə \(W_1<W_0\) olacağı üçün çap olunmuş tənlik mənfi faiz verir. Buna qarşılıq, mənbə bütün deqradasiya nəticələrini müsbət faizlərlə bildirir. Deməli, çap olunmuş tənlik ilə nəticələrin işarə istiqaməti arasında mənbədaxili uyğunsuzluq vardır. Verianla formulu özündən tərsinə çevirməmişdir.

Karides qabığı xitozanlı iskələ ilk üç həftədə kommersiya nəzarətinə nisbətən nəzərəçarpacaq dərəcədə daha yavaş kütlə itkisi göstərmişdir. Dördüncü həftədə iki dəyər bir-birinə yaxınlaşmış, lakin karides iskələsinin bildirilən deqradasiyası yenə də aşağı olmuşdur.

Mənbə bu davranışı karides qabığından izolyasiya edilmiş xitozanın daha aşağı saflığı, heterogen quruluşu, qalıq mineralları və hidrolitik fermentə daha aşağı əlçatanlığı ilə əlaqələndirir. Tədqiqatın öz deqradasiya təcrübəsi yalnız PBS içindədir; lizozim ehtiva edən fermentativ deqradasiya təcrübəsi aparılmamışdır.

Sıxılma möhkəmliyi necə hesablandı?

RT1-1225 A&D Company Universal Testing Machine istifadə edilmişdir. Mənbə nümunələrin düzbucaqlı formalı olduğunu və “length-to-diameter ratio 2:1” ifadəsini istifadə edir. Düzbucaqlı nümunə üçün “diameter” terminının həndəsi tərifi ayrıca izah edilməmişdir.

Mənbə həmçinin nümunələrin “2,5 kN pressure” ilə sıxıldığını yazır. kN təzyiq deyil, qüvvə vahididir; məqalənin verdiyi sıxılma möhkəmliyi tənliyi də qüvvənin sahəyə bölünməsinə əsaslanır:

\[ \sigma_c= \frac{F_c}{A} \]

Burada \(F_c\) sıxılma yükünü/qüvvəsini, \(A\) isə yükün tətbiq olunduğu kəsik sahəsini təmsil edir. Nəticə MPa ilə verilmişdir.

Sıxılma möhkəmliyi sümüklə müqayisə ediləndə nə baş verir?

Mənbə kortikal sümük üçün 100–230 MPa, kansellöz sümük üçün 2–12 MPa istinad aralıqlarını verir. İki iskələnin təxminən 0,97–0,991 MPa möhkəmliyi həm kortikal sümükdən xeyli aşağıdır, həm də mənbədə verilən 2 MPa kansellöz sümük aşağı həddindən aşağıdır.

Buna baxmayaraq, mənbə bir cümlədə dəyərlərin “cancellous bone range (2–12 MPa)” daxilinə düşdüyünü və trabekulyar sümük tətbiqlərinə uyğunluq təklif etdiyini yazır. Rəqəmsal dəyərlər bu cümləni dəstəkləmir. Həqiqətən də dərhal sonrakı cümlədə müəlliflər iskələlərin mexaniki möhkəmliyinin sümük toxuması mühəndisliyi meyarlarını qarşılamadığını bildirirlər.

Buna görə Verianla nəticəni “mexaniki baxımdan kansellöz sümüyə ekvivalent” şəklində təqdim etmir. Daha düzgün ifadə odur ki, iki eksperimental iskələ bir-birinə çox yaxın təxminən 1 MPa sıxılma möhkəmliyi göstərmiş, lakin mənbənin özünün verdiyi sümük istinad aralıqlarından aşağı qalmışdır.

MG-63 Hüceyrə Nəticələri Sümük Regenerasiyasını Sübut Edirmi?

Xeyr. MG-63 hüceyrələrinin iskələ üzərində yapışması, metabolik MTT siqnalının zamanla yüksəlməsi və SEM-də hüceyrə/ECM-bənzər strukturların görünməsi iskələnin in vitro sitouyğunluğunu və osteoblastabənzər hüceyrələri dəstəkləmək potensialını göstərir; lakin həqiqi sümük yaranmasını, osteointeqrasiyanı, vaskulyarizasiyanı, in vivo sümük defektinin sağalmasını və ya klinik effektivliyi sübut etmir.

MG-63 nədir?

MG-63 osteoblastabənzər xüsusiyyətlərinə görə sümük biomateriallarının hüceyrə kulturası qiymətləndirmələrində istifadə olunan insan mənşəli hüceyrə xəttidir. Bu tədqiqatda hüceyrə–iskələ qarşılıqlı təsirini in vitro qiymətləndirmək üçün istifadə edilmişdir.

Hüceyrə təcrübəsinin şərtləri

Mənbəyə görə \(5\times10^5\) MG-63 hüceyrəsi əvvəlcədən %5 Pluronic F127 ilə 30 dəqiqə örtülmüş 24 quyulu lövhədəki kompozit üzərinə əkilmişdir. Altı saatlıq yapışma dövründən sonra kompozitlər yeni qida mühiti olan yeni 24 quyulu lövhəyə köçürülmüşdür.

Metod bölməsi hüceyrələrin daha sonra 96 saat kultivasiya edildiyini bildirir. MTT qiymətləndirməsində tetrazolium duzu əlavə edilmiş, hüceyrələr 37 °C-də daha bir saat inkubasiya edilmiş və absorbans 450 nm-də Perkin Elmer çoxlövhəli oxuyucu ilə ölçülmüşdür.

SEM üçün nümunələr %4 paraformaldehidlə fiksasiya edilmiş və %70–100 pilləli etanol seriyası ilə dehidratasiya olunmuşdur.

MTT testi nəyi ölçür?

MTT testi metabolik cəhətdən aktiv hüceyrələrin tetrazolium birləşməsini rəngli formazan məhsuluna çevirməsinə əsaslanan dolayı hüceyrə canlılığı/metabolik aktivlik ölçümüdür. Absorbansın yüksəlməsi eyni təcrübə sistemi daxilində daha yüksək formazan yaranması ilə uyğundur; lakin absorbans təkbaşına birbaşa hüceyrə sayı, sümük yaranması və ya osteogen diferensiasiya ölçümü deyil.

Şəkil 5 izahına görə MTT məlumatı n=4-dür. Absorbans 24 saatdan 144 saata doğru yüksəlir və mənbə bunu hüceyrə yapışması/proliferasiyasının dəstəkləndiyi istiqamətdə şərh edir.

MTT vaxtlarında mənbədaxili fərq

Metod bölməsi hüceyrələrin 96 saat kultivasiya edildiyini yazsa da, nəticələr 144 saata qədər məlumat verir. Bundan əlavə, Şəkil 5 izahı 24, 48 və 144 saatları sadalayır, lakin mətndə və qrafikdə 96 saat dəyəri də mövcuddur. Mənbə bu fərqləri izah etməmişdir.

SEM-dəki hüceyrə görüntüsü nə göstərdi?

Mənbə hüceyrə əkilməsindən dörd gün sonra SEM vasitəsilə iskələ üzərində MG-63 hüceyrələrini və hüceyrəxarici matriks lifləri kimi şərh edilən strukturları göstərir. Tədqiqatçılar hüceyrələrin kollagendəki RGD motivləri ilə inteqrin reseptorları vasitəsilə qarşılıqlı təsirə girə biləcəyini və hüceyrəxarici matriks ifraz edərək iskələ şəbəkəsini yenidən formalaşdıra biləcəyini müzakirə edirlər.

Bu SEM görüntüsü eksperimental müşahidə olduğu üçün Verianla tərəfindən süni şəkildə yenidən yaradılmamışdır.

Tədqiqatın Metodu və Nəticələri

Tədqiqatın eksperimental dizaynı

Karidesin mənbəyi

Litopenaeus vannamei nümunələri 2023-cü ilin yanvarında Yogyakartadakı yerli bazardan alınmış və Universitas Gadjah Mada, Faculty of Biology, Laboratory of Animal Systematics tərəfindən N.46/BI/SH/III/2023 nömrəsi ilə təsdiqlənmişdir.

SEM və məsamə ölçümü

İskələ morfologiyası JEOL JSM7100F skanedici elektron mikroskopu ilə araşdırılmışdır. Nümunələr kəsilmiş, karbon lentdən istifadə etməklə alüminium stub üzərinə yerləşdirilmiş və görüntülər 50× və 250× böyütmədə alınmışdır.

Məsamə ölçüləri ImageJ istifadə edilməklə beş təkrar üzrə təhlil edilmişdir. Eyni cihazda EDS istifadə olunaraq element tərkibi qiymətləndirilmişdir.

Şişmə ilə porozluq eyni şeydirmi?

Xeyr. Porozluq iskələnin həcmi daxilində boşluqların nə qədər yer tutması ilə əlaqəli struktur xüsusiyyətdir. Şişmə isə materialın PBS kimi mayeni hopdurduqda ilkin quru kütləsinə nisbətən nə qədər maye qəbul etməsi ilə bağlıdır.

İki iskələ oxşar məsamə quruluşuna malik olsa belə, polimerin kimyəvi saflığı, hidrofilliyi və matriks tərkibinə görə maye qəbulu fərqli ola bilər. Mənbə karides qabığı iskələsindəki aşağı şişməni bu çərçivədə müzakirə edir.

Daha yavaş deqradasiya yaxşıdırmı?

Təkbaşına “yaxşı” və ya “pis” deyil. Toxuma mühəndisliyi iskələsinin kifayət qədər uzun müddət struktur dəstək verməsi, lakin yeni toxuma yaranarkən uyğun sürətlə parçalanması gözlənilir. Çox sürətli deqradasiya struktur dəstəyi erkən itirə bilər; həddindən artıq yavaş deqradasiya isə daimi yad material problemləri yarada bilər.

Bu tədqiqat yalnız dörd həftəlik PBS inkubasiyası təqdim edir. Canlı toxumadakı fermentlər, immun sistemi, mexaniki yüklənmə və digər bioloji proseslər olmadığından in vivo deqradasiya sürəti bu təcrübədən birbaşa çıxarıla bilməz.

Tədqiqatın güclü tərəfləri

• Dəniz məhsulu tullantısı olan karides qabığının xitozan mənbəyi kimi qiymətləndirilməsi.
• Karides xitozanının kommersiya xitozanı ilə eyni kompozit istehsal yanaşmasında müqayisə edilməsi.
• Kimyəvi, morfoloji, fiziki, mexaniki və hüceyrə xüsusiyyətlərinin eyni tədqiqat daxilində birlikdə qiymətləndirilməsi.
• Çarpaz bağlayıcı istifadə etmədən sadə dondurma–liyofilizasiya yanaşmasının tətbiqi.
• Məsamə diametri, porozluq, şişmə, deqradasiya və sıxılma möhkəmliyi kimi müxtəlif iskələ performans ölçülərinin ölçülməsi.
• MG-63 hüceyrələri ilə in vitro yapışma və metabolik aktivlik qiymətləndirməsinin əlavə edilməsi.

Tədqiqatın dəstəklədiyi nəticələr

• Karides qabığından xitozan əldə edilmiş və FTIR spektri kommersiya xitozanının xarakterik quruluşu ilə uyğunluq göstərmişdir.
• Karides qabığı xitozanının bildirilən DD dəyəri %77,22-dir.
• Xitozan, COL I və HAP çarpaz bağlayıcı istifadə edilmədən liyofilizə edilmiş üçölçülü kompozit iskələyə çevrilə bilmişdir.
• SEM iskələlərdə açıq və bir-biri ilə əlaqəli məsaməli mikroquruluş göstərmişdir.
• EDS karides qabığı kompozitində O, Ca, C və P varlığını göstərmişdir.
• Karides qabığı xitozanlı iskələ kommersiya nəzarəti ilə müqayisədə daha aşağı şişmə və daha yavaş PBS deqradasiyası göstərmişdir.
• Karides və kommersiya iskələlərinin ölçülmüş sıxılma möhkəmlikləri bir-birinə yaxındır.
• MG-63 MTT absorbansı zamanla yüksəlmiş və SEM-də iskələ üzərində hüceyrələrlə uyğun strukturlar müşahidə edilmişdir.

Tədqiqatın birbaşa dəstəkləmədiyi nəticələr

• İskələnin canlı orqanizmdə sümük defektini sağaltdığı göstərilməmişdir.
• İnsanlarda təhlükəsiz və ya effektiv sümük qrefti olduğu göstərilməmişdir.
• Həqiqi in vivo osteointeqrasiya ölçülməmişdir.
• Yeni damar yaranması və ya vaskulyarizasiya qiymətləndirilməmişdir.
• Uzunmüddətli bioloji parçalanma ölçülməmişdir.
• İmmun və ya iltihabi cavab qiymətləndirilməmişdir.
• MTT absorbansı birbaşa yeni sümük miqdarını ölçmür.
• MG-63 hüceyrə yapışması təkbaşına həqiqi osteokonduksiya və ya sümük regenerasiyası sübutu deyil.
• Təxminən 1 MPa sıxılma möhkəmliyinin yükdaşıyan sümük tətbiqləri üçün yetərli olduğu göstərilməmişdir.
• Mənbənin özünün verdiyi 2–12 MPa kansellöz sümük aralığına görə təxminən 1 MPa-lıq iskələlər bu aralığın altında qalır.

Tədqiqatın əsas məhdudiyyətləri

Birinci məhdudiyyət bioloji qiymətləndirmənin yalnız MG-63 osteoblastabənzər hüceyrə xətti və in vitro testlərlə aparılmasıdır. Heyvan modeli və ya həqiqi sümük defekti istifadə edilməmişdir.

İkinci məhdudiyyət mexaniki möhkəmliyin təxminən 1 MPa səviyyəsində olmasıdır. Mənbənin verdiyi sümük istinad aralıqları ilə müqayisədə bu dəyər aşağı qalır.

Üçüncü məhdudiyyət karides qabığı xitozanında qalan çirklərin aşağı şişmə və deqradasiya ilə əlaqələndirilməsinə baxmayaraq, qalıq zülal/mineral miqdarlarının hamısının ətraflı kəmiyyət saflıq təhlili ilə göstərilməməsidir.

Dördüncü məhdudiyyət tədqiqatda istifadə olunan bəzi statistik “significant/no significant difference” ifadələri üçün test adının, p dəyərinin və əhəmiyyətlilik həddinin aydın şəkildə bildirilməməsidir.

Beşinci məhdudiyyət mənbə daxilindəki bəzi formul, şəkil və rəqəm uyğunsuzluqlarıdır: deqradasiya tənliyində işarə istiqaməti, porozluq mətn–qrafik sırası, daxili məsamə qeyri-müəyyənlik dəyərinin səhv çapı, sıxılma möhkəmliyi–kansellöz sümük aralığı müqayisəsi və MTT vaxt nöqtələri bunların əsaslarıdır.

Mənbə və Metod Qeydi

Orijinal tədqiqat: Biomimetic Scaffold of Chitosan from Litopenaeus vannamei Shrimp Shells Incorporated with Collagen and Hydroxyapatite for Bone Tissue Regeneration

Müəlliflər: Cheryn Ivana; Hendrik Satria Dwi Putra; Nyoman Bayu Wisnu Kencana; Agustina Setiawati.

Məsul müəllif: Agustina Setiawati.

Məsul müəllif e-poçtu: nina@usd.ac.id

Qurum: Department of Pharmaceutical Biology, Faculty of Pharmacy, Sanata Dharma University, Yogyakarta, Indonesia.

Jurnal: Advanced Pharmaceutical Bulletin.

Cild / nömrə: 16 / 1.

Səhifələr: 52–61.

DOI: 10.34172/apb.025.45909.

Mənbə növü: Original Article; laboratoriya əsaslı biomaterial inkişafı və in vitro hüceyrə kulturası tədqiqatı.

Qəbul tarixi: 4 iyun 2025.

Reviziya tarixi: 19 sentyabr 2025.

Qəbul edilmə tarixi: 17 dekabr 2025.

Elektron nəşr tarixi: PDF məqalə tarixçəsində 21 dekabr 2025.

Nömrə biblioqrafiyası: Advanced Pharmaceutical Bulletin 2026;16(1):52–61. Elektron nəşr tarixi ilə jurnal nömrəsinin ili fərqlidir və ikisi ayrı saxlanılmışdır.

Nəşriyyat: TUOMS PRESS, Tabriz University of Medical Sciences.

Rəyçilik: Advanced Pharmaceutical Bulletin rəsmi olaraq rəyli, multidissiplinar açıq girişli jurnaldır.

Lisenziya: Creative Commons Attribution — CC BY. PDF, mənbə və müəlliflər göstərildiyi müddətdə istifadəyə, yaymağa və çoxaltmağa icazə verildiyini açıq şəkildə bildirir.

Etik təsdiq: Ethics Committee of the Faculty of Health Sciences, Respati University, Yogyakarta; təsdiq nömrəsi 051/FIKES/PL/III/2023.

Maliyyələşdirmə: Tədqiqat məsul müəllif tərəfindən öz vəsaiti ilə maliyyələşdirilmiş və heç bir təşkilatdan xarici maliyyə dəstəyi almamışdır.

Maraqlar toqquşması: Müəlliflər potensial maraqlar toqquşması bildirməmişlər.

Məlumatların əlçatanlığı: Əsas PDF-də ayrıca Data Availability bölməsi yoxdur.

Əlavə fayl: Mənbə Figure S1 kimi SEM-EDS spektrini və Table S1 kimi EDS spektr analiz nəticələrini əlavə material kimi göstərir.

Bərabər töhfə: Mənbədə bərabər töhfə və ya bərabər birinci müəlliflik bəyanatı yoxdur.

Müəllif töhfələri: Konseptuallaşdırma: Agustina Setiawati. Məlumatların kurasiyası: Agustina Setiawati. Formal təhlil: Agustina Setiawati, Cheryn Ivana, Nyoman Bayu Wisnu Kencana. Maliyyələşdirmənin əldə edilməsi: Agustina Setiawati. Tədqiqat: Agustina Setiawati. Metodologiya: Cheryn Ivana, Hendrik Satria Dwi Putra, Nyoman Bayu Wisnu Kencana. Layihə idarəçiliyi: Hendrik Satria Dwi Putra, Nyoman Bayu Wisnu Kencana. Resurslar: Agustina Setiawati. Proqram təminatı: Cheryn Ivana, Hendrik Satria Dwi Putra. Superviziya: Agustina Setiawati. Doğrulama: Agustina Setiawati. Vizualizasiya: Hendrik Satria Dwi Putra. İlkin qaralama: Cheryn Ivana, Agustina Setiawati. Baxış və redaktə: Agustina Setiawati.

Mənbədaxili uyğunluq qeydi 1 — deasetilasiya dərəcəsi: Karides qabığı xitozanı DD=%77,22 və kommersiya xitozanı DD=%69,87 olaraq ölçülmüşdür. Xülasə buna baxmayaraq karides iskələsindəki aşağı şişmə və deqradasiyanı “daha aşağı DD” ilə əlaqələndirir. Ölçülmüş dəyərlər bu ifadəni dəstəkləmir.

Mənbədaxili uyğunluq qeydi 2 — deqradasiya tənliyi: Mənbə \(W_0\)-ı ilkin quru kütlə, \(W_1\)-i deqradasiyadan sonrakı quru kütlə kimi müəyyən edərkən tənliyi \((W_1-W_0)/W_0\times100\) formasında çap edir. Müsbət kütlə itkisi nəticələri ilə formulun işarə istiqaməti uyğun deyil.

Mənbədaxili uyğunluq qeydi 3 — daxili məsamə diametri: Karides qabığı iskələsinin daxili məsamə diametri mətndə 107,56 µm kimi verildiyi halda standart yayınma “32.32.72 µm” formasında səhv çap edilmişdir. Verianla bu dəyəri təxmin edərək düzəltməmişdir.

Mənbədaxili uyğunluq qeydi 4 — porozluq: Mətn kommersiya və karides iskələləri üçün müvafiq olaraq %61,85 ± 2,61 və %64,71 ± 0,77 yazdığı halda Şəkil 3f-in sütun/əfsanə düzülüşü vizual olaraq əks qruplaşdırmanı göstərir.

Mənbədaxili uyğunluq qeydi 5 — sıxılma möhkəmliyi: Mənbə dəyərləri 0,97 və 0,991 MPa olduğu halda eyni paraqrafda kansellöz sümük aralığı 2–12 MPa kimi verilir. Buna görə iskələ dəyərlərinin 2–12 MPa aralığında olduğu barədə cümlə rəqəmsal baxımdan uyğun deyil. Mənbə dərhal sonra mexaniki möhkəmliyin sümük toxuması mühəndisliyi meyarlarını qarşılamadığını da bildirir.

Mənbədaxili uyğunluq qeydi 6 — MTT vaxtı: Metod 96 saat kulturasiyadan danışdığı halda nəticələr 144 saata qədər məlumat ehtiva edir. Şəkil 5 izahı isə 24, 48 və 144 saatları sadalasa da, nəticələr mətni və qrafik 96 saat dəyərini də ehtiva edir.

Mənbədaxili uyğunluq qeydi 7 — şişmə/deqradasiya şəkil izahı: Şəkil 4 izahındakı bəzi vaxt nöqtələri nəticələr mətnindəki 1, 3, 6, 12, 24 saatlıq şişmə və 1, 2, 3, 4 həftəlik deqradasiya seriyaları ilə tam uyğun gəlmir.

Statistika qeydi: Məsamə diametri və porozluq ölçmələrində n=5, sıxılma möhkəmliyində n=3, Şəkil 5 MTT qiymətləndirməsində n=4 məlumatı mövcuddur. Lakin əsas PDF-də ayrıca statistik təhlil bölməsi, istifadə olunan hipotez testi, p dəyəri və ya əhəmiyyətlilik həddi bildirilməmişdir. Buna görə mətndəki “significant” ifadələri ətraflı statistik sübut kimi genişləndirilməmişdir.

Əsas bioloji sərhəd: Tədqiqat in vitro MG-63 hüceyrə kulturasına əsaslanır. Heyvan modeli, insan təcrübəsi və ya həqiqi sümük defekti implantasiyası aparılmamışdır.

Osteokonduksiya sərhədi: Mənbə hüceyrə yapışması və proliferasiya nəticələrini osteokonduktiv potensialla əlaqələndirir; lakin yeni sümüyün iskələ səthində in vivo böyüməsi birbaşa ölçülməmişdir.

Mexaniki sərhəd: Təxminən 1 MPa-lıq sıxılma möhkəmliyi mənbənin özünün verdiyi 2–12 MPa kansellöz sümük aralığından aşağıdır; nəticə yükdaşıyan klinik sümük qrefti yetərliliyi kimi şərh edilməməlidir.