Temporomandibular eklem osteoartritinde (TMJOA) mandibular kondilin yüzey fibro-kıkırdağındaki doğal tip I kollajen ağı, eklem yüzeyinin zamana bağlı yük taşıma ve enerji dağıtma davranışına katkıda bulunan organize bir ekstraselüler matris mimarisidir. Bu preprint çalışma, MIA ile oluşturulan sıçan TMJOA modelinde erken mekanik bozukluğun kollajen miktarındaki belirgin fibrotik artıştan önce başlayabildiğini göstermektedir. Nanoindentasyon, polarizasyon-çözünürlüklü ikinci harmonik üretim mikroskopisi (pSHG), taramalı elektron mikroskopisi (SEM), floresans fotobeyazlatma sonrası geri kazanım (FRAP), immünboyama ve gen ekspresyon analizleri birlikte kullanıldığında hastalığın ilk haftasında uzun zaman ölçekli viskoelastik retardasyonun azaldığı, kollajen fibrillerinin hizasının bozulduğu, moleküler paketleme düzeninin düştüğü, kollajen demetlerinin birleşip düzensizleştiği ve matris geçirgenliğinin arttığı görülmüştür. Buna karşılık belirgin patolojik COL1 birikimi daha geç dönemde ortaya çıkmıştır. COL12A1 ekspresyonunun erken azalması da fibril organizasyonu bozukluğuyla ilişkili aday bir moleküler özellik olarak belirlenmiştir. Bulgular, erken TMJOA'da “daha fazla veya daha az kollajen” sorusundan önce doğal kollajen ağının nasıl örgütlendiğinin mekanik açıdan kritik olabileceğini düşündürmektedir; ancak çalışma hayvan modeli temellidir ve COL12A1 için nedensellik doğrudan genetik müdahaleyle gösterilmemiştir.

Temporomandibular eklem kıkırdağı neden diğer eklem kıkırdaklarından farklıdır?

Mandibular kondil kıkırdağı (mandibular condylar cartilage, MCC), diz gibi birçok sinovyal eklemdeki hiyalin kıkırdaktan yapısal olarak farklıdır. MCC'nin eklem yüzeyine bakan yüzeyel fibro-kıkırdak (superficial fibrocartilage, SF) tabakası yoğun biçimde organize tip I kollajen (COL1) içerirken, daha derindeki artiküler kıkırdak tabakası tip II kollajen ve glikozaminoglikan açısından daha zengindir.

Kaynak çalışmada sağlıklı MCC dört temel yapı halinde tarif edilmektedir: yüzeyel fibro-kıkırdak (SF), proliferatif tabaka (PF), artiküler kıkırdak (AC) ve subkondral kemik. Histolojik ve ikinci harmonik üretim görüntüleri, COL1 bakımından zengin yüzey tabakasının yoğun ve yönlenmiş kollajen demetlerinden oluştuğunu göstermektedir.

Bu yüzeyel ağ yalnız biyokimyasal bir yapı değildir. Eklem yüzeyinin deformasyona direnmesine, yükü dağıtmasına, sürtünmeyi azaltmasına ve zaman bağımlı mekanik yanıt üretmesine katkıda bulunur. Bu nedenle COL1 miktarı değişmeden bile fibrillerin yönü, aralıkları, paketlenmesi ve demet düzeni bozulduğunda doku işlevi değişebilir.

Erken TMJOA'da Asıl Değişen Kollajen Miktarı mı, Kollajen Mimarisi mi?

Bu çalışmanın verileri, MIA ile indüklenen erken TMJOA'nın ilk haftasında belirgin bir net COL1 birikiminden önce doğal COL1 ağının mimarisinde bozulma oluştuğunu desteklemektedir. İlk haftada COL1 ortalama floresans yoğunluğunda anlamlı bir artış ve Col1a1/Col1a2 transkriptlerinde yükselme görülmezken fibril hizası, moleküler paketleme, demet organizasyonu ve matris geçirgenliği değişmiştir; belirgin patolojik COL1 birikimi ise daha sonra, özellikle ikinci haftadan itibaren ortaya çıkmıştır.

Deneysel hastalık modeli

Araştırmacılar sekiz haftalık erkek Sprague–Dawley sıçanların her iki temporomandibular eklemine 50 µL salin içinde 0,5 mg monosodyum iyodoasetat (MIA) enjekte ederek TMJOA modeli oluşturmuştur. Kontrol hayvanlarına yalnız salin uygulanmıştır. Yapısal, mekanik ve moleküler değişimler birinci, ikinci ve dördüncü haftalarda değerlendirilmiştir.

Deneyler ARRIVE yönergelerine göre yürütülmüş ve Showa Medical University Animal Care and Use Committee tarafından 225080 referans numarasıyla onaylanmıştır.

Histoloji ve mikro-CT ile hastalık ilerlemesi

Mikro-CT incelemesinde MIA uygulanan eklemlerde ilerleyici subkondral kemik erozyonu gözlenmiştir. Histolojik analizlerde ise değiştirilmiş Mankin skoru ve TMJOA histolojik hasar derecesi birinci haftadan itibaren yükselmiştir.

Yüzeyel fibro-kıkırdak tabakasının kalınlığı ilk haftada artmış; hücrelerde büyüme, yuvarlaklaşma ve yüzeyde kümelenme gözlenmiştir. İkinci ve dördüncü haftalarda SF tabakası kalın kalmaya devam etmiş ancak hücre kaybı nedeniyle hiposelüler bir görünüm kazanmıştır.

Nanoindentasyon ile zaman bağımlı mekanik davranış

Taze mandibular kondil yüzeyleri, 50 µm çaplı düz uçlu bir indentör kullanan TI 950 TriboIndenter sistemiyle test edilmiştir. Örnekler PBS içinde 22 ± 1 °C'de hidratlı tutulmuştur. Her örnek için merkezi kondil yüzeyinden üçten fazla indentasyon ölçümü alınmış ve hayvan başına ortalama değer analiz edilmiştir.

Creep protokolünde yük hızla 5 µN'a çıkarılmış, 20 saniye sabit tutulmuş ve ardından hızla kaldırılmıştır. Sabit yük dönemindeki zamana bağlı deformasyon iki elemanlı genelleştirilmiş Kelvin–Voigt modeliyle değerlendirilmiştir.

Modelden iki retardasyon zamanı \(\tau_1\) ve \(\tau_2\), iki viskozite katsayısı \(\eta_1\) ve \(\eta_2\) ile elastik bileşenler \(E_1\) ve \(E_2\) çıkarılmıştır. Uzun zaman ölçekli ikinci bileşen için:

\[ \tau_2=\frac{\eta_2}{E_2} \]

ilişkisi kullanılmaktadır. Burada \(\eta_2\), doku matrisinin daha yavaş viskoz enerji dağıtım davranışıyla; \(E_2\) ise aynı mekanik bileşenin elastik direnciyle ilişkilidir. \(\tau_2\)'nin azalması, dokunun yavaş zaman ölçekli yük altında normal viskoelastik gecikme davranışını daha hızlı kaybettiğini gösterir.

Viskoelastik Retardasyon Süresi Neyi Gösterir?

Viskoelastik retardasyon süresi, bir viskoelastik dokunun uygulanan mekanik yük altında zamana bağlı deformasyonunun karakteristik hızını temsil eder. Bu çalışmada özellikle \(\tau_2=\eta_2/E_2\) ile tanımlanan uzun zaman ölçekli bileşenin azalması, yüzey fibro-kıkırdağının yük altında yavaş enerji dağıtma kapasitesinin erken TMJOA sırasında bozulduğunu göstermektedir; araştırmacılar bu değişimin esas olarak \(\eta_2\)'deki oransal olarak daha büyük düşüşle ilişkili olduğunu raporlamıştır.

Birinci haftadaki mekanik sonuç

Birinci haftada azaltılmış elastik modül \(E_r\) MIA ve salin grupları arasında benzer kalmıştır. Birinci Kelvin–Voigt bileşenine ait \(\tau_1\), \(\eta_1\) ve \(E_1\) parametrelerinde de anlamlı fark raporlanmamıştır.

Buna karşılık uzun zaman ölçekli ikinci bileşenin \(\tau_2\) değeri belirgin biçimde azalmıştır. Ortalama \(\tau_2\), salin grubunda yaklaşık 44 saniyeden MIA grubunda yaklaşık 23 saniyeye düşmüştür ve fark istatistiksel olarak anlamlıdır (\(P=0{,}010\)).

Hem \(\eta_2\) hem \(E_2\) azalmış, ancak \(\eta_2\)'deki oransal düşüş daha büyük olduğundan \(\tau_2\)'deki azalmayı esas olarak viskoz enerji dağıtım kapasitesinin kaybı yönlendirmiştir. Benzer düşüş ikinci haftada anlamlı biçimde devam etmiş ve dördüncü haftada aynı yönde eğilim korunmuştur.

COL1 miktarı ilk haftada neden tek başına açıklayıcı değil?

İmmünfloresans analizinde sağlıklı eklemde COL1 esas olarak SF ve PF–AC geçiş bölgesinde, COL2 ise daha derindeki artiküler kıkırdak bölgesinde görülmüştür.

MIA uygulamasından bir hafta sonra yüzey tabakasının genişlemesine bağlı olarak COL1 sinyalinin uzamsal dağılımı değişmiş, ancak ortalama floresans yoğunluğunda anlamlı bir artış bulunmamıştır. COL1-pozitif alan azalma eğilimi göstermiştir (\(P=0{,}13\)). Aynı dönemde Col1a1 ve Col1a2 gen ekspresyonlarında da artış görülmemiştir.

İkinci ve dördüncü haftalarda ise COL1-pozitif alan ve ortalama floresans yoğunluğu artmış, ikinci haftada Col1a1 ve Col1a2 ekspresyonları da yükselmiştir. Dolayısıyla belirgin fibrotik COL1 birikimi mekanik bozukluğun başladığı ilk haftadan sonra ortaya çıkmaktadır.

LOX bulgusu ve klasik fibrozis modeliyle fark

Hiyalin kıkırdak osteoartritinde LOX aracılı kollajen çapraz bağlanması, matriks sertleşmesi ve fibrotik dönüşümle ilişkilendirilebilir. Ancak bu TMJOA modelinde birinci haftada LOX proteininde belirgin artış görülmemiş, Lox transkript düzeyi MIA grubunda azalmıştır.

Bu bulgu, erken TMJ fibro-kıkırdak bozukluğunun klasik “LOX artışı → çapraz bağlanma → matriks sertleşmesi → fibrozis” modeliyle tamamen açıklanamayabileceğini göstermektedir.

pSHG ile kollajen fibril yönelimi ve moleküler paketleme

Polarizasyon-çözünürlüklü ikinci harmonik üretim (pSHG) mikroskopisi, kollajen fibrillerinin yönelimi ve moleküler düzeni hakkında optik bilgi sağlamıştır. Sağlıklı kontrol grubunda yüzeyel tabakadaki fibriller büyük ölçüde eklem yüzeyine paralel yönlenmiştir.

MIA grubunda fibrillerin 30°–60° ve 60°–90° aralıklarına kaydığı, yani yüzeyden sapmanın arttığı görülmüştür. Moleküler paketleme göstergesi olan \(I_2\) dağılımının tepe değeri yaklaşık 0,275'ten 0,20'ye kaymıştır. Araştırmacılar bunu kollajen moleküllerinin düzenli paketlenmesinde azalma olarak yorumlamaktadır.

SEM ile fibril demetlerinin doğrudan görünümü

SEM görüntülerinde salin kontrol grubu yoğun ve düzenli fibriler ağ gösterirken, MIA örneklerinde daha kaba, kümelenmiş, dolaşmış ve kıvrımlı fibril demetleri görülmüştür. Hücre kümeleriyle ilişkili olduğu düşünülen boşluk benzeri yapılar ve yüzey sürekliliğinde bozulmalar da raporlanmıştır.

Bu yapı bozuklukları pSHG ile ölçülen fibril yön kaybı ve moleküler paketlenme azalmasıyla aynı bölgelerde uyumluluk göstermiştir.

FRAP ile matris geçirgenliği

FRAP analizinde 70 kDa fluorescein işaretli dekstran kıkırdak matrisi içine dengelenmiş, seçilen bir bölge 488 nm lazerle fotobeyazlatılmış ve floresans geri kazanımı zaman içinde izlenmiştir.

Geri kazanım yarı-zamanı \(t_{1/2}\), moleküllerin matris içinde ne kadar hızlı yeniden dağıldığını gösteren bir ölçüttür. İlk haftada MIA grubunun \(t_{1/2}\) değeri kontrol grubundan anlamlı biçimde daha kısa bulunmuştur (\(P=0{,}041\)). Bu sonuç artmış matris geçirgenliğiyle uyumludur.

Dördüncü haftada ise durum tersine dönmüş ve MIA grubunda \(t_{1/2}\) kontrol grubuna göre daha uzun olmuştur (\(P=0{,}042\)). Araştırmacılar bu geç dönem sonucunu fibrotik yeniden yapılanmaya eşlik eden azalmış geçirgenlikle ilişkilendirmiştir.

Geç Dönemde Daha Fazla COL1 Mekanik İşlevi Geri Getiriyor mu?

Bu çalışmada hayır. Dördüncü haftadaki fibrotik yeniden yapılanmada COL1 miktarı artmış ve erken dönemdeki yüksek geçirgenlik eğilimi tersine dönmüş olmasına rağmen uzun zaman ölçekli viskoelastik retardasyon başlangıçtaki sağlıklı düzeye geri dönmemiştir. Bu bulgu, sonradan biriken patolojik COL1'in doğal kollajen ağının özgün fibril organizasyonunu ve zaman bağımlı mekanik işlevini otomatik olarak yeniden oluşturmadığını düşündürmektedir.

COL12A1 neden öne çıktı?

Araştırmacılar kollajen fibril organizasyonuyla ilişkili genleri farklı hayvan türlerindeki TMJOA transkriptom veri setlerinde karşılaştırmıştır. Col12a1, sıçan ve fare veri setlerinde tutarlı biçimde azalan genlerden biri olmuştur; raporlanan log2FC değerleri sırasıyla yaklaşık −0,31 ve −0,32'dir.

Yüzey tabakasının ayrı analiz edildiği tavşan veri setinde Col12a1, incelenen genler arasında daha güçlü bir değişim göstermiştir: log2FC yaklaşık −1,65 ve \(P<0{,}05\).

Kendi MIA modelindeki RT-qPCR ve immünfloresans sonuçları da birinci haftada Col12a1/COL12A1 azalmasını desteklemiştir. COL12A1 protein azalmasının dördüncü haftada da sürmesi, fibril düzenleyici programdaki bozukluğun geç dönemde devam edebileceğini düşündürmektedir.

COL12A1 Erken TMJOA İçin Kanıtlanmış Bir Nedensel Belirteç midir?

Hayır. Çalışma COL12A1 azalmasını erken yüzey fibro-kıkırdak kollajen ağı bozulmasıyla tutarlı bir moleküler özellik ve aday belirteç olarak göstermektedir, ancak doğrudan Col12a1 kayıp-fonksiyon veya kazanım-fonksiyon deneyi yapılmamıştır. Bu nedenle COL12A1 azalmasının TMJOA'daki mimari veya mekanik bozukluğu tek başına başlattığı ya da düzeltilmesinin hastalığı önleyeceği bu çalışma tarafından kanıtlanmamıştır.

SLRP ailesindeki değişiklikler

Küçük lösin bakımından zengin proteoglikanlar (SLRP'ler) fibril çapını, lateral büyümeyi, aralıkları ve kollajen paketlenmesini düzenleyebilir. Çalışmada Fmod ve Lum birinci haftada Col12a1 ile birlikte azalmıştır.

Sınıf I SLRP'lerde ise zamana bağlı farklı bir desen görülmüştür. Dcn birinci haftada artmış, ikinci haftada azalmıştır; Bgn ise hem birinci hem ikinci haftada yükselmiştir. Araştırmacılar ikinci haftadaki Dcn azalması ile devam eden Bgn artışını fibrotik yeniden yapılanmaya geçişle ilişkili moleküler bir desen olarak yorumlamaktadır.

Erken ve geç hastalık evreleri için önerilen model

Kaynağın önerdiği çalışma modeli üç evreyi ayırmaktadır:

1. Sağlıklı TMJ: Yüzeye paralel, iyi organize edilmiş doğal COL1 ağı; normal fibril düzenleyicileri; kontrollü geçirgenlik ve normal viskoelastik enerji dağıtımı.
2. Erken TMJOA: COL1 miktarında belirgin fibrotik artış olmadan fibril yön kaybı, moleküler paketleme azalması, demet düzensizliği, artmış geçirgenlik ve azalmış viskoelastik retardasyon.
3. Geç TMJOA: Patolojik COL1 birikimi ve fibrotik yeniden yapılanma; geçirgenliğin azalması ancak doğal matrisin normal viskoelastik işlevinin tam olarak geri kazanılamaması.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Kullanılan temel yöntemler

Histolojik örnekleme ve boyama

Eklem örnekleri %4 paraformaldehitle fikse edilmiş ve Kawamoto yöntemi kullanılarak 4 µm kalınlığında kriyokesitler hazırlanmıştır. Safranin O/Fast Green, toluidin mavisi ve H&E boyaları morfoloji ve matriks yapısı için kullanılmıştır. Dejenerasyon iki kör araştırmacı tarafından TMJOA histolojik hasar skoru ve değiştirilmiş Mankin skoru ile değerlendirilmiştir.

pSHG görüntüleme ayrıntıları

pSHG analizinde özel yapım çok-fotonlu mikroskop kullanılmış, uyarım dalga boyu 810 nm olarak ayarlanmıştır. Doğrusal polarizasyon 0° ile 180° arasında 12 eşit adımda döndürülmüştür. Elde edilen polarizasyona bağlı SHG yoğunluğundan kollajen moleküler paketleme düzeni ve ana fibril yönü hesaplanmıştır.

SEM hazırlığı

Kollajen ağını daha görünür hale getirmek için örnekler 100 mM Soerensen fosfat tamponunda; 1 mg/mL hyaluronidaz, 1 mg/mL tripsin ve %0,5 sodyum azid içeren çözeltiyle 37 °C'de üç gün işlenmiştir. Daha sonra %2,5 glutaraldehit ve %1 osmiyum tetroksit fiksasyonu, dereceli etanol dehidrasyonu, kritik nokta kurutma ve osmiyum kaplama uygulanmıştır. Yüzey fibrilleri SU8600 SEM ile 2 kV'da görüntülenmiştir.

İstatistiksel analiz

İstatistikler GraphPad Prism v11.0.2 ile yapılmıştır. Bağımsız biyolojik tekrar sayısı hayvan sayısını ifade etmektedir; aynı hayvandaki tekrarlı ölçümler karşılaştırma öncesinde ortalanmıştır. Çoklu zaman noktası ve grup karşılaştırmalarında Tukey post hoc testli iki yönlü ANOVA, iki grup karşılaştırmalarında iki kuyruklu eşleşmemiş t-testi kullanılmıştır. Veriler aksi belirtilmedikçe ortalama ± %95 güven aralığı şeklinde sunulmuş ve \(P<0{,}05\) anlamlı kabul edilmiştir.

Temel nicel sonuçlar

Çalışmanın desteklediği

• MIA modelinde yüzey fibro-kıkırdağının viskoelastik işlevi hastalığın ilk haftasında bozulmaktadır.
• Bu mekanik bozukluk belirgin fibrotik COL1 birikiminden önce ortaya çıkmaktadır.
• Erken dönemde fibril yönelimi, moleküler paketleme, kollajen demet yapısı ve matris geçirgenliği değişmektedir.
• COL12A1 ve bazı fibril düzenleyici SLRP'lerin ekspresyonu erken dönemde azalmaktadır.
• Geç fibrotik COL1 birikimi, doğal ağın normal viskoelastik işlevini tamamen geri getirmemektedir.
• TMJ fibro-kıkırdağında erken hastalık mekaniklerini değerlendirirken kollajen miktarı kadar kollajen organizasyonu da önemlidir.

Çalışmanın desteklemediği

• Bulgular insanlarda erken TMJOA tanısı için klinik olarak doğrulanmış biyobelirteç sunmamaktadır.
• COL12A1'in TMJOA'yı başlattığı nedensel olarak kanıtlanmamıştır.
• COL12A1'i artırmanın TMJOA'yı tedavi edeceği gösterilmemiştir.
• MIA modeli bütün insan TMJOA nedenlerini temsil etmemektedir.
• Erken mimari bozulmanın her TMJOA hastasında aynı zaman çizelgesiyle ilerlediği gösterilmemiştir.
• Sonuçlar doğrudan bir klinik tedavi veya tanı protokolü değildir.

Çalışmanın sınırlılıkları

Birinci sınırlılık, kullanılan MIA modelinin kimyasal olarak indüklenen hızlı ve kontrol edilebilir bir osteoartrit modeli olmasıdır. Bu yaklaşım erken olayların zamanlamasını çözmek için yararlı olsa da kronik mekanik aşırı yüklenme, disk bozukluğu ve insan hastalığının uzun süreli doğal gelişimini bütünüyle temsil etmeyebilir.

İkinci olarak, çalışma esas olarak doku ve matris düzeyindeki değişiklikleri çözmektedir. Yüzey fibro-kıkırdak tabakasındaki protein değişiklikleri doğrulanmış olsa da aynı modelde daha yüksek çözünürlüklü hücre tipi veya mekânsal transkriptom analizi yapılması farklı hücre popülasyonlarının katkısını daha açık ortaya koyabilir.

Üçüncü olarak, Col12a1 için doğrudan genetik kayıp-fonksiyon veya kazanım-fonksiyon deneyi gerçekleştirilmemiştir. Dolayısıyla yapısal, mekanik ve moleküler bulgular arasındaki güçlü zaman uyumuna rağmen kesin moleküler nedensellik henüz kurulmamıştır.

Kaynak ve Yöntem Notu

Özgün başlık:Native collagen architecture shapes viscoelastic function during early temporomandibular joint fibrocartilage degeneration

Yazarlar: Ruyu Han, Lu Chen, Jingrui Hu, Jingxiao Zhong, Li Zhou, Takashi Takaki, Chie Watanabe, Peter Winlove, Joo-Ri Kim-Kaneyama, Reina Tanaka, Junning Chen, Jun Zhou ve Yo Shibata.

Eş katkılı yazarlar: Ruyu Han ve Lu Chen.

Sorumlu yazarlar: Junning Chen, Jun Zhou ve Yo Shibata.

Başlıca kurumlar: Showa Medical University Graduate School of Dentistry; Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital; University of Exeter; University of Sydney; Showa Medical University Center for Electron Microscopy; Showa Medical University Institute for Extracellular Matrix Research; University of New South Wales.

Kaynak türü: Araştırma preprinti.

Hakemlik durumu: Hakem değerlendirmesinden geçmemiştir. Kaynak PDF açık biçimde “This preprint research paper has not been peer reviewed” uyarısını taşımaktadır.

Platform: SSRN.

SSRN kayıt numarası: 7086740.

DOI: Kaynak belgede DOI raporlanmamıştır.

Deney modeli: Sekiz haftalık erkek Sprague–Dawley sıçanlarda bilateral 0,5 mg MIA / 50 µL salin enjeksiyonuyla oluşturulan TMJOA modeli; kontrol grubuna salin uygulanmıştır.

Zaman noktaları: 1., 2. ve 4. haftalar.

Başlıca yöntemler: Histoloji, immünfloresans, immünohistokimya, mikro-CT, nanoindentasyon, iki elemanlı genelleştirilmiş Kelvin–Voigt modellemesi, RT-qPCR, pSHG mikroskopisi, FRAP ve SEM.

Etik: Hayvan deneyleri ARRIVE ilkelerine uygun olarak yürütülmüş ve Showa Medical University Animal Care and Use Committee tarafından 225080 referansıyla onaylanmıştır.

Finansman: Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Early-Career Scientists hibeleri 23K16036 ve 26K20230; Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) New Investigator Award EP/T008059/1.

Çıkar çatışması: Yazarlar çıkar çatışması olmadığını bildirmiştir.

Veri erişilebilirliği: Çalışmada analiz edilen transkriptom veri setleri Gene Expression Omnibus üzerinde GSE207463, GSE276088 ve GSE232867 erişim numaralarıyla kamuya açıktır.

Temel yöntemsel sınır: Çalışma insan klinik araştırması değil, kimyasal olarak indüklenmiş bir sıçan TMJOA modelidir. COL12A1 ile erken kollajen ağı bozulması arasında güçlü ilişki raporlanmış olsa da doğrudan genetik nedensellik deneyi yapılmamıştır.