Görünən amiloza miqdarı — Apparent Amylose Content (AAC) — düyünün bişirmə zamanı yumşaq, yapışqan və ya daha quru və dənəvər qalmasını müəyyən edən ən mühüm nişasta xüsusiyyətlərindən biridir. Düyü endospermində amiloza sintezinin əsas tənzimləyicilərindən biri Waxy (Wx) geni tərəfindən kodlaşdırılan Granule-Bound Starch Synthase I (GBSSI) fermentidir.

Bu tədqiqat düyü seleksiyasında istifadə olunan mövcud DNT markerlərinin AAC səviyyəsini nə dərəcədə yaxşı proqnozlaşdırdığını qiymətləndirmiş və xüsusilə %24,5-dən yuxarı yüksək amilozalı genotipləri daha etibarlı seçmək məqsədilə GBSSI/Waxy genində yeni genetik variantlar axtarmışdır.

Ümumilikdə 127 düyü aksessiyası — 125 japonica və 2 indica — araşdırılmışdır. Birinci introndakı G/T SNP təkbaşına AAC variasiyasının %77,5-ni izah etdiyi halda, exon 6-dakı A/C SNP ilə birlikdə istifadə olunduqda izah edilən variasiya %79,5-ə yüksəlmişdir. RM190 mikrosatellitinin bu iki SNP-yə əlavə edilməsi isə göstəricini yalnız %79,6-ya yüksəltmişdir.

Mövcud marker haplotipləri AAC dəyəri %24,5-dən yuxarı olan aksessiyaları etibarlı şəkildə ayıra bilmədiyi üçün bütün AAC siniflərini təmsil edən 21 genotipdə GBSSI geni və təxminən 1 kb upstream tənzimləyici bölgə yenidən sekvenslənmişdir. Ümumilikdə 32 SNP aşkar edilmiş və bunlardan dördü yeni dCAPS molekulyar markerlərinin hazırlanmasında istifadə olunmuşdur.

Yeni markerlər bütün AAC variasiyasının izahını yalnız məhdud dərəcədə artırsa da, RM190 CT20 ilə exon 6 A və −1514 G allellərinin birlikdə olduğu haplotip tədqiqat kolleksiyasında davamlı olaraq AAC > %24,5 ilə əlaqələndirilmişdir. Buna görə yeni markerlərin ən mühüm töhfəsi ümumi variasiyanın izahını kəskin artırmaqdan daha çox, yüksək amilozalı müəyyən genotiplərin seçilməsi üçün daha spesifik molekulyar alət təqdim etməsidir.

Amiloza düyünün bişmə xüsusiyyətini niyə dəyişir?

Düyü nişastası əsasən amiloza və amilopektindən ibarətdir. Onların nisbəti bişmiş düyünün teksturasına və dənələrin bir-birinə yapışma meylinə güclü təsir göstərir.

Yüksək AAC-li sortlar adətən daha quru, sərt və bir-birindən ayrılan dənələr əmələ gətirdiyi halda, aşağı AAC-li sortlar daha yumşaq, parlaq və yapışqan xüsusiyyət göstərə bilər.

Tədqiqatda istifadə olunan ümumi təsnifata görə AAC qrupları waxy, aşağı, orta və yüksək amilozalı qruplara ayrılmışdır. Kommersiya təsnifatlarında təxminən %26–33 səviyyəsində AAC adətən yüksək amiloza sinfi kimi qiymətləndirilir.

GBSSI və Waxy geni nədir?

Waxy geni xromosom 6-da yerləşir və GBSSI fermentini kodlaşdırır. GBSSI düyü endospermində amiloza sintezinin əsas fermentlərindən biridir.

Waxy lokusunda geniş yayılmış iki allel xüsusilə əhəmiyyətlidir:

• Wxa:ümumiyyətlə yüksək AAC ilə əlaqəlidir.
• Wxb:əsasən aşağı və orta AAC ilə əlaqəlidir.

Wxb allelində birinci intronun 5′ splice bölgəsindəki G→T SNP mRNA-nın emalına təsir göstərərək funksional GBSSI miqdarının azalmasına səbəb ola bilər. Buna görə eyni genin müxtəlif allelləri düyü dənəsində amiloza miqdarının dəyişməsində mühüm rol oynayır.

Mövcud DNT Markerləri Amiloza Miqdarını Nə Qədər Yaxşı Proqnozlaşdırdı?

Tədqiqatçılar əvvəlcə düyü seleksiyasında daha əvvəl istifadə olunmuş RM190 mikrosatellitinin və Waxy genindəki mühüm SNP-lərin AAC proqnozundakı gücünü 127 aksessiyada qiymətləndirmişlər.

Bu nəticə xüsusilə birinci introndakı SNP-nin güclü təsirini ortaya qoyur. Intron 1 SNP təkbaşına AAC variasiyasının %77,5-ni izah etmişdir.

Exon 6 SNP təkbaşına daha aşağı izah gücünə malik olsa da, intron 1 ilə birlikdə istifadə edildikdə AAC proqnozu %79,5-ə yüksəlmişdir.

RM190-ın bu kombinasiyaya əlavə edilməsi yalnız %0,1 əlavə izah təmin etmişdir. Buna görə tədqiqatın germplazm kolleksiyasında RM190, intron 1 və exon 6 SNP-lərinin verdiyi məlumatdan kənarda böyük əlavə proqnoz üstünlüyü yaratmamışdır.

Niyə Yeni Molekulyar Markerlərə Ehtiyac Yarandı?

Mövcud marker kombinasiyaları aşağı, orta və ümumi yüksək AAC siniflərini bir-birindən ayıra bilsə də, xüsusilə AAC dəyəri %24,5-dən yuxarı olan genotiplərin etibarlı seçilməsi üçün yetərli olmamışdır.

Bu problem xüsusilə yüksək amilozalı düyünün üstün tutulduğu bazarlar və seleksiya proqramları üçün əhəmiyyətlidir. Seleksiyaçı yalnız “yüksək ola bilər” sinfini deyil, çox yüksək AAC-yə malik konkret valideynləri və ya xətləri erkən nəsillərdə seçmək istəyə bilər.

Buna görə tədqiqatçılarallel miningyanaşmasından istifadə etmişlər. Allel axtarışı eyni genin müxtəlif genotiplərdəki DNT ardıcıllıqlarını müqayisə etməklə əvvəllər məlum olmayan və ya kifayət qədər xarakterizə edilməmiş variantların tapılmasıdır.

GBSSI Allel Axtarışında Nə Tapıldı?

Bütün AAC siniflərini təmsil edən 21 genotip seçilmiş və GBSSI geninin hamısı ilə təxminən 1 kb upstream tənzimləyici bölgə yenidən sekvenslənmişdir.

Ardıcıllıqların böyük hissəsində yüksək oxşarlıq olmasına baxmayaraq, ümumilikdə32 SNPmüəyyən edilmişdir.

Yeni variantların mühüm hissəsi zülal kodlaşdıran exonlardan daha çox promoter və intron kimi kodlaşdırmayan bölgələrdə aşkar edilmişdir. Bu nəticə GBSSI-nin zülal kodlaşdıran hissəsinin mühüm funksiyasına görə nisbətən qorunmuş ola biləcəyini düşündürür.

Müəyyən edilmiş yeni SNP-lər arasından molekulyar marker hazırlamaq üçün dörd mövqe seçilmişdir:

• −1514 — promoter bölgəsi,
• +1801 — exon 9,
• +2282 — intron 10,
• +2806 — intron 12.

Bu SNP-lər üçün dCAPS markerləri hazırlanmış və 127 aksessiya yenidən skrininqdən keçirilmişdir.

Yeni Markerlər Yüksək Amilozalı Düyünü Daha Yaxşı Ayıra Bildimi?

Bəli, lakin töhfənin xarakteri vacibdir.

−1514 SNP-nin mövcud intron 1 və exon 6 SNP-lərinə əlavə edilməsi izah olunan AAC variasiyasını %79,5-dən təxminən %80,1-ə yüksəltmişdir. RM190 da modelə daxil edildikdə göstərici %80,3 olmuşdur.

Bu artım kiçikdir. Buna görə yeni markerlərin uğuru “AAC proqnoz gücünü böyük dərəcədə artırması” deyil.

Əsas mühüm nəticə müəyyən bir haplotipin yüksək AAC ilə güclü şəkildə əlaqələndirilməsidir.

RM190 CT20 + exon 6 A + −1514 Gkombinasiyası tədqiqat kolleksiyasında davamlı olaraqAAC > %24,5ilə əlaqəli müəyyən edilmişdir.

Beləliklə, tədqiqatçılar yüksək amilozalı düyülərin marker-assisted selection proqramlarında daha spesifik şəkildə seçilə bilməsi üçün yeni genetik alət təklif etmişlər.

+1801, +2282 və +2806 SNP-lərinin yaratdığı müəyyən allelik nümunələr də bəzi yüksək AAC donorlarını ayırmaq üçün faydalı ola biləcək əlavə diaqnostik məlumat təmin etmişdir.

Tədqiqatın Metodu və Nəticələri

Bitki materialı

Tədqiqat 127 Oryza sativa aksessiyasından ibarət kolleksiya üzərində aparılmışdır. Bunların 40-ı İtaliyadakı mühüm japonica sortlarından, 87-si isə müxtəlif ölkələrdən seçilmiş beynəlxalq germplazmdan ibarətdir.

Ümumi kolleksiyada 125 japonica və 2 indica aksessiyası vardır.

Hər aksessiya iki il ərzində üç təkrarlı tarla sınaqlarında yetişdirilmişdir.

AAC necə ölçüldü?

Yığılan düyülərin görünən amiloza miqdarı üyüdülmüş dənədə yod bağlanmasına əsaslanan spektrometrik üsulla ölçülmüşdür.

FOSS FIAstar 5000 sistemində nümunəyə NaOH məhlulu və yod əlavə edilmiş; yaranan rəng 720 nm absorbans əsasında qiymətləndirilmişdir.

Kalibrləmə üçün AAC-si %15,40, %23,10 və %27,7 olan sertifikatlı referens düyü nümunələrindən istifadə edilmişdir.

Molekulyar analiz

Genomik DNT gənc bitki yarpaqlarından izolə edilmişdir. RM190 mikrosatelliti və müxtəlif Waxy allellərini təmsil edən SNP-lər PCR və sekvensləmə əsaslı üsullarla müəyyən edilmişdir.

Yeni SNP-lər üçün dCAPS yanaşmasında mismatched primerlərdən istifadə edilmiş və PCR məhsulları uyğun restriksiya fermentləri ilə kəsilərək allellər ayrılmışdır.

Yenidən sekvensləmə

Seçilmiş 21 genotipdə təxminən 800–2500 bp uzunluğunda altı üst-üstə düşən PCR bölgəsi amplifikasiya edilərək GBSSI geni və 1 kb upstream tənzimləyici bölgə əhatə olunmuşdur.

Nipponbare genom ardıcıllığı referens kimi istifadə edilmişdir.

Ən mühüm AAC nəticələri

• RM190 təkbaşına AAC variasiyasının %74,9-ni izah etmişdir.
• Intron 1 G/T SNP %77,5 izah təmin etmişdir.
• Intron 1 + exon 6 kombinasiyası %79,5 ilə əsas markerlər arasında ən güclü modeli yaratmışdır.
• Yeni −1514 SNP ümumi izah olunan variasiyanı yalnız cüzi dərəcədə artırmışdır.
• Yeni markerlər xüsusilə AAC > %24,5 genotiplərinin seçilməsində daha spesifik haplotiplərin müəyyən edilməsini təmin etmişdir.

Dənə forması ilə əlaqə

126 non-glutinous aksessiyada AAC ilə dənə forması arasında əhəmiyyətli əlaqələr aşkar edilmişdir.

• AAC artdıqca dənə uzunluğu ümumiyyətlə artmışdır.
• AAC artdıqca uzunluq/en nisbəti artmışdır.
• AAC artdıqca dənə eni azalma meyli göstərmişdir.

Intron 1 SNP dənə enindəki variasiyanın %49,7-ni, uzunluq/en nisbətinin %47,7-ni və dənə uzunluğunun %30,8-ni izah etmişdir.

Tədqiqatçılar bu genetik əlaqəni GBSSI-nin birbaşa dənə formasını idarə etməsi kimi şərh etmirlər. Yüksək amiloza və müəyyən dənə formalarının uzunmüddətli seleksiya və istehlakçı üstünlükləri zamanı birlikdə seçilməsi Waxy allelləri ilə dənə forması arasındakı əlaqəni yaratmış ola bilər.

Tədqiqatın dəstəklədiyi nəticələr

• GBSSI/Waxy lokusu AAC variasiyasının mühüm hissəsini izah edir.
• Birinci introndakı G/T SNP araşdırılan germplazmda ən güclü tək markerlərdən biridir.
• Intron 1 və exon 6 SNP-lərinin kombinasiyası AAC variasiyasının %79,5-ni izah etmişdir.
• 21 genotipdə aparılan allel axtarışı 32 SNP aşkar etmişdir.
• Dörd yeni dCAPS markeri hazırlanmışdır.
• Müəyyən bir CT20/exon 6/−1514 haplotipi tədqiqat kolleksiyasında AAC > %24,5 ilə güclü şəkildə əlaqəlidir.
• Waxy haplotipləri ilə dənə forması xüsusiyyətləri arasında əhəmiyyətli statistik əlaqələr mövcuddur.

Tədqiqatın dəstəkləmədiyi nəticələr

• DNT markerləri amiloza faizini birbaşa fiziki olaraq ölçmür.
• Yeni markerlər AAC variasiyasının hamısını izah etmir.
• Müəyyən edilmiş haplotiplərin dünyanın bütün düyü germplazmında eyni proqnoz gücünü göstərəcəyi sübut edilməmişdir.
• Waxy SNP-lərinin dənə formasının birbaşa bioloji səbəbi olduğu göstərilməmişdir.
• AAC yalnız GBSSI tərəfindən müəyyən edilmir; digər nişasta metabolizmi genləri də təsir göstərə bilər.
• Marker-assisted selection bütün hallarda birbaşa fenotip ölçməsini tamamilə aradan qaldırmır.

Genetik fon niyə vacibdir?

Eyni markerlər müxtəlif düyü kolleksiyalarında fərqli miqdarda AAC variasiyasını izah edə bilər. Əvvəlki bəzi tədqiqatlar eyni və ya oxşar markerlərlə %85–94-ə yaxın izah göstəriciləri bildirmişdir; bu tədqiqatda isə ən güclü əhəmiyyətli kombinasiya təxminən %79,5-də qalmışdır.

Tədqiqatçılar bu fərqin araşdırılan materialın çoxsaylı ölkələrdən gəlməsi və daha geniş genetik müxtəliflik ehtiva etməsi ilə əlaqəli ola biləcəyini müzakirə edirlər.

Buna görə bir marker sisteminin bir germplazm kolleksiyasında uğurlu olması, başqa bir seleksiya populyasiyasında eyni proqnoz performansını avtomatik olaraq təmin etmir.

Mənbə və Metod Qeydi

Özgün tədqiqat:Improvement of marker-based predictability of Apparent Amylose Content in japonica rice through GBSSI allele mining

Müəlliflər:Chiara Biselli; Daniela Cavalluzzo; Rosaria Perrini; Alberto Gianinetti; Paolo Bagnaresi; Simona Urso; Gabriele Orasen; Francesca Desiderio; Elisabetta Lupotto; Luigi Cattivelli; Giampiero Valè.

Bərabər töhfə verən müəlliflər:Chiara Biselli və Daniela Cavalluzzo.

Məsul müəllif:Giampiero Valè.

Jurnal:Rice.

İl / cild / məqalə:2014, 7:1.

DOI:10.1186/1939-8433-7-1

Nəşr tarixi:2 yanvar 2014.

Lisenziya:Creative Commons Attribution 2.0 — CC BY 2.0.

Maliyyələşdirmə:AGER Foundation — RISINNOVA project grant 2010–2369 və MiPAAF — POLORISO project.

Maraqların toqquşması:Müəlliflər rəqabət aparan maraqlar bildirməmişlər.

Əsas metodoloji məhdudiyyətlər:Nəticələr 127 aksessiyadan ibarət konkret germplazm kolleksiyasına əsaslanır. Yeni SNP-lərin yalnız 21 təmsilçi genotipdə yenidən sekvensləmə ilə aşkar edilməsi kolleksiyadan kənarda başqa variantların mövcud ola biləcəyini göstərir. Marker-AAC əlaqələri genetik fon və ətraf mühit şəraitindən təsirlənə bilər. Müəyyən edilmiş markerlər yüksək AAC üçün güclü seçim alətləri verə bilər, lakin birbaşa kimyəvi AAC ölçməsinin universal əvəzi olan testlər kimi şərh edilməməlidir.

Verianla təqdimat prinsipi:Bu məzmun özgün məqalənin paraqraf-paraqraf tərcüməsi deyil. Tədqiqatın eksperimental dizaynı, molekulyar marker nəticələri, AAC variasiya faizləri, yeni SNP mövqeləri və elmi məhdudiyyətlər qorunmuş; məzmun müstəqil öyrədici struktur daxilində yenidən təşkil edilmişdir. Özgün ardıcıllıq sxemləri, gel görüntüləri və korrelyasiya qrafikləri üçün DOI vasitəsilə mənbə tədqiqatına baxılmalıdır.