Maudhui dhahiri ya amylose — Apparent Amylose Content (AAC) — ni mojawapo ya sifa muhimu zaidi za wanga zinazoamua kama mchele unabaki laini, unanata, au unakuwa mkavu zaidi na punje kutengana wakati wa kupikwa. Mojawapo ya vidhibiti vikuu vya usanisi wa amylose katika endospermu ya mchele ni kimeng'enya Granule-Bound Starch Synthase I (GBSSI), kinachosimbwa na jeni Waxy (Wx).

Utafiti huu ulitathmini jinsi alama za DNA zilizopo zinazotumika katika uzalishaji wa mchele zinavyoweza kutabiri kiwango cha AAC, na ukatafuta tofauti mpya za kijeni katika jeni GBSSI/Waxy ili hasa kuchagua kwa kuaminika zaidi genotipu zenye amylose nyingi zaidi ya %24,5.

Jumla ya aksesheni 127 za mchele — 125 japonica na 2 indica — zilichunguzwa. G/T SNP katika introni ya kwanza pekee ilieleza %77,5 ya utofauti wa AAC, na ilipotumiwa pamoja na A/C SNP katika exon 6, utofauti ulioelezwa uliongezeka hadi %79,5. Kuongeza microsatellite RM190 kwenye SNP hizi mbili kuliongeza thamani hiyo hadi %79,6 pekee.

Kwa kuwa haplotipu za marker zilizopo hazikuweza kutenganisha kwa kuaminika aksesheni zenye AAC zaidi ya %24,5, jeni zima la GBSSI na takriban 1 kb ya eneo la udhibiti la upstream zilisekwenishwa upya katika genotipu 21 zinazowakilisha madaraja yote ya AAC. Jumla ya 32 SNP zilitambuliwa, na nne kati yake zilitumiwa kutengeneza marker mpya za molekuli za dCAPS.

Ingawa marker mpya ziliongeza kwa kiwango kidogo tu sehemu ya utofauti wa AAC inayoweza kuelezwa, haplotipu yenye RM190 CT20 pamoja na allele za exon 6 A na −1514 G ilihusishwa kwa uthabiti na AAC > %24,5 katika mkusanyo wa utafiti. Kwa hiyo, mchango muhimu zaidi wa marker mpya si kuongeza kwa kiasi kikubwa utofauti wote unaoelezwa, bali kutoa zana ya molekuli iliyo mahususi zaidi kwa uteuzi wa genotipu fulani zenye amylose nyingi.

Kwa nini amylose hubadilisha namna mchele unavyopikwa?

Wanga wa mchele huundwa hasa na amylose na amylopectin. Uwiano wao huathiri kwa nguvu umbile la mchele uliopikwa na mwelekeo wa punje kushikana.

Aina zenye AAC ya juu kwa kawaida hutengeneza punje kavu zaidi, ngumu na zinazotengana, ilhali aina zenye AAC ya chini zinaweza kuwa laini zaidi, kung'aa na kunata.

Katika uainishaji wa jumla uliotumiwa na utafiti, makundi ya AAC yaligawanywa kuwa waxy, amylose ya chini, ya kati na ya juu. Katika uainishaji wa kibiashara, AAC ya takriban %26–33 kwa kawaida huchukuliwa kuwa daraja la amylose ya juu.

GBSSI na jeni Waxy ni nini?

Jeni Waxy iko kwenye kromosomu 6 na husimba kimeng'enya GBSSI. GBSSI ni mojawapo ya vimeng'enya vikuu vya usanisi wa amylose katika endospermu ya mchele.

Allele mbili zilizoenea katika lokasi ya Waxy ni muhimu hasa:

• Wxa:kwa ujumla huhusishwa na AAC ya juu.
• Wxb:kwa kawaida huhusishwa na AAC ya chini na ya kati.

Katika allele Wxb, G→T SNP katika eneo la 5′ splice la introni ya kwanza inaweza kuathiri uchakataji wa mRNA na kusababisha kupungua kwa kiasi cha GBSSI inayofanya kazi. Kwa hiyo, allele tofauti za jeni moja zina jukumu muhimu katika kubadilika kwa kiasi cha amylose kwenye punje ya mchele.

Marker za DNA Zilizopo Zilitabiri Maudhui ya Amylose kwa Usahihi Gani?

Watafiti kwanza walitathmini uwezo wa microsatellite RM190 iliyotumiwa awali katika uzalishaji wa mchele na SNP muhimu katika jeni Waxy kutabiri AAC katika aksesheni 127.

Matokeo haya yanaonyesha hasa athari kubwa ya SNP katika introni ya kwanza. Intron 1 SNP pekee ilieleza %77,5 ya utofauti wa AAC.

Ingawa Exon 6 SNP pekee ilikuwa na uwezo mdogo wa kueleza, ilipotumiwa pamoja na intron 1 utabiri wa AAC uliongezeka hadi %79,5.

Kuongeza RM190 kwenye mchanganyiko huu kulitoa ongezeko la maelezo la %0,1 pekee. Kwa hiyo, katika mkusanyo wa germplasm wa utafiti, RM190 haikuongeza sana uwezo wa utabiri zaidi ya taarifa iliyotolewa na intron 1 na exon 6 SNP.

Kwa Nini Marker Mpya za Molekuli Zilihitajika?

Ingawa mchanganyiko wa marker zilizopo uliweza kutenganisha madaraja ya AAC ya chini, ya kati na ya juu kwa ujumla, haukutosha hasa kwa kuchagua kwa kuaminika genotipu zenye AAC zaidi ya %24,5.

Tatizo hili ni muhimu hasa kwa masoko na programu za uzalishaji ambako mchele wenye amylose nyingi unapendelewa. Mfugaji wa mimea anaweza kutaka kuchagua katika vizazi vya mapema si tu daraja la “huenda ikawa juu”, bali wazazi au mistari maalum yenye AAC ya juu sana.

Kwa hiyo watafiti walitumia mbinu yaallel mining. Uchimbaji wa allele ni kutafuta tofauti ambazo hazikujulikana awali au hazijaainishwa vya kutosha kwa kulinganisha mfuatano wa DNA wa jeni moja katika genotipu tofauti.

Nini Kilipatikana katika Uchimbaji wa Allele za GBSSI?

Genotipu 21 zinazowakilisha madaraja yote ya AAC zilichaguliwa, na jeni lote la GBSSI pamoja na takriban 1 kb ya eneo la udhibiti la upstream zilisekwenishwa upya.

Licha ya kufanana kwa kiwango kikubwa katika sehemu kubwa ya mfuatano, jumla ya32 SNPzilitambuliwa.

Sehemu kubwa ya tofauti mpya ilipatikana zaidi katika maeneo yasiyosimba protini kama promoter na intron kuliko katika exon zinazokusimba protini. Matokeo haya yanaashiria kuwa sehemu ya GBSSI inayosimba protini huenda imehifadhiwa kwa kiwango kikubwa kwa sababu ya kazi yake muhimu.

Kati ya SNP mpya zilizotambuliwa, nafasi nne zilichaguliwa kwa ajili ya kutengeneza marker za molekuli:

• −1514 — eneo la promoter,
• +1801 — exon 9,
• +2282 — intron 10,
• +2806 — intron 12.

Marker za dCAPS zilitengenezwa kwa SNP hizi na aksesheni 127 zikachunguzwa tena.

Je, Marker Mpya Ziliweza Kutenganisha Vizuri Zaidi Mchele Wenye Amylose Nyingi?

Ndiyo, lakini aina ya mchango wake ni muhimu.

Kuongeza −1514 SNP kwenye intron 1 na exon 6 SNP zilizopo kuliongeza utofauti wa AAC ulioelezwa kutoka %79,5 hadi takriban %80,1. RM190 ilipoingizwa pia kwenye modeli, thamani ikawa %80,3.

Ongezeko hili ni dogo. Kwa hiyo mafanikio ya marker mpya si “kuongeza kwa kiasi kikubwa uwezo wa kutabiri AAC”.

Jambo muhimu zaidi ni kwamba haplotipu fulani ilihusishwa kwa nguvu na AAC ya juu.

RM190 CT20 + exon 6 A + −1514 Gmchanganyiko ulipatikana katika mkusanyo wa utafiti kuwa kwa uthabiti una uhusiano naAAC > %24,5.

Hivyo, watafiti walipendekeza zana mpya ya kijeni ili mchele wenye amylose nyingi uweze kuchaguliwa kwa umahususi zaidi katika programu za marker-assisted selection.

Mifumo fulani ya allele iliyoundwa na +1801, +2282 na +2806 SNP pia ilitoa taarifa ya ziada ya uchunguzi ambayo inaweza kusaidia kutenganisha baadhi ya donors wenye AAC ya juu.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Nyenzo za mimea

Utafiti ulifanywa kwenye mkusanyo wa aksesheni 127 za Oryza sativa. Kati ya hizo, 40 zilikuwa aina muhimu za japonica kutoka Italia, na 87 zilikuwa germplasm ya kimataifa iliyochaguliwa kutoka nchi mbalimbali.

Mkusanyo wote ulikuwa na aksesheni 125 za japonica na 2 za indica.

Kila aksesheni ilipandwa kwa miaka miwili katika majaribio ya shambani yenye marudio matatu.

AAC ilipimwaje?

Maudhui dhahiri ya amylose ya mchele uliovunwa yalipimwa kwa mbinu ya spectrometric inayotegemea kufungamana kwa iodini kwenye punje iliyosagwa.

Katika mfumo wa FOSS FIAstar 5000, suluhisho la NaOH na iodini viliongezwa kwenye sampuli; rangi iliyotokea ilitathminiwa kwa absorbance ya 720 nm.

Kwa kalibrasheni, sampuli za mchele za rejea zilizoidhinishwa zenye AAC ya %15,40, %23,10 na %27,7 zilitumiwa.

Uchambuzi wa molekuli

DNA ya jenomu ilitengwa kutoka kwenye majani machanga ya mimea. Microsatellite RM190 na SNP zinazowakilisha allele tofauti za Waxy zilitambuliwa kwa mbinu za PCR na usekwensishaji.

Kwa SNP mpya, mbinu ya dCAPS ilitumia mismatched primers, na bidhaa za PCR zilikatwa kwa vimeng'enya vinavyofaa vya restriction ili kutenganisha allele.

Usekwensishaji upya

Katika genotipu 21 zilizochaguliwa, maeneo sita ya PCR yanayopishana yenye urefu wa takriban 800–2500 bp yaliongezwa kwa amplification ili kufunika jeni GBSSI na 1 kb ya eneo la udhibiti la upstream.

Mfuatano wa jenomu wa Nipponbare ulitumiwa kama rejea.

Matokeo muhimu zaidi ya AAC

• RM190 pekee ilieleza %74,9 ya utofauti wa AAC.
• Intron 1 G/T SNP ilitoa maelezo ya %77,5.
• Mchanganyiko wa Intron 1 + exon 6 uliunda modeli yenye nguvu zaidi kati ya marker kuu kwa %79,5.
• −1514 SNP mpya iliongeza kwa kiwango kidogo tu utofauti wote ulioelezwa.
• Marker mpya zilisaidia hasa kutambua haplotipu zilizo mahususi zaidi kwa kuchagua genotipu zenye AAC > %24,5.

Uhusiano na umbo la punje

Katika aksesheni 126 za non-glutinous, uhusiano muhimu ulipatikana kati ya AAC na umbo la punje.

• AAC ilipoongezeka, urefu wa punje kwa ujumla uliongezeka.
• AAC ilipoongezeka, uwiano wa urefu/upana uliongezeka.
• AAC ilipoongezeka, upana wa punje ulionyesha mwelekeo wa kupungua.

Intron 1 SNP ilieleza %49,7 ya utofauti wa upana wa punje, %47,7 ya uwiano wa urefu/upana na %30,8 ya urefu wa punje.

Watafiti hawatafsiri uhusiano huu wa kijeni kuwa GBSSI inadhibiti moja kwa moja umbo la punje. Kuchaguliwa kwa pamoja kwa amylose nyingi na maumbo fulani ya punje kwa muda mrefu katika uzalishaji na mapendeleo ya watumiaji huenda kumesababisha uhusiano kati ya allele za Waxy na umbo la punje.

Matokeo yanayoungwa mkono na utafiti

• Lokasi ya GBSSI/Waxy inaeleza sehemu muhimu ya utofauti wa AAC.
• G/T SNP katika introni ya kwanza ni mojawapo ya marker moja zenye nguvu zaidi katika germplasm iliyochunguzwa.
• Mchanganyiko wa Intron 1 na exon 6 SNP ulieleza %79,5 ya utofauti wa AAC.
• Uchimbaji wa allele katika genotipu 21 ulifichua 32 SNP.
• Marker nne mpya za dCAPS zilitengenezwa.
• Haplotipu fulani ya CT20/exon 6/−1514 ilihusishwa kwa nguvu na AAC > %24,5 katika mkusanyo wa utafiti.
• Kuna uhusiano muhimu wa kitakwimu kati ya haplotipu za Waxy na sifa za umbo la punje.

Matokeo yasiyoungwa mkono na utafiti

• Marker za DNA hazipimi moja kwa moja kwa njia ya kifizikia asilimia ya amylose.
• Marker mpya hazielezi utofauti wote wa AAC.
• Haijathibitishwa kuwa haplotipu zilizotambuliwa zitakuwa na uwezo sawa wa utabiri katika germplasm yote ya mchele duniani.
• Haijaonyeshwa kuwa Waxy SNP ndizo sababu za moja kwa moja za kibiolojia za umbo la punje.
• AAC haiamuliwi na GBSSI pekee; jeni nyingine za metaboli ya wanga pia zinaweza kuwa na athari.
• Marker-assisted selection haiondoi kabisa hitaji la kipimo cha moja kwa moja cha fenotipu katika hali zote.

Kwa nini usuli wa kijeni ni muhimu?

Marker zilezile zinaweza kueleza viwango tofauti vya utofauti wa AAC katika mikusanyo tofauti ya mchele. Baadhi ya tafiti za awali ziliripoti thamani za maelezo zinazokaribia %85–94 kwa marker sawa au zinazofanana; katika utafiti huu, mchanganyiko wenye nguvu zaidi na wenye maana ulifikia takriban %79,5.

Watafiti wanajadili kuwa tofauti hii huenda inahusiana na ukweli kwamba nyenzo zilizochunguzwa zilitoka katika nchi nyingi na zilikuwa na utofauti mpana zaidi wa kijeni.

Kwa hiyo, mafanikio ya mfumo wa marker katika mkusanyo mmoja wa germplasm hayahakikishi moja kwa moja utendaji sawa wa utabiri katika populasheni nyingine ya uzalishaji.

Maelezo ya Chanzo na Mbinu

Utafiti asili:Improvement of marker-based predictability of Apparent Amylose Content in japonica rice through GBSSI allele mining

Waandishi:Chiara Biselli; Daniela Cavalluzzo; Rosaria Perrini; Alberto Gianinetti; Paolo Bagnaresi; Simona Urso; Gabriele Orasen; Francesca Desiderio; Elisabetta Lupotto; Luigi Cattivelli; Giampiero Valè.

Waandishi wenye mchango sawa:Chiara Biselli na Daniela Cavalluzzo.

Mwandishi wa mawasiliano:Giampiero Valè.

Jarida:Rice.

Mwaka / juzuu / makala:2014, 7:1.

DOI:10.1186/1939-8433-7-1

Tarehe ya kuchapishwa:2 Januari 2014.

Leseni:Creative Commons Attribution 2.0 — CC BY 2.0.

Ufadhili:AGER Foundation — RISINNOVA project grant 2010–2369 na MiPAAF — POLORISO project.

Mgongano wa maslahi:Waandishi hawakuripoti maslahi yanayoshindana.

Vikwazo vikuu vya mbinu:Matokeo yanategemea mkusanyo maalum wa germplasm wenye aksesheni 127. Ukweli kwamba SNP mpya ziligunduliwa kwa usekwensishaji upya katika genotipu 21 tu za uwakilishi unamaanisha kuwa tofauti nyingine zinaweza kuwepo nje ya mkusanyo huu. Uhusiano wa Marker-AAC unaweza kuathiriwa na usuli wa kijeni na hali za mazingira. Marker zilizotambuliwa zinaweza kutoa zana thabiti za uteuzi kwa AAC ya juu, lakini hazipaswi kufasiriwa kama vipimo vya ulimwengu mzima vinavyoweza kuchukua nafasi ya kipimo cha moja kwa moja cha kemikali cha AAC.

Kanuni ya uwasilishaji ya Verianla:Maudhui haya si tafsiri ya aya kwa aya ya makala asili. Muundo wa majaribio, matokeo ya marker za molekuli, asilimia za utofauti wa AAC, nafasi mpya za SNP na vikwazo vya kisayansi vimehifadhiwa; maudhui yamepangwa upya ndani ya muundo huru wa kielimu. Kwa michoro asili ya mfuatano, picha za gel na grafu za uhusiano, utafiti chanzo unapaswa kuangaliwa kupitia DOI.