Kanser ilaçlarının laboratuvar ortamında değerlendirilmesinde kullanılan klasik iki boyutlu hücre kültürleri, hücreleri düz bir yüzey üzerinde büyütür. Bu sistemler kolay uygulanabilmelerine rağmen gerçek tümör dokusundaki oksijen, besin, metabolik atık ve hücre-hücre etkileşimi gradyanlarını yeterince temsil etmeyebilir. Üç boyutlu tümör sferoidleri ise hücrelerin küresel bir doku benzeri yapı oluşturmasını sağlayarak tümör mikroçevresinin bazı özelliklerini daha gerçekçi biçimde yansıtır.

Üç boyutlu modellerin önemli bir dezavantajı, canlılıklarının ve ilaç yanıtlarının zaman içinde sürekli izlenmesinin güç olmasıdır. Parlak alan mikroskopisi sferoidin biçimini ve büyüklüğünü gösterebilir; ancak hücre zarının bütünlüğü, hücrelerin elektrolit akışına karşı oluşturduğu bariyer veya hücre-elektrot temasındaki fizyolojik değişiklikler hakkında sınırlı bilgi verir. Canlı–ölü boyaması gibi son nokta testleri ise çoğunlukla yalnızca deneyin belirli bir anındaki durumu gösterir ve aynı örneğin daha sonra izlenmesini engelleyebilir.

Bu çalışma, üç boyutlu tümör sferoidlerini etiket kullanmadan ve dokuyu parçalamadan izlemek amacıyla elektriksel empedans spektroskopisini mikroelektrot dizileriyle birleştirmiştir. Sistem, sferoidin örttüğü elektrot çiftlerini otomatik olarak belirlemek için denetimsiz makine öğrenmesi yöntemlerinden K-means kümelemeyi kullanmaktadır.

Temel ölçüm mantığı şöyledir:

• Sferoid elektrotların üzerine yerleştiğinde iyonların akım yolu değişir.
• Hücre zarları ve hücre-elektrot aralığı elektriksel bir bariyer oluşturur.
• Elektrot çiftleri arasındaki empedans özellikle 1–100 kHz aralığında yükselir.
• Hücreler öldüğünde, küçüldüğünde, birbirinden ayrıldığında veya elektrot temasını kaybettiğinde empedans azalır.

Çalışmada HCT-116 ve HT-29 insan kolorektal kanser hücrelerinden sferoidler oluşturulmuştur. Her sferoid, 1.000 hücrenin U tabanlı 96 kuyucuklu plakalarda üç gün kültüre edilmesiyle üretilmiş ve yaklaşık 200–300 µm çapa ulaştıktan sonra mikroelektrot dizilerinin üzerine aktarılmıştır.

İki farklı mikroelektrot sistemi kullanılmıştır:

Empedans ölçümleri 100 Hz–1 MHz frekans aralığında, 100 frekans basamağıyla ve ±10 mV sinüzoidal uyarım kullanılarak yapılmıştır. Sferoidlerin elektrot yüzeyine tutunması için 2–5 saat beklendikten sonra başlangıç ölçümü alınmış, daha sonra günlük kayıtlarla deneyler 80 saate kadar sürdürülmüştür.

Çalışmada elektriksel değişimi standartlaştırmak için değiştirilmiş göreli empedans değişimi, yani RIC kullanılmıştır:

\[ \mathrm{RIC} = \frac{Z_s-Z_{ref}} {Z_s+Z_{ref}} \times 100\% \]

Burada:

• Z_s, sferoid bulunan ölçümdeki empedansı,
• Z_ref, referans durumdaki empedansı

temsil etmektedir.

Bu denklem, farkı iki değerin toplamına böldüğü için ölçümü teorik olarak −%100 ile +%100 arasında sınırlar. Pozitif ve yüksek RIC, sferoid-elektrot temasının empedansı referansa göre artırdığını gösterir.

Ancak yöntem metninde Z_s ve Z_ref bazı cümlelerde “RIC” olarak tanımlanmıştır. Denklemde bu değişkenlerin empedans olması gerekirken metinde empedans ile RIC terminolojisi birbirine karışmıştır. Bu raporlama sorunu formülün yeniden uygulanması açısından açıklık gerektirmektedir.

İlk örnek sferoidde 30 komşu elektrot çifti incelenmiştir. Sferoidi örten beş elektrot çiftinde maksimum RIC değerleri %29–58 arasında; yalnızca kültür ortamıyla temas eden 25 çiftte ise çoğunlukla %10’un altında bulunmuştur. Araştırmacılar bu örnek için elle %16 eşik seçmiş ve optik görüntüyle elektriksel sınıflandırmanın genel olarak örtüştüğünü göstermiştir.

Daha sonra her sferoid için eşiğin insan tarafından seçilmesini ortadan kaldırmak amacıyla K-means kümeleme kullanılmıştır. Maksimum RIC değerleri iki kümeye ayrılmıştır:

• Sferoid tarafından örtülmeyen elektrot çiftleri
• Sferoidle doğrudan temas eden elektrot çiftleri

Küme merkezleri C₀ ve C₁ olarak tanımlandığında otomatik eşik:

\[ T = \operatorname{round} \left( \frac{C_0+C_1}{2} \right) \]

olarak hesaplanmıştır.

Araştırmacılar eşik geliştirme analizini 74 sferoid ve 2.422 elektrot çifti üzerinde değerlendirmiştir. Bu veri setinde HCT-116, HT-29, insan dermal fibroblastları, U87 MG glioblastoma hücreleri ve iki farklı ortak kültür modeli yer almıştır.

Metin bir yerde “beş farklı tip ve bir karışım” ifadesini kullanmasına rağmen listelenen gruplar dört tek hücre modeli ile iki ortak kültür olmak üzere toplam altı kategoridir. Bu, yöntem anlatımındaki küçük fakat önemli bir sayım tutarsızlığıdır.

Toplu dağılımda yalnızca kültür ortamıyla temas eden elektrotların maksimum RIC değerleri çoğunlukla %15–20 aralığında yoğunlaşmıştır. Sferoidle örtülü elektrotlarda ise dağılım %20–35 aralığında bir tepe oluşturmuş ve yaklaşık %80’e kadar uzanmıştır. İki dağılımın kısmen örtüşmesi, bütün sferoidlere uygulanacak tek sabit eşik yerine her sferoid için uyarlanan bir eşik kullanılmasının nedenini göstermektedir.

Sistem HCT-116 sferoidlerinde 25 µM Navitoclax, HT-29 sferoidlerinde ise 10 µM Navitoclax yanıtını izlemiştir. Navitoclax, çalışmada hücre ölümünü başlatmak için kullanılan deneysel sitotoksik müdahaledir.

Cam MEA üzerindeki örnek HCT-116 deneyinde:

• Tedavisiz sferoidin empedans profili 48 saat boyunca büyük ölçüde korunmuştur.
• Kontrol sferoidinin son canlılığı %91 olarak ölçülmüştür.
• 25 µM Navitoclax uygulanan sferoidde RIC zamanla azalmıştır.
• Toplam zaman etkisi için p = 0,006 bildirilmiştir.
• 2–5 saat ile 17–26 saat arasında anlamlı fark görülmemiştir: p = 0,515.
• 17–26 saat ile 30–48 saat arasında anlamlı düşüş oluşmuştur: p = 0,049.
• Tedavi edilen örneğin 48. saatteki canlılığı %28’e düşmüştür.

Daha geniş HCT-116 analizinde 16 kontrol ve başlangıçta 16 Navitoclax uygulanmış sferoid 80 saate kadar izlenmiştir. Kontrollerde empedans zamanla hafif yükselmiş, ancak farklar istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır. Kontrol sferoidlerinin canlılığı son zaman noktasına kadar genel olarak %80’in üzerinde kalmıştır.

Navitoclax grubunda empedans düşüşü 30–48 saat aralığında belirginleşmiş ve 60–80 saatte en güçlü düzeye ulaşmıştır. Son zaman noktasında ortalama canlılık yaklaşık %20’ye gerilemiştir. Bununla birlikte şekil açıklamasında canlılık zaman noktaları arasındaki farkların istatistiksel olarak anlamlı olmadığı belirtilmiştir. Bu nedenle elektriksel empedans düşüşü istatistiksel olarak güçlü görünürken, terminal canlılık ölçümleri aynı güçte zaman karşılaştırması sağlamamıştır.

Ağ yapılı MEA üzerindeki HT-29 sferoidlerinde, sferoidin merkezinde iki elektrodun da hücrelerle örtüldüğü çiftlerde RIC yaklaşık %90’a ulaşırken, yalnızca bir elektrodun örtüldüğü çevresel çiftlerde yaklaşık %60 düzeyinde kalmıştır. Bu sonuç, ölçülen sinyalin yalnızca hücre varlığından değil, elektrot çiftinin ne ölçüde doğrudan hücrelerle temas ettiğinden de etkilendiğini göstermektedir.

Ağ MEA deneylerinde:

• Kontrol grubu n = 5 sferoidden oluşmuştur.
• 10 µM Navitoclax grubu n = 4 sferoidden oluşmuştur.
• Kontrol RIC değeri ilk gün yükselmiş ve daha sonra büyük ölçüde kararlı kalmıştır.
• Navitoclax grubunda düşüş ikinci günden sonra belirginleşmiştir.
• 60–80 saatte maksimum RIC yaklaşık %40’ın altına inmiştir.
• 17–26 saat ile 60–80 saat arasındaki düşüş için p < 0,001 bildirilmiştir.

Çalışmanın temel sonucu, mikroelektrot dizileriyle ölçülen empedansın sferoidin elektrot yüzeyindeki temasını ve zaman içindeki fizyolojik değişimini izleyebildiğidir. K-means algoritması ise hangi elektrotların sferoidle temas ettiğini otomatik olarak belirleyerek insan tarafından eşik seçme gereksinimini azaltmıştır.

Bununla birlikte empedans doğrudan ve yalnızca “canlı hücre yüzdesi” ölçmez. Ölçüm şu faktörlerin tümünden etkilenebilir:

• Hücre zarının bütünlüğü
• Sferoidin elektrota yapışma kuvveti
• Hücreler arası bağlantılar
• Sferoidin büyüklüğü ve biçimi
• Elektrot ile sferoid arasındaki sıvı boşluğu
• Sferoidin elektrot üzerindeki konumu
• Kültür ortamının elektriksel özellikleri

Dolayısıyla RIC düşüşü hücre ölümüne eşlik edebilir; ancak yalnızca RIC değerinden kesin canlı hücre yüzdesi hesaplanamaz. Çalışma bunu terminal canlı–ölü floresan boyamalarıyla desteklemiş, fakat nicel bir canlılık tahmin modeli veya klinik doğruluk testi geliştirmemiştir.

Çalışmanın temel problemi nedir?

Kanser ilaçlarının etkisini laboratuvar ortamında araştırmak için kullanılan modelin, gerçek tümörü yeterince temsil etmesi gerekir. İki boyutlu kültürlerde hücreler düz bir plastik veya cam yüzeyde tek tabaka halinde büyür. Bu ortamda hemen hemen bütün hücreler benzer düzeyde oksijen, besin ve ilaca maruz kalır.

Gerçek tümörlerde ve üç boyutlu sferoidlerde ise durum farklıdır:

• Dış katmanlar daha fazla oksijen ve besin alır.
• Merkeze doğru oksijen azalabilir.
• Metabolik atıklar iç bölgelerde birikebilir.
• İlaçların doku içine geçişi sınırlı olabilir.
• Merkezde hipoksik veya nekrotik alanlar gelişebilir.
• Hücre-hücre ve hücre-matriks etkileşimleri ilaç yanıtını değiştirebilir.

Bu nedenlerle üç boyutlu tümör sferoidleri, iki boyutlu kültürlerden daha karmaşık ve biyolojik olarak daha gerçekçi bir preklinik model oluşturabilir.

Ancak sferoidin fizyolojik durumunu sürekli izlemek güçtür. Mikroskopi sferoidin fiziksel görünümünü gösterir; fakat hücrelerin hâlâ elektriksel olarak bariyer oluşturup oluşturmadığını veya membran bütünlüğünün bozulmaya başlayıp başlamadığını erken dönemde fark etmeyebilir.

Çalışmanın çözmeye çalıştığı temel problem şudur:

Üç boyutlu tümör sferoidlerinin elektrot yüzeyindeki konumu, canlılıkla ilişkili fizyolojik değişimleri ve ilaç yanıtı, görüntülerin elle incelenmesine gerek kalmadan elektriksel olarak ve otomatik biçimde izlenebilir mi?

Elektriksel empedans spektroskopisi nedir?

Elektriksel empedans spektroskopisinde biyolojik örneğe çok küçük bir alternatif elektrik sinyali uygulanır. Sistem, farklı frekanslarda akıma ne kadar karşı koyduğunu ölçer.

Empedans genel olarak:

\[ Z(f) = \frac{V(f)}{I(f)} \]

ilişkisiyle açıklanabilir.

Burada:

• Z(f), belirli frekanstaki empedansı,
• V(f), uygulanan gerilimi,
• I(f), ölçülen akımı,
• f, sinyal frekansını

göstermektedir.

Bu temel denklem çalışmada açıkça verilmemiştir; EIS yönteminin fiziksel mantığını açıklamak amacıyla eklenmiştir.

Empedans, yalnızca klasik elektrik direncinden ibaret değildir. Biyolojik hücre zarları kapasitif davranış gösterebilir; elektrot yüzeyi, sıvı ortam ve hücre-elektrot aralığı da frekansa bağlı elektriksel özellikler oluşturur.

Sferoid elektrot üzerindeyken empedans neden yükseliyor?

Kültür ortamı iyonları taşıyabildiği için elektrik akımı elektrotlar arasında görece kolay ilerler. Elektrotun üzerine hücre veya hücre topluluğu yerleştiğinde akımın yolu kısmen kapanır veya uzar.

Hücre zarları ve sıkı hücre toplulukları şu etkileri oluşturabilir:

• İyonların doğrudan elektrota ulaşmasını sınırlandırmak
• Akımı hücrelerin çevresindeki daha dar sıvı yollarına yönlendirmek
• Elektrot ile kültür ortamı arasındaki efektif kapasitansı değiştirmek
• Hücre-elektrot temasındaki elektriksel bariyeri artırmak

Bu nedenle sferoidle doğrudan temas eden elektrot çiftleri, yalnızca kültür ortamına maruz kalan çiftlerden daha yüksek empedans gösterebilir.

Orta frekans aralığı neden önemli?

Çalışmada en ayırt edici değişiklikler 1–100 kHz aralığında görülmüştür. RIC eğrileri bu bölgede çan biçimli bir tepe oluşturmuştur.

Araştırmacılar maksimum RIC değerini bu frekans aralığından seçmiştir:

\[ \mathrm{maxRIC}_i = \max_{1\,\mathrm{kHz}\leq f\leq100\,\mathrm{kHz}} \mathrm{RIC}_i(f) \]

Burada i, ölçülen elektrot çiftini temsil eder.

Bu gösterim çalışmanın analiz mantığını açıklamak için düzenlenmiştir. Her elektrot çifti için bütün spektrumdan tek bir maksimum değer çıkarılmış ve sınıflandırmada bu değer kullanılmıştır.

Üç boyutlu sferoidler nasıl oluşturuldu?

HCT-116 ve HT-29 insan kolorektal kanser hücreleri ayrı kültür ortamlarında büyütülmüştür. Her kuyucuğa:

\[ 1.000\ \mathrm{hücre}/200\ \mu L \]

ekilmiştir.

U tabanlı plakalar hücrelerin tek bir merkezde toplanarak küresel yapı oluşturmasını kolaylaştırmıştır. Kuyucuklar yapışmayı engelleyen solüsyonla önceden kaplanmış, böylece hücrelerin plastiğe yayılması yerine birbirine bağlanması sağlanmıştır.

Üç günlük kültür sonunda sferoidler yaklaşık 200–300 µm çapa ulaşmıştır. Daha sonra pipet ucuyla tek tek MEA üzerine aktarılmıştır.

Sferoidlerin aktarım sırasında zarar görmemesi önemlidir. Metin, bazı sferoidlerin transfer sırasında parçalandığını ve bu örneklerin canlılık analizinden çıkarıldığını belirtmektedir. Bu dışlama, özellikle kırılgan veya fazla hasarlı sferoidlerin sonuçlardan çıkarılması nedeniyle canlılık değerlendirmesinde seçilim yanlılığı oluşturabilir.

Sferoidler neden 2–5 saat bekletildi?

Sferoid MEA üzerine konulduktan hemen sonra elektrotlarla kararlı temas kurmayabilir. Kültür sıvısındaki küçük hareketler sferoidi yerinden oynatabilir ve sferoid ile elektrotlar arasında sıvı tabakası bulunabilir.

Bu nedenle ilk ölçümden önce 2–5 saat beklenmiş ve sferoidin elektrotlara tutunmasına izin verilmiştir. Cam MEA üzerindeki otomatik eşik bu ilk 2–5 saatlik zaman noktasında belirlenmiştir.

Ağ MEA’da ise en güçlü tutunma ve en yüksek RIC ilk günde ortaya çıktığı için aktif elektrotların belirlenmesinde 17–26 saatlik ölçüm kullanılmıştır.

Cam MEA nasıl yapılandırıldı?

Cam MEA’da elektrotlar 70 µm aralıkla yerleştirilmiştir. İridyum oksit elektrotların gözenekli yüzeyi ve düşük empedansı, biyolojik örneklerden hassas kayıt alınmasını kolaylaştırmaktadır.

İletken yollar silikon nitrürle elektriksel olarak yalıtılmıştır. Sferoidin elektrotlara tutunmasını artırmak için yüzeye:

• 0,2 mbar basınçta,
• 80 W güçte,
• iki dakika

plazma işlemi uygulanmıştır. Ardından cihaz distile suyla temizlenmiş ve 30 dakika ultraviyole ışıkla sterilize edilmiştir.

Özel SLA odası neden üretildi?

Araştırmacılar sferoidin sıvı hareketiyle elektrot alanından uzaklaşmasını azaltmak için stereolitografi, yani SLA tipi üç boyutlu yazıcıyla özel bir silindirik oda üretmiştir.

Ancak yöntem metninde ticari odanın çapı 2,6 mm, özel odanın çapı ise 8 mm olarak verilmiş; özel parçanın mevcut odanın içine yerleştiği söylenmiştir. Sekiz milimetrelik bir parçanın 2,6 milimetrelik alanın içine yerleşmesi geometrik olarak mümkün görünmemektedir.

Değerlerden birinin yazım hatası olması mümkündür; fakat PDF’de hangi ölçünün doğru olduğu açıklanmamıştır. Bu nedenle cihazın yeniden üretilmesi için oda boyutları doğrudan kullanılamaz.

Ağ yapılı MEA’nın farkı nedir?

Ağ MEA, 12 µm kalınlığındaki poliimid yapı üzerine yerleştirilmiş titanyum nitrür elektrotlardan oluşmuştur. Ağ açıklıkları sayesinde kültür ortamı sferoidin yalnızca üst ve yan yüzeylerine değil alt yüzeyine de daha kolay ulaşabilir.

Şekil 1’de cam MEA üzerindeki sferoidin zaman içinde daha yayvan, “yarı pankek” benzeri biçime dönüştüğü; ağ MEA üzerindeki sferoidin ise küresel yapısını daha fazla koruduğu gösterilmiştir.

Hücrelerin ağın çevresine ve kısmen içine büyümesi, elektrotların sferoidin daha iç katmanlarına yakın kayıt alabilmesini sağlayabilir.

Şekil 1 ne anlatıyor?

Şekil 1, deneyin bütün iş akışını göstermektedir:

1. Kanser hücrelerinin U tabanlı plakalarda sferoid oluşturması
2. Sferoidlerin cam veya ağ MEA’ya aktarılması
3. Navitoclax veya çözücü kontrolünün uygulanması
4. Farklı zamanlarda empedans ölçümü
5. K-means ile sferoidin örttüğü elektrotların belirlenmesi
6. Deney sonunda canlı–ölü floresan boyaması

Şekilde cam ve ağ MEA’ların fotoğrafları, sferoidlerin parlak alan görüntüleri ve deney sonunda elde edilen canlı–ölü floresan görüntüleri birlikte verilmiştir.

Şekil açıklamasında ölçek çubuğu “200 µM” biçiminde yazılmıştır. Mikroskopi ölçek çubuğu bir uzunluk birimi olması gerektiği halde µM bir konsantrasyon birimidir. PDF’deki bu kullanım editoryal birim hatasıdır.

RIC formülünün teknik anlamı

Çalışmada kullanılan formül:

\[ \mathrm{RIC} = \frac{Z_s-Z_{ref}} {Z_s+Z_{ref}} \times 100 \]

şeklindedir.

Eğer sferoidli empedans referanstan yüksekse RIC pozitif olur. Örnek olarak:

\[ Z_s = 150\ \mathrm{k\Omega},\quad Z_{ref}=100\ \mathrm{k\Omega} \]

olduğunda:

\[ \mathrm{RIC} = \frac{150-100}{150+100} \times100 = 20\% \]

elde edilir.

Bu örnek yalnızca formülün matematiksel anlamını göstermek için verilmiştir; çalışmadaki belirli bir elektrotun ham verisi değildir.

Referans empedans nasıl seçildi?

Cam MEA için referans, üzerinde sferoid bulunmayan ve yalnızca kültür ortamı bulunan ölçüm olarak tanımlanmıştır.

Ağ MEA için referans seçiminde farklı bir yaklaşım kullanılmıştır. Bir ile 10 kHz arasındaki en düşük beş empedans büyüklüğünün ortalaması referans kabul edilmiştir.

İki platformda farklı referans tanımlarının kullanılması, cam ve ağ sistemlerindeki mutlak RIC değerlerinin doğrudan karşılaştırılmasını sınırlandırabilir.

Neden komşu elektrot çiftleri ölçüldü?

Empedans iki elektrot arasından ölçülmüştür. Her ölçümde iki komşu ve aynı büyüklükte elektrot kullanılmıştır. Böylece sferoidin farklı bölgeleri boyunca çok noktalı elektriksel harita oluşturulmuştur.

Sferoidin merkezindeki iki elektrot da hücrelerle örtüldüğünde ölçülen empedans, yalnızca bir elektrodun örtüldüğü çevresel çiftlerden daha yüksek olmuştur.

Bu gözlem önemlidir: Empedans yalnızca “sferoid var veya yok” bilgisini değil, elektrot çiftinin sferoid altında ne ölçüde kaldığını da yansıtmaktadır.

Elle seçilen eşik nasıl doğrulandı?

Şekil 2’de örnek bir sferoid için:

• 30 elektrot çiftinin empedans spektrumları,
• RIC eğrileri,
• mikroskop görüntüsü,
• elektriksel ısı haritası,
• RIC dağılım grafiği

birlikte verilmiştir.

Sferoidle temas eden beş çiftte maksimum RIC değerleri %29, %33, %33, %36 ve %58 olarak işaretlenmiştir. Yalnızca sıvıyla temas eden elektrotlar çoğunlukla %10’un altında kalmıştır.

Bu örnek için %16 eşik seçilmiştir. %16’nın üzerinde kalan elektrot çiftleri sferoidle örtülü olarak sınıflandırılmıştır.

Elektriksel ısı haritasındaki yüksek RIC bölgeleri mikroskop görüntüsündeki sferoid alanıyla büyük ölçüde örtüşmüştür. Ancak görsel olarak sferoidin altında görünen bazı elektrotlar düşük empedans göstermiştir. Araştırmacılar bunu sferoidin üç boyutlu ve düzensiz alt yüzeyi nedeniyle elektrotla doğrudan temas etmeyen bölgelerin bulunmasıyla açıklamıştır.

Hartigan Dip testi ne için kullanıldı?

Hartigan Dip testi, dağılımın tek tepeli olup olmadığını değerlendiren istatistiksel bir yöntemdir. Çalışmada RIC değerlerinin tek bir dağılımdan değil, örtülü ve örtüsüz elektrotlara karşılık gelen iki farklı popülasyondan oluşup oluşmadığını değerlendirmek için kullanılmıştır.

Örnek sferoidde iki belirgin grup görülmüştür:

• Örtüsüz elektrotlar: düşük RIC
• Örtülü elektrotlar: yüksek RIC

Hartigan Dip testi tek başına otomatik eşik üretmemiştir. Dağılımın çok tepeli olabileceğini göstermiş; gerçek otomatik sınıflandırma K-means ile yapılmıştır.

K-means kümeleme nasıl çalıştı?

K-means, verileri benzerliklerine göre önceden belirlenen sayıda kümeye ayırır. Bu çalışmada:

[ k = 2 ]

olarak seçilmiştir.

Amaç fonksiyonu açıklama amacıyla şöyle gösterilebilir:

\[ \underset{C_0,C_1}{\operatorname{argmin}} \sum_{j=0}^{1} \sum_{x_i \in C_j} \left\|x_i-\mu_j\right\|^2 \]

Burada:

• x_i, bir elektrot çiftinin maksimum RIC değerini,
• C_j, kümeyi,
• µ_j, küme merkezini

ifade eder.

Bu denklem makalede açıkça yazılmamıştır; K-means yönteminin matematiksel mantığını açıklamak amacıyla eklenmiştir.

Algoritma şu basamaklarla çalışmıştır:

1. Her maksimum RIC değeri en yakın küme merkezine atanmıştır.
2. Her kümenin ortalaması yeni merkez olarak hesaplanmıştır.
3. Atamalar değişmeyene kadar işlem tekrarlanmıştır.
4. İki küme merkezinin ortası eşik kabul edilmiştir.
5. Eşik, kırpılmamış özgün veriye uygulanmıştır.

“Trimmed K-means” ne anlama geliyor?

Sonuç bölümünde algoritmanın eğitim sırasında en yüksek %5’lik uç değerleri dışarıda bıraktığı belirtilmektedir. Amaç, birkaç aşırı yüksek elektrot değerinin küme merkezini ve eşiği gereksiz biçimde yükseltmesini önlemektir.

Bu yaklaşım, sferoidin örttüğü alanın olduğundan küçük sınıflandırılmasını azaltabilir. Ancak uç değerlerin hangi aşamada, hangi kuralla çıkarıldığı yöntem bölümünde tam olarak açıklanmamıştır.

Dinamik eşik neden gerekliydi?

Her sferoidin:

• büyüklüğü,
• elektrota temas alanı,
• hücre yoğunluğu,
• alt yüzey geometrisi,
• tutunma kuvveti

farklı olabilir.

Bu nedenle bir sferoidde %16 uygun eşik olurken başka bir sferoidde daha yüksek veya daha düşük eşik gerekebilir. Küme merkezlerine göre hesaplanan eşik, her deneyin kendi elektriksel dağılımına uyarlanmıştır.

Şekil 2F’deki 74 sferoid ne gösteriyor?

Toplam 74 sferoidden elde edilen 2.422 elektrot çiftinin dağılımı incelendiğinde, örtüsüz elektrotların yaklaşık %15–20 RIC civarında keskin bir tepe oluşturduğu görülmüştür.

Sferoidle örtülü elektrotlarda ise:

• yaklaşık %20–35 arasında ana tepe,
• %35–80 arasında daha geniş bir kuyruk

bulunmuştur.

Bu geniş dağılım, sferoid altındaki bütün elektrotların aynı ölçüde hücreyle temas etmediğini göstermektedir. Bazı elektrotlarda sıvı aralığı kalırken bazıları yoğun hücre tabakasıyla doğrudan örtülmektedir.

Elektriksel ısı haritası nasıl üretildi?

Her elektrot çiftinin maksimum RIC değeri, MEA üzerindeki konumuna yerleştirilerek renkli bir harita oluşturulmuştur. Yüksek değerler sıcak renklerle, düşük değerler açık renklerle gösterilmiştir.

K-means eşiğinin üzerindeki bölgelerin çevresine otomatik siyah sınır çizilmiş ve sferoidin elektriksel “ayak izi” oluşturulmuştur.

MEA sınırındaki elektrotlar görselleştirme amacıyla komşu değerlerden türetilen RIC değerleriyle doldurulmuştur. Bu sınır noktaları nicel analizden çıkarılmıştır.

Metindeki “en yakın minimum değerlere dayalı maksimum RIC” ifadesi işlem yöntemini tam olarak açıklamamaktadır. Isı haritası sınırlarının hangi interpolasyon kuralıyla doldurulduğu yeniden üretim açısından belirsizdir.

Zaman boyunca hangi elektrotlar izlendi?

Algoritma sferoidin başlangıçta örttüğü elektrotları belirlemiş, sonraki analizlerde yalnızca bu elektrotların RIC değerleri izlenmiştir.

Bir sferoidin temsilî RIC değeri açıklama amacıyla şu şekilde ifade edilebilir:

\[ \overline{\mathrm{maxRIC}} = \frac{1}{N_c} \sum_{i=1}^{N_c} \mathrm{maxRIC}_i \]

Burada:

• N_c, başlangıçta örtülü sınıflandırılan elektrot çifti sayısını,
• maxRIC_i, ilgili çiftin maksimum RIC değerini

göstermektedir.

Bu formül, metinde tarif edilen ortalama hesabını açıklamak için düzenlenmiştir.

Başlangıçtaki elektrotların sabit tutulması, ilaç etkisinin aynı algılama noktalarında izlenmesini sağlar. Ancak kontrol sferoidi büyüyerek yeni elektrotları örttüğünde bu yeni temas alanları nicel ortalamaya dahil edilmemiştir. Dolayısıyla yöntem toplam sferoid alanındaki bütün değişimi değil, başlangıçta seçilen temas bölgesinin elektriksel değişimini izlemektedir.

Kontrol HCT-116 sferoidinde ne oldu?

Şekil 3’ün üst bölümünde tedavi uygulanmayan HCT-116 sferoidi gösterilmiştir.

Dördüncü saatte sferoid belirli bir elektrot grubuyla temas etmiştir. Yirminci–yirmi dördüncü saat civarında hücrelerin yayılması ve çoğalmasıyla daha fazla elektrot yüksek RIC göstermiştir.

Kırk sekizinci saatte maksimum RIC’de küçük bir azalma görülmüştür. Yazarlar bunu sferoid merkezinde hipoksi, besin yetersizliği ve atık birikimine bağlı nekrotik çekirdeğin başlamasıyla açıklamaktadır.

Çalışmada nekrotik çekirdek doğrudan histolojik kesit veya oksijen ölçümüyle gösterilmemiştir. Bu nedenle 48. saatteki küçük düşüş için sunulan nekrotik çekirdek açıklaması önceki literatüre dayalı mekanizma yorumudur.

Navitoclax uygulandığında ne oldu?

Şekil 3’ün alt bölümünde 25 µM Navitoclax uygulanan HCT-116 sferoidi gösterilmiştir.

Parlak alan görüntülerinde:

• çekirdekte koyulaşma,
• kenarlarda parçalanma,
• morfolojik düzensizlik

görülse de bu değişiklikler erken aşamada nicel olarak belirgin değildir.

Elektriksel kayıtta ise RIC tepe noktası zamanla azalmış ve 48. saatte örtüsüz elektrotların düzeyine yaklaşmıştır.

Yazarların önerdiği mekanizma şöyledir:

\[ \mathrm{Navitoclax} \rightarrow \mathrm{apoptoz} \rightarrow \mathrm{hücre\ küçülmesi\ ve\ ayrılması} \rightarrow \mathrm{elektrot\ temasının\ azalması} \rightarrow \mathrm{RIC}\downarrow \]

Hücreler birbirinden ve yüzeyden ayrıldığında elektrolit akım için daha açık bir yol oluşturur. Böylece ölçülen empedans düşer.

Şekil 4’teki tek sferoid karşılaştırması

Kontrol sferoidinde 2–5, 17–26 ve 30–48 saat aralıkları arasında anlamlı RIC farkı görülmemiştir. Son floresan boyamasında canlılık %91’dir.

Navitoclax uygulanan sferoidde toplam zaman etkisi anlamlıdır:

\[ p = 0{,}006 \]

İlk iki zaman aralığı arasındaki fark:

\[ p = 0{,}515 \]

olup anlamlı değildir.

17–26 saat ile 30–48 saat arasındaki fark:

\[ p = 0{,}049 \]

olarak bildirilmiştir.

Bu sonuç, Navitoclax etkisinin hemen ortaya çıkmadığını; ilk gün görece kararlı bir dönemden sonra elektriksel bozulmanın belirginleştiğini düşündürmektedir.

Ancak Şekil 4’te kontrol için n = 4, tedavi için n = 6 ifadesi sferoid sayısını değil, aynı sferoidin altında ölçülen elektrot çifti sayısını temsil etmektedir. Aynı sferoide ait elektrot çiftleri bağımsız biyolojik örnek değildir.

Elektrot çiftleri bağımsız tekrarlar gibi istatistiksel teste dahil edildiyse p değerleri biyolojik bağımsızlığı olduğundan fazla yansıtabilir. Bu deney, mekanizmayı gösteren temsilî örnek olarak değerlendirilmeli; bağımsız sferoid popülasyonu kanıtı olarak yorumlanmamalıdır.

Şekil 5’teki 32 HCT-116 sferoidi

Popülasyon düzeyindeki deneyde başlangıçta:

• 16 kontrol sferoidi
• 16 Navitoclax uygulanmış sferoid

bulunmaktadır.

Her veri noktası, bir sferoidin başlangıçta örtülü sınıflandırılan elektrotlarından hesaplanan ortalama maksimum RIC değerini temsil etmektedir.

Kontrol grubunda RIC 80 saat boyunca hafif yükselmiş, ancak zaman aralıkları arasında anlamlı fark oluşmamıştır. Bu artış sferoid büyümesi ve yoğunluğuyla ilişkilendirilmiştir.

Navitoclax grubunda:

• 2–5 saat ile 17–26 saat arasında anlamlı düşüş yoktur.
• 30–48 saatte anlamlı elektriksel azalma başlamıştır.
• 60–80 saatte düşüş p < 0,001 düzeyine ulaşmıştır.
• Son canlılık yaklaşık %20’dir.

Deneylerin canlılık testi için farklı zamanlarda sonlandırıldığı belirtilmektedir. Bu nedenle her zaman noktasında kaç sferoid bulunduğu ve aynı sferoidlerin bütün zamanlarda tekrar ölçülüp ölçülmediği şekil açıklamasından tam olarak anlaşılamamaktadır.

İstatistik bölümünde tek yönlü ANOVA veya Kruskal–Wallis testi yazılmış; tekrarlı ölçümlü veri için karma model ya da tekrarlı ölçüm ANOVA’sı belirtilmemiştir. Aynı sferoidlerin birden fazla zamanda ölçüldüğü durumlarda zaman içi bağımlılığın nasıl ele alındığı açıklanmamıştır.

Şekil 6: Merkez ve çevre elektrotları

Ağ MEA üzerindeki HT-29 sferoidinin merkezinde iki komşu elektrot da sferoid tarafından örtülmektedir. Çevre bölgede ise çiftin yalnızca bir elektrodu sferoidle temas etmektedir.

17–26 saatlik ölçümde:

• Merkez çiftleri: yaklaşık %90 RIC
• Çevre çiftleri: yaklaşık %60 RIC

göstermiştir.

Bu sonuç, elektrot yüzeyinin ne kadarının hücrelerle örtüldüğünün sinyal büyüklüğünü güçlü biçimde etkilediğini göstermektedir.

Ağ MEA’daki HT-29 sonuçları

Kontrol grubunda ilk gün RIC yaklaşık %20’den %70 civarına yükselmiştir. Bu yükseliş sferoidin ağ üzerinde daha güçlü tutunmasına bağlanmıştır. Daha sonraki zamanlarda anlamlı değişiklik görülmemiştir.

10 µM Navitoclax grubunda RIC ilk gün yükselmiş, daha sonra azalmaya başlamış ve 60–80 saatte yaklaşık %40’ın altına düşmüştür.

İlk yüksek değerin görüldüğü 17–26 saat ile 60–80 saat arasındaki fark:

\[ p < 0{,}001 \]

olarak bildirilmiştir.

Ağ MEA gerçekten daha iyi mi?

Yazarlar ağ MEA’nın kültür ortamını sferoidin her yönüne ulaştırdığını, küresel biçimi koruduğunu ve daha yüksek RIC sağladığını belirtmektedir.

Bu açıklama kullanılan görüntülerle uyumludur; ancak cam ve ağ MEA deneyleri doğrudan eşlenmiş değildir:

• Cam MEA’da HCT-116 kullanılmıştır.
• Ağ MEA’da HT-29 kullanılmıştır.
• Cam deneyinde 25 µM Navitoclax uygulanmıştır.
• Ağ deneyinde 10 µM Navitoclax uygulanmıştır.
• Referans RIC hesapları farklıdır.
• Elektrot aralıkları farklıdır.

Bu nedenle daha yüksek ağ MEA sinyalinin ne kadarının platformdan, ne kadarının hücre hattından, ilaç dozundan veya referans yönteminden kaynaklandığı mevcut çalışmayla ayrıştırılamaz.

Canlı–ölü boyaması nasıl yapıldı?

HCT-116 sferoidlerinde canlı hücreler Calcein-AM ile yeşil, ölü hücreler SYTOX Orange ile turuncu gösterilmiştir.

HT-29 sferoidlerinde ise Calcein-AM ve propidyum iyodür kullanılmıştır.

Bu boyamalar deney sonunda empedans sonuçlarını doğrulamak amacıyla yapılmıştır. Bazı sferoidler MEA üzerinde doğrudan, bazıları MEA’dan çıkarıldıktan sonra boyanmıştır.

Boyama yönteminin örnekler arasında farklı olması, canlılık ölçümüne ek değişkenlik katabilir. Ayrıca transfer sırasında parçalanan sferoidlerin analiz dışı bırakılması, en fazla zarar görmüş örneklerin sonuçlarda temsil edilmemesine yol açabilir.

Empedans ile canlılık aynı şey midir?

Hayır. Empedans fizyolojik duruma duyarlı olmakla birlikte doğrudan canlılık yüzdesi değildir.

Yüksek empedans şu durumlarla ilişkili olabilir:

• Yoğun hücre kütlesi
• Sağlam hücre zarları
• Güçlü hücre-hücre bağlantıları
• Elektrota sıkı tutunma
• İki elektrodun da sferoid tarafından örtülmesi

Düşük empedans ise:

• Hücre ölümü
• Membran geçirgenliğinin artması
• Elektrottan ayrılma
• Sferoidin yer değiştirmesi
• Sferoid-elektrot arasına sıvı girmesi
• Sferoidin parçalanması

gibi farklı nedenlerle oluşabilir.

Dolayısıyla çalışma empedansın canlılıkla ilişkili olduğunu göstermektedir; fakat belirli bir RIC değerinin kesin olarak belirli bir canlılık yüzdesine karşılık geldiğini gösteren kalibrasyon denklemi sunmamaktadır.

K-means sınıflandırmasının performansı ölçüldü mü?

Çalışma, elektriksel sınırların mikroskop görüntüleriyle genel olarak örtüştüğünü göstermektedir. Ancak otomatik sınıflandırma için şu ölçüler verilmemiştir:

• Duyarlılık
• Özgüllük
• Doğru sınıflandırma oranı
• Yanlış pozitif ve yanlış negatif sayısı
• ROC eğrisi
• Alan altı değer
• Bağımsız test veri seti

Bu nedenle algoritmanın “kesin” sınıflandırma doğruluğu hesaplanamamaktadır. Yöntem elektriksel ve görsel uyum göstermiştir; fakat standart makine öğrenmesi doğrulama ölçütleriyle tam performans analizi sunulmamıştır.

K-means’in temel varsayımı

Algoritma RIC değerlerini iki kümeye ayırmaktadır. Bu yaklaşım, veride örtülü ve örtüsüz elektrotları temsil eden yeterince ayrılabilir iki popülasyon bulunduğunu varsayar.

Aşağıdaki durumlarda iki kümeli yapı zayıflayabilir:

• Sferoid elektrotlara çok zayıf tutunmuşsa
• Örtülü ve örtüsüz elektrotların RIC değerleri büyük ölçüde örtüşüyorsa
• Sferoid çok küçükse
• Elektrotların çoğu aynı fiziksel durumda kalıyorsa
• Gürültü veya referans kayması yüksekse
• İlaç etkisi ilk eşik belirleme zamanından önce başlamışsa

Yazarlar sonuç bölümünde eşik doğruluğunun veri dağılımına, sferoidin tutunmasına ve yerleştirmeden sonraki zamana bağlı olduğunu çalışmanın temel sınırlılığı olarak kabul etmiştir.

Çalışma gerçekten tamamen optiksiz mi?

Geliştirilen algoritma elektrot örtülmesini empedans verisinden belirleyerek gelecekte optik doğrulama gereksinimini azaltmayı amaçlamaktadır.

Bununla birlikte mevcut deneyde:

• Sferoidler mikroskop altında elektrotlara yerleştirilmiştir.
• Başlangıçta parlak alan görüntüleri alınmıştır.
• Elektriksel sınırlar optik görüntülerle karşılaştırılmıştır.
• Deney sonunda floresan canlı–ölü görüntüleri kullanılmıştır.

Dolayısıyla çalışma tamamen optiksiz bir süreç göstermemiştir. Elektriksel yöntemin optik görüntülemeye olan bağımlılığı azaltabileceğini gösteren bir yöntem geliştirme aşamasındadır.

Yüksek verimli tarama gösterildi mi?

Sistem çok kanallı ve otomatik eşik üretebildiği için yüksek verimli ilaç taramasına uyarlanabilir. Ancak mevcut deneylerde her MEA üzerinde sınırlı sayıda sferoid izlenmiş ve ticari çok kuyucuklu, yüzlerce örneği aynı anda değerlendiren tam otomatik bir tarama sistemi gösterilmemiştir.

Bu nedenle “yüksek verimli tarama kapasitesi” mevcut cihazın doğrudan kanıtlanmış üretim hızı değil, sistemin gelecekte ölçeklenebilecek bir özelliğidir.

Çalışmanın güçlü yönleri

• Etiketsiz ölçüm: Günlük empedans kaydı için floresan veya kimyasal etiket gerekmemektedir.
• Örneği bozmayan yaklaşım: Aynı sferoid zaman içinde tekrar ölçülebilmektedir.
• Çok frekanslı veri: Tek frekans yerine 100 Hz–1 MHz spektrum kaydedilmiştir.
• Yüksek uzamsal çözünürlük: Çok sayıda küçük elektrot, sferoidin elektriksel haritasını üretmiştir.
• İki MEA platformu: Yöntem hem cam hem de ağ tabanlı sistemde denenmiştir.
• İki kolorektal kanser hücre hattı: HCT-116 ve HT-29 Navitoclax deneylerinde kullanılmıştır.
• Geniş eşik veri seti: 74 sferoid ve 2.422 elektrot çifti değerlendirilmiştir.
• Uyarlanabilir eşik: Her sferoidin elektriksel dağılımına göre ayrı eşik üretilmiştir.
• Uzamsal ve zamansal izleme: Isı haritası ile zaman serisi aynı sistemde birleştirilmiştir.
• Terminal biyolojik doğrulama: Canlı–ölü boyaması empedans değişimiyle birlikte değerlendirilmiştir.
• İlaç etkisindeki gecikme gösterilmiştir: Navitoclax etkisinin ilk gün sınırlı, sonraki günlerde daha belirgin olduğu görülmüştür.
• Açıklanabilir algoritma: K-means ve küme merkezi ortalaması, kara kutu modelden daha kolay yorumlanabilir.

Çalışmanın sınırlılıkları

• Hakem değerlendirmesi yoktur: Çalışma SSRN preprintidir.
• Klinik çalışma değildir: Hasta tümörü, hasta tedavi yanıtı veya klinik sonuç incelenmemiştir.
• Sınırlı ilaç çeşitliliği: Yalnızca Navitoclax değerlendirilmiştir.
• Doz–yanıt analizi yoktur: Her hücre hattında tek Navitoclax konsantrasyonu kullanılmıştır.
• İki CRC hücre hattı: İlaç izleme sonuçları HCT-116 ve HT-29 ile sınırlıdır.
• Hasta kaynaklı organoid yoktur: Genetik ve klinik tümör heterojenliği temsil edilmemiştir.
• İmmün mikroçevre yoktur: T hücreleri, makrofajlar, damar hücreleri ve stromal bileşenler ilaç deneylerinde birlikte değerlendirilmemiştir.
• Empedans canlılığa özgü değildir: Tutunma, biçim ve elektrot aralığı sinyali değiştirebilir.
• Canlılık kalibrasyonu yoktur: RIC’den doğrudan canlı hücre yüzdesi hesaplayan model geliştirilmemiştir.
• Sınıflandırma doğruluğu raporlanmamıştır: Duyarlılık, özgüllük ve ROC değerleri bulunmamaktadır.
• Bağımsız dış doğrulama yoktur: Algoritma başka laboratuvarın bağımsız kör veri setinde test edilmemiştir.
• K-means iki kümeyi varsayar: Örtülü ve örtüsüz dağılımlar ayrışmadığında eşik güvenilirliği azalabilir.
• Eşik zamana bağlıdır: Cam ve ağ MEA’da farklı zaman noktaları kullanılmıştır.
• Başlangıç elektrotları sabitlenmiştir: Sferoid büyüdüğünde yeni örtülen elektrotlar zaman serisine eklenmemiştir.
• Tek sferoid analizinde psödoreplikasyon riski vardır: Aynı sferoide ait elektrot çiftleri bağımsız n olarak gösterilmiştir.
• Tekrarlı ölçüm yöntemi açıklanmamıştır: Zaman içi bağımlılık için karma model raporlanmamıştır.
• Zaman noktası örnek sayıları belirsizdir: Şekil 5’te “n = 16 başlangıçta” denmiş, sonraki zamanlardaki kesin n verilmemiştir.
• Cam ve ağ platformları doğrudan karşılaştırılamaz: Hücre hattı, ilaç dozu, referans ve elektrot aralığı farklıdır.
• Transfer kaynaklı dışlama vardır: Parçalanan sferoidler canlılık analizinden çıkarılmıştır.
• Canlılık boyama protokolü değişkendir: Bazı örnekler MEA üzerinde, bazıları çıkarıldıktan sonra boyanmıştır.
• Özel oda boyutları tutarsızdır: 2,6 mm ve 8 mm değerleri birbiriyle uyuşmamaktadır.
• RIC değişken tanımları belirsizdir: Z değerleri bazı cümlelerde empedans yerine RIC olarak yazılmıştır.
• Sınır doldurma yöntemi net değildir: Isı haritası için kullanılan görsel interpolasyon ayrıntılı açıklanmamıştır.
• Hücre modeli sayımı tutarsızdır: “Beş tip” ifadesiyle listelenen altı kategori uyuşmamaktadır.
• Ölçek birimi hatası vardır: Mikroskopi ölçekleri µm yerine µM biçiminde yazılmıştır.
• Veri ve kod açık değildir: Verilerin talep üzerine paylaşılacağı belirtilmiş, özel Python kodları kamuya açık depo üzerinden verilmemiştir.
• Yüksek verim potansiyel düzeydedir: Çok kuyucuklu büyük ölçekli otomatik ilaç taraması doğrudan gösterilmemiştir.

Çalışma ne söylüyor?

• Üç boyutlu sferoidler mikroelektrot dizileri üzerinde ölçülebilir empedans değişikliği oluşturmaktadır.
• En belirgin değişiklikler 1–100 kHz aralığında görülmektedir.
• Sferoidle doğrudan temas eden elektrot çiftleri daha yüksek RIC göstermektedir.
• Elektriksel ısı haritası sferoidin elektrot üzerindeki temas alanını gösterebilmektedir.
• K-means, yüksek ve düşük RIC kümelerini otomatik ayırabilmektedir.
• Her sferoid için uyarlanan eşik, elle eşik seçme gereksinimini azaltmaktadır.
• Tedavisiz HCT-116 ve HT-29 sferoidlerinde empedans genel olarak kararlı kalmıştır.
• Navitoclax uygulaması sonrasında empedans zamanla azalmıştır.
• Empedans düşüşüne terminal canlılık azalması eşlik etmiştir.
• Navitoclax etkisi hemen değil, yaklaşık bir–iki günlük gecikmeden sonra belirginleşmiştir.
• Ağ MEA, sferoidin daha küresel kalmasına ve daha yüksek sinyal oluşmasına katkı sağlayabilir.
• Yöntem gelecekte otomatik ve yüksek kapasiteli preklinik tarama sistemlerine uyarlanabilir.

Çalışma ne söylemiyor?

• Sistemin insanlarda kanser tanısı koyabildiğini göstermemektedir.
• Bir hastanın hangi ilaca yanıt vereceğini klinik olarak öngördüğünü göstermemektedir.
• RIC değerinin doğrudan canlı hücre yüzdesi olduğunu göstermemektedir.
• Düşük empedansın her zaman yalnızca hücre ölümünden kaynaklandığını kanıtlamamaktadır.
• K-means sınıflandırmasının bütün sferoid tiplerinde hatasız çalıştığını göstermemektedir.
• Optik mikroskopinin veya son nokta testlerinin tamamen gereksiz olduğunu göstermemektedir.
• Navitoclax’ın kolorektal kanser hastalarında etkili olduğunu kanıtlamamaktadır.
• Cam MEA’dan ağ MEA’nın kesin olarak üstün olduğunu gösteren eşlenmiş karşılaştırma sunmamaktadır.
• Tek bir empedans eşiğinin bütün cihazlarda kullanılabileceğini göstermemektedir.
• Yöntemin enfeksiyon, immünoterapi, radyoterapi veya bütün ilaç sınıflarında doğrulandığını göstermemektedir.
• Sistemin klinik laboratuvarda veya hastanede kullanıma hazır olduğunu göstermemektedir.
• Yüzlerce ya da binlerce sferoidin aynı anda tarandığı tam ölçekli bir yüksek verim sistemi göstermemektedir.

Geçmiş açısından önemi

Hücre-elektrot empedans ölçümleri uzun süredir iki boyutlu hücre tabakalarının tutunmasını, çoğalmasını ve ölümünü izlemek için kullanılmaktadır. Ancak üç boyutlu sferoidler, düz hücre tabakalarından daha karmaşık bir temas geometrisine sahiptir.

Sferoidin yalnızca küçük bir bölümü elektrota doğrudan temas eder. Alt yüzey düzensizdir ve elektrot ile hücreler arasında farklı kalınlıklarda kültür sıvısı kalabilir. Bu nedenle iki boyutlu kültürlerde kullanılan tek elektrot veya tek eşik yaklaşımı üç boyutlu modellerde yeterli olmayabilir.

Bu çalışma, çok sayıda küçük elektrot ve sferoide özgü uyarlanabilir eşik kullanarak bu geometrik soruna yaklaşmaktadır.

Bugün açısından önemi

İlaç geliştirme sürecinde bir sferoidin yalnızca deneyin sonunda canlı olup olmadığını bilmek sınırlı bilgi sağlar. İlacın:

• etki göstermeye ne zaman başladığı,
• ilk gün etkisiz görünüp daha sonra etkili olup olmadığı,
• sferoidin merkez ve çevresini aynı biçimde etkileyip etkilemediği,
• fizyolojik bozulmanın mikroskopik görünümden önce başlayıp başlamadığı

da önemlidir.

Elektriksel zaman serisi, Navitoclax’ın ilk saatlerde sınırlı değişim oluşturduğunu ve daha belirgin düşüşün 30–48 saatten sonra ortaya çıktığını göstermiştir. Bu tür zaman bilgisi yalnızca deney sonundaki tek bir canlılık testiyle elde edilemez.

Gelecek açısından önemi

Yöntemin daha güçlü bir preklinik platforma dönüşebilmesi için gelecekte şu çalışmalar gereklidir:

• Bağımsız ve kör doğrulama veri setleri
• Optik görüntülerden elde edilen gerçek temas alanıyla nicel karşılaştırma
• Duyarlılık, özgüllük ve ROC analizi
• RIC ile canlılık yüzdesi arasında kalibrasyon modelleri
• Birden fazla ilaç ve geniş doz–yanıt deneyleri
• Farklı ölüm mekanizmalarının ayrıştırılması
• Hasta kaynaklı tümör organoidleri
• Fibroblast, bağışıklık ve damar hücresi içeren ortak kültürler
• Tekrarlı ölçümler için karma etkili istatistiksel modeller
• Daha yüksek yoğunluklu CMOS mikroelektrot dizileri
• Yatay ve dikey komşu elektrot ölçümlerinin birlikte kullanılması
• Üç boyutlu elektriksel tomografiye yaklaşan uzamsal rekonstrüksiyon
• Sferoidin büyümesiyle yeni örtülen elektrotları dinamik olarak modele ekleyen algoritmalar
• Otomatik sıvı işleme ve çok kuyucuklu sistemlerle entegrasyon
• Kod ve ham verilerin açık erişimli olarak paylaşılması
• Kişiselleştirilmiş immünoterapi yanıtının değerlendirilmesi

Gündelik yaşam ve kanser araştırması açısından anlamı

Çalışmanın gündelik yaşama doğrudan etkisi henüz sınırlıdır; yöntem bir klinik cihaz değil, laboratuvar araştırma platformudur.

Uzun vadede bu tür sistemlerin temel yararı, potansiyel ilaçların üç boyutlu tümör modellerinde daha erken ve daha ayrıntılı değerlendirilmesi olabilir. Başarısız ilaç adaylarının erken aşamada elenmesi, daha umut verici adayların seçilmesi ve hasta kaynaklı modellerde kişiye özgü yanıtların incelenmesi hedeflenebilir.

Bununla birlikte mevcut çalışma, bir hastadan alınan tümörün sisteme konularak doğru ilacın seçilebildiğini göstermemektedir. Bu kullanım, araştırmacıların geleceğe yönelik öngördüğü bir geliştirme alanıdır.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Araştırma tasarımının teknik özeti

Mikroelektrot sistemlerinin teknik özellikleri

EIS kayıt parametreleri

RIC ve eşik formülleri

\[ \mathrm{RIC} = \frac{Z_s-Z_{ref}} {Z_s+Z_{ref}} \times100\% \]

\[ \mathrm{maxRIC}_i = \max_{1\,\mathrm{kHz}\le f\le100\,\mathrm{kHz}} \mathrm{RIC}_i(f) \]

\[ T = \operatorname{round} \left( \frac{C_0+C_1}{2} \right) \]

Burada:

• Z_s: sferoidli ölçüm empedansı
• Z_ref: referans empedans
• maxRIC_i: i elektrot çiftinin 1–100 kHz arasındaki en yüksek RIC değeri
• C₀ ve C₁: K-means küme merkezleri
• T: örtülü ve örtüsüz elektrotları ayıran otomatik eşik

anlamına gelmektedir.

Otomatik analiz basamakları

1. Her elektrot çifti için 100 Hz–1 MHz empedans spektrumu kaydedildi.
2. Referansa göre RIC spektrumu hesaplandı.
3. 1–100 kHz aralığındaki maksimum RIC seçildi.
4. En yüksek %5’lik uç değerlerin eşik eğitimindeki etkisi azaltıldı.
5. K-means ile değerler iki kümeye ayrıldı.
6. Küme merkezlerinin ortası otomatik eşik olarak belirlendi.
7. Eşik özgün, kırpılmamış veri setine uygulandı.
8. Eşik üzerindeki elektrotlar sferoidle örtülü sınıflandırıldı.
9. Başlangıçta örtülü bulunan elektrotların RIC değerleri zaman boyunca izlendi.
10. Deney sonunda floresan canlılık testiyle biyolojik doğrulama yapıldı.

Örnek sferoidin elektriksel dağılımı

74 sferoidlik eşik veri seti

Temsilî HCT-116 sferoid sonuçları

HCT-116 popülasyon analizi

HT-29 ağ MEA sonuçları

Kullanılan istatistiksel yaklaşım

• Normallik: Shapiro–Wilk testi
• Varyans homojenliği: Levene testi
• Parametrik grup karşılaştırması: Tek yönlü ANOVA
• Parametrik olmayan karşılaştırma: Kruskal–Wallis testi
• ANOVA sonrası: Tukey HSD
• Kruskal–Wallis sonrası: Dunn testi
• Anlamlılık sınırı: p < 0,05

Zaman içinde aynı sferoidin tekrar ölçülmesi nedeniyle tekrarlı ölçüm yapısı bulunmaktadır. Bununla birlikte yöntem bölümünde tekrarlı ölçüm ANOVA’sı, eşleştirilmiş analiz veya karma etkili model açıkça belirtilmemiştir.

Şekillerin birlikte anlattığı temel sonuç

1. Şekil 1: Sferoid üretimini, cam ve ağ MEA sistemlerini ve canlılık doğrulamasını göstermektedir.
2. Şekil 2: Sferoidle örtülü elektrotlarda daha yüksek RIC oluştuğunu ve elektriksel haritanın optik konumla örtüştüğünü göstermektedir.
3. Şekil 3: Kontrol sferoidinde kararlı, Navitoclax sferoidinde azalan elektriksel ayak izini göstermektedir.
4. Şekil 4: Tek sferoid örneklerinde RIC değişimini %91 ve %28 terminal canlılıkla karşılaştırmaktadır.
5. Şekil 5: HCT-116 popülasyonunda kontrol ve 25 µM Navitoclax yanıtını 80 saate kadar göstermektedir.
6. Şekil 6: HT-29 sferoidlerinde merkez ve çevre elektrot farkını ve ağ MEA’daki 10 µM Navitoclax yanıtını göstermektedir.

Teknik olarak en önemli sonuç

Çalışmanın en önemli teknik katkısı, sferoidin elektrot üzerinde hangi noktalarla gerçek temas kurduğunu her deney için ayrı olarak belirleyen otomatik eşik yöntemidir.

Bu yaklaşım:

• tek bir sabit eşik kullanmamakta,
• her sferoidin başlangıç RIC dağılımını incelemekte,
• değerleri düşük ve yüksek RIC kümelerine ayırmakta,
• yalnızca başlangıçta sferoidle temas eden elektrotları zaman içinde takip etmektedir.

Böylece sferoidin fiziksel konumu ve ilaç sonrası elektriksel bozulması aynı veri akışı içinde ölçülebilmektedir.

Ancak sistem henüz canlılığı doğrudan ölçen klinik bir test değildir. En doğru tanım, sferoid-elektrot temasını ve canlılıkla ilişkili fizyolojik değişimleri etiket kullanmadan izleyen otomatik preklinik empedans platformudur.

Kaynak ve Yöntem Notu

Bu içerik, Ahmed Khattab, Ruth Grabowski, Ha Un Chung, Tobias Schmidt, Mai Thu Bui, Christian Schmees ve Günther Michael Zeck tarafından hazırlanan “Automated Viability Assessment of Tumor Spheroids via Electrical Impedance Spectroscopy” başlıklı çalışmaya dayanmaktadır.

Çalışma; insan kaynaklı HCT-116 ve HT-29 kolorektal kanser hücrelerinden oluşturulan üç boyutlu sferoidleri, cam ve poliimid ağ tabanlı mikroelektrot dizilerini, elektriksel empedans spektroskopisini, K-means kümelemeyi ve Navitoclax müdahalesini birleştiren preklinik in vitro biyosensör ve yöntem geliştirme araştırmasıdır.

İnsanlarda yürütülmüş klinik çalışma değildir. Hasta tümörü, kanser hastası, klinik tedavi sonucu, sağkalım veya kişiselleştirilmiş ilaç seçimi verisi bulunmamaktadır.

Metinde açıkça “This preprint research paper has not been peer reviewed” ve “Preprint not peer reviewed” ifadeleri bulunmaktadır. Dolayısıyla çalışma hakem değerlendirmesinden geçmemiştir.

Sayfa üst bilgisinde “Biosensors and Bioelectronics, Vol. X, No. X (2026)” yazmaktadır. Ancak cilt ve sayı alanlarının X olarak kalması, DOI ve kabul tarihinin bulunmaması nedeniyle bu ifade nihai yayımlanmış makale veya dergi kabulü olarak değerlendirilemez.

Çalışmanın Avusturya Araştırma Teşvik Ajansı tarafından 895365 numaralı proje ve Almanya Federal Ekonomi ve İklim Koruma Bakanlığı tarafından KK5046205AJ2 numaralı proje kapsamında desteklendiği belirtilmiştir. Yazarlar bilinen mali çıkar çatışması veya kişisel ilişki bildirmemiştir.

Verilerin makul talep üzerine paylaşılacağı belirtilmiş; özel Python analiz kodları ve ham empedans verileri için açık erişimli bir depo bağlantısı verilmemiştir.

K-means yaklaşımı 74 sferoid ve 2.422 elektrot çiftinden elde edilen RIC dağılımlarıyla geliştirilmiştir. Ancak sınıflandırma için duyarlılık, özgüllük, ROC eğrisi veya bağımsız dış doğrulama sonuçları sunulmamıştır.

Empedans değişikliği hücre canlılığıyla ilişkili olmakla birlikte yalnızca canlılığı ölçmez. Sferoidin elektrota tutunması, biçimi, büyüklüğü, elektrotla arasındaki sıvı boşluğu ve elektrot çiftinin örtülme oranı da RIC değerini etkileyebilir.

Cam ve ağ MEA sonuçları farklı hücre hatları, farklı Navitoclax dozları, farklı elektrot aralıkları ve farklı referans hesaplarıyla elde edilmiştir. Bu nedenle iki platform arasında kesin üstünlük karşılaştırması yapılamaz.

Tek sferoid örneklerinde elektrot çiftleri n değeri olarak kullanılmıştır. Aynı sferoide ait elektrot çiftleri bağımsız biyolojik tekrar olmadığı için bu sonuçların istatistiksel yorumunda dikkatli olunmalıdır.

Özel SLA odasının boyutları, RIC değişkenlerinin bazı tanımları, hücre modeli kategorilerinin sayısı ve mikroskopi ölçek birimleri PDF içinde açıklık gerektiren raporlama sorunları içermektedir.

Bu makale yalnızca yüklenen PDF’deki yöntemler, formüller, grafikler, mikroskopi görüntüleri, elektriksel ısı haritaları, canlılık sonuçları ve yazarların yorumlarına dayanılarak hazırlanmıştır. PDF’de bulunmayan klinik tanı doğruluğu, hasta tedavi başarısı, Navitoclax etkinliği, kesin canlılık tahmini veya yüksek verimli ticari kullanım iddiası eklenmemiştir.