Xərçəng dərmanlarının laboratuvar ortamında dəyərlendirilmesinde kullanılan klasik ikiölçülü hüceyrə kültürleri, hüceyrələri düz bir yüzey üzerinde büyütür. Bu sistemler kolay uygulanabilmelerine rağmen gerçek şiş dokusundaki oksijen, besin, metabolik atık və hüceyrə-hüceyrə etkileşimi gradyanlarını yeterince temsil etmeyebilir. Üç boyutlu şiş sferoidleri ise hüceyrələrin küresel bir doku benzeri yapı oluşturmasını sağlayarak şiş mikroçevresinin bazı özelliklerini daha gerçekçi biçimde yansıtır.

Üç boyutlu modellerin mühüm bir dezavantajı, canlılıqlarının və ilaç yanıtlarının zaman içində sürekli izlenmesinin güç olmasıdır. Parlak alan mikroskopiyasi sferoidin biçimini və büyüklüğünü gösterebilir; ancak hüceyrə zarının bütünlüğü, hüceyrələrin elektrolit akışına karşı oluşturduğu bariyer veya hüceyrə-elektrod temasındaki fizyolojik değişiklikler hakkında sınırlı bilgi verir. Canlı–ölü boyaması gibi son nokta testleri ise çoğunlukla yalnız təcrübəin belirli bir anındaki durumu gösterir və eyni örneğin daha sonra izlenmesini engelleyebilir.

Bu tədqiqat, üçölçülü şiş sferoidlerini etiket kullanmadan və dokuyu parçalamadan izlemek amacıyla elektrik impedansı spektroskopiyasıni mikroelektrod dizileriyle birleştirmiştir. Sistem, sferoidin örttüğü elektrod çiftlerini avtomatik kimi belirlemek üçün nəzarətsiz maşın öyrənməsi yöntemlerinden K-means klasterləşdirməyi kullanmaktadır.

Əsas ölçmə mantığı şöyledir:

• Sferoid elektrodların üzerine yerleştiğinde iyonların akım yolu değişir.
• Hücre zarları və hüceyrə-elektrod aralığı elektriksel bir bariyer oluşturur.
• Elektrot çiftleri arasındaki impedans özellikle 1–100 kHz aralığında yükselir.
• Hücreler öldüğünde, küçüldüğünde, birbirinden ayrıldığında veya elektrod temasını kaybettiğinde impedans azalır.

Tədqiqatda HCT-116 və HT-29 insan kolorektal xərçəng hüceyrələrindən sferoidler oluşturulmuştur. Her sferoid, 1.000 hüceyrənin U tabanlı 96 kuyucuklu plakalarda üç gün kültüre edilmesiyle üretilmiş və yaklaşık 200–300 µm çapa ulaştıktan sonra mikroelektrod dizilerinin üzerine aktarılmıştır.

İki fərqli mikroelektrod sistemi istifadə edilmişdir:

Empedans ölçmələri 100 Hz–1 MHz tezlik aralığında, 100 tezlik basamağıyla və ±10 mV sinüzoidal uyarım kullanılarak yapılmıştır. Sferoidlerin elektrod yüzeyine tutunması üçün 2–5 saat beklendikten sonra başlanğıc ölçməü alınmış, daha sonra günlük kayıtlarla təcrübələr 80 saate kadar sürdürülmüştür.

Tədqiqatda elektriksel değişimi standartlaştırmak üçün değiştirilmiş göreli impedans değişimi, yani RIC istifadə edilmişdir:

\[ \mathrm{RIC} = \frac{Z_s-Z_{ref}} {Z_s+Z_{ref}} \times 100\% \]

Burada:

• Z_s, sferoid bulunan ölçmədeki impedansı,
• Z_ref, referans durumdaki impedansı

temsil etmektedir.

Bu denklem, farkı iki dəyərin toplamına böldüğü üçün ölçməü teorik kimi −%100 ilə +%100 arasında sınırlar. Pozitif və yüksək RIC, sferoid-elektrod temasının impedansı referansa görə artırdığını gösterir.

Lakin yöntem metninde Z_s və Z_ref bazı cümlelerde “RIC” kimi tanımlanmıştır. Denklemde bu değişkenlerin impedans olması gerekirken metinde impedans ilə RIC terminolojisi birbirine karışmıştır. Bu raporlama sorunu formülün yeniden uygulanması baxımından açıklık gerektirmektedir.

İlk örnek sferoidde 30 komşu elektrod çifti araşdırılmışdır. Sferoidi örten beş elektrod çiftinde maksimum RIC dəyərləri %29–58 arasında; yalnız kultura mühitiyla temas eden 25 çiftte ise çoğunlukla %10’un altında tapılmışdır. Tədqiqatçılar bu örnek üçün elle %16 hədd seçmiş və optik görüntüyle elektriksel sınıflandırmanın genel kimi örtüştüğünü göstərmişdir.

Daha sonra her sferoid üçün eşiğin insan tarafından seçilmesini ortadan kaldırmak amacıyla K-means klasterləşdirmə istifadə edilmişdir. Maksimum RIC dəyərləri iki kümeye ayrılmıştır:

• Sferoid tarafından örtülmeyen elektrod çiftleri
• Sferoidle birbaşa temas eden elektrod çiftleri

Küme merkezleri C₀ və C₁ kimi tanımlandığında avtomatik hədd:

\[ T = \operatorname{round} \left( \frac{C_0+C_1}{2} \right) \]

kimi hesablanmışdır.

Tədqiqatçılar hədd geliştirme analizini 74 sferoid və 2.422 elektrod çifti üzerinde dəyərlendirmiştir. Bu veri setinde HCT-116, HT-29, insan dermal fibroblastları, U87 MG glioblastoma hüceyrələri və iki fərqli ortak kültür modeli yer almıştır.

Metin bir yerde “beş fərqli tip və bir karışım” ifadesini kullanmasına rağmen listelenen qruplar dörd tek hüceyrə modeli ilə iki ortak kültür olmak üzere toplam altı kategoridir. Bu, yöntem anlatımındaki kiçik fakat mühüm bir sayım tutarsızlığıdır.

Toplu paylanmada yalnız kultura mühitiyla temas eden elektrodların maksimum RIC dəyərləri çoğunlukla %15–20 aralığında yoğunlaşmıştır. Sferoidle örtülü elektrodlarda ise paylanma %20–35 aralığında bir tepe oluşturmuş və yaklaşık %80’e kadar uzanmıştır. İki paylanmaın qismən örtüşmesi, bütün sferoidlere uygulanacak tek sabit hədd yerine her sferoid üçün uyarlanan bir hədd kullanılmasının niyəini göstərir.

Sistem HCT-116 sferoidlerinde 25 µM Navitoclax, HT-29 sferoidlerinde ise 10 µM Navitoclax yanıtını izlemiştir. Navitoclax, tədqiqatda hüceyrə ölümünü başlatmak üçün kullanılan təcrübəsel sitotoksik müdahaledir.

Cam MEA üzerindeki örnek HCT-116 təcrübəinde:

• Tedavisiz sferoidin impedans profili 48 saat boyunca böyük ölçüde korunmuştur.
• Kontrol sferoidinin son canlılığı %91 kimi ölçülmüşdür.
• 25 µM Navitoclax uygulanan sferoidde RIC zamanla azalmışdır.
• Toplam zaman etkisi üçün p = 0,006 bildirilmişdir.
• 2–5 saat ilə 17–26 saat arasında anlamlı fark görülmemiştir: p = 0,515.
• 17–26 saat ilə 30–48 saat arasında anlamlı düşüş oluşmuştur: p = 0,049.
• Tedavi edilen örneğin 48. saatteki canlılığı %28’e azalmışdır.

Daha geniş HCT-116 analizinde 16 nəzarət və başlangıçta 16 Navitoclax uygulanmış sferoid 80 saate kadar izlenmiştir. Kontrollerde impedans zamanla hafif yükselmiş, ancak farklar statistik kimi anlamlı bulunmamıştır. Kontrol sferoidlerinin canlılığı son zaman noktasına kadar genel kimi %80’in üzerinde kalmıştır.

Navitoclax qrupunda impedans düşüşü 30–48 saat aralığında belirginleşmiş və 60–80 saatte en güçlü düzeye ulaşmıştır. Son zaman noktasında ortalama canlılıq yaklaşık %20’ye gerilemiştir. Bununla belə şekil açıklamasında canlılıq zaman noktaları arasındaki farkların statistik kimi anlamlı olmadığı qeyd edilmişdir. Bu səbəbdən elektrik impedansı düşüşü statistik kimi güçlü görünürken, terminal canlılıq ölçmələri eyni güçte zaman karşılaştırması sağlamamıştır.

Ağ yapılı MEA üzerindeki HT-29 sferoidlerinde, sferoidin merkezinde iki elektrodun da hüceyrələrlə örtüldüğü çiftlerde RIC yaklaşık %90’a ulaşırken, yalnız bir elektrodun örtüldüğü çevresel çiftlerde yaklaşık %60 düzeyinde kalmıştır. Bu nəticə, ölçülen sinyalin yalnız hüceyrə varlığından deyil, elektrod çiftinin ne ölçüde birbaşa hüceyrələrlə temas ettiğinden de etkilendiğini göstərir.

Ağ MEA təcrübələrinde:

• Kontrol qrupu n = 5 sferoidden oluşmuştur.
• 10 µM Navitoclax qrupu n = 4 sferoidden oluşmuştur.
• Kontrol RIC dəyəri ilk gün yükselmiş və daha sonra böyük ölçüde kararlı kalmıştır.
• Navitoclax qrupunda düşüş ikinci günden sonra belirginleşmiştir.
• 60–80 saatte maksimum RIC yaklaşık %40’ın altına inmiştir.
• 17–26 saat ilə 60–80 saat arasındaki düşüş üçün p < 0,001 bildirilmişdir.

Tədqiqatnın əsas sonucu, mikroelektrod dizileriyle ölçülen impedansın sferoidin elektrod yüzeyindeki temasını və zaman içindeki fizyolojik değişimini izleyebildiğidir. K-means alqoritmsı ise hangi elektrodların sferoidle temas ettiğini avtomatik kimi belirleyerek insan tarafından hədd seçme gereksinimini azaltmışdır.

Bununla belə impedans birbaşa və yalnız “canlı hüceyrə faizi” ölçmez. Ölçüm şu faktörlerin tümünden etkilenebilir:

• Hücre zarının bütünlüğü
• Sferoidin elektroda yapışma kuvveti
• Hücreler arası bağlantılar
• Sferoidin büyüklüğü və biçimi
• Elektrot ilə sferoid arasındaki sıvı boşluğu
• Sferoidin elektrod üzerindeki konumu
• Kültür ortamının elektriksel özellikleri

Buna görə RIC düşüşü hüceyrə ölümüne eşlik edebilir; ancak yalnız RIC dəyərinden kesin canlı hüceyrə faizi hesaplanamaz. Tədqiqat bunu terminal canlı–ölü flüoresan boyamalarıyla desteklemiş, fakat nicel bir canlılıq tahmin modeli veya klinik doğruluk testi geliştirmemiştir.

Tədqiqatnın əsas problemi nədir?

Xərçəng dərmanlarının etkisini laboratuvar ortamında tədqiqatk üçün kullanılan modelin, gerçek şişü yeterince temsil etmesi gerekir. İki boyutlu kültürlerde hüceyrəler düz bir plastik veya cam yüzeyde tek tabaka halinde büyür. Bu ortamda hemen hemen bütün hüceyrəler benzer düzeyde oksijen, besin və ilaca maruz kalır.

Gerçek şişlerde və üçölçülü sferoidlerde ise durum farklıdır:

• Dış katmanlar daha fazla oksijen və besin alır.
• Merkeze doğru oksijen azalabilir.
• Metabolik atıklar iç bölgelerde birikebilir.
• İlaçların doku içine geçişi sınırlı ola bilər.
• Merkezde hipoksik veya nekrotik alanlar gelişebilir.
• Hücre-hüceyrə və hüceyrə-matriks etkileşimleri dərman cavabını değiştirebilir.

Bu səbəbdənrle üçölçülü şiş sferoidleri, ikiölçülü kültürlerden daha karmaşık və biyolojik kimi daha gerçekçi bir preklinik model yarada bilər.

Lakin sferoidin fizyolojik durumunu sürekli izlemek güçtür. Mikroskopi sferoidin fiziksel görünümünü gösterir; fakat hüceyrələrin hâlâ elektriksel kimi bariyer oluşturup oluşturmadığını veya membran bütünlüğünün bozulmaya başlayıp başlamadığını erken dönemde fark etmeyebilir.

Tədqiqatnın çözmeye çalıştığı əsas problem şudur:

Üç boyutlu şiş sferoidlerinin elektrod yüzeyindeki konumu, canlılıqla ilişkili fizyolojik değişimleri və dərman cavabı, görüntülerin elle incelenmesine gerek kalmadan elektriksel kimi və avtomatik biçimde izlenebilir mi?

Elektriksel impedans spektroskopiyası nədir?

Elektriksel impedans spektroskopiyasınde biyolojik örneğe çox kiçik bir alternatif elektrik sinyali uygulanır. Sistem, fərqli tezliklarda akıma nə qədər karşı koyduğunu ölçer.

Empedans genel kimi:

\[ Z(f) = \frac{V(f)}{I(f)} \]

ilişkisiyle açıklanabilir.

Burada:

• Z(f), belirli tezliktaki impedansı,
• V(f), uygulanan gerilimi,
• I(f), ölçülen akımı,
• f, sinyal tezlikını

göstərir.

Bu əsas denklem tədqiqatda açıkça verilmemiştir; EIS yönteminin fiziksel mantığını açıklamak amacıyla eklenmiştir.

Empedans, yalnız klasik elektrik direncinden ibaret deyil. Biyolojik hüceyrə zarları kapasitif davranış gösterebilir; elektrod yüzeyi, sıvı ortam və hüceyrə-elektrod aralığı da tezlika bağlı elektriksel özellikler oluşturur.

Sferoid elektrod üzerindeyken impedans niyə yükseliyor?

Kültür ortamı iyonları taşıyabildiği üçün elektrik akımı elektrodlar arasında görece kolay ilerler. Elektrotun üzerine hüceyrə veya hüceyrə topluluğu yerleştiğinde akımın yolu qismən kapanır veya uzar.

Hücre zarları və sıkı hüceyrə toplulukları şu etkileri yarada bilər:

• İyonların birbaşa elektroda ulaşmasını sınırlandırmak
• Akımı hüceyrələrin çevresindeki daha dar sıvı yollarına yönlendirmek
• Elektrot ilə kultura mühiti arasındaki efektif kapasitansı değiştirmek
• Hücre-elektrod temasındaki elektriksel bariyeri artırmak

Bu səbəbdən sferoidle birbaşa temas eden elektrod çiftleri, yalnız kultura mühitina maruz kalan çiftlerden daha yüksək impedans gösterebilir.

Orta tezlik aralığı niyə mühüm?

Tədqiqatda en ayırt edici değişiklikler 1–100 kHz aralığında görülmüştür. RIC eğrileri bu bölgede çan biçimli bir tepe oluşturmuştur.

Tədqiqatçılar maksimum RIC dəyərini bu tezlik aralığından seçmiştir:

\[ \mathrm{maxRIC}_i = \max_{1\,\mathrm{kHz}\leq f\leq100\,\mathrm{kHz}} \mathrm{RIC}_i(f) \]

Burada i, ölçülen elektrod çiftini temsil eder.

Bu gösterim tədqiqatnın analiz mantığını açıklamak üçün düzenlenmiştir. Her elektrod çifti üçün bütün spektrumdan tek bir maksimum dəyər çıkarılmış və sınıflandırmada bu dəyər istifadə edilmişdir.

Üç boyutlu sferoidler necə oluşturuldu?

HCT-116 və HT-29 insan kolorektal xərçəng hüceyrələri ayrı kültür ortamlarında büyütülmüştür. Her kuyucuğa:

\[ 1.000\ \mathrm{hücre}/200\ \mu L \]

ekilmiştir.

U tabanlı plakalar hüceyrələrin tek bir merkezde toplanarak küresel yapı oluşturmasını kolaylaştırmıştır. Kuyucuklar yapışmayı engelleyen solüsyonla əvvəlden kaplanmış, böylece hüceyrələrin plastiğe yayılması yerine birbirine bağlanması sağlanmıştır.

Üç günlük kültür sonunda sferoidler yaklaşık 200–300 µm çapa ulaşmıştır. Daha sonra pipet ucuyla tek tek MEA üzerine aktarılmıştır.

Sferoidlerin aktarım sırasında zarar görmemesi mühümdir. Metin, bazı sferoidlerin transfer sırasında parçalandığını və bu örneklerin canlılıq analizinden çıkarıldığını belirtmektedir. Bu dışlama, özellikle kırılgan veya fazla hasarlı sferoidlerin nəticələrdan çıkarılması niyəiyle canlılıq dəyərlendirmesinde seçilim yanlılığı yarada bilər.

Sferoidler niyə 2–5 saat bekletildi?

Sferoid MEA üzerine konulduktan hemen sonra elektrodlarla kararlı temas kurmayabilir. Kültür sıvısındaki kiçik hərəkətler sferoidi yerinden oynatabilir və sferoid ilə elektrodlar arasında sıvı tabakası bulunabilir.

Bu səbəbdən ilk ölçməden əvvəl 2–5 saat beklenmiş və sferoidin elektrodlara tutunmasına izin verilmiştir. Cam MEA üzerindeki avtomatik hədd bu ilk 2–5 saatlik zaman noktasında belirlenmiştir.

Ağ MEA’da ise en güçlü tutunma və en yüksək RIC ilk günde ortaya çıktığı üçün aktif elektrodların belirlenmesinde 17–26 saatlik ölçmə istifadə edilmişdir.

Cam MEA necə yapılandırıldı?

Cam MEA’da elektrodlar 70 µm aralıkla yerleştirilmiştir. İridyum oksit elektrodların gözenekli yüzeyi və aşağı impedansı, biyolojik örneklerden hassas kayıt alınmasını kolaylaştırmaktadır.

İletken yollar silikon nitrürle elektriksel kimi yalıtılmıştır. Sferoidin elektrodlara tutunmasını artırmak üçün yüzeye:

• 0,2 mbar basınçta,
• 80 W güçte,
• iki dəqiqə

plazma işlemi tətbiq edilmişdir. Ardından cihaz distile suyla temizlenmiş və 30 dəqiqə ultraviyole ışıkla sterilize edilmiştir.

Özel SLA odası niyə üretildi?

Tədqiqatçılar sferoidin sıvı hərəkətiyle elektrod alanından uzaklaşmasını azaltmak üçün stereolitografi, yani SLA tipi üçölçülü yazıcıyla özel bir silindirik oda üretmiştir.

Lakin yöntem metninde ticari odanın çapı 2,6 mm, özel odanın çapı ise 8 mm kimi verilmiş; özel parçanın mevcut odanın içine yerleştiği söylenmiştir. Səkkiz milimetrelik bir parçanın 2,6 milimetrelik alanın içine yerleşmesi geometrik kimi mümkün görünmemektedir.

Değerlerden birinin yazım hatası olması mümkündür; fakat PDF’de hangi ölçünün doğru olduğu açıklanmamıştır. Bu səbəbdən cihazın yeniden üretilmesi üçün oda boyutları birbaşa kullanılamaz.

Ağ yapılı MEA’nın farkı nədir?

Ağ MEA, 12 µm kalınlığındaki poliimid yapı üzerine yerleştirilmiş titanyum nitrür elektrodlardan oluşmuştur. Ağ açıklıkları sayesinde kultura mühiti sferoidin yalnız üst və yan yüzeylerine deyil alt yüzeyine de daha kolay ulaşabilir.

Şekil 1’de cam MEA üzerindeki sferoidin zaman içində daha yayvan, “yarı pankek” benzeri biçime dönüştüğü; ağ MEA üzerindeki sferoidin ise küresel yapısını daha fazla koruduğu gösterilmiştir.

Hücrelerin ağın çevresine və qismən içine büyümesi, elektrodların sferoidin daha iç katmanlarına yakın kayıt alabilmesini sağlayabilir.

Şekil 1 ne izah edir?

Şekil 1, təcrübəin bütün iş akışını göstərir:

1. Kanser hüceyrələrinin U tabanlı plakalarda sferoid oluşturması
2. Sferoidlerin cam veya ağ MEA’ya aktarılması
3. Navitoclax veya çözücü nəzarətünün uygulanması
4. Fərqli zamanlarda impedans ölçməü
5. K-means ilə sferoidin örttüğü elektrodların belirlenmesi
6. Deney sonunda canlı–ölü flüoresan boyaması

Şekilde cam və ağ MEA’ların fotoğrafları, sferoidlerin parlak alan görüntüleri və təcrübə sonunda elde edilen canlı–ölü flüoresan görüntüleri birlikte verilmiştir.

Şekil açıklamasında ölçek çubuğu “200 µM” biçiminde yazılmıştır. Mikroskopi ölçek çubuğu bir uzunluk birimi olması gerektiği halde µM bir konsantrasyon birimidir. PDF’deki bu kullanım editoryal birim hatasıdır.

RIC formülünün texniki anlamı

Tədqiqatda kullanılan formül:

\[ \mathrm{RIC} = \frac{Z_s-Z_{ref}} {Z_s+Z_{ref}} \times 100 \]

şeklindedir.

Eğer sferoidli impedans referanstan yüksekse RIC pozitif olur. Örnek kimi:

\[ Z_s = 150\ \mathrm{k\Omega},\quad Z_{ref}=100\ \mathrm{k\Omega} \]

olduğunda:

\[ \mathrm{RIC} = \frac{150-100}{150+100} \times100 = 20\% \]

elde edilir.

Bu örnek yalnız formülün matematiksel anlamını göstermek üçün verilmiştir; tədqiqatdaki belirli bir elektrodun ham verisi deyil.

Referans impedans necə seçildi?

Cam MEA üçün referans, üzerinde sferoid bulunmayan və yalnız kultura mühiti bulunan ölçmə kimi tanımlanmıştır.

Ağ MEA üçün referans seçiminde fərqli bir yaklaşım istifadə edilmişdir. Bir ilə 10 kHz arasındaki en aşağı beş impedans büyüklüğünün ortalaması referans kabul edilmiştir.

İki platformda fərqli referans tanımlarının kullanılması, cam və ağ sistemlerindeki mutlak RIC dəyərlərinin birbaşa karşılaştırılmasını sınırlandırabilir.

Neden komşu elektrod çiftleri ölçüldü?

Empedans iki elektrod arasından ölçülmüşdür. Her ölçməde iki komşu və eyni büyüklükte elektrod istifadə edilmişdir. Böylece sferoidin fərqli bölgeleri boyunca çox noktalı elektriksel harita oluşturulmuştur.

Sferoidin merkezindeki iki elektrod da hüceyrələrlə örtüldüğünde ölçülen impedans, yalnız bir elektrodun örtüldüğü çevresel çiftlerden daha yüksək olmuştur.

Bu gözlem mühümdir: Empedans yalnız “sferoid var veya yok” bilgisini deyil, elektrod çiftinin sferoid altında ne ölçüde kaldığını da yansıtmaktadır.

Elle seçilen hədd necə doğrulandı?

Şekil 2’de örnek bir sferoid üçün:

• 30 elektrod çiftinin impedans spektrumları,
• RIC eğrileri,
• mikroskop görüntüsü,
• elektriksel ısı haritası,
• RIC paylanma grafiği

birlikte verilmiştir.

Sferoidle temas eden beş çiftte maksimum RIC dəyərləri %29, %33, %33, %36 və %58 kimi işaretlenmiştir. Yalnızca sıvıyla temas eden elektrodlar çoğunlukla %10’un altında kalmıştır.

Bu örnek üçün %16 hədd seçilmiştir. %16’nın üzerinde kalan elektrod çiftleri sferoidle örtülü kimi sınıflandırılmıştır.

Elektriksel ısı haritasındaki yüksək RIC bölgeleri mikroskop görüntüsündeki sferoid alanıyla böyük ölçüde örtüşmüştür. Lakin görsel kimi sferoidin altında görünen bazı elektrodlar aşağı impedans göstərmişdir. Tədqiqatçılar bunu sferoidin üçölçülü və düzensiz alt yüzeyi niyəiyle elektrodla birbaşa temas etmeyen bölgelerin bulunmasıyla açıklamıştır.

Hartigan Dip testi ne üçün kullanıldı?

Hartigan Dip testi, paylanmaın tek tepeli olup olmadığını dəyərlendiren statistik bir yöntemdir. Tədqiqatda RIC dəyərlərinin tek bir paylanmadan deyil, örtülü və örtüsüz elektrodlara karşılık gelen iki fərqli popülasyondan oluşup oluşmadığını dəyərlendirmek üçün istifadə edilmişdir.

Örnek sferoidde iki belirgin qrup görülmüştür:

• Örtüsüz elektrodlar: aşağı RIC
• Örtülü elektrodlar: yüksək RIC

Hartigan Dip testi tek başına avtomatik hədd üretmemiştir. Dağılımın çox tepeli olabileceğini göstermiş; gerçek avtomatik sınıflandırma K-means ilə yapılmıştır.

K-means klasterləşdirmə necə çalıştı?

K-means, məlumatlari benzerliklerine görə əvvəlden belirlenen sayıda kümeye ayırır. Bu tədqiqatda:

[ k = 2 ]

kimi seçilmiştir.

Amaç fonksiyonu açıklama amacıyla şöyle gösterilebilir:

\[ \underset{C_0,C_1}{\operatorname{argmin}} \sum_{j=0}^{1} \sum_{x_i \in C_j} \left\|x_i-\mu_j\right\|^2 \]

Burada:

• x_i, bir elektrod çiftinin maksimum RIC dəyərini,
• C_j, kümeyi,
• µ_j, küme merkezini

ifade eder.

Bu denklem makalede açıkça yazılmamıştır; K-means yönteminin matematiksel mantığını açıklamak amacıyla eklenmiştir.

Algoritma şu basamaklarla çalışmıştır:

1. Her maksimum RIC dəyəri en yakın küme merkezine atanmıştır.
2. Her kümenin ortalaması yeni merkez kimi hesablanmışdır.
3. Atamalar değişmeyenə qədər işlem tekrarlanmıştır.
4. İki küme merkezinin ortası hədd kabul edilmiştir.
5. Eşik, kırpılmamış özgün veriye tətbiq edilmişdir.

“Trimmed K-means” ne anlama geliyor?

Sonuç bölümünde alqoritmnın eğitim sırasında en yüksək %5’lik uç dəyərləri dışarıda bıraktığı belirtilmektedir. Amaç, birkaç aşırı yüksək elektrod dəyərinin küme merkezini və eşiği gereksiz biçimde yükseltmesini önlemektir.

Bu yaklaşım, sferoidin örttüğü alanın olduğundan kiçik sınıflandırılmasını azalda bilər. Lakin uç dəyərlərin hangi aşamada, hangi kuralla çıkarıldığı yöntem bölümünde tam kimi açıklanmamıştır.

Dinamik hədd niyə gerekliydi?

Her sferoidin:

• büyüklüğü,
• elektroda temas alanı,
• hüceyrə yoğunluğu,
• alt yüzey geometrisi,
• tutunma kuvveti

fərqli ola bilər.

Bu səbəbdən bir sferoidde %16 uygun hədd olurken başka bir sferoidde daha yüksək veya daha aşağı hədd gerekebilir. Küme merkezlerine görə hesaplanan hədd, her təcrübəin kendi elektriksel paylanmaına uyarlanmıştır.

Şekil 2F’deki 74 sferoid ne gösteriyor?

Toplam 74 sferoidden elde edilen 2.422 elektrod çiftinin paylanmaı incelendiğinde, örtüsüz elektrodların yaklaşık %15–20 RIC civarında keskin bir tepe oluşturduğu görülmüştür.

Sferoidle örtülü elektrodlarda ise:

• yaklaşık %20–35 arasında ana tepe,
• %35–80 arasında daha geniş bir kuyruk

tapılmışdır.

Bu geniş paylanma, sferoid altındaki bütün elektrodların eyni ölçüde hüceyrəyle temas etmediğini göstərir. Bazı elektrodlarda sıvı aralığı kalırken bazıları yoğun hüceyrə tabakasıyla birbaşa örtülmektedir.

Elektriksel ısı haritası necə üretildi?

Her elektrod çiftinin maksimum RIC dəyəri, MEA üzerindeki konumuna yerleştirilerek renkli bir harita oluşturulmuştur. Yüksək dəyərler sıcak renklerle, aşağı dəyərler açık renklerle gösterilmiştir.

K-means eşiğinin üzerindeki bölgelerin çevresine avtomatik siyah sınır çizilmiş və sferoidin elektriksel “ayak izi” oluşturulmuştur.

MEA sınırındaki elektrodlar görselleştirme amacıyla komşu dəyərlerden türetilen RIC dəyərləriyle doldurulmuştur. Bu sınır noktaları nicel analizden çıkarılmıştır.

Metindeki “en yakın minimum dəyərlere dayalı maksimum RIC” ifadesi işlem yöntemini tam kimi açıklamamaktadır. Isı haritası sınırlarının hangi interpolasyon kuralıyla doldurulduğu yeniden üretim baxımından belirsizdir.

Zaman boyunca hangi elektrodlar izlendi?

Algoritma sferoidin başlangıçta örttüğü elektrodları belirlemiş, sonraki analizlerde yalnız bu elektrodların RIC dəyərləri izlenmiştir.

Bir sferoidin temsilî RIC dəyəri açıklama amacıyla şu şekilde ifade edilebilir:

\[ \overline{\mathrm{maxRIC}} = \frac{1}{N_c} \sum_{i=1}^{N_c} \mathrm{maxRIC}_i \]

Burada:

• N_c, başlangıçta örtülü sınıflandırılan elektrod çifti sayısını,
• maxRIC_i, ilgili çiftin maksimum RIC dəyərini

göstərir.

Bu formül, metinde tarif edilen ortalama hesabını açıklamak üçün düzenlenmiştir.

Başlangıçtaki elektrodların sabit tutulması, ilaç etkisinin eyni algılama noktalarında izlenmesini sağlar. Lakin nəzarət sferoidi büyüyerek yeni elektrodları örttüğünde bu yeni temas alanları nicel ortalamaya dahil edilmemiştir. Buna görə yöntem toplam sferoid alanındaki bütün değişimi deyil, başlangıçta seçilen temas bölgesinin elektriksel değişimini izlemektedir.

Kontrol HCT-116 sferoidinde ne oldu?

Şekil 3’ün üst bölümünde müalicə uygulanmayan HCT-116 sferoidi gösterilmiştir.

Dördüncü saatte sferoid belirli bir elektrod qrupuyla temas etmiştir. Yirminci–yirmi dördüncü saat civarında hüceyrələrin yayılması və çoğalmasıyla daha fazla elektrod yüksək RIC göstərmişdir.

Kırk sekizinci saatte maksimum RIC’de kiçik bir azalma görülmüştür. Yazarlar bunu sferoid merkezinde hipoksi, besin yetersizliği və atık birikimine bağlı nekrotik çekirdeğin başlamasıyla açıklamaktadır.

Tədqiqatda nekrotik çekirdek birbaşa histolojik kesit veya oksijen ölçməüyle gösterilmemiştir. Bu səbəbdən 48. saatteki kiçik düşüş üçün sunulan nekrotik çekirdek açıklaması əvvəlki literatüre dayalı mekanizma yorumudur.

Navitoclax uygulandığında ne oldu?

Şekil 3’ün alt bölümünde 25 µM Navitoclax uygulanan HCT-116 sferoidi gösterilmiştir.

Parlak alan görüntülerinde:

• çekirdekte koyulaşma,
• kenarlarda parçalanma,
• morfolojik düzensizlik

görülse de bu değişiklikler erken aşamada nicel kimi belirgin deyil.

Elektriksel kayıtta ise RIC tepe noktası zamanla azalmış və 48. saatte örtüsüz elektrodların düzeyine yaklaşmıştır.

Yazarların önerdiği mekanizma şöyledir:

\[ \mathrm{Navitoclax} \rightarrow \mathrm{apoptoz} \rightarrow \mathrm{hücre\ küçülmesi\ ve\ ayrılması} \rightarrow \mathrm{elektrot\ temasının\ azalması} \rightarrow \mathrm{RIC}\downarrow \]

Hücreler birbirinden və yüzeyden ayrıldığında elektrolit akım üçün daha açık bir yol oluşturur. Böylece ölçülen impedans düşer.

Şekil 4’teki tek sferoid karşılaştırması

Kontrol sferoidinde 2–5, 17–26 və 30–48 saat aralıkları arasında anlamlı RIC farkı görülmemiştir. Son flüoresan boyamasında canlılıq %91’dir.

Navitoclax uygulanan sferoidde toplam zaman etkisi anlamlıdır:

\[ p = 0{,}006 \]

İlk iki zaman aralığı arasındaki fark:

\[ p = 0{,}515 \]

olup anlamlı deyil.

17–26 saat ilə 30–48 saat arasındaki fark:

\[ p = 0{,}049 \]

kimi bildirilmişdir.

Bu nəticə, Navitoclax etkisinin hemen ortaya çıkmadığını; ilk gün görece kararlı bir dönemden sonra elektriksel bozulmanın belirginleştiğini düşündürmektedir.

Lakin Şekil 4’te nəzarət üçün n = 4, müalicə üçün n = 6 ifadesi sferoid sayısını deyil, eyni sferoidin altında ölçülen elektrod çifti sayısını temsil etmektedir. Eyni sferoide ait elektrod çiftleri bağımsız biyolojik örnek deyil.

Elektrot çiftleri bağımsız tekrarlar gibi statistik teste dahil edildiyse p dəyərləri biyolojik bağımsızlığı olduğundan fazla yansıtabilir. Bu təcrübə, mekanizmayı gösteren temsilî örnek kimi dəyərlendirilmeli; bağımsız sferoid popülasyonu kanıtı kimi yorumlanmamalıdır.

Şekil 5’teki 32 HCT-116 sferoidi

Popülasyon düzeyindeki təcrübəde başlangıçta:

• 16 nəzarət sferoidi
• 16 Navitoclax uygulanmış sferoid

bulunmaktadır.

Her veri noktası, bir sferoidin başlangıçta örtülü sınıflandırılan elektrodlarından hesaplanan ortalama maksimum RIC dəyərini temsil etmektedir.

Kontrol qrupunda RIC 80 saat boyunca hafif yükselmiş, ancak zaman aralıkları arasında anlamlı fark oluşmamıştır. Bu artış sferoid büyümesi və yoğunluğuyla ilişkilendirilmiştir.

Navitoclax qrupunda:

• 2–5 saat ilə 17–26 saat arasında anlamlı düşüş yoktur.
• 30–48 saatte anlamlı elektriksel azalma başlamıştır.
• 60–80 saatte düşüş p < 0,001 düzeyine ulaşmıştır.
• Son canlılıq yaklaşık %20’dir.

Deneylerin canlılıq testi üçün fərqli zamanlarda sonlandırıldığı belirtilmektedir. Bu səbəbdən her zaman noktasında kaç sferoid bulunduğu və eyni sferoidlerin bütün zamanlarda tekrar ölçülüp ölçülmediği şekil açıklamasından tam kimi anlaşılamamaktadır.

İstatistik bölümünde tek yönlü ANOVA veya Kruskal–Wallis testi yazılmış; tekrarlı ölçməlü veri üçün karma model ya da tekrarlı ölçmə ANOVA’sı belirtilmemiştir. Eyni sferoidlerin birden fazla zamanda ölçüldüğü durumlarda zaman içi bağımlılığın necə ele alındığı açıklanmamıştır.

Şekil 6: Merkez və çevre elektrodları

Ağ MEA üzerindeki HT-29 sferoidinin merkezinde iki komşu elektrod da sferoid tarafından örtülmektedir. Çevre bölgede ise çiftin yalnız bir elektrodu sferoidle temas etmektedir.

17–26 saatlik ölçməde:

• Merkez çiftleri: yaklaşık %90 RIC
• Çevre çiftleri: yaklaşık %60 RIC

göstərmişdir.

Bu nəticə, elektrod yüzeyinin nə qədərının hüceyrələrlə örtüldüğünün sinyal büyüklüğünü güçlü biçimde etkilediğini göstərir.

Ağ MEA’daki HT-29 nəticələrı

Kontrol qrupunda ilk gün RIC yaklaşık %20’den %70 civarına yüksəlmişdir. Bu yükseliş sferoidin ağ üzerinde daha güçlü tutunmasına bağlanmıştır. Daha sonraki zamanlarda anlamlı değişiklik görülmemiştir.

10 µM Navitoclax qrupunda RIC ilk gün yükselmiş, daha sonra azalmaya başlamış və 60–80 saatte yaklaşık %40’ın altına azalmışdır.

İlk yüksək dəyərin görüldüğü 17–26 saat ilə 60–80 saat arasındaki fark:

\[ p < 0{,}001 \]

kimi bildirilmişdir.

Ağ MEA gerçekten daha iyi mi?

Yazarlar ağ MEA’nın kultura mühitinı sferoidin her yönüne ulaştırdığını, küresel biçimi koruduğunu və daha yüksək RIC sağladığını belirtmektedir.

Bu açıklama kullanılan görüntülerle uyumludur; ancak cam və ağ MEA təcrübələri birbaşa eşlenmiş deyil:

• Cam MEA’da HCT-116 istifadə edilmişdir.
• Ağ MEA’da HT-29 istifadə edilmişdir.
• Cam təcrübəinde 25 µM Navitoclax tətbiq edilmişdir.
• Ağ təcrübəinde 10 µM Navitoclax tətbiq edilmişdir.
• Referans RIC hesapları farklıdır.
• Elektrot aralıkları farklıdır.

Bu səbəbdən daha yüksək ağ MEA sinyalinin nə qədərının platformdan, nə qədərının hüceyrə hattından, ilaç dozundan veya referans yönteminden kaynaklandığı mevcut tədqiqatyla ayrıştırılamaz.

Canlı–ölü boyaması necə yapıldı?

HCT-116 sferoidlerinde canlı hüceyrəler Calcein-AM ilə yeşil, ölü hüceyrəler SYTOX Orange ilə turuncu gösterilmiştir.

HT-29 sferoidlerinde ise Calcein-AM və propidyum iyodür istifadə edilmişdir.

Bu boyamalar təcrübə sonunda impedans nəticələrını doğrulamak amacıyla yapılmıştır. Bazı sferoidler MEA üzerinde birbaşa, bazıları MEA’dan çıkarıldıktan sonra boyanmıştır.

Boyama yönteminin örnekler arasında fərqli olması, canlılıq ölçməüne ek değişkenlik katabilir. Ayrıca transfer sırasında parçalanan sferoidlerin analiz dışı bırakılması, en fazla zarar görmüş örneklerin nəticələrda temsil edilmemesine yol açabilir.

Empedans ilə canlılıq eyni şey midir?

Hayır. Empedans fizyolojik duruma duyarlı olmakla birlikte birbaşa canlılıq faizi deyil.

Yüksək impedans şu durumlarla ilişkili ola bilər:

• Yoğun hüceyrə kütlesi
• Sağlam hüceyrə zarları
• Güçlü hüceyrə-hüceyrə bağlantıları
• Elektrota sıkı tutunma
• İki elektrodun da sferoid tarafından örtülmesi

Aşağı impedans ise:

• Hücre ölümü
• Membran geçirgenliğinin artması
• Elektrottan ayrılma
• Sferoidin yer değiştirmesi
• Sferoid-elektrod arasına sıvı girmesi
• Sferoidin parçalanması

gibi fərqli niyəlerle oluşabilir.

Buna görə tədqiqat impedansın canlılıqla ilişkili olduğunu göstərir; fakat belirli bir RIC dəyərinin kesin kimi belirli bir canlılıq faizine karşılık geldiğini gösteren kalibrasyon denklemi sunmamaktadır.

K-means sınıflandırmasının performansı ölçüldü mü?

Tədqiqat, elektriksel sınırların mikroskop görüntüleriyle genel kimi örtüştüğünü göstərir. Lakin avtomatik sınıflandırma üçün şu ölçüler verilmemiştir:

• Duyarlılık
• Özgüllük
• Doğru sınıflandırma nisbəti
• Yanlış pozitif və yanlış negatif sayısı
• ROC eğrisi
• Alan altı dəyər
• Bağımsız test veri seti

Bu səbəbdən alqoritmnın “kesin” sınıflandırma doğruluğu hesaplanamamaktadır. Yöntem elektriksel və görsel uyum göstərmişdir; fakat standart makine öğrenmesi doğrulama ölçütleriyle tam performans analizi sunulmamıştır.

K-means’in əsas varsayımı

Algoritma RIC dəyərlərini iki kümeye ayırmaktadır. Bu yaklaşım, veride örtülü və örtüsüz elektrodları temsil eden yeterince ayrılabilir iki popülasyon bulunduğunu varsayar.

Aşağıdaki durumlarda iki kümeli yapı zayıflayabilir:

• Sferoid elektrodlara çox zayıf tutunmuşsa
• Örtülü və örtüsüz elektrodların RIC dəyərləri böyük ölçüde örtüşüyorsa
• Sferoid çox küçükse
• Elektrotların çoğu eyni fiziksel durumda kalıyorsa
• Gürültü veya referans kayması yüksekse
• İlaç etkisi ilk hədd belirleme zamanından əvvəl başlamışsa

Yazarlar nəticə bölümünde hədd doğruluğunun veri paylanmaına, sferoidin tutunmasına və yerleştirmeden sonraki zamana bağlı olduğunu tədqiqatnın əsas sınırlılığı kimi kabul etmiştir.

Tədqiqat gerçekten tamamen optiksiz mi?

Geliştirilen alqoritm elektrod örtülmesini impedans verisinden belirleyerek gelecekte optik doğrulama gereksinimini azaltmayı amaçlamaktadır.

Bununla belə mevcut təcrübəde:

• Sferoidler mikroskop altında elektrodlara yerleştirilmiştir.
• Başlangıçta parlak alan görüntüleri alınmıştır.
• Elektriksel sınırlar optik görüntülerle karşılaştırılmıştır.
• Deney sonunda flüoresan canlı–ölü görüntüleri istifadə edilmişdir.

Buna görə tədqiqat tamamen optiksiz bir süreç göstermemiştir. Elektriksel yöntemin optik görüntülemeye olan bağımlılığı azaltabileceğini gösteren bir yöntem geliştirme aşamasındadır.

Yüksək verimli tarama gösterildi mi?

Sistem çox kanallı və avtomatik hədd üretebildiği üçün yüksək verimli ilaç taramasına uyğunlaşdırıla bilən. Lakin mevcut təcrübələrde her MEA üzerinde sınırlı sayıda sferoid izlenmiş və ticari çox kuyucuklu, yüzlerce örneği eyni anda dəyərlendiren tam avtomatik bir tarama sistemi gösterilmemiştir.

Bu səbəbdən “yüksək verimli tarama kapasitesi” mevcut cihazın birbaşa kanıtlanmış üretim hızı deyil, sistemin gelecekte ölçeklenebilecek bir özelliğidir.

Tədqiqatnın güclü tərəfləri

• Etiketsiz ölçmə: Günlük impedans kaydı üçün flüoresan veya kimyasal etiket gerekmemektedir.
• Örneği bozmayan yaklaşım: Eyni sferoid zaman içində tekrar ölçülebilmektedir.
• Çox tezliklı veri: Tek tezlik yerine 100 Hz–1 MHz spektrum kaydedilmiştir.
• Yüksək uzamsal çözünürlük: Çox sayıda kiçik elektrod, sferoidin elektriksel haritasını üretmiştir.
• İki MEA platformu: Yöntem hem cam hem de ağ tabanlı sistemde denenmiştir.
• İki kolorektal xərçəng hüceyrə hattı: HCT-116 və HT-29 Navitoclax təcrübələrinde istifadə edilmişdir.
• Geniş hədd veri seti: 74 sferoid və 2.422 elektrod çifti qiymətləndirilmişdir.
• Uyarlanabilir hədd: Her sferoidin elektriksel paylanmaına görə ayrı hədd üretilmiştir.
• Uzamsal və zamansal izleme: Isı haritası ilə zaman serisi eyni sistemde birleştirilmiştir.
• Terminal biyolojik doğrulama: Canlı–ölü boyaması impedans değişimiyle birlikte qiymətləndirilmişdir.
• İlaç etkisindeki gecikme gösterilmiştir: Navitoclax etkisinin ilk gün sınırlı, sonraki günlerde daha belirgin olduğu görülmüştür.
• Açıklanabilir alqoritm: K-means və küme merkezi ortalaması, kara kutu modelden daha kolay yorumlanabilir.

Tədqiqatnın məhdudiyyətləri

• Hakem dəyərlendirmesi yoktur: Tədqiqat SSRN preprintidir.
• Klinik tədqiqat deyil: Hasta şişü, hasta müalicə yanıtı veya klinik nəticə incelenmemiştir.
• Sınırlı ilaç çeşitliliği: Yalnızca Navitoclax qiymətləndirilmişdir.
• Doz–yanıt analizi yoktur: Her hüceyrə hattında tek Navitoclax konsantrasyonu istifadə edilmişdir.
• İki CRC hüceyrə hattı: İlaç izleme nəticələrı HCT-116 və HT-29 ilə sınırlıdır.
• Hasta kaynaklı organoid yoktur: Genetik və klinik şiş heterojenliği temsil edilmemiştir.
• İmmün mikroçevre yoktur: T hüceyrələri, makrofaqlar, damar hüceyrələri və stromal bileşenler ilaç təcrübələrinde birlikte dəyərlendirilmemiştir.
• Empedans canlılığa özgü deyil: Tutunma, biçim və elektrod aralığı sinyali değiştirebilir.
• Canlılık kalibrasyonu yoktur: RIC’den birbaşa canlı hüceyrə faizi hesaplayan model geliştirilmemiştir.
• Sınıflandırma doğruluğu raporlanmamıştır: Duyarlılık, özgüllük və ROC dəyərləri bulunmamaktadır.
• Bağımsız dış doğrulama yoktur: Algoritma başka laboratuvarın bağımsız kör veri setinde test edilmemiştir.
• K-means iki kümeyi varsayar: Örtülü və örtüsüz paylanmalar ayrışmadığında hədd güvenilirliği azalabilir.
• Eşik zamana bağlıdır: Cam və ağ MEA’da fərqli zaman noktaları istifadə edilmişdir.
• Başlanğıc elektrodları sabitlenmiştir: Sferoid büyüdüğünde yeni örtülen elektrodlar zaman serisine eklenmemiştir.
• Tek sferoid analizinde psödoreplikasyon riski vardır: Eyni sferoide ait elektrod çiftleri bağımsız n kimi gösterilmiştir.
• Tekrarlı ölçmə yöntemi açıklanmamıştır: Zaman içi bağımlılık üçün karma model raporlanmamıştır.
• Zaman noktası örnek sayıları belirsizdir: Şekil 5’te “n = 16 başlangıçta” denmiş, sonraki zamanlardaki kesin n verilmemiştir.
• Cam və ağ platformları birbaşa karşılaştırılamaz: Hücre hattı, ilaç dozu, referans və elektrod aralığı farklıdır.
• Transfer kaynaklı dışlama vardır: Parçalanan sferoidler canlılıq analizinden çıkarılmıştır.
• Canlılık boyama protokolü değişkendir: Bazı örnekler MEA üzerinde, bazıları çıkarıldıktan sonra boyanmıştır.
• Özel oda boyutları tutarsızdır: 2,6 mm və 8 mm dəyərləri birbiriyle uyuşmamaktadır.
• RIC değişken tanımları belirsizdir: Z dəyərləri bazı cümlelerde impedans yerine RIC kimi yazılmıştır.
• Sınır doldurma yöntemi net deyil: Isı haritası üçün kullanılan görsel interpolasyon ayrıntılı açıklanmamıştır.
• Hücre modeli sayımı tutarsızdır: “Beş tip” ifadesiyle listelenen altı kategori uyuşmamaktadır.
• Ölçek birimi hatası vardır: Mikroskopi ölçekleri µm yerine µM biçiminde yazılmıştır.
• Veri və kod açık deyil: Verilerin talep üzerine paylaşılacağı belirtilmiş, özel Python kodları kamuya açık depo üzərindən verilmemiştir.
• Yüksək verim potansiyel düzeydedir: Çox kuyucuklu böyük ölçekli avtomatik ilaç taraması birbaşa gösterilmemiştir.

Tədqiqat nə deyir?

• Üç boyutlu sferoidler mikroelektrod dizileri üzerinde ölçülebilir impedans değişikliği oluşturmaktadır.
• En belirgin değişiklikler 1–100 kHz aralığında görülmektedir.
• Sferoidle birbaşa temas eden elektrod çiftleri daha yüksək RIC göstərir.
• Elektriksel ısı haritası sferoidin elektrod üzerindeki temas alanını gösterebilmektedir.
• K-means, yüksək və aşağı RIC kümelerini avtomatik ayırabilmektedir.
• Her sferoid üçün uyarlanan hədd, elle hədd seçme gereksinimini azaltmaktadır.
• Tedavisiz HCT-116 və HT-29 sferoidlerinde impedans genel kimi kararlı kalmıştır.
• Navitoclax uygulaması sonra impedans zamanla azalmışdır.
• Empedans düşüşüne terminal canlılıq azalması eşlik etmiştir.
• Navitoclax etkisi hemen deyil, yaklaşık bir–iki günlük gecikmeden sonra belirginleşmiştir.
• Ağ MEA, sferoidin daha küresel kalmasına və daha yüksək sinyal oluşmasına katkı sağlayabilir.
• Yöntem gelecekte avtomatik və yüksək kapasiteli preklinik tarama sistemlerine uyğunlaşdırıla bilən.

Tədqiqat nə demir?

• Sistemin insanlarda xərçəng tanısı koyabildiğini göstermemektedir.
• Bir hastanın hangi ilaca yanıt vereceğini klinik kimi öngördüğünü göstermemektedir.
• RIC dəyərinin birbaşa canlı hüceyrə faizi olduğunu göstermemektedir.
• Aşağı impedansın her zaman yalnız hüceyrə ölümünden kaynaklandığını kanıtlamamaktadır.
• K-means sınıflandırmasının bütün sferoid tiplerinde hatasız çalıştığını göstermemektedir.
• Optik mikroskopiyanin veya son nokta testlerinin tamamen gereksiz olduğunu göstermemektedir.
• Navitoclax’ın kolorektal xərçəng hastalarında etkili olduğunu kanıtlamamaktadır.
• Cam MEA’dan ağ MEA’nın kesin kimi üstün olduğunu gösteren eşlenmiş karşılaştırma sunmamaktadır.
• Tek bir impedans eşiğinin bütün cihazlarda kullanılabileceğini göstermemektedir.
• Yöntemin enfeksiyon, immünoterapi, radyoterapi veya bütün ilaç sınıflarında doğrulandığını göstermemektedir.
• Sistemin klinik laboratuvarda veya hastanede kullanıma hazır olduğunu göstermemektedir.
• Yüzlerce ya da binlerce sferoidin eyni anda tarandığı tam ölçekli bir yüksək verim sistemi göstermemektedir.

Geçmiş baxımından önemi

Hücre-elektrod impedans ölçmələri uzun süredir ikiölçülü hüceyrə tabakalarının tutunmasını, çoğalmasını və ölümünü izlemek üçün kullanılmaktadır. Lakin üçölçülü sferoidler, düz hüceyrə tabakalarından daha karmaşık bir temas geometrisine sahiptir.

Sferoidin yalnız kiçik bir bölümü elektroda birbaşa temas eder. Alt yüzey düzensizdir və elektrod ilə hüceyrəler arasında fərqli kalınlıklarda kültür sıvısı kalabilir. Bu səbəbdən ikiölçülü kültürlerde kullanılan tek elektrod veya tek hədd yaklaşımı üçölçülü modellerde yeterli olmayabilir.

Bu tədqiqat, çox sayıda kiçik elektrod və sferoide özgü uyğunlaşdırıla bilən hədd kullanarak bu geometrik soruna yaklaşmaktadır.

Bugün baxımından önemi

İlaç geliştirme sürecinde bir sferoidin yalnız təcrübəin sonunda canlı olup olmadığını bilmek sınırlı bilgi sağlar. İlacın:

• etki göstermeye ne zaman başladığı,
• ilk gün etkisiz görünüp daha sonra etkili olup olmadığı,
• sferoidin merkez və çevresini eyni biçimde etkileyip etkilemediği,
• fizyolojik bozulmanın mikroskopiyak görünümden əvvəl başlayıp başlamadığı

da mühümdir.

Elektriksel zaman serisi, Navitoclax’ın ilk saatlerde sınırlı değişim oluşturduğunu və daha belirgin düşüşün 30–48 saatten sonra ortaya çıktığını göstərmişdir. Bu tür zaman bilgisi yalnız təcrübə sonundaki tek bir canlılıq testiyle elde edilemez.

Gelecek baxımından önemi

Yöntemin daha güçlü bir preklinik platforma dönüşebilmesi üçün gelecekte şu tədqiqatlar gereklidir:

• Bağımsız və kör doğrulama veri setleri
• Optik görüntülerden elde edilen gerçek temas alanıyla nicel karşılaştırma
• Duyarlılık, özgüllük və ROC analizi
• RIC ilə canlılıq faizi arasında kalibrasyon modelleri
• Birden fazla ilaç və geniş doz–yanıt təcrübələri
• Fərqli ölüm mekanizmalarının ayrıştırılması
• Hasta kaynaklı şiş organoidleri
• Fibroblast, immun və damar hüceyrəsi içeren ortak kültürler
• Tekrarlı ölçməler üçün karma etkili statistik modeller
• Daha yüksək yoğunluklu CMOS mikroelektrod dizileri
• Yatay və dikey komşu elektrod ölçmələrinin birlikte kullanılması
• Üç boyutlu elektriksel tomografiye yaklaşan uzamsal rekonstrüksiyon
• Sferoidin büyümesiyle yeni örtülen elektrodları dinamik kimi modele ekleyen alqoritmlar
• Otomatik sıvı işleme və çox kuyucuklu sistemlerle entegrasyon
• Kod və ham məlumatlarin açık erişimli kimi paylaşılması
• Kişiselleştirilmiş immünoterapi yanıtının dəyərlendirilmesi

Gündelik yaşam və xərçəng tədqiqatsı baxımından anlamı

Tədqiqatnın gündelik yaşama birbaşa etkisi henüz sınırlıdır; yöntem bir klinik cihaz deyil, laboratuvar tədqiqat platformudur.

Uzun vadede bu tür sistemlerin əsas yararı, potansiyel ilaçların üçölçülü şiş modellerinde daha erken və daha ayrıntılı dəyərlendirilmesi ola bilər. Başarısız ilaç adaylarının erken aşamada elenmesi, daha umut verici adayların seçilmesi və hasta kaynaklı modellerde kişiye özgü yanıtların incelenmesi hedeflenebilir.

Bununla belə mevcut tədqiqat, bir hastadan alınan şişün sisteme konularak doğru ilacın seçilebildiğini göstermemektedir. Bu kullanım, tədqiqatçıların geleceğe yönelik öngördüğü bir geliştirme alanıdır.

Tədqiqatnın Yöntemi və Bulguları

Tədqiqat tasarımının texniki özeti

Mikroelektrod sistemlerinin texniki özellikleri

EIS kayıt parametreleri

RIC və hədd formülleri

\[ \mathrm{RIC} = \frac{Z_s-Z_{ref}} {Z_s+Z_{ref}} \times100\% \]

\[ \mathrm{maxRIC}_i = \max_{1\,\mathrm{kHz}\le f\le100\,\mathrm{kHz}} \mathrm{RIC}_i(f) \]

\[ T = \operatorname{round} \left( \frac{C_0+C_1}{2} \right) \]

Burada:

• Z_s: sferoidli ölçmə impedansı
• Z_ref: referans impedans
• maxRIC_i: i elektrod çiftinin 1–100 kHz arasındaki en yüksək RIC dəyəri
• C₀ və C₁: K-means küme merkezleri
• T: örtülü və örtüsüz elektrodları ayıran avtomatik hədd

anlamına gelmektedir.

Otomatik analiz basamakları

1. Her elektrod çifti üçün 100 Hz–1 MHz impedans spektrumu kaydedildi.
2. Referansa görə RIC spektrumu hesaplandı.
3. 1–100 kHz aralığındaki maksimum RIC seçildi.
4. En yüksək %5’lik uç dəyərlərin hədd eğitimindeki etkisi azaltıldı.
5. K-means ilə dəyərler iki kümeye ayrıldı.
6. Küme merkezlerinin ortası avtomatik hədd kimi belirlendi.
7. Eşik özgün, kırpılmamış veri setine uygulandı.
8. Eşik üzerindeki elektrodlar sferoidle örtülü sınıflandırıldı.
9. Başlangıçta örtülü bulunan elektrodların RIC dəyərləri zaman boyunca izlendi.
10. Deney sonunda flüoresan canlılıq testiyle biyolojik doğrulama yapıldı.

Örnek sferoidin elektriksel paylanmaı

74 sferoidlik hədd veri seti

Temsilî HCT-116 sferoid nəticələrı

HCT-116 popülasyon analizi

HT-29 ağ MEA nəticələrı

Kullanılan statistik yaklaşım

• Normallik: Shapiro–Wilk testi
• Varyans homojenliği: Levene testi
• Parametrik qrup karşılaştırması: Tek yönlü ANOVA
• Parametrik olmayan karşılaştırma: Kruskal–Wallis testi
• ANOVA sonrası: Tukey HSD
• Kruskal–Wallis sonrası: Dunn testi
• Anlamlılık sınırı: p < 0,05

Zaman içində eyni sferoidin tekrar ölçülmesi niyəiyle tekrarlı ölçmə yapısı bulunmaktadır. Bununla belə yöntem bölümünde tekrarlı ölçmə ANOVA’sı, eşleştirilmiş analiz veya karma etkili model açıkça belirtilmemiştir.

Şekillerin birlikte anlattığı əsas nəticə

1. Şekil 1: Sferoid üretimini, cam və ağ MEA sistemlerini və canlılıq doğrulamasını göstərir.
2. Şekil 2: Sferoidle örtülü elektrodlarda daha yüksək RIC oluştuğunu və elektriksel haritanın optik konumla örtüştüğünü göstərir.
3. Şekil 3: Kontrol sferoidinde kararlı, Navitoclax sferoidinde azalan elektriksel ayak izini göstərir.
4. Şekil 4: Tek sferoid örneklerinde RIC değişimini %91 və %28 terminal canlılıqla karşılaştırmaktadır.
5. Şekil 5: HCT-116 popülasyonunda nəzarət və 25 µM Navitoclax yanıtını 80 saate kadar göstərir.
6. Şekil 6: HT-29 sferoidlerinde merkez və çevre elektrod farkını və ağ MEA’daki 10 µM Navitoclax yanıtını göstərir.

Teknik kimi en mühüm nəticə

Tədqiqatnın en mühüm texniki katkısı, sferoidin elektrod üzerinde hangi noktalarla gerçek temas kurduğunu her təcrübə üçün ayrı kimi belirleyen avtomatik hədd yöntemidir.

Bu yaklaşım:

• tek bir sabit hədd kullanmamakta,
• her sferoidin başlanğıc RIC paylanmaını incelemekte,
• dəyərləri aşağı və yüksək RIC kümelerine ayırmakta,
• yalnız başlangıçta sferoidle temas eden elektrodları zaman içində takip etmektedir.

Böylece sferoidin fiziksel konumu və ilaç sonrası elektriksel bozulması eyni veri akışı içində ölçülebilmektedir.

Lakin sistem henüz canlılığı birbaşa ölçen klinik bir test deyil. En doğru tanım, sferoid-elektrod temasını və canlılıqla ilişkili fizyolojik değişimleri etiket kullanmadan izleyen avtomatik preklinik impedans platformudur.

Kaynak və Yöntem Notu

Bu içerik, Ahmed Khattab, Ruth Grabowski, Ha Un Chung, Tobias Schmidt, Mai Thu Bui, Christian Schmees və Günther Michael Zeck tarafından hazırlanan “Automated Viability Assessment of Tumor Spheroids via Electrical Impedance Spectroscopy” başlıklı tədqiqatya dayanmaktadır.

Tədqiqat; insan kaynaklı HCT-116 və HT-29 kolorektal xərçəng hüceyrələrindən oluşturulan üçölçülü sferoidleri, cam və poliimid ağ tabanlı mikroelektrod dizilerini, elektrik impedansı spektroskopiyasıni, K-means klasterləşdirməyi və Navitoclax müdahalesini birleştiren preklinik in vitro biyosensör və yöntem geliştirme tədqiqatsıdır.

İnsanlarda yürütülmüş klinik tədqiqat deyil. Hasta şişü, xərçəng hastası, klinik müalicə sonucu, sağkalım veya kişiselleştirilmiş ilaç seçimi verisi bulunmamaktadır.

Metinde açıkça “This preprint research paper has not been peer reviewed” və “Preprint not peer reviewed” ifadeleri bulunmaktadır. Buna görə tədqiqat hakem dəyərlendirmesinden geçmemiştir.

Sayfa üst bilgisinde “Biosensors and Bioelectronics, Vol. X, No. X (2026)” yazmaktadır. Lakin cilt və sayı alanlarının X kimi kalması, DOI və kabul tarihinin bulunmaması niyəiyle bu ifade nihai yayımlanmış makale veya dergi kabulü kimi dəyərlendirilemez.

Tədqiqatnın Avusturya Tədqiqat Teşvik Ajansı tarafından 895365 numaralı proje və Almanya Federal Ekonomi və İklim Koruma Bakanlığı tarafından KK5046205AJ2 numaralı proje kapsamında desteklendiği qeyd edilmişdir. Yazarlar bilinen mali çıkar çatışması veya kişisel ilişki bildirmemiştir.

Verilerin makul talep üzerine paylaşılacağı belirtilmiş; özel Python analiz kodları və ham impedans məlumatlari üçün açık erişimli bir depo bağlantısı verilmemiştir.

K-means yaklaşımı 74 sferoid və 2.422 elektrod çiftinden elde edilen RIC paylanmalarıyla geliştirilmiştir. Lakin sınıflandırma üçün duyarlılık, özgüllük, ROC eğrisi veya bağımsız dış doğrulama nəticələrı sunulmamıştır.

Empedans değişikliği hüceyrə canlılığıyla ilişkili olmakla birlikte yalnız canlılığı ölçmez. Sferoidin elektroda tutunması, biçimi, büyüklüğü, elektrodla arasındaki sıvı boşluğu və elektrod çiftinin örtülme nisbəti da RIC dəyərini etkileyebilir.

Cam və ağ MEA nəticələrı fərqli hüceyrə hatları, fərqli Navitoclax dozları, fərqli elektrod aralıkları və fərqli referans hesaplarıyla elde edilmiştir. Bu səbəbdən iki platform arasında kesin üstünlük karşılaştırması yapılamaz.

Tek sferoid örneklerinde elektrod çiftleri n dəyəri kimi istifadə edilmişdir. Eyni sferoide ait elektrod çiftleri bağımsız biyolojik tekrar olmadığı üçün bu nəticələrın statistik yorumunda dikkatli olunmalıdır.

Özel SLA odasının boyutları, RIC değişkenlerinin bazı tanımları, hüceyrə modeli kategorilerinin sayısı və mikroskopiya ölçek birimleri PDF içində açıklık gerektiren raporlama sorunları içermektedir.

Bu makale yalnız yüklenen PDF’deki yöntemler, formüller, grafikler, mikroskopiya görüntüleri, elektriksel ısı haritaları, canlılıq nəticələrı və yazarların yorumlarına dayanılarak hazırlanmıştır. PDF’de bulunmayan klinik tanı doğruluğu, hasta müalicə başarısı, Navitoclax etkinliği, kesin canlılıq tahmini veya yüksək verimli ticari kullanım iddiası eklenmemiştir.