Uwekaji wa kipaumbele wa kihierarkia wa kihesabu wa fitokemikali ni mbinu ya kuchagua wagombea inayopunguza hatua kwa hatua idadi kubwa ya misombo ya asili kwa kutumia vichujio vya kihesabu vinavyokamilishana, kama vile takwimu, molecular docking, makadirio ya nishati ya kufungamana, makadirio ya pharmacokinetics na toxicity, unyumbufu wa receptor, molecular dynamics na viashiria vya quantum chemistry, badala ya kuipanga kwa docking score moja pekee. Utafiti huu ulitathmini fitokemikali 105 zilizokuwa tayari zimeainishwa kimuundo kutoka mmea Uvaria chamae dhidi ya mfumo wa glycoprotein wa virusi vya Ebola GP1-GP2 na papain-like protease PLpro ya SARS-CoV-2; Proanthocyanidin iliwekewa kipaumbele kwa lengo la Ebola na Uvangoletin kwa PLpro kama wagombea wa kihesabu wanaoweza kupelekwa katika uchunguzi zaidi wa majaribio. Utafiti haukuonyesha ufanisi wa antiviral katika seli, wanyama au binadamu.

Seti ya awali ya data ilikuwa na metabolites 106 za Uvaria chamae. Hata hivyo, kwa kuwa muundo wa kemikali wa kiwanja kinachoitwa joolanin haukuweza kupewa kwa uhakika kutokana na maelezo ya kimuundo yasiyolingana katika maandiko yaliyopo, kiliondolewa katika utafiti na hesabu zilifanywa kwa misombo 105 iliyokuwa imeainishwa kimuundo. Misombo hii inajumuisha flavonoids, acetogenins, misombo ya phenolic, alkaloids, sterols, terpenes, viambato vya essential oils na madaraja mengine ya fitokemikali yaliyoripotiwa kutoka mizizi, mashina, majani na mbegu.

Kwa virusi vya Ebola, PDB ID 5F1B ilitumika. Muundo huu ulichaguliwa kwa kuchunguza hatua ya kuingia ya virusi kabla ya membrane fusion kwa sababu unawakilisha mwingiliano wa glycoprotein ya Ebola iliyochakatwa na receptor ya endosomal Niemann–Pick C1 (NPC1). Kwa SARS-CoV-2, papain-like protease PLpro katika PDB ID 7CMD ilitumika. PLpro ni enzyme ya virusi inayohusika katika uchakataji wa viral polyproteins na pia katika ukandamizaji wa innate immunity ya mwenyeji kupitia shughuli za deubiquitination na deISGylation. Kwa kuwa muundo wa 7CMD una non-covalent inhibitor GRL0617, unatoa eneo la kufungamana la rejea lililobainishwa kwa majaribio kwa ajili ya docking na ulinganisho wa dynamics.

Katika uchanganuzi wa takwimu, sehemu ya mmea haikujitokeza kama kigezo chenye nguvu cha utendaji wa jumla wa docking. Kwa lengo la Ebola 5F1B, hakukuwa na tofauti yenye maana kati ya sehemu za mmea; kwa 7CMD, ingawa mtihani wa Kruskal–Wallis ulitoa kwa jumla \(p=0.0316\), hakuna jozi ya sehemu iliyobaki na maana baada ya marekebisho ya Dunn ya multiple comparisons. Kwa upande mwingine, athari ya daraja la fitokemikali ilikuwa dhahiri zaidi: flavonoids zilikuwa na mean ranks za chini zaidi, yaani zinazofaa zaidi, katika malengo yote mawili, na tofauti kati ya flavonoids na acetogenins kwa 5F1B ilikuwa \(p=0.0002\), na kwa 7CMD ilikuwa \(p=0.0018\).

Hata hivyo, utafiti hauhitimishi kwamba “mizizi na mashina ni bora zaidi kwa antiviral kuliko sehemu nyingine”. Sehemu kubwa ya wagombea binafsi wenye nafasi za juu iliripotiwa kutoka mizizi na mashina; lakini mgawanyo katika kiwango cha sehemu za mmea haukutengana vya kutosha kwa takwimu. Aidha, kwa kuwa baadhi ya metabolites hupatikana katika zaidi ya sehemu moja ya mmea, uwezekano wa kiwanja kilekile kuchangia katika makundi zaidi ya moja unapunguza uhalali wa dhana ya uhuru wa makundi.

Katika lengo la Ebola GP, Proanthocyanidin ilionyesha wasifu wenye nguvu katika uchanganuzi wa kwanza wa docking kwenye mnyororo GP1, ikiwa na XP score ya −6,17 kcal/mol na thamani ya Prime MM-GBSA ya −45,66 kcal/mol. Hata hivyo, Proanthocyanidin si peke yake “molekuli yenye nishati hasi zaidi” kati ya wagombea wote wa Ebola. Kwa mfano, Squamocin ilionyesha Prime MM-GBSA ya −54,86 kcal/mol katika mnyororo GP2, na Neoannonin −58,35 kcal/mol katika uchanganuzi wa GP1-GP2 kamili. Sababu ya kuchaguliwa kwa Proanthocyanidin katika hatua ya mwisho ni kwamba ilionyesha wasifu wenye uthabiti zaidi katika tata kamili na katika uchanganuzi tofauti wa GP1 na GP2, iliweza kupelekwa kwenye uchanganuzi wa receptor flexibility, na ilidumisha binding pose thabiti wakati wa molecular dynamics.

Kwa SARS-CoV-2 PLpro, XP docking score ya awali ya Uvangoletin ilikuwa −6,20 kcal/mol na makadirio ya Prime MM-GBSA −41,69 kcal/mol. Baada ya induced-fit docking, docking score iliboreshwa hadi −9,43 kcal/mol. Ingawa IFD score ya Diuvaretin ilikuwa ya chini zaidi, yaani inayofaa zaidi, −11,57 kcal/mol, Uvangoletin ilichaguliwa kwa molecular dynamics kwa sababu ya uwiano wake wa jumla kati ya docking, binding energy, ADMET, sifa za medicinal chemistry na mwingiliano unaodumishwa na residues muhimu za PLpro.

Simulations za molecular dynamics za 100 ns zililinganisha Proanthocyanidin na Toremifene kwenye Ebola GP1-GP2, na Uvangoletin na GRL0617 kwenye PLpro, chini ya hali sawa za receptor. Protein backbone RMSD zilifikia plateau haraka katika mifumo minne mikuu na hakukuwa na structural drift kubwa. Hata hivyo, trajectory-based MM-GBSA ilionyesha kuwa reference inhibitors zilitoa makadirio ya nishati yanayofaa zaidi katika malengo yote mawili: Toremifene −49,7 ± 0,3 kcal/mol dhidi ya Proanthocyanidin −37,2 ± 0,3 kcal/mol; GRL0617 −33,7 ± 0,2 kcal/mol dhidi ya Uvangoletin −26,8 ± 0,2 kcal/mol. Kwa hiyo, uwekaji wa kipaumbele wa wagombea hautegemei dai kwamba “wanafungamana kwa nguvu zaidi kuliko reference inhibitor”.

Katika uchanganuzi wa conceptual density functional theory (DFT), HOMO-LUMO gap ilihesabiwa kuwa 5,37 eV kwa Proanthocyanidin na 4,81 eV kwa Uvangoletin. Chanzo kinahusisha thamani hizi na frontier-orbital reactivity ya chini na uthabiti wa ndani wa kielektroniki ulio juu kiasi. Hata hivyo, viashiria vya DFT vinawakilisha sifa za kielektroniki za ligand iliyotengwa katika solution; havipimi protein-ligand binding affinity na haviwezi kutumika badala ya MM-GBSA.

Hitimisho kuu la utafiti si kwamba ugunduzi wa dawa ya antiviral umekamilika, bali ni kwamba maktaba kubwa na yenye utofauti wa kikemia ya natural products inaweza kuwekewa kipaumbele kwa utaratibu katika viwango vitatu — sehemu ya mmea, daraja la fitokemikali na metabolite binafsi — kabla ya kuingia katika majaribio ya kivitendo. Kwa hiyo Proanthocyanidin na Uvangoletin si “antiviral agents zilizothibitishwa”, bali ni wagombea wa kihesabu wanaopendekezwa kupelekwa kwenye uthibitishaji wa majaribio.

Kwa nini huu si utafiti wa ufanisi wa dawa ya antiviral, bali ni utafiti wa kuweka wagombea katika kipaumbele?

Kwa sababu katika seli zilizoambukizwa Ebola au SARS-CoV-2, utafiti haukupima ufanisi wa antiviral, viral load, IC50/EC50, cytotoxicity, matibabu ya wanyama au matokeo ya kliniki; watafiti walipunguza natural products 105 kwa ajili ya majaribio ya kivitendo kwa kutumia modeli za kihesabu na katika matokeo yao wenyewe wakafafanua Proanthocyanidin na Uvangoletin kama “prioritized computational candidates”.

Misombo 105 ilipatikana vipi?

Seti ya data ya kikemia ya utafiti ilitolewa kutoka seti pana ya data ya fitokemia ya Uvaria chamae iliyochapishwa hapo awali na kundi la waandishi. Seti hii ya data ilikusanywa kutoka utafutaji wa PubMed, Scopus, ScienceDirect na Google Scholar, na ni misombo tu ambayo isolation yake kutoka Uvaria chamae au structural characterization ya kuaminika ilikuwa imeripotiwa ndiyo iliyohifadhiwa.

Mwanzoni:

\[ N_{\mathrm{başlangıç}}=106 \]

kulikuwa na fitokemikali. Kwa kuwa muundo wa Joolanin haukuweza kubainishwa kwa uthabiti katika maandiko:

\[ N_{\mathrm{analiz}}=105 \]

fitokemikali ziliingizwa katika hesabu.

Idadi hii ya 105 si matokeo ya extraction mpya ya maabara; ni maktaba ya kihesabu ya molekuli ambazo miundo yake ilikuwa tayari imeainishwa katika maandiko ya fitokemia ya awali.

Ligands ziliandaliwaje?

Miundo ya ligand ya pande tatu ilipatikana kutoka PubChem pale ilipowezekana na ikaandaliwa kwa LigPrep ndani ya Schrödinger Suite v2025-1. Hatua ya maandalizi ilijumuisha energy minimization, ukaguzi wa stereochemistry, utengenezaji wa ionization states katika pH 7,4 ± 2,0 kuwakilisha hali za kifizyolojia, na geometry optimization kwa OPLS4 force field.

Mchakato huu ni muhimu kwa sababu docking algorithm haitumii tu formula ya kikemia ya pande mbili ya molekuli, bali hutumia hali maalum ya protonation, stereochemistry na conformation ya pande tatu. Kwa hiyo, maandalizi ya ligand ni hatua ya kimetodolojia inayoathiri moja kwa moja energy scores zinazofuata.

Kwa nini Ebola GP1-GP2 na SARS-CoV-2 PLpro zilichaguliwa kama malengo mawili tofauti?

Malengo haya mawili yanawakilisha hatua tofauti za mzunguko wa maisha ya virusi: 5F1B ilichaguliwa kutathmini wagombea wa kufungamana kihesabu dhidi ya hatua ya endosomal entry na fusion ya glycoprotein ya Ebola inayohusiana na NPC1, ilhali PLpro katika 7CMD ilichaguliwa dhidi ya uchakataji wa protini za virusi na mifumo ya immune evasion ya SARS-CoV-2.

Lengo la Ebola: PDB 5F1B

5F1B inawakilisha muktadha wa kimuundo ambapo primed Ebola virus glycoprotein inaingiliana na endosomal Niemann-Pick C1 receptor. Mwingiliano huu hutokea katika hatua muhimu kabla ya membrane fusion na kutolewa kwa viral genome ndani ya seli.

Kwa kuwa hakuna co-crystallized small molecule inayofaa kwa docking validation katika muundo wa 5F1B, watafiti walitabiri binding pocket kwa SiteMap. Grid center coordinates zilizoundwa kutoka pocket yenye nafasi ya juu zaidi ni:

Grid coordinates hizo hizo zilihifadhiwa katika uchanganuzi husika wa kimuundo wa 5F1B kwa madhumuni ya ulinganisho.

Lengo la SARS-CoV-2: PLpro, PDB 7CMD

Kwa kuwa muundo wa crystal wa 7CMD una non-covalent inhibitor GRL0617, docking grid iliwekwa moja kwa moja katikati ya eneo la kufungamana la ligand hii:

\[ X=-34.22,\qquad Y=-11.63,\qquad Z=-30.06 \]

Ili kujaribu ikiwa docking protocol inaweza kuzalisha tena crystal structure yake, co-crystallized ligand ilifanyiwa redocking. RMSD kati ya crystal pose na predicted pose ilikuwa:

\[ \mathrm{RMSD}=0.24~\text{\AA} \]

. Utafiti hutumia mkengeuko huu mdogo kama validation kwamba docking protocol ya 7CMD inaweza kuzalisha tena binding pose.

Docking, MM-GBSA, IFD, ADMET, molecular dynamics na DFT hutoa taarifa tofauti kwa namna gani?

Docking hutathmini binding pose inayowezekana na score ya awali; Prime MM-GBSA makadirio ya nishati ya static complex; ADMET makadirio ya developability na pharmacokinetics; induced-fit docking unyumbufu wa ndani wa receptor; molecular dynamics tabia ya binding pose kwa muda; trajectory MM-GBSA ulinganisho wa nishati kati ya mgombea na reference kwenye receptor ileile; na DFT sifa za electronic reactivity za isolated ligand. Vipimo hivi havibadilishani nafasi.

1. Uchujaji wa takwimu ulifanya nini?

XP docking scores ziliwekwa kwanza katika makundi kulingana na sehemu ya mmea ambako misombo ilipatikana na daraja la fitokemikali. Kwa kuwa data yote haikufuata normal distribution, baada ya Shapiro-Wilk normality check, non-parametric Kruskal-Wallis test ilitumika na, pale significance ilipopatikana, Dunn multiple-comparison test ilitumika.

Kikomo cha statistical significance kiliwekwa kuwa:

\[ p<0.05 \]

.

Mean rank ya chini kwa ujumla inalingana na docking scores zinazofaa zaidi. Hata hivyo, tafsiri ya matokeo ya sehemu za mmea ni yenye mipaka. Kwa kuwa baadhi ya metabolites zimeripotiwa katika zaidi ya sehemu moja, molekuli ileile inaweza kuingia katika zaidi ya kundi moja; hali hii inapunguza independence kamili ya takwimu ya makundi.

Matokeo ya madaraja ya fitokemikali

Kwa 5F1B mean rank ya flavonoids ni 20,82, na kwa 7CMD ni 13,09. Chanzo kinajadili kwamba aromatic system na hydroxyl groups nyingi katika flavonoid scaffold zinaweza kufaa kwa hydrogen bonds, π-interactions na hydrophobic contacts. Hata hivyo, waandishi pia wanataja kama limitation kwamba docking scoring functions zinaweza kutoa systematic advantage kwa polyhydroxylated aromatic structures. Kwa hiyo tofauti ya daraja si ushahidi wa majaribio wa ufanisi halisi wa antiviral.

2. Glide XP docking inapima nini?

Docking hukadiria ni geometric poses zipi ligand inaweza kuchukua katika binding pocket iliyochaguliwa ya target protein na jinsi poses hizo zilivyo favorable chini ya scoring function inayotumika. XP docking score iliyo hasi zaidi huwakilisha mwingiliano uliokadiriwa kuwa favorable zaidi katika modeli iliyotumika; lakini docking score si experimental binding constant.

3. Kwa nini Prime MM-GBSA ilitumika baada ya docking?

Mbali na simplified scoring function ya docking, Prime MM-GBSA ilitathmini upya makadirio ya nishati ya protein-ligand complexes kwa OPLS4 force field na VSGB 2.0 implicit-solvation model. Hatua hii husaidia kutenganisha wagombea wanaoonekana kuwa na docking score nzuri lakini wanakuwa dhaifu katika energy calculation yenye maelezo zaidi.

Jedwali linaonyesha wazi kwamba hakukuwa na uchaguzi wa hatua moja kwa mantiki ya “thamani hasi zaidi ya MM-GBSA = mgombea wa mwisho”. Ingawa Neoannonin na O,O-Dimethylcoclaurine zinaonekana kuwa favorable zaidi katika baadhi ya vipimo vya nishati, wagombea wa mwisho wa MD walichaguliwa kwa uthabiti wa jumla katika vichujio vyote.

4. Makadirio ya ADMET yanatathmini nini?

ADMET ni kifupi cha absorption, distribution, metabolism, excretion na toxicity. Katika utafiti, deep multitask DMPNN model ya ADMETlab 3.0 ilitumiwa kukadiria kihesabu permeability, plasma-protein binding, distribution, blood-brain barrier, CYP interactions, clearance, half-life na toxicity endpoints mbalimbali za wagombea sita waliowekewa kipaumbele.

Kulingana na matokeo ya chanzo, flavonoids kwa ujumla zilionyesha makadirio ya high plasma-protein binding na limited blood-brain-barrier penetration. Neoannonin ilionyesha predicted volume of distribution ya juu zaidi, na Proanthocyanidin membrane permeability ya chini zaidi. Cytochrome P450 interactions zilikadiriwa kwa wagombea kadhaa.

Waandishi wanasema hakuna kati ya wagombea sita aliyeonyesha “prohibitive toxicity profile” inayohitaji kuondolewa moja kwa moja katika hatua hii ya kihesabu. Kauli hii haimaanishi kwamba misombo sita imeonyeshwa kwa majaribio kuwa haina sumu au ni salama. Matokeo ya ADMETlab ni makadirio ya modeli; katika Jedwali 5 la chanzo, classification endpoints nyingi hutolewa tu kama probability za modeli.

Wasifu wa medicinal chemistry

Chanzo kinajadili hasa kwamba Proanthocyanidin ina limitations kwa direct oral developability kwa sababu ya molecular weight kubwa, polar surface area kubwa, idadi kubwa ya hydrogen-bond donor/acceptor groups na predicted permeability ya chini. Kwa hiyo, badala ya kuiita moja kwa moja “drug candidate”, inafaa zaidi kuitafsiri kama biologically active scaffold, mechanistic probe au mgombea anayehitaji pharmaceutical optimization.

5. Induced-fit docking iliongeza nini?

Wakati standard docking mara nyingi hutumia muundo wa receptor ulio relatively fixed, induced-fit docking huruhusu ligand pamoja na nearby protein side chains katika binding pocket kujipanga upya. Hivyo hutathminiwa tena ikiwa ligand inaweza kutoshea kwenye pocket chini ya local protein flexibility.

Baada ya IFD, Proanthocyanidin iliunda mtandao mnene wa hydrogen bonds nane unaohusisha residues kama GLU71, ASN69, GLU103, TRP104, ARG136 na GLU106. Uvangoletin ilionyesha hydrogen bonds nne na LEU162, TYR264, GLY163 na GLN269.

Kikomo cha 5F1B IFD: Chanzo kinasema wazi kwamba hakikuweza kutumia IFD protocol kwenye full multichain GP1-GP2 complex. Kwa kuwa Neoannonin na Chametin/Chamanetin zilichaguliwa hasa kutoka interface region kati ya chains mbili, kuhamisha ligands hizi kwenye isolated chain moja kungebadilisha binding environment. Kwa upande mwingine, Proanthocyanidin ilipelekwa kwenye uchanganuzi wa receptor flexibility kwa sababu ilionyesha tabia thabiti zaidi katika full complex na separate-chain analyses.

Tofauti ya ishara ndani ya chanzo katika Jedwali 7: Kwa Uvangoletin, seli ya \(\Delta G_{\rm IFD}\) katika Jedwali 7 inaandika \(+41.69\). Kinyume chake, muhtasari, Jedwali 4 na maandishi husika ya matokeo yanatoa Prime MM-GBSA kuwa \(-41.69~\mathrm{kcal/mol}\). Verianla haibadilishi rekodi hizi mbili kimya kimya kuwa marekebisho moja.

Simulation ya molecular dynamics ya 100 ns inaonyesha nini na haionyeshi nini?

Molecular dynamics ya 100 ns katika utafiti huu inaonyesha ikiwa binding poses za kihesabu zinahifadhiwa kimuundo kwa muda katika mazingira ya explicit water na jinsi wagombea wanavyotenda ikilinganishwa na reference inhibitors kwenye receptor ileile; haionyeshi moja kwa moja ufanisi wa antiviral, bioavailability au mafanikio ya matibabu.

Mfumo wa molecular dynamics uliundwaje?

Mifumo mitano iliyosolvate iliigwa. Ulinganisho mkuu ni complexes nne: Uvangoletin–PLpro, GRL0617–PLpro, Proanthocyanidin–GP1-GP2 na Toremifene–GP1-GP2. Mfumo wa tano ni control system ambapo Proanthocyanidin imefungamana na isolated GP1 subunit, na maelezo yake yameripotiwa katika Supplementary Material.

RMSD ni nini?

Root mean square deviation (RMSD) hufuatilia wastani wa mkengeuko wa anga wa kundi la atoms dhidi ya reference structure wakati wa simulation. Kutofika kwa protein-backbone RMSD katika eneo fulani na kisha kuendelea kupanda bila udhibiti hutumika kutathmini kwamba muundo haujapata large-scale drift. Utafiti huu unaripoti kwamba complexes zote nne kuu ziliingia katika plateau region ndani ya takriban 10 ns za kwanza.

Kwa nini ligand RMSD ya Uvangoletin ilihesabiwa upya?

Chanzo kilibaini katika automated ligand-RMSD analysis kwamba Uvangoletin ilikuwa imeonekana katika neighboring simulation box chini ya periodic boundary conditions, na hivyo RMSD ya bandia iliyo juu na karibu thabiti ilitokea kuanzia frame ya kwanza. Watafiti waliunganisha tena protein na ligand kutoka trajectory snapshots, wakalinganisha kila frame na frame ya kwanza kwa Kabsch fit kupitia protein backbone, kisha wakahesabu upya ligand heavy-atom RMSD.

Uvangoletin ligand RMSD iliyosahihishwa ilikuwa:

\[ 0.278\pm0.111~\mathrm{nm} \]

. Kwa GRL0617:

\[ 0.176\pm0.066~\mathrm{nm} \]

ilipatikana.

Uvangoletin ilikuwa na mobility kubwa zaidi takriban kati ya 45–65 ns na katika 64 ns ilifikia maximum ya takriban 0,58 nm. Hata hivyo, movement hii haikutafsiriwa kama ligand kuondoka kwenye pocket; hydrogen bond ya GLN269 ilihifadhiwa katika asilimia 92 ya frames zilizochambuliwa.

RMSF na radius of gyration zinaeleza nini?

RMSF hutathmini mobility ya individual protein residues kwa muda. Chanzo kinaripoti kuwa mean RMSF katika mifumo minne ilikuwa takriban 0,11–0,15 nm na kwamba binding-pocket residues zilibadilika kidogo kuliko surface-exposed loop regions.

Radius of gyration hufuatilia compactness ya mgawanyo wa protein atoms kulingana na center of mass. Uthabiti wa Rg values za complexes nne wakati wa simulation ulitafsiriwa kwamba proteins hazikuonyesha large-scale unfolding au collapse.

SASA ilikuwa nini?

Solvent-accessible surface area hufuatilia surface area ya protein complex inayofikika kwa solvent. Chanzo kinaripoti kuwa SASA ilibaki takriban thabiti katika mifumo yote na kwamba ligand binding haikusababisha ufunguzi mkubwa wa surface au structural rearrangement katika proteins.

DSSP ilikagua nini?

DSSP analysis ilifuatilia ikiwa α-helix, β-sheet na vipengele vingine vya secondary structure vya proteins vilihifadhiwa katika trajectory. Katika mifumo yote minne, miundo ya α-helix na β-sheet kwa ujumla ilihifadhiwa; mabadiliko madogo yalionekana katika idadi ndogo tu ya loop regions.

Trajectory MM-GBSA ilitekelezwaje?

Hesabu za MM-GBSA zilifanywa kwenye frames zilizochaguliwa kwa vipindi sawa kutoka 20 ns za mwisho za production trajectories:

\[ N=201 \]

frames.

Masharti makuu yaliyotumika:

• gmx_MMPBSA v1.6.4 na MMPBSA.py v16.0,
• OBC2 Generalized Born model, \(igb=5\),
• mbondi2 intrinsic radii,
• 0,150 M implicit salt concentration,
• 298,15 K,
• LCPO-based solvent-accessible surface area kwa nonpolar solvation.

Configurational entropy haikuhesabiwa. Kwa hiyo, chanzo hutafsiri total values si kama absolute experimental binding free energies, bali kama enthalpy-weighted effective MM-GBSA estimates zinazotumiwa kulinganisha kwa uwiano mgombea na reference wanaofungamana na receptor ileile.

Katika jozi ya Ebola, Toremifene ilionyesha favorable electrostatic component yenye nguvu sana:

\[ -142.9~\mathrm{kcal/mol} \]

lakini faida hii ilisawazishwa kwa kiasi kikubwa na unfavorable polar desolvation component kubwa:

\[ +150.9~\mathrm{kcal/mol} \]

. Electrostatic contribution ya Proanthocyanidin iliripotiwa kuwa −15,1 kcal/mol, polar desolvation penalty +31,1 kcal/mol na van der Waals contribution −46,6 kcal/mol.

Katika jozi ya PLpro, chanzo kikuu cha tofauti ya 6,9 kcal/mol kati ya GRL0617 na Uvangoletin ni van der Waals component:

\[ -38.0~\mathrm{kcal/mol} \quad\text{ve}\quad -30.7~\mathrm{kcal/mol}. \]

Electrostatic contribution ni favorable zaidi kidogo kwa Uvangoletin:

\[ -20.6~\mathrm{kcal/mol} \]

na kwa GRL0617:

\[ -16.1~\mathrm{kcal/mol}. \]

Mwingiliano endelevu wa protein-ligand

Mwingiliano unaodumishwa na Uvangoletin karibu na TYR264, TYR268, GLN269 na PRO247/248 unahusishwa katika chanzo na muundo unaojulikana wa BL2 subpocket ambako GRL0617 hufungamana. Watafiti hutafsiri mfanano huu kama mechanistically meaningful structural hypothesis. Hata hivyo, chanzo kinasema wazi kwamba huu si ushahidi wa majaribio wa enzyme inhibition.

Proanthocyanidin ilitumia chemical strategy tofauti na Toremifene katika GP1-GP2 interface region. Wakati Proanthocyanidin ilionyesha network iliyosambazwa katika hydrophobic na hydrogen-bond contacts nyingi, Toremifene iliunda salt bridge na GP2 GLU523 kupitia protonated tertiary amine yake katika asilimia 60 ya frames.

DCCM inapima nini?

Dynamic cross-correlation matrix (DCCM) hutathmini ikiwa movement za protein residues hutokea pamoja katika mwelekeo uleule, kinyume, au kwa kujitegemea. Chanzo kilinormalize 3 × 3 Cartesian covariance blocks kama:

\[ \frac{C_{ij}} {\sqrt{C_{ii}C_{jj}}} \]

.

Katika PLpro, tofauti ya collective motion kati ya Uvangoletin na GRL0617 ni ndogo: mean absolute deviation katika off-diagonal residue pairs ni 0,107 na asilimia 2,4 tu ya pairs iko juu ya 0,3.

Katika mfumo wa Ebola GP1-GP2, tofauti ya dynamics kati ya mgombea na reference ni kubwa zaidi: mean absolute deviation 0,178; asilimia 18,7 ya pairs iko juu ya 0,3 na asilimia 3,9 juu ya 0,5. Tofauti zilijikita hasa karibu na GP2 na GP1-GP2 interface. Chanzo kinatafsiri hali hii si kama secondary-structure loss, bali kama redistribution ya dynamic coupling kati ya segments.

Free-energy landscape ilihesabiwaje?

Chanzo kilihesabu free-energy landscape kutoka probability density kwenye backbone principal components mbili za kwanza kwa uhusiano:

\[ \Delta G = -k_B T \ln \left( \frac{P}{P_{\max}} \right) \]

.

Hapa \(k_B\) ni Boltzmann constant, \(T=298.15\) K ni temperature, \(P\) ni probability density katika eneo maalum la PC1-PC2, na \(P_{\max}\) ni maximum probability density. Maeneo yenye \(\Delta G\) ya chini zaidi yanawakilisha low-free-energy conformational basins ambazo trajectory ilisample mara nyingi zaidi.

Katika contour ya 2 kJ/mol, trajectory ya PLpro–GRL0617 ilikuwa na asilimia 71 katika basin moja dominant, na trajectory ya Uvangoletin ilikuwa na asilimia 50 katika basin hiyo. Kwa Uvangoletin, secondary minimum iko 3,12 kJ/mol juu ya main minimum na ina frames za 23 ns za kwanza pekee; chanzo hutafsiri hii kama initial state iliyoachwa wakati wa equilibration.

Katika mfumo wa Ebola, complexes zote mbili zilionyesha basins mbili. Secondary basin ya Toremifene ilikuwa 1,35 kJ/mol juu ya global minimum na ilionekana kati ya 16–42 ns. Basins mbili za Proanthocyanidin zilikuwa karibu isoenergetic, zikiwa na tofauti ya 0,76 kJ/mol pekee, na transition ilitokea karibu na 51 ns. Ukweli kwamba Proanthocyanidin ligand RMSD ilibaki chini kwa wakati huo huo ulitafsiriwa kwamba protein ilijipanga upya karibu na binding pose ambayo ligand haikuiacha.

Chanzo hakikugawanya free-energy landscapes hizi katika enthalpy components. Potential energy ya solvated simulation box karibu haina uhusiano na PC1/PC2:

\[ R^2=0.0004. \]

Kwa hiyo, chanzo kinasema kwamba decomposition ya aina hiyo ingeakisi solvent fluctuations zaidi kuliko conformational free energy.

Residue-level MM-GBSA ilionyesha nini?

Jambo la kufundisha ambalo chanzo linasisitiza hasa ni GLU100: ingawa Toremifene–GLU100 contact ilionekana katika asilimia 16 tu ya frames, ilitoa contribution kubwa zaidi katika residue-energy decomposition, −6,24 kcal/mol. Hii inaonyesha kwamba dhana za mwingiliano unaonekana mara ngapi na mchango wake wa energetic ni mkubwa kiasi gani si kitu kimoja.

Kwa nini conceptual DFT iko katika hatua ya mwisho ya utafiti?

DFT analysis haikutumiwa kupanga upya binding scores, bali kulinganisha electronic structures na frontier-orbital reactivity ya final candidates dhidi ya reference inhibitors. Initial geometries zilichukuliwa kutoka frame ya mwisho ya MD trajectories.

Geometry optimization ilifanywa katika:

\[ \mathrm{B3LYP-D3BJ/6-31G(d,p)} \]

level kwa kutumia ORCA 6.1.1 pamoja na CPCM implicit-aqueous solvation. Kutopatikana kwa imaginary frequency katika harmonic frequency analysis kuliunga mkono kwamba optimized structures zilikuwa local minima kwenye potential-energy surface.

Kwa kuwa 6-31G(d,p) basis set haina diffuse functions, single-point calculation yenye basis set kubwa zaidi:

\[ \mathrm{B3LYP-D3BJ/6-311+G(d,p)} \]

ilitumika hasa kwa ufafanuzi wa LUMO.

Chanzo hutengeneza conceptual-DFT descriptors zifuatazo kutoka Koopmans approximation:

\[ IP=-E_{\mathrm{HOMO}} \]

\[ EA=-E_{\mathrm{LUMO}} \]

\[ \chi= \frac{IP+EA}{2} \]

\[ \eta= \frac{IP-EA}{2} \]

\[ S= \frac{1}{2\eta} \]

\[ \omega= \frac{\chi^2}{2\eta} \]

Hapa \(IP\) ni ionization potential, \(EA\) electron affinity, \(\chi\) electronegativity, \(\eta\) chemical hardness, \(S\) softness na \(\omega\) electrophilicity index.

Kwa nini diffuse functions katika DFT zilikuwa muhimu?

Kuongeza diffuse functions kwenye basis set kulibadilisha HOMO-LUMO gaps kwa hadi takriban 0,14 eV, lakini kuliongeza electrophilicity index values kwa asilimia 22–39 katika ligands zote nne. LUMO ya Proanthocyanidin katika kiwango cha 6-31G(d,p) ilikuwa:

\[ -0.02~\mathrm{eV} \]

ilhali katika hesabu yenye diffuse functions ilikuwa:

\[ -0.55~\mathrm{eV} \]

. Chanzo kilitathmini thamani ya kwanza kuwa representation ya orbital ambayo haijafungamana vya kutosha kimwili, na hivyo kilitumia extended basis set kwa frontier-orbital descriptors.

Toremifene iliigwa katika simulation katika protonated form yenye net charge +1. Kwa kuwa dipole moment ya charged species inategemea coordinate origin, chanzo hakikuripoti dipole moment kwa Toremifene. Kwa hiyo ulinganisho wa Proanthocyanidin–Toremifene uliwekwa hasa kwenye tofauti za orbital energy kama HOMO-LUMO gap na hardness.

Kikomo cha tafsiri ya matokeo ya DFT ni muhimu hasa: descriptors hizi zinaeleza electronic structure ya isolated ligands katika solution. Hazipimi protein-binding affinity, hazibatilishi trajectory MM-GBSA na hazionyeshi antiviral activity.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Rasilimali za kihesabu

Muhtasari wa mbinu hatua kwa hatua

1. Fitokemikali 106 za Uvaria chamae zilizoripotiwa hapo awali zilichukuliwa kama initial dataset.
2. Joolanin, ambayo muundo wake haukuweza kubainishwa kwa kuaminika, iliondolewa na misombo 105 ikahifadhiwa.
3. Ligands ziliandaliwa kwa LigPrep; protonation/ionization states zilitengenezwa katika pH 7,4 ± 2,0 na optimized kwa OPLS4.
4. Lengo la Ebola 5F1B na lengo la SARS-CoV-2 7CMD yalipitia protein-preparation protocol.
5. Docking protocol ya 7CMD ilivalidate kwa redocking ya co-crystallized ligand na RMSD ya 0,24 Å ikapatikana.
6. Kwa kuwa hakukuwa na small-molecule reference inayofaa kwa 5F1B, binding pocket ilibainishwa kwa SiteMap.
7. Fitokemikali 105 zilifanyiwa docking kwa Glide XP.
8. Docking scores zilichunguzwa kwa Shapiro-Wilk, Kruskal-Wallis na Dunn tests kulingana na sehemu ya mmea na daraja la fitokemikali.
9. Docked complexes zote zilifanyiwa rescoring kwa Prime MM-GBSA.
10. Fitokemikali sita zenye kipaumbele cha juu zilichaguliwa kwa kutathmini pamoja binding score, energy, interaction profile na ADMET.
11. ADMET, physicochemical na medicinal-chemistry profiles za wagombea hawa sita zilichunguzwa.
12. Complexes zilizochaguliwa zilitathminiwa upya chini ya local receptor flexibility kwa induced-fit docking.
13. Proanthocyanidin kwa Ebola na Uvangoletin kwa PLpro zilichaguliwa kama wagombea wakuu wa MD.
14. Wagombea walilinganishwa na references Toremifene na GRL0617 kwenye receptor ileile chini ya MD ya 100 ns.
15. RMSD, RMSF, Rg, SASA, hydrogen bonds, DSSP, PLIP, PCA, DCCM, FEL na residue-level energy decomposition zilichambuliwa.
16. Trajectory MM-GBSA ilihesabiwa kwa kutumia 20 ns za mwisho na frames 201.
17. Final ligand geometries zilioptimized kwa DFT na conceptual-DFT descriptors zikahesabiwa.
18. Kwa kutathmini filters zote pamoja, Proanthocyanidin na Uvangoletin ziliwekewa kipaumbele kwa experimental validation.

Kwa nini Proanthocyanidin ilichaguliwa kama mgombea wa Ebola?

Proanthocyanidin ilionyesha nafasi za juu kwa kurudiwa katika full GP1-GP2 complex na separate GP chains, iliunda dense hydrogen-bond network baada ya induced-fit docking, na katika MD ya 100 ns ilihifadhi binding pose kwa uthabiti zaidi ikiwa na ligand RMSD ya chini kuliko Toremifene.

Hata hivyo, kuna mipaka miwili muhimu:

• Makadirio ya trajectory MM-GBSA energy ya Toremifene ni favorable zaidi kuliko ya Proanthocyanidin.
• High molecular weight, high TPSA na low predicted permeability ya Proanthocyanidin vinapunguza direct oral developability yake.

Kwa hiyo, utafiti hauiweki Proanthocyanidin kama “dawa bora zaidi ya antiviral”, bali kama computational lead/scaffold yenye uthabiti wa kimuundo na mgombea wa experimental investigation.

Kwa nini Uvangoletin ilichaguliwa kama mgombea wa PLpro?

Ingawa Diuvaretin ilitoa score inayofaa zaidi katika IFD, Uvangoletin ilionyesha profile yenye uwiano zaidi katika filters zote. Molekuli ilikuwa final MD candidate kwa sababu ya QED ya juu zaidi, ulinganifu wa Lipinski/Golden Triangle na interactions endelevu na residues muhimu katika BL2 region ya PLpro.

Uvangoletin ilibaki katika PLpro pocket kwa 100 ns; ilidumisha GLN269 hydrogen bond katika asilimia 92 ya frames na candidate–reference DCCM difference ilibaki ndogo. Hata hivyo, ligand RMSD yake ni kubwa kuliko ya GRL0617 na trajectory MM-GBSA energy yake si favorable kama ya GRL0617. Kwa hiyo hitimisho si kwamba “Uvangoletin ni inhibitor bora kuliko GRL0617”.

Matokeo yanayoungwa mkono na utafiti

• Inawezekana kuweka kipaumbele kwa fitokemikali 105 za Uvaria chamae kwa filters za kihesabu za hatua nyingi badala ya score moja.
• Sehemu ya mmea haikuunda tofauti ya takwimu yenye nguvu na thabiti katika global docking performance.
• Wagombea wenye nafasi za juu walipatikana hasa kati ya misombo iliyoripotiwa katika mizizi na mashina.
• Flavonoids kwa ujumla zilionyesha docking ranks zinazofaa zaidi katika malengo yote mawili yaliyochunguzwa.
• Proanthocyanidin ilionyesha candidate profile thabiti katika multiple structural analyses za mfumo wa Ebola GP.
• Uvangoletin ilionyesha interactions endelevu katika BL2 pocket ya PLpro inayohusishwa na GRL0617 kwa 100 ns MD.
• Backbone RMSD, Rg, SASA na secondary-structure profiles za candidate na reference protein complexes kwa ujumla zilibaki thabiti wakati wa 100 ns.
• Katika trajectory MM-GBSA, reference inhibitors zilitoa makadirio ya nishati yanayofaa zaidi kuliko wagombea katika malengo yote mawili.
• Conceptual DFT ilionyesha kwamba Proanthocyanidin na Uvangoletin zina HOMO-LUMO gaps pana zaidi na hardness values za juu zaidi kuliko references zao.
• Molekuli mbili za mwisho ni computational starting points zenye mantiki ya kimuundo na kielektroniki kwa experimental validation inayofuata.

Matokeo ambayo utafiti hauungi mkono

• Haijaonyeshwa kwamba Proanthocyanidin huzuia virusi vya Ebola katika seli au kiumbe hai.
• Haijaonyeshwa kwa majaribio kwamba Uvangoletin huzuia SARS-CoV-2 replication au PLpro enzyme activity.
• Hakuna mgombea aliyepimwa kwa IC50, EC50 au reduction ya viral load.
• Computational ADMET results si data halisi za human pharmacokinetics au safety.
• Trajectory ya MD ya 100 ns si ushahidi wa clinical au biological efficacy.
• Docking score si experimental dissociation constant au binding affinity.
• Prime MM-GBSA na trajectory MM-GBSA values si vipimo vya experimental free energy.
• DFT HOMO-LUMO gap haipimi moja kwa moja nguvu ya protein binding.
• Haijaonyeshwa kwamba mizizi na mashina ni intrinsically antiviral zaidi kuliko sehemu nyingine.
• Real cellular antiviral efficacy ya flavonoids dhidi ya malengo haya haikujaribiwa katika utafiti huu.
• Kuweka kipaumbele kwa molekuli tofauti katika malengo ya virusi viwili tofauti hakuonyeshi kwamba kiwanja kimoja kinalenga virusi vyote viwili kwa wakati mmoja.

Mapungufu makuu ya kimetodolojia

• In silico kabisa: Matokeo yote ni ya kihesabu; hakuna biochemical au cell-based validation.
• Trajectory moja ya 100 ns: Production trajectory moja ilitumika kwa kila main complex; variation kati ya trajectories haikupimwa.
• Hakuna dhamana ya full convergence: Structural stability ya 100 ns haithibitishi kwamba full conformational space imesampleiwa.
• Force-field dependence: Matokeo yanaweza kuathiriwa na uchaguzi wa modeli kama AMBER99SB-ILDN, GAFF2 na TIP3P.
• Ebola GP model: Mfumo wa MD hauna full trimer, membrane, NPC1 na hasa native glycosylation.
• MM-GBSA limitation: Ni endpoint approach na configurational entropy haikuhesabiwa.
• ADMET model domain: Miundo tata ya kikemia ya natural products inaweza kuwa nje au pembezoni mwa applicability domain ya prediction models.
• Filters si independent: Baadhi ya hatua za docking, MM-GBSA, IFD na MD zinategemea initial structures, protonation states na force fields zilezile.
• Class sample sizes: N values za fitokemikali classes si sawa na zinaweza kuathiri rank-based comparisons.
• Organ groups si independent: Kwa kuwa metabolite ileile inaweza kupatikana katika sehemu nyingi, dhana ya full independence katika organ statistics inaweza kudhoofika.

Hatua za majaribio zinazofuata zinazopendekezwa na chanzo

Waandishi wanapendekeza PLpro enzymatic-inhibition assays, GP-NPC1 competition au pseudovirus-entry assays, cell-based antiviral testing, cytotoxicity assessment, solubility, permeability, microsomal stability na metabolite profiling ili kubainisha real antiviral potential ya computational candidates. Pia wanasema structural hypotheses zinapaswa kujaribiwa tena kwa replicated MD simulations, ensemble receptor conformations na glycosylated GP model.

Vidokezo vya uwasilishaji na uthabiti ndani ya chanzo

• Kwa Uvangoletin, katika abstract, Jedwali 4 na prose, thamani ya Prime MM-GBSA ni −41,69 kcal/mol, lakini katika seli ya \(\Delta G_{\rm IFD}\) ya Jedwali 7 inaonekana kama +41,69.
• Sehemu ya general computational resources inatoa tarehe ya kufikia RCSB PDB kuwa 7 Oktoba 2026, ilhali sehemu ya protein preparation inatoa 25 Mei 2026.
• Katika Jedwali 4, baadhi ya control docking-score cells zinaonekana kuchapishwa kama “−5429” au “−6566” bila decimal point; cells hizi hazikuhamishwa katika Verianla kwa precise quantitative comparison.
• Ingawa Proanthocyanidin ni final Ebola candidate, haikutoa thamani hasi zaidi kati ya vipimo vyote vya 5F1B MM-GBSA; uchaguzi ulitegemea multi-criteria consistency.
• Ingawa Uvangoletin ni final PLpro candidate, best IFD score ni ya Diuvaretin; Uvangoletin ilichaguliwa kwa overall developability balance.

Dokezo la Chanzo na Mbinu

Kichwa asili: Hierarchical Computational Prioritization of Uvaria chamae Phytochemicals Targeting Ebola Virus Glycoprotein and SARS-CoV-2 PLpro

Waandishi: Sèdami Medegan Fagla, Toussaint Sovegnon, Mélaine Bete, Mariette Sanvi, Boris Legba, Konei E. Hounsou, Jean-Robert Klotoe, Victorien Dougnon.

Mpangilio wa waandishi: Sèdami Medegan Fagla → Toussaint Sovegnon → Mélaine Bete → Mariette Sanvi → Boris Legba → Konei E. Hounsou → Jean-Robert Klotoe → Victorien Dougnon.

Mwandishi wa mawasiliano: Victorien Dougnon.

Mchango sawa: Chanzo hakina taarifa ya equal first authorship au equal contribution.

Taasisi 1: Medicinal and Organic Chemistry Laboratory, Faculty of Health Sciences, University of Abomey-Calavi, Cotonou, Benin.

Taasisi 2: Research Unit in Applied Microbiology and Pharmacology of Natural Substances, Research Laboratory in Applied Biology, Polytechnic School of Abomey-Calavi, University of Abomey-Calavi, Abomey Calavi, Benin.

Taasisi 3: Research Unit in Plant Physiology and Adaptation to Abiotic Stresses, Laboratory of Plant Science and Pharmacopoeia, University of Abomey-Calavi, Abomey Calavi, Benin.

Jarida: Compounds.

Mchapishaji: MDPI, Basel, Switzerland.

Juzuu / toleo / namba ya makala: 6(4), 57.

DOI: 10.3390/compounds6040057.

Uwasilishaji: 20 Julai 2026.

Marekebisho: 17 Septemba 2026.

Kukubaliwa: 4 Oktoba 2026.

Kuchapishwa: 9 Oktoba 2026.

Aina ya chanzo: Makala ya utafiti iliyopitiwa na wenzao kuhusu computational natural products / molecular modeling / antiviral candidate prioritization.

Leseni: Creative Commons Attribution 4.0 International, CC BY 4.0.

Seti kuu ya data: Fitokemikali 105 za Uvaria chamae zilizoainishwa kimuundo katika maandiko; joolanin iliondolewa kutoka misombo 106 ya awali kwa sababu ya structural uncertainty.

Malengo ya virusi: Ebola virus glycoprotein GP1-GP2 / PDB 5F1B na SARS-CoV-2 papain-like protease PLpro / PDB 7CMD.

Mlolongo mkuu wa mbinu: Shapiro-Wilk → Kruskal-Wallis → Dunn multiple comparison → Glide XP docking → Prime MM-GBSA → ADMETlab 3.0 → medicinal-chemistry profiling → induced-fit docking → 100 ns GROMACS molecular dynamics → trajectory MM-GBSA → PLIP/PCA/DCCM/FEL → conceptual DFT.

Docking validation: 7CMD co-crystallized ligand redocking RMSD = 0,24 Å. Kwa kuwa hakukuwa na co-crystallized small-molecule ligand inayofaa kwa 5F1B, binding pocket ilitabiriwa kwa SiteMap.

Final computational candidates: Proanthocyanidin kwa Ebola GP; Uvangoletin kwa SARS-CoV-2 PLpro.

Reference inhibitors: Toremifene katika ulinganisho wa Ebola GP1-GP2 MD; GRL0617 katika ulinganisho wa PLpro.

Ufadhili: Waandishi walisema hawakupokea ufadhili maalum kwa utafiti huu.

Upatikanaji wa data: Ilielezwa kwamba michango asili ya utafiti imo katika makala na Supplementary Materials, na maswali ya ziada yanaweza kuelekezwa kwa mwandishi wa mawasiliano.

Mgongano wa maslahi: Waandishi walitangaza kutokuwa na conflict of interest.

Michango ya waandishi: S.M.F. conceptualization na review/editing ya makala; T.S. conceptualization, method development, calculations, data analysis/interpretation, figures na first draft; M.B. conceptualization, methodology, interpretation ya matokeo na editing; M.S. na B.L. data validation na editing; K.E.H. methodology, data validation na editing; J.-R.K. na V.D. supervision pamoja na review/editing.

Taarifa ya matumizi ya akili bandia: Waandishi walieleza kwamba walitumia Claude (Anthropic, 2026) katika design na production ya graphical abstract, na ChatGPT (GPT-5.5 Instant; OpenAI) kusaidia English-language editing na translation; wao wenyewe walipitia na kuhariri outputs na wakakubali responsibility ya maudhui ya publication.

Hitimisho kuu la kisayansi: Hierarchical computational workflow ilipunguza molekuli 105 kwa vigezo vingi na kutambua Proanthocyanidin na Uvangoletin kama prioritized computational candidates zinazoweza kupelekwa katika experimental validation.

Kikomo muhimu zaidi cha tafsiri: Antiviral activity ya moja kwa moja haikupimwa katika utafiti. Matokeo ya docking, MD, MM-GBSA, ADMET au DFT si ushahidi wa clinical au cellular antiviral efficacy.

Kikomo cha molecular dynamics: Production trajectory moja ya 100 ns kwa kila complex haithibitishi full convergence au variability kati ya trajectories.

Kikomo cha structural model ya Ebola: Main GP1-GP2 MD model haina full trimer, membrane, NPC1 na hasa native glycosylation; vipengele hivi vinaweza kubadilisha actual binding-pocket accessibility na dynamics.

Kikomo cha MM-GBSA: Configurational entropy haikuhesabiwa; values ni effective energy estimates zinazotumika kwa relative comparison ya ligands kwenye receptor ileile.

Kikomo cha DFT: Conceptual-DFT descriptors zinaeleza electronic structure ya isolated ligand; si kipimo cha protein-ligand binding affinity.

Tofauti ya ishara ya nishati ndani ya chanzo: Kwa Uvangoletin, main text na Jedwali 4 zinatoa Prime MM-GBSA ya −41,69 kcal/mol, ilhali Jedwali 7 linaonyesha +41,69 katika seli husika.

Tofauti ya tarehe ya ufikiaji ndani ya chanzo: Tarehe ya kufikia RCSB PDB inaonekana kama 7 Oktoba 2026 na pia 25 Mei 2026 ndani ya chanzo.

Hitaji la experimental validation: Chanzo kinasema wazi kwamba tafiti zinazofuata kama PLpro enzyme inhibition, GP-NPC1 competition/pseudovirus-entry, cell-based antiviral assay, cytotoxicity, solubility, permeability, microsomal stability na metabolite profiling zinahitajika.