Katika tathmini ya maabara ya dawa za saratani, tamaduni za kawaida za seli za pande mbili hukuza seli kwenye uso tambarare. Ingawa mifumo hii ni rahisi kutumia, haiwezi kuwakilisha kikamilifu gradieni za oksijeni, virutubisho, taka za kimetaboliki na mwingiliano wa seli kwa seli unaopatikana katika tishu halisi za uvimbe. Sferoidi za uvimbe za pande tatu huruhusu seli kuunda muundo wa duara unaofanana na tishu na hivyo kuakisi kwa uhalisia zaidi baadhi ya sifa za mazingira madogo ya uvimbe.

Hasara muhimu ya modeli za pande tatu ni ugumu wa kufuatilia uhai na mwitikio wa dawa kwa kuendelea kwa muda. Hadubini ya bright-field inaweza kuonyesha umbo na ukubwa wa sferoidi, lakini hutoa taarifa chache kuhusu uadilifu wa utando wa seli, kizuizi ambacho seli huunda dhidi ya mtiririko wa elektroliti au mabadiliko ya kifiziolojia katika mgusano wa seli na elektrodi. Vipimo vya mwisho kama live–dead staining kwa kawaida huonyesha hali katika muda fulani tu wa jaribio na vinaweza kuzuia kufuatiliwa kwa sampuli hiyo hiyo baadaye.

Utafiti huu uliunganisha electrical impedance spectroscopy na microelectrode arrays ili kufuatilia sferoidi za uvimbe za pande tatu bila lebo na bila kuharibu tishu. Mfumo unatumia K-means clustering, mojawapo ya mbinu za ujifunzaji wa mashine usiosimamiwa, ili kutambua kiotomatiki jozi za elektrodi zinazofunikwa na sferoidi.

Mantiki ya msingi ya kipimo ni hii:

• Sferoidi inapokaa juu ya elektrodi, njia ya mkondo wa ioni hubadilika.
• Utando wa seli na pengo kati ya seli na elektrodi huunda kizuizi cha umeme.
• Impedance kati ya jozi za elektrodi huongezeka hasa katika masafa ya 1–100 kHz.
• Seli zinapokufa, kupungua ukubwa, kutengana au kupoteza mgusano na elektrodi, impedance hupungua.

Katika utafiti, sferoidi zilitengenezwa kutoka seli za saratani ya kolorektali ya binadamu HCT-116 na HT-29. Kila sferoidi iliundwa kwa kukuza seli 1.000 katika sahani za visima 96 zenye chini ya U kwa siku tatu, na baada ya kufikia kipenyo cha takriban 200–300 µm ilihamishiwa juu ya microelectrode arrays.

Mifumo miwili tofauti ya microelectrode ilitumika:

Vipimo vya impedance vilifanywa katika masafa ya 100 Hz–1 MHz, kwa hatua 100 za masafa na msisimko wa sinusoidal wa ±10 mV. Baada ya kusubiri saa 2–5 ili sferoidi zishikamane na uso wa elektrodi, kipimo cha mwanzo kilichukuliwa; baadaye rekodi za kila siku ziliendelea hadi saa 80.

Ili kusawazisha mabadiliko ya umeme, utafiti ulitumia modified relative impedance change, yaani RIC:

\[ \mathrm{RIC} = \frac{Z_s-Z_{ref}} {Z_s+Z_{ref}} \times 100\% \]

Hapa:

• Z_s ni impedance katika kipimo chenye sferoidi,
• Z_ref ni impedance katika hali ya rejea

vinawakilisha.

Kwa kuwa mlinganyo huu hugawanya tofauti kwa jumla ya thamani hizo mbili, kinadharia huweka kipimo kati ya −%100 na +%100. RIC chanya na ya juu inaonyesha kwamba mgusano wa sferoidi na elektrodi umeongeza impedance ikilinganishwa na rejea.

Hata hivyo, katika baadhi ya sentensi za sehemu ya mbinu, Z_s na Z_ref zimefafanuliwa kama “RIC”. Katika mlinganyo, vigezo hivi vinapaswa kuwa impedance, lakini maandishi yanachanganya istilahi za impedance na RIC. Tatizo hili la uripoti linahitaji ufafanuzi ili mlinganyo urudiwe.

Katika sferoidi ya mfano ya kwanza, jozi 30 za elektrodi jirani zilichunguzwa. Katika jozi tano zilizofunikwa na sferoidi, thamani za juu za RIC zilikuwa kati ya %29–58; katika jozi 25 zilizogusana tu na medium ya utamaduni, kwa kawaida zilikuwa chini ya %10. Kwa mfano huu, watafiti walichagua kwa mkono kizingiti cha %16 na wakaonyesha kwamba uainishaji wa umeme uliendana kwa ujumla na picha ya optiki.

Baadaye K-means clustering ilitumika kuondoa hitaji la mtu kuchagua kizingiti kwa kila sferoidi. Thamani za juu za RIC ziligawanywa katika makundi mawili:

• Jozi za elektrodi zisizofunikwa na sferoidi
• Jozi za elektrodi zilizo katika mgusano wa moja kwa moja na sferoidi

Vituo vya makundi vilipofafanuliwa kama C₀ na C₁, kizingiti cha kiotomatiki kilihesabiwa kama:

\[ T = \operatorname{round} \left( \frac{C_0+C_1}{2} \right) \]

ndivyo kilivyohesabiwa.

Watafiti walitathmini uchambuzi wa maendeleo ya kizingiti katika sferoidi 74 na jozi 2.422 za elektrodi. Seti hii ya data ilijumuisha HCT-116, HT-29, fibroblasti za dermis ya binadamu, seli za glioblastoma U87 MG na modeli mbili tofauti za co-culture.

Ingawa sehemu moja ya maandishi inatumia kauli “aina tano tofauti na mchanganyiko mmoja”, vikundi vilivyoorodheshwa ni modeli nne za seli moja na co-culture mbili, jumla ya makundi sita. Hii ni dosari ndogo lakini muhimu ya kuhesabu katika maelezo ya mbinu.

Katika usambazaji wa pamoja, thamani za juu za RIC za elektrodi zilizogusana tu na medium ya utamaduni zilikusanyika zaidi katika %15–20. Kwa elektrodi zilizofunikwa na sferoidi, usambazaji ulikuwa na kilele katika %20–35 na mkia uliopanuka hadi takriban %80. Kuingiliana kwa sehemu kwa usambazaji huu miwili kunaonyesha kwa nini kizingiti kinachobadilishwa kwa kila sferoidi kilitumika badala ya kizingiti kimoja kisichobadilika kwa sferoidi zote.

Mfumo ulifuatilia mwitikio wa 25 µM Navitoclax katika sferoidi za HCT-116 na 10 µM Navitoclax katika sferoidi za HT-29. Navitoclax ilitumika katika utafiti kama uingiliaji wa majaribio wa sitotoksiki ili kuanzisha kifo cha seli.

Katika jaribio la mfano la HCT-116 kwenye MEA ya kioo:

• Profaili ya impedance ya sferoidi isiyotibiwa ilidumu kwa kiasi kikubwa kwa saa 48.
• Uhai wa mwisho wa sferoidi ya udhibiti ulipimwa kuwa %91.
• Katika sferoidi iliyotibiwa kwa 25 µM Navitoclax, RIC ilipungua kwa muda.
• Kwa athari ya jumla ya muda, p = 0,006 iliripotiwa.
• Hakukuwa na tofauti ya maana kati ya saa 2–5 na saa 17–26: p = 0,515.
• Kupungua kwa maana kulitokea kati ya saa 17–26 na saa 30–48: p = 0,049.
• Uhai wa sampuli iliyotibiwa ulipungua hadi %28 katika saa ya 48.

Katika uchambuzi mpana wa HCT-116, sferoidi 16 za udhibiti na sferoidi 16 zilizopokea Navitoclax mwanzoni zilifuatiliwa hadi saa 80. Katika udhibiti, impedance iliongezeka kidogo kwa muda, lakini tofauti hazikuwa na maana ya kitakwimu. Uhai wa sferoidi za udhibiti kwa ujumla uliendelea kuwa juu ya %80 hadi hatua ya mwisho.

Katika kundi la Navitoclax, kushuka kwa impedance kulionekana wazi katika saa 30–48 na kufikia kiwango kikubwa zaidi katika saa 60–80. Katika hatua ya mwisho, wastani wa uhai ulipungua hadi takriban %20. Hata hivyo, maelezo ya kielelezo yanasema kwamba tofauti za uhai kati ya nyakati hazikuwa na maana ya kitakwimu. Kwa hiyo, kushuka kwa impedance ya umeme kunaonekana kuwa na nguvu ya kitakwimu, lakini vipimo vya mwisho vya uhai havikutoa ulinganisho wa muda wenye nguvu sawa.

Katika sferoidi za HT-29 kwenye MEA ya wavu, jozi ambapo elektrodi zote mbili katikati ya sferoidi zilifunikwa na seli zilifikia RIC ya takriban %90, huku jozi za pembeni ambapo elektrodi moja tu ilifunikwa zikibaki karibu %60. Hii inaonyesha kwamba ishara inayopimwa haiathiriwi tu na uwepo wa seli, bali pia na kiwango cha mgusano wa moja kwa moja wa jozi ya elektrodi na seli.

Katika majaribio ya MEA ya wavu:

• Kundi la udhibiti lilikuwa na n = 5 sferoidi.
• Kundi la 10 µM Navitoclax lilikuwa na n = 4 sferoidi.
• RIC ya udhibiti iliongezeka siku ya kwanza na kisha ikabaki kwa kiasi kikubwa thabiti.
• Katika kundi la Navitoclax, kupungua kulianza kuwa wazi baada ya siku ya pili.
• Katika saa 60–80, maximum RIC ilishuka chini ya takriban %40.
• Kupungua kati ya saa 17–26 na saa 60–80 kuliripotiwa kuwa p < 0,001.

Hitimisho kuu la utafiti ni kwamba impedance inayopimwa na microelectrode arrays inaweza kufuatilia mgusano wa sferoidi na uso wa elektrodi na mabadiliko yake ya kifiziolojia kwa muda. Algorithimu ya K-means ilipunguza hitaji la kuchagua kizingiti kwa mkono kwa kutambua kiotomatiki elektrodi zinazogusana na sferoidi.

Hata hivyo, impedance haipimi moja kwa moja na kwa pekee “asilimia ya seli hai”. Kipimo kinaweza kuathiriwa na mambo yote yafuatayo:

• Uadilifu wa utando wa seli
• Nguvu ya kushikamana kwa sferoidi na elektrodi
• Miunganisho kati ya seli
• Ukubwa na umbo la sferoidi
• Pengo la kimiminika kati ya elektrodi na sferoidi
• Nafasi ya sferoidi juu ya elektrodi
• Sifa za umeme za medium ya utamaduni

Kwa hiyo, kushuka kwa RIC kunaweza kuambatana na kifo cha seli, lakini asilimia halisi ya seli hai haiwezi kuhesabiwa kutoka RIC pekee. Utafiti uliunga mkono hili kwa terminal live–dead fluorescence staining, lakini haukuunda modeli ya kukadiria uhai kwa kiasi au kipimo cha usahihi wa kliniki.

Tatizo kuu la utafiti ni lipi?

Modeli inayotumiwa kuchunguza athari za dawa za saratani maabara inapaswa kuwakilisha uvimbe halisi kwa kiwango kinachofaa. Katika utamaduni wa pande mbili, seli hukua kama tabaka moja kwenye plastiki au kioo. Katika mazingira haya karibu seli zote hukutana na viwango vinavyofanana vya oksijeni, virutubisho na dawa.

Katika uvimbe halisi na sferoidi za pande tatu, hali ni tofauti:

• Tabaka za nje hupata oksijeni na virutubisho zaidi.
• Oksijeni inaweza kupungua kuelekea katikati.
• Taka za kimetaboliki zinaweza kujikusanya katika maeneo ya ndani.
• Uingiaji wa dawa ndani ya tishu unaweza kuwa mdogo.
• Maeneo ya hipoksia au nekrosisi yanaweza kutokea katikati.
• Mwingiliano wa seli–seli na seli–matrix unaweza kubadilisha mwitikio wa dawa.

Kwa sababu hizi, sferoidi za uvimbe za pande tatu zinaweza kuwa modeli ya preclinical yenye uhalisia zaidi wa kibaolojia kuliko utamaduni wa pande mbili.

Hata hivyo, ni vigumu kufuatilia hali ya kifiziolojia ya sferoidi kwa kuendelea. Hadubini huonyesha mwonekano wa sferoidi, lakini huenda isitambue mapema kama seli bado zinaunda kizuizi cha umeme au kama uadilifu wa utando unaanza kuharibika.

Tatizo kuu ambalo utafiti unajaribu kutatua ni:

Je, nafasi ya sferoidi ya uvimbe ya pande tatu juu ya elektrodi, mabadiliko ya kifiziolojia yanayohusiana na uhai na mwitikio wa dawa yanaweza kufuatiliwa kwa umeme na kiotomatiki bila kuchunguza picha kwa mkono?

Electrical impedance spectroscopy ni nini?

Katika electrical impedance spectroscopy, ishara ndogo sana ya umeme wa kubadilishana huwekwa kwenye sampuli ya kibaolojia. Mfumo hupima kiwango ambacho sampuli inazuia mkondo katika masafa tofauti.

Kwa ujumla impedance inaweza kuelezwa kwa uhusiano:

\[ Z(f) = \frac{V(f)}{I(f)} \]

inaweza kuelezwa kwa uhusiano huu.

Hapa:

• Z(f) ni impedance katika masafa fulani,
• V(f) ni voltage iliyowekwa,
• I(f) ni mkondo uliopimwa,
• f ni masafa ya ishara

vinawakilisha.

Mlinganyo huu wa msingi haukutolewa wazi katika utafiti; umeongezwa ili kueleza mantiki ya kifizikia ya EIS.

Impedance si upinzani wa kawaida wa umeme pekee. Utando wa seli unaweza kuwa na tabia ya capacitive; uso wa elektrodi, mazingira ya kimiminika na pengo la seli–elektrodi pia huunda sifa za umeme zinazotegemea masafa.

Kwa nini impedance huongezeka sferoidi inapokuwa juu ya elektrodi?

Kwa kuwa medium ya utamaduni hubeba ioni, mkondo wa umeme unaweza kupita kwa urahisi kiasi kati ya elektrodi. Seli au mkusanyiko wa seli unapowekwa juu ya elektrodi, njia ya mkondo hufungwa kwa sehemu au kuwa ndefu zaidi.

Utando wa seli na mikusanyiko minene ya seli unaweza:

• Kuzuia ioni kufikia elektrodi moja kwa moja
• Kulazimisha mkondo kupita katika njia nyembamba zaidi za kimiminika kuzunguka seli
• Kubadilisha capacitance halisi kati ya elektrodi na medium ya utamaduni
• Kuongeza kizuizi cha umeme katika mgusano wa seli–elektrodi

Kwa hiyo, jozi za elektrodi zilizo katika mgusano wa moja kwa moja na sferoidi zinaweza kuonyesha impedance ya juu kuliko jozi zilizo wazi kwa medium pekee.

Kwa nini masafa ya kati ni muhimu?

Mabadiliko yanayotofautisha zaidi katika utafiti yalionekana katika 1–100 kHz. Mikunjo ya RIC iliunda kilele chenye umbo la kengele katika eneo hili.

Watafiti walichagua maximum RIC katika masafa haya:

\[ \mathrm{maxRIC}_i = \max_{1\,\mathrm{kHz}\leq f\leq100\,\mathrm{kHz}} \mathrm{RIC}_i(f) \]

Hapa i inawakilisha jozi ya elektrodi inayopimwa.

Uwasilishaji huu umeandaliwa ili kueleza mantiki ya uchambuzi wa utafiti. Kutoka spektrum nzima ya kila jozi ya elektrodi, thamani moja ya juu ilichukuliwa na kutumiwa katika uainishaji.

Sferoidi za pande tatu ziliundwaje?

Seli za saratani ya kolorektali ya binadamu HCT-116 na HT-29 zilikuzwa katika media tofauti. Katika kila kisima:

\[ 1.000\ \mathrm{hücre}/200\ \mu L \]

zilipandwa.

Sahani zenye chini ya U zilirahisisha seli kukusanyika katikati na kuunda muundo wa duara. Visima vilipakwa awali suluhisho linalozuia kushikamana ili seli zisienee kwenye plastiki bali zishikamane zenyewe.

Baada ya siku tatu za utamaduni, sferoidi zilifikia kipenyo cha takriban 200–300 µm. Kisha zilihamishwa moja moja kwenye MEA kwa ncha ya pipette.

Ni muhimu sferoidi zisiharibike wakati wa uhamisho. Maandishi yanasema baadhi ya sferoidi zilivunjika wakati wa transfer na zikaondolewa katika uchambuzi wa uhai. Uondoaji huu unaweza kuleta selection bias kwa sababu sferoidi dhaifu zaidi au zilizoharibika zaidi haziwakilishwi katika matokeo ya uhai.

Kwa nini sferoidi zilisubiriwa saa 2–5?

Mara tu sferoidi inapowekwa kwenye MEA, inaweza kutokuwa na mgusano thabiti na elektrodi. Harakati ndogo katika kimiminika zinaweza kuisogeza na tabaka la kimiminika linaweza kubaki kati ya sferoidi na elektrodi.

Kwa hiyo, kabla ya kipimo cha kwanza, saa 2–5 zilisubiriwa ili sferoidi ishikamane na elektrodi. Kizingiti cha kiotomatiki kwenye MEA ya kioo kilibainishwa katika hatua hii ya kwanza ya saa 2–5.

Katika MEA ya wavu, kwa sababu kushikamana kwa nguvu zaidi na RIC ya juu zaidi vilitokea siku ya kwanza, kipimo cha saa 17–26 kilitumika kutambua elektrodi hai.

MEA ya kioo iliundwaje?

Katika MEA ya kioo, elektrodi ziliwekwa kwa nafasi ya 70 µm. Uso wenye vinyweleo na impedance ya chini wa elektrodi za iridium oxide husaidia kupata rekodi nyeti kutoka sampuli za kibaolojia.

Njia za conductive zilihamiwa kwa silicon nitride. Ili kuongeza kushikamana kwa sferoidi na elektrodi, uso ulitibiwa kwa plasma kwa:

• shinikizo la 0,2 mbar,
• nguvu ya 80 W,
• dakika mbili

Baadaye kifaa kilisafishwa kwa maji yaliyodistiliwa na kutakaswa kwa mwanga wa ultraviolet kwa dakika 30.

Kwa nini chumba maalum cha SLA kilitengenezwa?

Watafiti walitengeneza chumba maalum cha silinda kwa printa ya pande tatu ya stereolithography, yaani SLA, ili kupunguza kuondoka kwa sferoidi kwenye eneo la elektrodi kutokana na harakati za kimiminika.

Hata hivyo, sehemu ya mbinu inasema kipenyo cha chumba cha kibiashara ni 2,6 mm na kipenyo cha chumba maalum ni 8 mm, huku ikisema sehemu maalum imewekwa ndani ya chumba kilichopo. Kijiometria, sehemu ya milimita nane haiwezi kutoshea ndani ya eneo la milimita 2,6.

Inawezekana moja ya thamani ni kosa la uandishi, lakini PDF haielezi ipi ni sahihi. Kwa hiyo vipimo vya chumba haviwezi kutumiwa moja kwa moja kuzalisha kifaa upya.

MEA ya wavu ina tofauti gani?

MEA ya wavu ina elektrodi za titanium nitride zilizowekwa kwenye muundo wa polyimide wa unene wa 12 µm. Matundu huruhusu medium ya utamaduni kufikia kwa urahisi zaidi si tu sehemu za juu na pembeni za sferoidi, bali pia uso wake wa chini.

Kielelezo 1 kinaonyesha kwamba sferoidi kwenye MEA ya kioo hufanyika bapa zaidi na kuwa kama “nusu-pancake” kwa muda, huku sferoidi kwenye MEA ya wavu ikihifadhi umbo la duara kwa kiwango kikubwa.

Kukua kwa seli kuzunguka na kiasi ndani ya wavu kunaweza kuruhusu elektrodi kurekodi karibu zaidi na tabaka za ndani za sferoidi.

Kielelezo 1 kinaonyesha nini?

Kielelezo 1 kinaonyesha mtiririko mzima wa majaribio:

1. Seli za saratani kuunda sferoidi katika sahani zenye chini ya U
2. Kuhamisha sferoidi kwenye MEA ya kioo au wavu
3. Kutumia Navitoclax au udhibiti wa solvent
4. Kupima impedance katika nyakati tofauti
5. Kutambua elektrodi zinazofunikwa na sferoidi kwa K-means
6. Kufanya live–dead fluorescence staining mwishoni mwa jaribio

Kielelezo kina picha za MEA za kioo na wavu, picha za bright-field za sferoidi na picha za live–dead fluorescence za mwisho.

Katika maelezo ya kielelezo, scale bar imeandikwa “200 µM”. Ingawa scale bar ya hadubini inapaswa kuwa kitengo cha urefu, µM ni kitengo cha mkusanyiko. Hii ni makosa ya kitengo ya uhariri katika PDF.

Maana ya kiufundi ya fomula ya RIC

Fomula iliyotumika ni:

\[ \mathrm{RIC} = \frac{Z_s-Z_{ref}} {Z_s+Z_{ref}} \times 100 \]

imefafanuliwa kwa namna hii.

Ikiwa impedance yenye sferoidi ni kubwa kuliko rejea, RIC huwa chanya. Kwa mfano:

\[ Z_s = 150\ \mathrm{k\Omega},\quad Z_{ref}=100\ \mathrm{k\Omega} \]

ikiwa:

\[ \mathrm{RIC} = \frac{150-100}{150+100} \times100 = 20\% \]

hupatikana.

Mfano huu umetolewa tu kueleza maana ya kihisabati ya fomula; si data ghafi ya elektrodi maalum katika utafiti.

Impedance ya rejea ilichaguliwaje?

Kwa MEA ya kioo, rejea ilifafanuliwa kama kipimo chenye medium ya utamaduni pekee bila sferoidi.

Kwa MEA ya wavu, mbinu tofauti ilitumika. Wastani wa magnitudes tano za chini zaidi za impedance kati ya kHz moja na 10 kHz ulitumika kama rejea.

Matumizi ya ufafanuzi tofauti wa rejea katika majukwaa mawili yanaweza kuzuia ulinganisho wa moja kwa moja wa RIC kamili kati ya mfumo wa kioo na wa wavu.

Kwa nini jozi za elektrodi jirani zilipimwa?

Impedance ilipimwa kati ya elektrodi mbili. Kila kipimo kilitumia elektrodi mbili jirani zenye ukubwa sawa. Kwa njia hii, ramani ya umeme yenye pointi nyingi iliundwa katika maeneo tofauti ya sferoidi.

Wakati elektrodi zote mbili katikati ya sferoidi zilifunikwa na seli, impedance iliyopimwa ilikuwa juu kuliko katika jozi za pembeni ambapo elektrodi moja tu ilifunikwa.

Uchunguzi huu ni muhimu: Impedance huakisi si tu taarifa ya “sferoidi ipo au haipo”, bali pia kiwango ambacho jozi ya elektrodi iko chini ya sferoidi.

Kizingiti kilichochaguliwa kwa mkono kilithibitishwaje?

Kielelezo 2 kinaonyesha kwa sferoidi moja ya mfano:

• Spektrum za impedance za jozi 30 za elektrodi,
• Mikunjo ya RIC,
• Picha ya hadubini,
• Heatmap ya umeme,
• Grafu ya usambazaji wa RIC

kwa pamoja.

Katika jozi tano zilizogusana na sferoidi, maximum RIC zilionyeshwa kama %29, %33, %33, %36 na %58. Elektrodi zilizogusana tu na kimiminika kwa kawaida zilikuwa chini ya %10.

Kwa mfano huu, kizingiti cha %16 kilichaguliwa. Jozi za elektrodi zilizo juu ya %16 ziliainishwa kama zilizofunikwa na sferoidi.

Maeneo ya RIC ya juu katika heatmap ya umeme yaliendana kwa kiasi kikubwa na eneo la sferoidi kwenye picha ya hadubini. Hata hivyo, baadhi ya elektrodi zilizoonekana kuwa chini ya sferoidi kwa macho zilionyesha impedance ya chini. Watafiti walieleza hili kwa uwepo wa maeneo ambayo hayakuwa na mgusano wa moja kwa moja na elektrodi kutokana na uso wa chini wa sferoidi wa pande tatu na usio sawa.

Hartigan Dip test ilitumika kwa nini?

Hartigan Dip test ni mbinu ya takwimu inayotathmini kama usambazaji una kilele kimoja. Katika utafiti, ilitumika kutathmini kama thamani za RIC zinatoka katika usambazaji mmoja au katika idadi mbili tofauti zinazowakilisha elektrodi zilizofunikwa na zisizofunikwa.

Katika sferoidi ya mfano, makundi mawili yalionekana:

• Elektrodi zisizofunikwa: RIC ya chini
• Elektrodi zilizofunikwa: RIC ya juu

Hartigan Dip test yenyewe haikutoa kizingiti cha kiotomatiki. Ilionyesha kwamba usambazaji unaweza kuwa na kilele zaidi ya kimoja; uainishaji wa kiotomatiki ulifanywa na K-means.

K-means clustering ilifanyaje kazi?

K-means hugawanya data katika idadi iliyowekwa ya makundi kwa msingi wa kufanana. Katika utafiti huu:

[ k = 2 ]

ilichaguliwa.

Kwa maelezo, objective function inaweza kuonyeshwa hivi:

\[ \underset{C_0,C_1}{\operatorname{argmin}} \sum_{j=0}^{1} \sum_{x_i \in C_j} \left\|x_i-\mu_j\right\|^2 \]

Hapa:

• x_i ni maximum RIC ya jozi ya elektrodi,
• C_j ni kundi,
• µ_j ni kituo cha kundi

vinawakilisha.

Mlinganyo huu haukuandikwa wazi katika makala; umeongezwa ili kueleza mantiki ya kihisabati ya K-means.

Algorithimu ilifanya kazi kwa hatua hizi:

1. Kila maximum RIC iliwekwa kwenye kituo cha kundi kilicho karibu zaidi.
2. Wastani wa kila kundi ukawa kituo kipya.
3. Mchakato ulirudiwa hadi ugawaji usibadilike.
4. Wastani wa vituo viwili ukawa kizingiti.
5. Kizingiti kilitumika kwa data asilia isiyotrim.

“Trimmed K-means” inamaanisha nini?

Katika sehemu ya matokeo, imeelezwa kwamba algorithimu iliondoa %5 ya thamani za juu zaidi wakati wa mafunzo. Lengo ni kuzuia elektrodi chache zenye thamani kubwa sana kuinua bila sababu vituo vya makundi na kizingiti.

Mkabala huu unaweza kupunguza uainishaji wa eneo la sferoidi kuwa dogo kuliko halisi. Hata hivyo, hatua na kanuni kamili ya kuondoa outliers haijaelezwa kikamilifu katika sehemu ya mbinu.

Kwa nini kizingiti cha dynamic kilihitajika?

Kila sferoidi inaweza kutofautiana kwa:

• ukubwa,
• eneo la mgusano na elektrodi,
• msongamano wa seli,
• jiometri ya uso wa chini,
• nguvu ya kushikamana

vinaweza kutofautiana.

Kwa hiyo, %16 inaweza kuwa kizingiti sahihi katika sferoidi moja lakini nyingine ikahitaji cha juu au chini. Kizingiti kinachohesabiwa kutoka vituo vya makundi kiliwekwa kulingana na usambazaji wa umeme wa kila jaribio.

Sferoidi 74 katika Kielelezo 2F zinaonyesha nini?

Uchambuzi wa jozi 2.422 za elektrodi kutoka sferoidi 74 ulionyesha kwamba elektrodi zisizofunikwa zina kilele kikali karibu %15–20 RIC.

Katika elektrodi zilizofunikwa na sferoidi kulikuwa na:

• kilele kikuu karibu %20–35,
• mkia mpana zaidi wa %35–80

ndivyo vilivyopatikana.

Usambazaji mpana unaonyesha kwamba si elektrodi zote chini ya sferoidi zina kiwango sawa cha mgusano wa seli. Katika baadhi kuna pengo la kimiminika, ilhali nyingine zimefunikwa moja kwa moja na tabaka nene la seli.

Heatmap ya umeme iliundwaje?

Maximum RIC ya kila jozi ya elektrodi iliwekwa katika nafasi yake kwenye MEA na kutengeneza ramani ya rangi. Thamani za juu zilionyeshwa kwa rangi za joto na za chini kwa rangi nyepesi.

Mpaka mweusi wa kiotomatiki ulitolewa kuzunguka maeneo yaliyo juu ya kizingiti cha K-means na kuunda “electrical footprint” ya sferoidi.

Kwa madhumuni ya kuona, elektrodi za mpaka wa MEA zilijazwa na RIC zinazotokana na thamani za jirani. Pointi hizi za mpaka hazikujumuishwa katika uchambuzi wa kiasi.

Kauli katika maandishi kuhusu “maximum RIC kulingana na minimum za karibu” haielezi kikamilifu mbinu. Kanuni kamili ya interpolation iliyotumika kujaza mipaka ya heatmap haiko wazi kwa urudiaji.

Ni elektrodi zipi zilifuatiliwa kwa muda?

Algorithimu ilitambua elektrodi zilizofunikwa na sferoidi mwanzoni na katika uchambuzi wa baadaye ikafuatilia RIC za elektrodi hizo pekee.

Kwa maelezo, RIC wakilishi ya sferoidi inaweza kuonyeshwa:

\[ \overline{\mathrm{maxRIC}} = \frac{1}{N_c} \sum_{i=1}^{N_c} \mathrm{maxRIC}_i \]

Hapa:

• N_c ni idadi ya jozi zilizotambuliwa kuwa zimefunikwa mwanzoni,
• maxRIC_i ni maximum RIC ya jozi husika

vinawakilisha.

Fomula hii imeandaliwa kueleza hesabu ya wastani iliyofafanuliwa katika maandishi.

Kuweka elektrodi za mwanzo bila kubadilika huruhusu athari ya dawa kufuatiliwa katika pointi zilezile. Hata hivyo, sferoidi ya udhibiti inapokua na kufunika elektrodi mpya, maeneo mapya hayajaongezwa kwenye wastani wa kiasi. Kwa hiyo mbinu haifuati mabadiliko yote ya eneo la sferoidi, bali mabadiliko ya umeme katika eneo la mgusano lililochaguliwa mwanzoni.

Nini kilitokea katika sferoidi ya udhibiti HCT-116?

Sehemu ya juu ya Kielelezo 3 inaonyesha sferoidi ya HCT-116 isiyotibiwa.

Saa ya nne, sferoidi ilikuwa katika mgusano na kundi fulani la elektrodi. Karibu saa ya ishirini hadi ishirini na nne, kuenea na kuongezeka kwa seli kulifanya elektrodi zaidi zionyeshe RIC ya juu.

Katika saa ya arobaini na nane, kulikuwa na upungufu mdogo wa maximum RIC. Waandishi waliueleza kama mwanzo wa kiini cha nekrosisi kutokana na hipoksia, upungufu wa virutubisho na mkusanyiko wa taka katikati ya sferoidi.

Utafiti haukuonyesha kiini cha nekrosisi moja kwa moja kwa histolojia au kipimo cha oksijeni. Kwa hiyo maelezo ya kiini cha nekrosisi kwa kushuka kidogo saa ya 48. ni tafsiri ya kimakanika inayotegemea fasihi ya awali.

Nini kilitokea baada ya Navitoclax?

Sehemu ya chini ya Kielelezo 3 inaonyesha sferoidi ya HCT-116 iliyotibiwa kwa 25 µM Navitoclax.

Katika picha za bright-field:

• giza zaidi katikati,
• kuvunjika pembeni,
• kutokuwa sawa kwa umbo

kulionekana, lakini mabadiliko haya hayakuwa dhahiri kwa kiasi katika hatua za mapema.

Katika rekodi ya umeme, kilele cha RIC kilipungua kwa muda na kufikia karibu kiwango cha elektrodi zisizofunikwa saa ya 48.

Utaratibu unaopendekezwa na waandishi ni:

\[ \mathrm{Navitoclax} \rightarrow \mathrm{apoptoz} \rightarrow \mathrm{hücre\ küçülmesi\ ve\ ayrılması} \rightarrow \mathrm{elektrot\ temasının\ azalması} \rightarrow \mathrm{RIC}\downarrow \]

Seli zinapotengana kutoka kwa kila mmoja na uso, njia ya elektroliti huwa wazi zaidi kwa mkondo. Hivyo impedance inayopimwa hupungua.

Ulinganisho wa sferoidi moja katika Kielelezo 4

Katika sferoidi ya udhibiti, hakuna tofauti ya maana ya RIC kati ya saa 2–5, 17–26 na 30–48. Uhai katika fluorescence staining ya mwisho ulikuwa %91.

Katika sferoidi iliyotibiwa kwa Navitoclax, athari ya jumla ya muda ilikuwa na maana:

\[ p = 0{,}006 \]

Tofauti kati ya vipindi viwili vya kwanza:

\[ p = 0{,}515 \]

haikuwa na maana.

Tofauti kati ya saa 17–26 na 30–48:

\[ p = 0{,}049 \]

iliripotiwa.

Hii inaonyesha kwamba athari ya Navitoclax haikutokea mara moja; baada ya kipindi thabiti kiasi katika siku ya kwanza, uharibifu wa umeme ulianza kuwa wazi.

Hata hivyo, katika Kielelezo 4, n = 4 kwa udhibiti na n = 6 kwa matibabu zinawakilisha idadi ya jozi za elektrodi chini ya sferoidi hiyo hiyo, si idadi ya sferoidi.

Jozi za elektrodi kutoka sferoidi moja si marudio huru ya kibaolojia. Ikiwa jozi hizo zilitumiwa kama marudio huru katika mtihani wa takwimu, p values zinaweza kuonyesha uhuru wa kibaolojia kwa kiwango kikubwa kuliko halisi. Jaribio hili linapaswa kuonekana kama mfano wakilishi wa utaratibu, si ushahidi wa idadi huru ya sferoidi.

Sferoidi 32 za HCT-116 katika Kielelezo 5

Katika jaribio la kiwango cha idadi, mwanzoni kulikuwa na:

• sferoidi 16 za udhibiti
• sferoidi 16 zilizotibiwa kwa Navitoclax

ndivyo vilivyokuwepo.

Kila pointi ya data inawakilisha wastani wa maximum RIC kutoka elektrodi zilizoainishwa kuwa zimefunikwa mwanzoni kwa sferoidi moja.

Katika kundi la udhibiti, RIC iliongezeka kidogo katika saa 80, lakini hakuna tofauti ya maana kati ya vipindi vya muda. Ongezeko hili lilihusishwa na ukuaji na msongamano wa sferoidi.

Katika kundi la Navitoclax:

• Hakuna kupungua kwa maana kati ya saa 2–5 na 17–26.
• Kupungua kwa umeme kulianza kuwa na maana saa 30–48.
• Saa 60–80, kupungua kulifikia p < 0,001.
• Uhai wa mwisho ulikuwa takriban %20.

Imeelezwa kwamba majaribio yalikomeshwa kwa nyakati tofauti kwa ajili ya kipimo cha uhai. Kwa hiyo, haieleweki kikamilifu kutoka maelezo ya kielelezo ni sferoidi ngapi zilikuwepo katika kila hatua ya muda na kama sferoidi zilezile zilipimwa katika nyakati zote.

Sehemu ya takwimu inataja one-way ANOVA au Kruskal–Wallis, lakini haijaeleza mixed model au repeated-measures ANOVA kwa data za vipimo vinavyorudiwa. Haijaelezwa jinsi utegemezi wa ndani ya sferoidi kwa muda ulivyoshughulikiwa.

Kielelezo 6: Elektrodi za katikati na pembeni

Katika sferoidi ya HT-29 kwenye MEA ya wavu, elektrodi mbili jirani katikati zimefunikwa na sferoidi. Pembeni, elektrodi moja tu ya jozi iko katika mgusano na sferoidi.

Katika kipimo cha saa 17–26:

• Jozi za katikati: takriban %90 RIC
• Jozi za pembeni: takriban %60 RIC

ziliripotiwa.

Hii inaonyesha kwamba kiwango cha uso wa elektrodi kinachofunikwa na seli kinaathiri sana ukubwa wa ishara.

Matokeo ya HT-29 kwenye MEA ya wavu

Katika kundi la udhibiti, RIC iliongezeka kutoka takriban %20 hadi karibu %70 siku ya kwanza. Ongezeko hili lilihusishwa na kushikamana kwa nguvu zaidi kwa sferoidi kwenye wavu. Baada ya hapo, hakuna mabadiliko ya maana yaliyoonekana.

Katika kundi la 10 µM Navitoclax, RIC iliongezeka siku ya kwanza, kisha ikaanza kupungua na kufikia chini ya takriban %40 katika saa 60–80.

Tofauti kati ya saa 17–26, wakati thamani ya kwanza ya juu ilionekana, na saa 60–80 ilikuwa:

\[ p < 0{,}001 \]

iliripotiwa.

Je, MEA ya wavu ni bora kweli?

Waandishi wanasema MEA ya wavu huruhusu medium ya utamaduni kufikia sferoidi kutoka pande zote, huhifadhi umbo la duara na hutoa RIC ya juu zaidi.

Maelezo haya yanaendana na picha, lakini majaribio ya MEA ya kioo na wavu hayakuwa matched moja kwa moja:

• HCT-116 ilitumika katika MEA ya kioo.
• HT-29 ilitumika katika MEA ya wavu.
• 25 µM Navitoclax ilitumika katika jaribio la kioo.
• 10 µM Navitoclax ilitumika katika jaribio la wavu.
• Hesabu za rejea za RIC zilikuwa tofauti.
• Nafasi kati ya elektrodi ilikuwa tofauti.

Kwa hiyo, utafiti huu hauwezi kutenganisha ni kiasi gani cha ishara ya juu ya MEA ya wavu kinatokana na jukwaa lenyewe na ni kiasi gani kinatokana na mstari wa seli, dozi ya dawa au mbinu ya rejea.

Live–dead staining ilifanywaje?

Katika sferoidi za HCT-116, seli hai zilionyeshwa kijani kwa Calcein-AM na seli zilizokufa kwa rangi ya machungwa kwa SYTOX Orange.

Katika sferoidi za HT-29, Calcein-AM na propidium iodide zilitumika.

Staining hizi zilifanywa mwishoni mwa jaribio ili kuthibitisha matokeo ya impedance. Baadhi ya sferoidi ziliwekwa rangi moja kwa moja kwenye MEA, na nyingine baada ya kuondolewa kwenye MEA.

Kutofautiana kwa mbinu ya staining kati ya sampuli kunaweza kuongeza utofauti wa kipimo cha uhai. Aidha, kuondoa sferoidi zilizovunjika wakati wa transfer kunaweza kusababisha sampuli zilizoharibika zaidi kutowakilishwa katika matokeo.

Je, impedance na uhai ni kitu kimoja?

Hapana. Impedance ni nyeti kwa hali ya kifiziolojia, lakini si asilimia ya uhai moja kwa moja.

Impedance ya juu inaweza kuhusishwa na:

• Misa kubwa ya seli
• Utando wa seli ulio salama
• Miunganisho imara ya seli–seli
• Kushikamana kwa nguvu na elektrodi
• Elektrodi zote mbili kufunikwa na sferoidi

Impedance ya chini inaweza kutokea kutokana na:

• Kifo cha seli
• Kuongezeka kwa upenyezaji wa utando
• Kutengana na elektrodi
• Kusogea kwa sferoidi
• Kuingia kwa kimiminika kati ya sferoidi na elektrodi
• Kuvunjika kwa sferoidi

inaweza kutokea kwa sababu mbalimbali kama hizi.

Kwa hiyo, utafiti unaonyesha kwamba impedance inahusiana na uhai, lakini hauwasilishi calibration equation inayolinganishwa RIC maalum na asilimia maalum ya seli hai.

Je, utendaji wa uainishaji wa K-means ulipimwa?

Utafiti unaonyesha kwamba mipaka ya umeme iliendana kwa ujumla na picha za hadubini. Hata hivyo, vipimo vifuatavyo vya uainishaji wa kiotomatiki havikutolewa:

• Sensitivity
• Specificity
• Accuracy
• Idadi ya false positive na false negative
• ROC curve
• Area under the curve
• Seti huru ya majaribio

Kwa hiyo, usahihi “kamili” wa algorithimu hauwezi kuhesabiwa. Mbinu ilionyesha ulinganifu wa umeme na picha, lakini haikutoa uchambuzi kamili wa utendaji kwa metrics za kawaida za machine learning.

Dhana ya msingi ya K-means

Algorithimu hugawanya thamani za RIC katika makundi mawili. Mkabala huu unadhania kwamba kuna idadi mbili zinazoweza kutenganishwa vya kutosha zinazowakilisha elektrodi zilizofunikwa na zisizofunikwa.

Muundo wa makundi mawili unaweza kuwa dhaifu katika hali zifuatazo:

• Sferoidi ikiwa imeshikamana kwa udhaifu sana na elektrodi
• RIC za elektrodi zilizofunikwa na zisizofunikwa zikiingiliana sana
• Sferoidi ikiwa ndogo sana
• Elektrodi nyingi zikibaki katika hali moja ya kifizikia
• Kelele au reference drift ikiwa kubwa
• Athari ya dawa ikianza kabla ya muda wa kwanza wa kuweka kizingiti

Waandishi walikubali katika sehemu ya matokeo kwamba usahihi wa kizingiti hutegemea usambazaji wa data, kushikamana kwa sferoidi na muda baada ya kuwekwa, na hili ni moja ya mapungufu muhimu ya utafiti.

Je, utafiti hauna matumizi ya optiki kabisa?

Algorithimu iliyotengenezwa inalenga kupunguza utegemezi wa uthibitisho wa optiki kwa kutambua ufunikaji wa elektrodi kutoka data ya impedance.

Hata hivyo, katika jaribio la sasa:

• Sferoidi ziliwekwa kwenye elektrodi chini ya hadubini.
• Picha za bright-field zilichukuliwa mwanzoni.
• Mipaka ya umeme ililinganishwa na picha za optiki.
• Picha za fluorescence live–dead zilitumika mwishoni mwa jaribio.

Kwa hiyo, utafiti haujaonyesha mchakato usiotumia optiki kabisa. Ni hatua ya maendeleo ya mbinu inayoonyesha kwamba kipimo cha umeme kinaweza kupunguza utegemezi wa imaging.

Je, high-throughput screening ilionyeshwa?

Mfumo unaweza kuendelezwa kwa high-throughput drug screening kwa sababu una njia nyingi na kizingiti cha kiotomatiki. Hata hivyo, majaribio ya sasa yalifuatilia idadi ndogo ya sferoidi kwenye kila MEA na hayakuonyesha mfumo kamili wa automated multiwell unaochambua mamia ya sampuli kwa wakati mmoja.

Kwa hiyo, “high-throughput potential” ni uwezo unaoweza kupanuliwa baadaye, si kiwango cha uzalishaji kilichothibitishwa moja kwa moja na kifaa cha sasa.

Nguvu za utafiti

• Kipimo kisicho na lebo: Rekodi ya impedance ya kila siku haihitaji fluorescence au lebo za kemikali.
• Mbinu isiyoharibu sampuli: Sferoidi hiyo hiyo inaweza kupimwa mara kwa mara kwa muda.
• Data ya masafa mengi: Spektrum ya 100 Hz–1 MHz ilirekodiwa badala ya masafa moja.
• Azimio la juu la nafasi: Elektrodi nyingi ndogo ziliunda ramani ya umeme ya sferoidi.
• Majukwaa mawili ya MEA: Mbinu ilijaribiwa kwenye mfumo wa kioo na wa wavu.
• Mistari miwili ya saratani ya kolorektali: HCT-116 na HT-29 zilitumika katika majaribio ya Navitoclax.
• Seti kubwa ya data ya kizingiti: Sferoidi 74 na jozi 2.422 za elektrodi zilitathminiwa.
• Kizingiti kinachobadilika: Kizingiti tofauti kilitolewa kwa kila usambazaji wa umeme wa sferoidi.
• Ufuatiliaji wa nafasi na muda: Heatmap na time series ziliunganishwa katika mfumo mmoja.
• Uthibitisho wa mwisho wa kibaolojia: Live–dead staining ilitathminiwa pamoja na mabadiliko ya impedance.
• Ucheleweshaji wa athari ya dawa ulionyeshwa: Athari ya Navitoclax ilikuwa ndogo siku ya kwanza na ikawa dhahiri zaidi baadaye.
• Algorithimu inayoelezeka: K-means na wastani wa vituo vya kundi ni rahisi kutafsiri kuliko black-box model.

Mapungufu ya utafiti

• Hakuna mapitio ya rika: Utafiti ni preprint ya SSRN.
• Sio utafiti wa kliniki: Uvimbe wa mgonjwa, mwitikio wa matibabu ya mgonjwa au matokeo ya kliniki hayajachunguzwa.
• Aina chache za dawa: Navitoclax pekee ilitathminiwa.
• Hakuna dose–response analysis: Kila mstari wa seli ulitumia mkusanyiko mmoja wa Navitoclax.
• Mistari miwili tu ya CRC: Matokeo ya ufuatiliaji wa dawa yamewekewa HCT-116 na HT-29.
• Hakuna organoid kutoka kwa mgonjwa: Heterojeni ya kijeni na kliniki ya uvimbe haijawakilishwa.
• Hakuna mazingira ya kinga: T cells, macrophages, vascular cells na stromal components hazikupimwa pamoja katika majaribio ya dawa.
• Impedance si maalum kwa uhai: Kushikamana, umbo na nafasi ya elektrodi vinaweza kubadilisha ishara.
• Hakuna calibration ya uhai: Hakuna modeli iliyoundwa kuhesabu asilimia ya seli hai moja kwa moja kutoka RIC.
• Usahihi wa uainishaji haujaripotiwa: Hakuna sensitivity, specificity au ROC.
• Hakuna uthibitisho huru wa nje: Algorithimu haijajaribiwa katika data huru, iliyopofushwa kutoka maabara nyingine.
• K-means inadhania makundi mawili: Uaminifu wa kizingiti unaweza kushuka usambazaji wa kufunikwa na kutofunikwa unapochanganyika.
• Kizingiti hutegemea muda: Nyakati tofauti zilitumika kwa MEA ya kioo na wavu.
• Elektrodi za mwanzo zilibaki zisibadilike: Elektrodi mpya zinazofunikwa sferoidi inapokua hazikuongezwa kwenye time series.
• Hatari ya pseudoreplication katika uchambuzi wa sferoidi moja: Jozi za elektrodi za sferoidi moja zilionyeshwa kama n huru.
• Mbinu ya repeated measures haijaelezwa: Mixed model ya utegemezi wa muda haijaripotiwa.
• Idadi ya sampuli katika kila muda haiko wazi: Kielelezo 5 kinasema “n = 16 mwanzoni”, lakini n halisi katika nyakati za baadaye haijatolewa.
• Majukwaa ya kioo na wavu hayawezi kulinganishwa moja kwa moja: Mstari wa seli, dozi ya dawa, rejea na nafasi ya elektrodi ni tofauti.
• Kuna uondoaji unaotokana na transfer: Sferoidi zilizovunjika ziliondolewa katika uchambuzi wa uhai.
• Itifaki ya staining ya uhai inabadilika: Baadhi ya sampuli zilipakwa rangi kwenye MEA na nyingine baada ya kuondolewa.
• Vipimo vya chumba maalum havilingani: 2,6 mm na 8 mm haviendani.
• Ufafanuzi wa vigezo vya RIC si wazi: Z ziliandikwa katika baadhi ya sentensi kama RIC badala ya impedance.
• Mbinu ya kujaza mipaka haiko wazi: Visual interpolation ya heatmap haijaelezwa kwa kina.
• Hesabu ya modeli za seli haipatani: Kauli “aina tano” haitoshei makundi sita yaliyoorodheshwa.
• Kuna kosa la kitengo cha scale: Vipimo vya hadubini vimeandikwa µM badala ya µm.
• Data na code si wazi: Data inaweza kutolewa kwa ombi, lakini Python code maalum haijatolewa katika repository ya umma.
• High-throughput ni uwezo tu: Mfumo mkubwa wa automated multiwell haujaonyeshwa moja kwa moja.

Utafiti unasema nini?

• Sferoidi za pande tatu huunda mabadiliko ya impedance yanayopimika kwenye microelectrode arrays.
• Mabadiliko makubwa zaidi yanaonekana katika 1–100 kHz.
• Jozi za elektrodi zilizo katika mgusano wa moja kwa moja na sferoidi zina RIC ya juu.
• Heatmap ya umeme inaweza kuonyesha eneo la mgusano wa sferoidi juu ya elektrodi.
• K-means inaweza kutenganisha kiotomatiki makundi ya RIC ya juu na ya chini.
• Kizingiti kinachorekebishwa kwa kila sferoidi hupunguza hitaji la kuchagua kizingiti kwa mkono.
• Katika sferoidi za HCT-116 na HT-29 zisizotibiwa, impedance kwa ujumla ilibaki thabiti.
• Baada ya Navitoclax, impedance ilipungua kwa muda.
• Kupungua kwa impedance kuliambatana na kupungua kwa uhai wa mwisho.
• Athari ya Navitoclax haikuwa ya papo hapo; ilianza kuwa dhahiri baada ya takriban siku moja–mbili.
• MEA ya wavu inaweza kusaidia sferoidi kubaki na umbo la duara zaidi na kutoa ishara ya juu.
• Mbinu inaweza baadaye kuunganishwa na mifumo ya automated preclinical screening yenye uwezo mkubwa.

Utafiti hausimi nini?

• Hauonyeshi kwamba mfumo unaweza kutambua saratani kwa binadamu.
• Hauonyeshi kwamba unaweza kutabiri kliniki ni dawa gani mgonjwa ataitikia.
• Hauonyeshi kwamba RIC ni asilimia ya seli hai moja kwa moja.
• Haithibitishi kwamba impedance ya chini daima hutokana tu na kifo cha seli.
• Hauonyeshi kwamba K-means hufanya kazi bila kosa kwa aina zote za sferoidi.
• Hauonyeshi kwamba hadubini ya optiki au vipimo vya mwisho havihitajiki kabisa.
• Hauonyeshi ufanisi wa Navitoclax kwa wagonjwa wa saratani ya kolorektali.
• Hauwasilishi ulinganisho matched unaothibitisha MEA ya wavu ni bora kuliko MEA ya kioo.
• Hauonyeshi kwamba kizingiti kimoja cha impedance kinaweza kutumika katika vifaa vyote.
• Hauonyeshi uthibitisho wa mfumo kwa maambukizi, immunotherapy, radiotherapy au madarasa yote ya dawa.
• Hauonyeshi kwamba mfumo uko tayari kutumiwa katika maabara ya kliniki au hospitali.
• Hauonyeshi mfumo kamili wa high-throughput unaochambua mamia au maelfu ya sferoidi kwa wakati mmoja.

Umuhimu wake kwa mtazamo wa zamani

Vipimo vya impedance kati ya seli na elektrodi vimetumika kwa muda mrefu kufuatilia kushikamana, kuongezeka na kifo cha tabaka za seli za pande mbili. Hata hivyo, sferoidi za pande tatu zina jiometri ya mgusano iliyo tata zaidi kuliko tabaka tambarare.

Ni sehemu ndogo tu ya sferoidi inayogusana moja kwa moja na elektrodi. Uso wa chini si sawa na tabaka za medium zinaweza kubaki kati ya elektrodi na seli kwa unene tofauti. Kwa hiyo, mbinu ya elektrodi moja au kizingiti kimoja inayotumika kwa 2D inaweza kutotosha kwa modeli za 3D.

Utafiti huu unashughulikia tatizo la kijiometri kwa kutumia elektrodi nyingi ndogo na kizingiti kinachobadilishwa kwa kila sferoidi.

Umuhimu wake leo

Katika maendeleo ya dawa, kujua tu kama sferoidi iko hai mwishoni mwa jaribio ni taarifa ndogo. Pia ni muhimu kujua:

• dawa inaanza kufanya kazi lini,
• ikiwa inaonekana kutofanya kazi siku ya kwanza lakini baadaye kuwa na ufanisi,
• ikiwa inaathiri katikati na pembeni ya sferoidi kwa njia sawa,
• ikiwa uharibifu wa kifiziolojia huanza kabla ya mabadiliko ya mwonekano wa hadubini

pia ni muhimu.

Time series ya umeme ilionyesha kwamba Navitoclax ilisababisha mabadiliko madogo katika saa za kwanza na kushuka kwa wazi zaidi baada ya saa 30–48. Taarifa hii ya muda haiwezi kupatikana kutoka kipimo kimoja cha uhai mwishoni mwa jaribio.

Umuhimu wake kwa siku zijazo

Ili mbinu iwe jukwaa la preclinical lenye nguvu zaidi, tafiti zifuatazo zinahitajika:

• Seti huru na zilizopofushwa za uthibitisho
• Ulinganisho wa kiasi na eneo halisi la mgusano kutoka picha za optiki
• Sensitivity, specificity na ROC analysis
• Modeli za calibration kati ya RIC na asilimia ya uhai
• Dawa nyingi na majaribio mapana ya dose–response
• Kutenganisha mekanizimu tofauti za kifo
• Patient-derived tumor organoids
• Co-culture zenye fibroblasti, seli za kinga na seli za mishipa
• Mixed-effects statistical models kwa repeated measures
• CMOS microelectrode arrays zenye msongamano mkubwa
• Kutumia vipimo vya elektrodi jirani vya mlalo na wima pamoja
• Spatial reconstruction inayokaribia 3D electrical tomography
• Algorithimu zinazoongeza dynamically elektrodi mpya zinazofunikwa sferoidi inapokua
• Ujumuishaji na automated liquid handling na mifumo ya multiwell
• Kuweka code na raw data wazi kwa umma
• Kutathmini mwitikio wa individualized immunotherapy

Maana yake kwa maisha ya kila siku na utafiti wa saratani

Athari ya moja kwa moja kwa maisha ya kila siku bado ni ndogo; mbinu ni jukwaa la maabara, si kifaa cha kliniki.

Kwa muda mrefu, faida kuu ya mifumo kama hii inaweza kuwa kutathmini dawa zinazowezekana mapema na kwa kina zaidi katika modeli za uvimbe za pande tatu. Inaweza kusaidia kuondoa mapema dawa zisizo na ufanisi, kuchagua zenye matumaini zaidi na, katika modeli za mgonjwa, kuchunguza mwitikio wa mtu binafsi.

Hata hivyo, utafiti wa sasa haujaonyesha kwamba uvimbe kutoka kwa mgonjwa unaweza kuwekwa kwenye mfumo na dawa sahihi kuchaguliwa. Matumizi hayo ni eneo la maendeleo linalopendekezwa kwa siku zijazo.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Muhtasari wa kiufundi wa muundo wa utafiti

Sifa za kiufundi za mifumo ya microelectrode

Parameta za rekodi ya EIS

Fomula za RIC na kizingiti

\[ \mathrm{RIC} = \frac{Z_s-Z_{ref}} {Z_s+Z_{ref}} \times100\% \]

\[ \mathrm{maxRIC}_i = \max_{1\,\mathrm{kHz}\le f\le100\,\mathrm{kHz}} \mathrm{RIC}_i(f) \]

\[ T = \operatorname{round} \left( \frac{C_0+C_1}{2} \right) \]

Hapa:

• Z_s: impedance ya kipimo chenye sferoidi
• Z_ref: impedance ya rejea
• maxRIC_i: maximum RIC ya jozi i kati ya 1–100 kHz
• C₀ na C₁: vituo vya makundi ya K-means
• T: kizingiti cha kiotomatiki kinachotenganisha elektrodi zilizofunikwa na zisizofunikwa

vinamaanisha.

Hatua za uchambuzi wa kiotomatiki

1. Spektrum ya impedance ya 100 Hz–1 MHz ilirekodiwa kwa kila jozi ya elektrodi.
2. RIC spectrum ilihesabiwa dhidi ya rejea.
3. Maximum RIC katika 1–100 kHz ilichaguliwa.
4. Athari ya %5 ya thamani za juu zaidi kwenye mafunzo ya kizingiti ilipunguzwa.
5. K-means iligawa thamani katika makundi mawili.
6. Wastani wa vituo vya makundi uliwekwa kuwa kizingiti cha kiotomatiki.
7. Kizingiti kilitumika kwenye data asilia isiyotrim.
8. Elektrodi juu ya kizingiti ziliainishwa kuwa zimefunikwa na sferoidi.
9. RIC za elektrodi zilizofunikwa mwanzoni zilifuatiliwa kwa muda.
10. Mwishoni, fluorescence viability test ilitumika kwa uthibitisho wa kibaolojia.

Usambazaji wa umeme wa sferoidi ya mfano

Seti ya data ya kizingiti ya sferoidi 74

Matokeo wakilishi ya HCT-116

Uchambuzi wa idadi ya HCT-116

Matokeo ya HT-29 kwenye MEA ya wavu

Mbinu ya takwimu iliyotumika

• Normality: Shapiro–Wilk test
• Homogeneity of variance: Levene test
• Parametric group comparison: One-way ANOVA
• Non-parametric comparison: Kruskal–Wallis test
• Baada ya ANOVA: Tukey HSD
• Baada ya Kruskal–Wallis: Dunn test
• Kizingiti cha umuhimu: p < 0,05

Kwa kuwa sferoidi hiyo hiyo hupimwa mara kwa mara kwa muda, data ina repeated-measures structure. Hata hivyo, repeated-measures ANOVA, paired analysis au mixed-effects model haijaelezwa wazi katika sehemu ya mbinu.

Matokeo ya msingi yanayoonyeshwa na vielelezo kwa pamoja

1. Kielelezo 1: Kinaonyesha uzalishaji wa sferoidi, mifumo ya MEA ya kioo na wavu na uthibitisho wa uhai.
2. Kielelezo 2: Kinaonyesha RIC ya juu katika elektrodi zilizofunikwa na sferoidi na kuendana kwa ramani ya umeme na nafasi ya optiki.
3. Kielelezo 3: Kinaonyesha electrical footprint thabiti katika sferoidi ya udhibiti na footprint inayopungua katika sferoidi ya Navitoclax.
4. Kielelezo 4: Kinalinganisha mabadiliko ya RIC katika sferoidi za mfano na uhai wa mwisho wa %91 na %28.
5. Kielelezo 5: Kinaonyesha mwitikio wa udhibiti na 25 µM Navitoclax katika idadi ya HCT-116 hadi saa 80.
6. Kielelezo 6: Kinaonyesha tofauti ya elektrodi za katikati na pembeni katika sferoidi za HT-29 na mwitikio wa 10 µM Navitoclax kwenye MEA ya wavu.

Matokeo muhimu zaidi kiufundi

Mchango muhimu zaidi wa kiufundi ni mbinu ya kizingiti cha kiotomatiki inayotambua kwa kila jaribio pointi halisi za mgusano wa sferoidi na elektrodi.

Mkabala huu:

• hautumii kizingiti kimoja kisichobadilika,
• huchunguza usambazaji wa RIC wa mwanzo wa kila sferoidi,
• hugawanya thamani katika makundi ya RIC ya chini na ya juu,
• hufuata kwa muda elektrodi tu zilizogusana na sferoidi mwanzoni.

Kwa hivyo nafasi ya kifizikia ya sferoidi na uharibifu wa umeme baada ya dawa vinaweza kupimwa katika mtiririko mmoja wa data.

Hata hivyo, mfumo bado si kipimo cha kliniki kinachopima uhai moja kwa moja. Maelezo sahihi zaidi ni jukwaa la preclinical la impedance linalofuatilia bila lebo mgusano wa sferoidi–elektrodi na mabadiliko ya kifiziolojia yanayohusiana na uhai.

Maelezo ya Chanzo na Mbinu

Maudhui haya yanategemea utafiti wa Ahmed Khattab, Ruth Grabowski, Ha Un Chung, Tobias Schmidt, Mai Thu Bui, Christian Schmees na Günther Michael Zeck wenye kichwa “Automated Viability Assessment of Tumor Spheroids via Electrical Impedance Spectroscopy”.

Utafiti huu ni utafiti wa preclinical in vitro wa biosensor na maendeleo ya mbinu unaounganisha sferoidi za pande tatu kutoka seli za saratani ya kolorektali ya binadamu HCT-116 na HT-29, microelectrode arrays za kioo na wavu wa polyimide, electrical impedance spectroscopy, K-means clustering na uingiliaji wa Navitoclax.

Huu si utafiti wa kliniki uliofanywa kwa binadamu. Hakuna data ya uvimbe wa mgonjwa, mgonjwa wa saratani, matokeo ya matibabu ya kliniki, uhai au uteuzi wa dawa binafsi.

Maandishi yana kauli “This preprint research paper has not been peer reviewed” na “Preprint not peer reviewed”. Kwa hiyo utafiti haujapitia mapitio ya rika.

Kichwa cha ukurasa kinasema “Biosensors and Bioelectronics, Vol. X, No. X (2026)”. Hata hivyo, kwa kuwa sehemu za volume na issue bado ni X na hakuna DOI au tarehe ya kukubaliwa, kauli hii haiwezi kuchukuliwa kama makala ya mwisho iliyochapishwa au iliyokubaliwa na jarida.

Utafiti uliripotiwa kuungwa mkono na Austrian Research Promotion Agency kupitia mradi 895365 na German Federal Ministry for Economic Affairs and Climate Action kupitia mradi KK5046205AJ2. Waandishi hawakuripoti mgongano unaojulikana wa maslahi ya kifedha au uhusiano wa kibinafsi.

Imeelezwa kwamba data itapatikana kwa ombi la busara; hakuna repository ya wazi iliyotolewa kwa Python code maalum za uchambuzi au raw impedance data.

Mbinu ya K-means iliendelezwa kwa usambazaji wa RIC kutoka sferoidi 74 na jozi 2.422 za elektrodi. Hata hivyo, sensitivity, specificity, ROC curve au matokeo ya independent external validation hayakutolewa.

Mabadiliko ya impedance yanahusiana na uhai wa seli lakini hayapimi uhai pekee. Kushikamana kwa sferoidi na elektrodi, umbo, ukubwa, pengo la kimiminika na kiwango cha kufunikwa kwa jozi ya elektrodi vinaweza pia kuathiri RIC.

Matokeo ya MEA ya kioo na wavu yalipatikana kwa mistari tofauti ya seli, dozi tofauti za Navitoclax, nafasi tofauti za elektrodi na hesabu tofauti za rejea. Kwa hiyo, hakuna ulinganisho wa uhakika wa ubora kati ya majukwaa mawili.

Katika mifano ya sferoidi moja, jozi za elektrodi zilitumika kama n. Kwa kuwa jozi kutoka sferoidi moja si marudio huru ya kibaolojia, matokeo hayo yanahitaji tahadhari katika tafsiri ya takwimu.

Vipimo vya chumba maalum cha SLA, baadhi ya ufafanuzi wa vigezo vya RIC, idadi ya makundi ya modeli za seli na vitengo vya scale katika picha za hadubini vina matatizo ya uripoti yanayohitaji ufafanuzi ndani ya PDF.

Makala haya yameandaliwa kwa kutegemea tu mbinu, fomula, grafu, picha za hadubini, heatmap za umeme, matokeo ya uhai na tafsiri za waandishi katika PDF iliyopakiwa. Hakuna madai ya usahihi wa kliniki wa utambuzi, mafanikio ya matibabu ya mgonjwa, ufanisi wa Navitoclax, makadirio ya uhai ya uhakika au matumizi ya kibiashara ya high-throughput yasiyopatikana katika PDF yaliyoongezwa.