Katika utafiti wa kugundua adenokasinoma ya mirija ya kongosho (pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC) mapema kutoka kwenye seramu, mfumo wa Signal-Enhanced Lateral Flow Immunoassay (SELFI) uliundwa ili kupima kiwango cha carbohydrate antigen 19-9 (CA19-9). Mfumo huu unatumia maeneo ya plasmonic “hotspot” yanayotokea kwenye nafasi za kiwango cha nanomita ndani ya nanoprobes za SiO₂@Au@Au, ambapo chembe nyingi za dhahabu zimewekwa juu ya chembe ya silika. SELFI ilikamilisha uchambuzi wa CA19-9 kwa takribani dakika 15 na katika utafiti ilifikia kikomo cha ugunduzi cha 0.012 U mL⁻¹. Katika tathmini ya seramu ya kliniki, wastani wa ROC-AUC wa kutofautisha PDAC ya hatua ya mapema na watu wenye afya ulikuwa 0.862 kwa SELFI, 0.854 kwa ELISA na 0.550 kwa LFIA ya kawaida. Hata hivyo, utafiti ulifanywa katika kituo kimoja, washiriki wote walikuwa Wakorea Kusini, na haukuwa uthibitishaji huru wa kliniki unaotokana na uchunguzi wa idadi ya watu katika maisha halisi.

Ubunifu mkuu wa SELFI si kugundua biomarker mpya ya CA19-9, bali ni kuunda usanifu wa nanoprobe unaofanya ishara iliyopo ya CA19-9 iwe yenye nguvu zaidi na kusomeka katika viwango vya chini zaidi. Kadiri nafasi kati ya chembe za dhahabu inavyopungua, msongamano wa uga wa sumakuumeme huongezeka. Maeneo ya plasmonic hotspot yanayotokea katika nafasi mahususi za nanomita huongeza extinction ya mwanga unaoonekana na hivyo kuimarisha utofautishaji wa rangi kwenye membrane ya nitrocellulose.

Katika majaribio ya modeli ya uchambuzi, ishara kwenye mstari wa kipimo cha SELFI ilifika kwenye hali ya karibu na kujaa baada ya takribani dakika 15. Katika utafiti huo huo, utaratibu wa ELISA ulihitaji dakika 285. Kwa SELFI, wakati mkusanyiko wa CA19-9 ulikuwa 1 U mL⁻¹, ukali wa ishara ya rangi ulikuwa 24.67, na ulipokuwa 200 U mL⁻¹ ulikuwa 73.17; kwa LFIA ya kawaida inayotumia chembe moja ya dhahabu, ishara katika safu hiyo iliongezeka tu kutoka 6.59 hadi 11.76. Utafiti pia uliripoti kuwa SELFI ilionyesha mwelekeo wa ishara ya uchambuzi yenye nguvu zaidi kuliko LFIA kwa PSA na ICAM-1 katika majaribio ya kalibresheni, lakini majaribio haya ya ziada hayathibitishi utambuzi wa kliniki wa magonjwa mengine yanayohusiana na biomarkers hizo.

Matokeo muhimu zaidi ya kliniki yalionekana katika kundi la PDAC ya hatua ya mapema. Wakati wagonjwa wa hatua ya mapema walilinganishwa na watu wenye afya, AUC ya wastani ya SELFI ilikuwa 0.862 na ya ELISA 0.854; uchambuzi wa takwimu uliorudiwa uliripoti P < 0.0001 kwa tofauti hiyo. Kwa PDAC ya hatua ya juu dhidi ya watu wenye afya, SELFI na ELISA zilionyesha utendaji karibu sawa: AUC zilikuwa 0.925 na 0.926, na tofauti haikuwa muhimu kitabakwimu (P = 0.3363). Kwa hiyo matokeo yanaunga mkono uwezo wa SELFI hasa katika kutenganisha sampuli za hatua ya mapema, lakini hayaonyeshi kuwa mbinu hiyo imekuwa kiwango cha uchunguzi wa kliniki au imethibitishwa katika makundi huru ya watu.

Ina maana gani kwa Uturuki?

Washiriki wote 150 wa utafiti walikuwa Wakorea Kusini na sampuli zilikusanywa katika hospitali moja ya kiwango cha juu. Kwa hiyo AUC zilizoripotiwa, usambazaji wa CA19-9 au viwango vya ukomo vinavyoweza kutumika baadaye haviwezi kuhamishwa moja kwa moja kwa wagonjwa na watu wenye afya nchini Uturuki. Ili kutathmini matumizi nchini Uturuki, kunahitajika tafiti za uthibitishaji katika makundi ya wagonjwa ya ndani na huru, vituo vingi vya kliniki, ulinganishaji wa viwango vya uchambuzi na upimaji wa ukomo wa utambuzi uliowekwa mapema. Utafiti huu hauthibitishi matumizi ya kawaida ya kliniki nchini Uturuki, lakini unatoa jukwaa la kiufundi la kuchunguza kipimo cha CA19-9 cha lateral flow chenye kasi na ishara kubwa.

Tatizo kuu la utafiti ni lipi?

Chanzo cha utafiti ni ugumu wa kugundua PDAC katika hatua ya mapema. Badala ya kutafuta biomarker mpya, kazi hii inalenga kuendeleza mfumo wa uchambuzi unaoweza kupima CA19-9 katika seramu kwa haraka na kwa unyeti mkubwa zaidi.

Immunoassay za mtiririko wa pembeni zina faida kwa sababu ni za haraka na rahisi, lakini katika mifumo ya kawaida ishara ya rangi inayotolewa na chembe moja ya dhahabu ya takribani 20 nm inaweza kuwa dhaifu katika viwango vya chini vya lengo. Watafiti walijaribu kutatua tatizo hilo kwa kuunganisha chembe nyingi za dhahabu kwenye kiini cha silika kwa nafasi za nanomita zinazodhibitiwa, si kwa kuongeza tu ukubwa wa ishara ya chembe moja.

SELFI hufanya kazi vipi?

Nanoprobe kuu inayotumika katika SELFI ni SiO₂@Au@Au. Chembe ya silika hutumika kama kiini cha kubeba; chembe za dhahabu kwenye uso wake hukaribiana katika kiwango cha nanomita. Katika nafasi hizo finyu, localized surface plasmon resonance huzalisha maeneo yenye uga mkali wa sumakuumeme, yaani plasmonic hotspots.

Kulingana na maelezo ya kimekanizimu, kuimarika kwa uga wa umeme wa ndani huongeza absorption cross-section ya nanoparticles. Kunyonya mwanga zaidi hufanya nanoprobe ionekane nyeusi zaidi na yenye utofautishaji mkubwa kwenye membrane nyeupe ya nitrocellulose. Kwa hivyo, katika mkusanyiko uleule wa lengo, ishara ya rangi huwa kubwa kuliko ile ya LFIA ya kawaida inayotumia AuNP moja.

Wakati wa jaribio, CA19-9 hushikiliwa kati ya antibody ya kugundua iliyo kwenye nanoprobe na antibody ya kukamata iliyo kwenye mstari wa kipimo. Nanoprobes za SiO₂@Au@Au zinazokusanyika kwenye mstari wa kipimo hutengeneza ishara ya rangi nyeusi. Baada ya kupigwa picha, ishara hii hupimwa kwa ImageJ na kubadilishwa kuwa mkusanyiko wa CA19-9 kwa kutumia curve za kalibresheni.

Kwa nini nafasi ya nanomita ni muhimu?

Watafiti walichunguza kwanza muundo wa nanoprobe kwa kutumia simulation za 3D wave optics. Katika modeli, AuNP 270 zilisambazwa sawasawa kwenye uso wa nanoparticle ya SiO₂ yenye kipenyo cha 168 nm. Nafasi za G_Au kati ya chembe za dhahabu zilichambuliwa kwa 10, 8, 6, 4, 2 na 1 nm. Mawimbi ya sumakuumeme yenye TE-polarization katika 400–800 nm yalitumiwa, na nanostructure ilichukuliwa kuwa ndani ya maji.

Kadiri nafasi kati ya AuNP ilivyopungua, uga wa umeme kwenye uso uliongezeka. Hasa G_Au ilipokuwa chini ya 6 nm, maeneo dhahiri ya hotspot yalionekana kati ya chembe. Absorption, scattering na extinction cross-section pia ziliongezeka pamoja na uga huo.

Watafiti pia walijaribu kama ongezeko hilo lilitokana tu na kuongezeka kwa kipenyo cha AuNP. Kwa kipenyo kikubwa zaidi, absorption cross-section ya AuNP ndani ya nanostructure iliyounganishwa ilikuwa takribani mara 2.65 zaidi kuliko AuNP moja iliyo pekee kwenye uso wa silika. Hata kipenyo cha AuNP kilipowekwa sawa, kupunguza nafasi kati ya chembe kulileta mabadiliko makubwa zaidi katika uundaji wa hotspot. Hii inaunga mkono wazo kwamba chanzo kikuu cha kuimarika kwa ishara ni mwingiliano wa plasmonic unaotokana na nanogap.

Nanoprobes zilitengenezwa na kuthibitishwa vipi?

Katika hatua ya majaribio, nanoparticles za SiO₂ zenye takribani 145 nm zilitengenezwa kwa modified Stöber method. Uso wa silika uliwekewa amine kwa APTES; gold nanoseeds za 3–5 nm zilitayarishwa na kufungwa kwenye uso wa SiO₂-NH₂, kisha AuNP zilikuzwa kwa seed-mediated growth.

Kwa kubadilisha idadi ya mizunguko ya kuongeza gold precursor na ascorbic acid, miundo ya SiO₂@Au@Au₁, SiO₂@Au@Au₃, SiO₂@Au@Au₅, SiO₂@Au@Au₇, SiO₂@Au@Au₉ na SiO₂@Au@Au₁₁ ilitengenezwa. Picha za Cs-STEM zilionyesha nafasi za wastani za AuNP-AuNP kuwa 9.55, 7.63, 5.89, 3.53, 1.33 na 1.20 nm.

Extinction ya mwanga unaoonekana iliongezeka kadiri nafasi ilivyopungua. Katika SiO₂@Au@Au₁₁, extinction ya juu ilikuwa 0.426; baada ya kuondoa kiini cha silika na kupata AuNP pekee ilikuwa 0.120, na kwa nanoseeds za 3–5 nm ilikuwa 0.031. Maximum extinction ya nanoprobe hii ilikuwa takribani mara 58 zaidi kuliko 200 nm AuNP na takribani mara 1.439 zaidi kuliko 20 nm AuNP inayotumika katika LFIA ya kawaida.

Uchambuzi wa CA19-9 ni wa haraka kiasi gani?

Ukali wa rangi kwenye mstari wa kipimo cha SELFI ulifuatiliwa kwa muda wa 1, 2, 5, 10, 15, 30 na 60 dakika. Ishara iliongezeka haraka mwanzoni na baada ya takribani dakika 15 ilikaribia kujaa katika vipimo vya ImageJ. Kwa hiyo vipimo vilivyofuata vilitumia muda wa dakika 15. Utaratibu wa ELISA uliolinganishwa ulihitaji jumla ya dakika 285.

Katika majaribio ya modeli ya CA19-9 kati ya 0–200 U mL⁻¹, mstari wa SELFI uliweza kuonekana kwa macho juu ya 5 U mL⁻¹, ilhali LFIA ya kawaida haikuonyesha mstari unaoonekana hadi 100 U mL⁻¹, na hata hapo ishara ilikuwa dhaifu.

Kikomo cha ugunduzi kilikuwa nini?

Kikomo cha ugunduzi (limit of detection, LOD) cha CA19-9 kilichoripotiwa kwa SELFI kilikuwa 0.012 U mL⁻¹, na kwa ELISA ya kibiashara 0.3 U mL⁻¹. Katika sehemu ya matokeo, LOD ya LFIA ya kawaida ya 20 nm AuNP ilitolewa kama 121.477 U mL⁻¹, na SELFI ilitajwa kuwa na LOD ndogo kwa mara 10.123.

Kumbuka kuhusu kutokulingana ndani ya chanzo: Katika Discussion, thamani hiyo hiyo ya LOD kwa LFIA iliandikwa kama 12.477 U mL⁻¹. Hata hivyo, thamani ya 121.477 U mL⁻¹ ndiyo inayolingana na tofauti ya mara 10.123. Kwa hiyo namba hizi mbili hazikuunganishwa kimya kimya kuwa thamani moja.

Sampuli za seramu ya kliniki zilionyesha nini?

Tathmini ya kliniki ilitumia sampuli 150 za seramu: 50 za watu wenye afya, 40 za PDAC ya hatua ya mapema/resectable na 60 za PDAC ya hatua ya juu/local advanced au metastatic. Viwango vya CA19-9 vilipimwa kwa SELFI, LFIA ya kawaida na ELISA.

Katika uchambuzi wa ROC, 90% ya sampuli ndani ya kila kundi ilichaguliwa kwa nasibu na mchakato huo ukarudiwa mara 100. Hivyo, badala ya matokeo yanayotegemea mgawanyo mmoja, ROC curves 100 na AUC 100 zilitengenezwa.

Kwa PDAC ya hatua ya mapema dhidi ya watu wenye afya, SELFI ilikuwa na AUC 0.862 (%95 CI: 0.841–0.888), ELISA 0.854 (%95 CI: 0.834–0.881), na LFIA 0.550 (%95 CI: 0.528–0.556). Ulinganisho wa AUC za SELFI na ELISA ulitoa P < 0.0001. Kwa hatua ya juu, SELFI ilikuwa 0.925, ELISA 0.926 na LFIA 0.692; tofauti ya SELFI na ELISA haikuwa muhimu (P = 0.3363). Sampuli zote 150 zilipotathminiwa pamoja, SELFI ilikuwa 0.899, ELISA 0.896 na LFIA 0.634.

Kutokulingana kwa pili ndani ya chanzo: Katika Discussion, mpangilio wa “0.896 vs. 0.899” unaonekana kinyume na sentensi inayosema SELFI iko juu kuliko ELISA. Jedwali 1 na Kielelezo 4 vinatoa ELISA = 0.896 na SELFI = 0.899, kwa hiyo maadili hayo yalihifadhiwa.

Vielelezo vinaeleza nini?

Kielelezo 1 kinaonyesha muktadha wa kibaolojia kutoka seli za PDAC hadi kipimo cha CA19-9 katika seramu, nanogaps katika SiO₂@Au@Au, mantiki ya test strip ya SELFI na ulinganisho wa muda wa ELISA. Kielelezo 2 kinaunganisha simulation ya sumakuumeme na characterization ya nanostructure ya majaribio. Kielelezo 3 kinaonyesha SELFI kufikia karibu kujaa kwa ishara baada ya dakika 15, curves za ishara dhidi ya CA19-9, pamoja na kalibresheni za PSA na ICAM-1. Kielelezo 4 kinaonyesha uchambuzi wa ROC wa sampuli 150 za seramu ya kliniki.

Matokeo yanayoungwa mkono na utafiti

• Nanogaps ndogo za AuNP-AuNP katika SiO₂@Au@Au zinahusiana na uundaji wa plasmonic hotspots na extinction kali ya macho.
• SiO₂@Au@Au₁₁ ilitoa ishara ya rangi yenye nguvu zaidi kuliko AuNP moja ya kawaida.
• SELFI ilipima CA19-9 kwa takribani dakika 15 katika hali za majaribio.
• LOD ya CA19-9 kwa SELFI iliripotiwa kuwa 0.012 U mL⁻¹.
• Katika kohort ya seramu ya Korea Kusini, SELFI ilionyesha AUC 0.862 kwa kutofautisha PDAC ya mapema na watu wenye afya.
• LFIA ya kawaida ya 20 nm AuNP ilikuwa chini ya SELFI na ELISA katika utendaji wa kutenganisha makundi ya kliniki.
• Katika kalibresheni za PSA na ICAM-1, SELFI pia ilionyesha ishara ya uchambuzi yenye mwelekeo wa juu kuliko LFIA.

Matokeo ambayo utafiti haujathibitisha bado

• Haijaonyeshwa kuwa SELFI iko tayari kwa uchunguzi wa saratani ya kongosho katika idadi ya watu wote.
• Hakuna uthibitishaji huru wa vituo vingi au wa kimataifa uliofanywa.
• Utendaji katika idadi ya watu wa Kituruki haukutathminiwa.
• Hakukuwa na cut-off ya mwisho ya kliniki iliyothibitishwa kwa cohort huru.
• Haijaonyeshwa kuwa utambuzi wa mapema kwa test hii unaboresha survival au matokeo ya matibabu.
• Vizuizi vya kibaolojia vya CA19-9 havijaondolewa; waandishi wanataja biomarkers za ziada kwa visa vya Lewis-negative kama kazi ya baadaye.
• Majaribio ya PSA na ICAM-1 hayathibitishi utendaji wa utambuzi wa kliniki kwa magonjwa yanayohusiana na biomarkers hizo.
• Matokeo hayawezi kujumlishwa moja kwa moja kwa makundi mengine ya kikabila, kijiografia au kliniki.

Mbinu na matokeo ya utafiti

Muundo wa utafiti na sampuli ya kliniki

Idhini ya kimaadili kwa matumizi ya sampuli za seramu ya binadamu ilitolewa na Seoul National University Bundang Hospital Human Bioresource Center. Nambari ya IRB iliripotiwa kuwa X-2011-651-903, na washiriki wote walitoa ridhaa iliyoandikwa. Taarifa za wagonjwa zilifichwa utambulisho kabla ya uchambuzi.

Watu wenye afya walilinganishwa na makundi ya saratani kwa umri na jinsia kwa propensity matching. Washiriki wote walikuwa East Asian na Wakorea Kusini. Ukubwa wa sampuli haukuamuliwa kwa power analysis ya awali bali kwa upatikanaji wa sampuli za kliniki; majaribio hayakufanywa kwa randomization na watafiti hawakuwa blinded.

Simulation ya nanostructure

Simulation za macho zilifanywa kwa COMSOL Multiphysics 5.4. Mawimbi ya TE-polarized katika 400–800 nm yalitumika. Modeli ilikuwa na AuNP 270 juu ya sphere ya SiO₂ ya 168 nm, huku nafasi za G_Au zikiwa 10, 8, 6, 4, 2 na 1 nm.

Utengenezaji wa nanoprobe na test strip

Nanoparticles za SiO₂ za takribani 145 nm zilitengenezwa kwa modified Stöber method, uso ukawekewa APTES, gold nanoseeds za 3–5 nm zikaunganishwa na AuNP zikaoteshwa kwa seed-mediated growth. Nanoprobe ya SiO₂@Au@Au₁₁ iliunganishwa na antibody ya CA19-9 kupitia 11-MUA, EDC na sulfo-NHS. Test strip ilikuwa na goat anti-mouse IgG kwenye control line na anti-CA19-9 capture antibody kwenye test line.

Uchambuzi wa modeli na kalibresheni

Jaribio la CA19-9 lilitumia 3 μL ya sampuli, 5 μL ya suspension ya nanoprobe na 25 μL ya %0.5 PBST, jumla 33 μL. Strip ilikuzwa kwa dakika 15 na ishara ikapimwa kwa ImageJ. Viwango vya kalibresheni vilikuwa 0, 0.0037, 0.037, 0.37, 3.7, 37, 370, 3700 na 37000 U mL⁻¹.

Curve ya SELFI kwa CA19-9:

\[ \\mathrm{Signal\\ intensity} = 83.84+ \\frac{14.75-83.84} {1+\\left(\\frac{\\mathrm{Concentration}}{20.62}\\right)^{0.85}} \\]

Curve ya LFIA ya kawaida:

\[ \\mathrm{Signal\\ intensity} = 31.13+ \\frac{6.45-31.13} {1+\\left(\\frac{\\mathrm{Concentration}}{689.82}\\right)^{1.26}} \\]

Ishara ya LOD ilihesabiwa kwa \(I_{\\mathrm{LOD}} = I_{\\mathrm{Blank}} + 3\\sigma_{\\mathrm{Blank}}\), kisha ikaingizwa katika equation ya kinyume cha kalibresheni ili kupata LOD katika mkusanyiko wa biomarker.

Seramu ya kliniki na takwimu

Sampuli za seramu zili-dilute mara 10 kwa %0.5 PBST kabla ya SELFI na LFIA. ELISA ilifanywa kwa protocol ya mtengenezaji kwa duplicate. ROC na AUC zilihesabiwa kwa R na pROC; 10% ya kila kundi ilitolewa kwa nasibu, 90% ikatumika, na mchakato ukarudiwa mara 100. Ulinganisho wa usambazaji wa AUC ulitumia Student t-test ya pande mbili.

Vizuizi vya msingi vya mbinu

• Ukubwa wa sampuli haukupangwa kwa power analysis ya awali.
• Utafiti ni wa kituo kimoja.
• Washiriki wote 150 ni Wakorea Kusini.
• Majaribio hayakuwa randomized.
• Watafiti hawakuwa blinded kwa makundi au tathmini ya matokeo.
• Hakuna nguvu ya kutosha kwa uchambuzi wa kijinsia wa utendaji wa utambuzi.
• Hakuna uthibitisho wa clinical cutoff ya SELFI katika cohort huru ya nje.

Maelezo ya chanzo na mbinu

Waandishi

Sohyeon Jang, Minsup Shin, Jiseok Han, Han-Joo Bae, Yuna Youn, Hye-Seong Cho, Kwanghee Yoo, Jun-Sik Chu, Jaehyun An, Geunhyeong An, Hyejin Chang, Jin-Hyeok Hwang, Jaehi Kim, Jihwan Song, Jong-chan Lee, Luke P. Lee na Bong-Hyun Jun.

Mchango sawa: Sohyeon Jang, Minsup Shin na Jiseok Han walichangia kwa usawa. Waandishi wa mawasiliano: Jaehi Kim, Jihwan Song, Jong-chan Lee, Luke P. Lee na Bong-Hyun Jun.

Taasisi, ufadhili, data na code

Taasisi zinahusisha Konkuk University, Hanbat National University, Seoul National University Bundang Hospital, BioSquare, Kangwon National University, Seoul National University, Harvard Medical School, Brigham and Women’s Hospital, University of California Berkeley na POSTECH. Ufadhili ulihusishwa na Ministry of Science and ICT ya Korea na National Research Foundation of Korea. Data za kiasi zilizochakatwa zilitolewa katika supplemental tables na source data; data binafsi za seramu ya binadamu haziko wazi kwa sababu za kimaadili na kisheria za faragha. Code ilitajwa kuwepo kwenye GitHub JKim-45/SELFI na kuhifadhiwa Zenodo kwa 10.5281/zenodo.17958691.

Mchango wa waandishi na mgongano wa maslahi

S.J., M.S., J.K. na B.-H.J. walibuni majaribio; S.J., M.S., J.H., H.-J.B., Y.Y., H.-S.C., K.Y., J.-S.C., J.A., G.A. na J.K. walifanya majaribio na uchambuzi; J.K. aliunda R code ya takwimu; waandishi kadhaa walihusika katika uandishi na marekebisho; L.P.L. na B.-H.J. walisimamia kazi. Waandishi walitangaza kutokuwa na mgongano wa maslahi.

Leseni na mipaka ya tafsiri ya kisayansi

Kwa kuwa makala ilichapishwa chini ya CC BY-NC-ND 4.0, vielelezo asili 1–4 havikunakiliwa au kuchorwa upya kama nyenzo iliyorekebishwa katika maudhui ya Verianla. Kutokulingana kwa LOD ya LFIA na mpangilio wa 0.896/0.899 katika maelezo ya AUC kumewekwa wazi badala ya kusahihishwa kimya kimya.

Utafiti huu ni kazi ya maendeleo ya nanobiosensor na diagnostic assay. Unasaidia hitimisho kwamba SELFI inaweza kupima CA19-9 kwa haraka na LOD ya chini katika cohort iliyopo, na kwamba inaonyesha AUC yenye nguvu kwa PDAC ya hatua ya mapema dhidi ya watu wenye afya. Lakini kwa sababu ni utafiti wa kituo kimoja, idadi moja ya kijiografia/kikabila, bila randomization au blinding, bila power analysis ya awali na bila external validation, hauungi mkono hitimisho kwamba SELFI tayari ni kiwango cha kawaida cha clinical screening au diagnosis.