Utafiti huu unaonyesha kwamba bioreaktori za kiwango kidogo na cha kati huenda zisiwe “zimechanganyika kikamilifu” kama inavyodhaniwa mara nyingi. Watafiti walipima kwamba, katika uchachushaji wa E. coli wa fed-batch uliofanywa katika bioreaktori ya daraja la 15–20 L, oksijeni iliyoyeyushwa inaweza kubadilika kwa kiasi kikubwa kulingana na urefu wa reaktori. Kulingana na matokeo, oksijeni iliyoyeyushwa katika eneo la chini hubaki chini kuliko katika eneo la juu, na katika baadhi ya hali tofauti kati ya juu na chini inaweza kufikia takribani %30.

Matokeo haya ni muhimu kwa sababu katika bioreaktori sensa ya oksijeni iliyoyeyushwa kwa kawaida hupima katika sehemu moja tu, na mfumo wa udhibiti hurekebisha uingizaji hewa na uchanganyaji kulingana na kipimo hicho. Ikiwa sensa iko katika eneo la chini, mfumo wa udhibiti unaweza kuweka oksijeni katika sehemu hiyo kwenye thamani lengwa; hata hivyo, hii haimaanishi kwamba kiwango kilekile cha oksijeni kinapatikana katika reaktori nzima. Utafiti unaonyesha kuwa mahali pa sensa kunaweza kuathiri moja kwa moja maamuzi ya ufuatiliaji wa mchakato, udhibiti, uundaji wa modeli na kuongeza kiwango cha uzalishaji.

Katika utafiti huo, ingawa hakukuonekana gradienti dhahiri za nafasi katika vipimo vya glukosi, asetati na biomasi, tofauti muhimu kulingana na urefu zilipatikana kwa oksijeni iliyoyeyushwa. Ili kueleza tofauti hizi, modeli yenye vyumba sita ya bioreaktori yenye mienendo ya muda ilitengenezwa kutokana na hesabu za CFD. Modeli hiyo ilizingatia maeneo ya mzunguko ndani ya reaktori, ikaamua viwango vya mtiririko kati ya vyumba, na ikakokotoa kwa pamoja uhamishaji wa oksijeni, ukuaji wa seli, matumizi ya oksijeni na usafirishaji kati ya vyumba.

Ujumbe mkuu wa utafiti ni huu: hata katika bioreaktori ndogo kiasi za 20 L, si salama kila wakati kudhani kwamba oksijeni iliyoyeyushwa inayopimwa na sensa moja inawakilisha ujazo wote. Hali hii ni muhimu hasa kwa uzalishaji wa dawa za kibayolojia, chanjo, protini rekombinanti na michakato ya kuongeza kiwango cha bioprocess za viwandani. Hata hivyo, utafiti huu ni preprint na baadhi ya uchunguzi, kama gradienti za pH, haujawekewa modeli katika makala hii; kwa hiyo matokeo yanapaswa kusomwa kwa tahadhari na ndani ya muktadha wake.

Bioreaktori ni vifaa vya mchakato vilivyofungwa ambamo vijidudu, seli au mifumo ya kibayolojia hukuzwa chini ya hali zinazodhibitiwa. Vinachukua nafasi muhimu katika maeneo kama uzalishaji wa chanjo, protini rekombinanti, vimeng’enya, dawa za kibayolojia na uchachushaji wa viwandani. Katika mifumo hii, vigezo kama halijoto, pH, virutubisho, uchanganyaji, uingizaji hewa na oksijeni iliyoyeyushwa huathiri moja kwa moja ukuaji wa seli, mavuno ya bidhaa na ubora wa bidhaa.

Hatua ya kuanzia ya utafiti ni kuhoji dhana inayotumiwa sana katika bioreaktori: kwamba bioreaktori za kiwango kidogo huchanganyika vizuri na hivyo viwango vya vitu ndani ya reaktori huwa takribani sawa kila mahali. Dhana hii ni muhimu sana kwa matumizi ya kiutendaji, kwa sababu thamani ya pH au oksijeni iliyoyeyushwa inayopimwa na sensa moja huchukuliwa kuwa inawakilisha reaktori nzima. Kwa hiyo mfumo wa udhibiti unaweza kufanya maamuzi kwa kutumia data kutoka sehemu moja. Lakini tabia halisi ya kiowevu inaweza kuwa changamano zaidi, hasa pale mchanganyiko wa gesi-kioevu, athari ya impela, usambazaji wa viputo na matumizi ya oksijeni na seli vinapohusika.

Kwa muda mrefu imejulikana kwamba katika bioreaktori kubwa za viwandani mchanganyiko si sawia kikamilifu. Katika ujazo mkubwa, muda wa kuchanganya huongezeka, virutubisho na oksijeni havifiki kila sehemu kwa kasi sawa, na seli hupitia mazingira madogo tofauti. Kinyume chake, katika bioreaktori za 15–20 L zilizo karibu na kiwango cha maabara/benchi, mara nyingi hufikiriwa kwamba kutokuwepo kwa usawa huku kunaweza kupuuzwa. Utafiti huu unauliza moja kwa moja dhana hiyo na unaonyesha kwa msingi wa majaribio na modeli kwamba gradienti za oksijeni iliyoyeyushwa zinaweza kutokea hata katika kiwango cha 20 L.

Bioreaktori iliyotumiwa katika utafiti ni mfumo wenye ujazo wa 19,5 L uliotajwa kama New Brunswick Scientific BioFlo 415 SIP Fermentation System. Katika majaribio ya fed-batch, ujazo wa kazi uliwekwa katika takribani 13,5–14 L. Kiumbe kilichotumiwa ni E. coli BL21 (DE3) pET-VP1. E. coli ilichaguliwa kwa sababu ni kiumbe mfano na cha uzalishaji kinachotumiwa sana katika bioteknolojia na uzalishaji wa dawa. Uchaguzi huu unaifanya kazi kuwa na maana si tu kwa mitambo ya msingi ya vimiminika bali pia kwa uzalishaji halisi wa bioprocess.

Katika majaribio, urefu wa sensa ya oksijeni iliyoyeyushwa na kifaa cha kuchukua sampuli uliweza kubadilishwa. Vipimo vilifanywa katika maeneo matatu makuu ya urefu: eneo la chini takribani 0,14 m, eneo la kati takribani 0,305 m na eneo la juu takribani 0,47 m. Impela ziliwekwa katika takribani 0,09 m, 0,29 m na 0,51 m. Mpangilio huu unaonyesha kuwa tofauti za oksijeni iliyoyeyushwa zinaweza kuathiriwa si tu na umbali wima, bali pia na maeneo ya mzunguko yanayotengenezwa na impela.

Ugunduzi wa kwanza muhimu wa majaribio ni kwamba tofauti za kijiografia kwa glukosi, asetati na biomasi zilikuwa ndogo sana. Katika majaribio ya fed-batch, viwango vya glukosi na asetati katika sampuli zilizochukuliwa kwa urefu tofauti vilipatikana kuwa kwa kiasi kikubwa sawa. Katika vipimo vya biomasi, kulionekana mwelekeo wa msongamano wa macho kuwa takribani %10 juu zaidi katika eneo la juu; hata hivyo, tofauti hii ilitafsiriwa kwa tahadhari kuwa huenda iko ndani ya kelele ya kipimo na inaweza kuhusiana na athari za buoyancy/msongamano wa seli zinazoweza kufanya seli ziwe nyingi kidogo juu. Kwa hiyo katika modeli ilidhaniwa kwamba biomasi, glukosi na asetati ni sawia kwa nafasi.

Oksijeni iliyoyeyushwa ilionyesha tabia tofauti. Katika majaribio ilionekana kwamba oksijeni iliyoyeyushwa huongezeka kadiri urefu wa reaktori unavyoongezeka; yaani, oksijeni ya chini kabisa ilipimwa katika eneo la chini na ya juu kabisa katika eneo la juu. Katika fed-batch ya kwanza, kati ya saa 8,98–9,05 tofauti ya chini-kati ilikuwa takribani %16 na tofauti ya kati-juu takribani %14. Katika utafiti huo huo, kati ya saa 11,07–11,12 tofauti ya chini-kati iliongezeka hadi takribani %17 na tofauti ya kati-juu hadi takribani %21. Katika fed-batch ya pili, urefu wa sensa ulibadilishwa katika nyakati 11 tofauti; wastani wa tofauti ya chini-kati ulikuwa takribani %12 na wa kati-juu takribani %15. Mwelekeo wa jumla ulikuwa uleule katika majaribio yote mawili: oksijeni iliyoyeyushwa ilikuwa juu zaidi sehemu ya juu na chini zaidi sehemu ya chini.

Matokeo haya yanaweza kueleweka kwa mfano rahisi wa kila siku: si sahihi kila wakati kupima halijoto katika sehemu moja ya chumba na kudhani chumba chote kina halijoto hiyo hiyo. Radiator, kiyoyozi au mtiririko wa hewa unaweza kufanya baadhi ya maeneo yawe moto au baridi zaidi. Vivyo hivyo, katika bioreaktori sensa moja ya oksijeni iliyoyeyushwa hupima oksijeni katika sehemu ilipo tu. Ikiwa kuna tofauti ya oksijeni kutoka juu kwenda chini, mahali pa sensa hubadilisha tafsiri ya mkakati mzima wa udhibiti.

Jambo muhimu kwa bioprocess ni hili: mfumo wa kudhibiti oksijeni iliyoyeyushwa kwa kawaida huleta thamani katika sehemu yenye sensa kwenye setpoint lengwa. Katika utafiti huu setpoint ya udhibiti iliwekwa kuwa 30% DO, na katika modeli thamani ya oksijeni iliyoyeyushwa ya chumba ambamo sensa ipo iliandikwa hivi:

\[ O_2(t) = O^{set}_2 = 0.0018 \, g/L \]

Hapa \\(O_2(t)\\) inawakilisha mkusanyiko wa oksijeni iliyoyeyushwa unaobadilika kwa muda katika chumba cha pili ambamo sensa ipo, na \\(O^{set}_2\\) inawakilisha setpoint ya udhibiti. Kauli hii inaeleza kwamba wakati kitanzi cha udhibiti kimewashwa, oksijeni katika eneo la sensa hudumishwa kwenye thamani lengwa. Hata hivyo, utafiti unaonyesha kuwa oksijeni katika vyumba vingine inaweza kubaki tofauti na thamani hii.

Majaribio ya “gassing-out” pia yalifanywa. Katika majaribio haya uingizaji hewa ulisimamishwa kwa muda mfupi, na ulianzishwa tena oksijeni iliyoyeyushwa iliposhuka chini ya %10. Kwa kawaida majaribio ya aina hii hutumiwa kukadiria kLa, yaani mgawo wa uhamishaji wa oksijeni kwa ujazo. kLa ni kigezo cha msingi cha bioreaktori kinachoonyesha ufanisi wa oksijeni kuhama kutoka awamu ya gesi kwenda kioevu. Ikiwa kLa ni kubwa, oksijeni huhamishwa kwa kasi zaidi kwenda kwenye kioevu cha reaktori; ikiwa ni ndogo, inaweza kuwa vigumu kukidhi mahitaji ya oksijeni ya seli.

Katika utafiti, majaribio ya gassing-out hayakutumiwa tu kukadiria thamani moja ya jumla ya kLa, bali pia kuelewa majibu ya oksijeni yanayobadilika katika urefu tofauti. Uingizaji hewa unapositishwa, oksijeni iliyoyeyushwa hushuka kutokana na matumizi ya oksijeni na seli na usambazaji upya kati ya vyumba. Uingizaji hewa unapoanzishwa tena, oksijeni hupanda tena. Kasi ya kupanda huku hutoa taarifa kuhusu uhamishaji wa gesi-kioevu, usambazaji wa viputo, uchanganyaji na matumizi ya oksijeni ya kibaolojia katika eneo hilo.

Matokeo ya gassing-out yalionyesha kwamba maadili ya kLa kwa kawaida yalikuwa ya chini zaidi katika sehemu ya chini ya reaktori. Hali hii inaendana na kipimo cha oksijeni iliyoyeyushwa kuwa chini zaidi katika eneo la chini. Inawezekana kwamba viputo vya gesi, gas holdup au eneo la uhamishaji wa oksijeni vina ufanisi zaidi katika sehemu ya juu, na hivyo kuchangia oksijeni iliyoyeyushwa kubaki juu zaidi. Modeli ya utafiti pia inazingatia tofauti za uhamishaji wa oksijeni kulingana na urefu kwa namna inayounga mkono tafsiri hii.

Kwa upande wa modeli, utafiti una tabaka kuu mbili. Tabaka la kwanza ni modeli ya kinetiki inayoeleza mienendo ya biomasi, glukosi na asetati ya utamaduni wa E. coli. Tabaka la pili ni modeli yenye vyumba inayoungwa mkono na CFD na inayoeleza jinsi oksijeni iliyoyeyushwa inavyobadilika kutoka chumba hadi chumba ndani ya reaktori. Kwa njia hii ukuaji wa kibaolojia na matumizi ya oksijeni hushughulikiwa pamoja na usafirishaji wa kihidrodinamiki.

Kinetiki ya Monod ya kawaida ni modeli inayotumiwa sana kueleza ukuaji wa vijidudu unaotegemea substrate. Hata hivyo, utafiti unasema kuwa usemi rahisi wa Monod pekee haukutosha kueleza kwa kutosha mienendo ya glukosi, asetati na biomasi. Sababu ni kwamba katika ukuaji wa E. coli, mienendo ya lag/adaptation, uzuiaji wa ukuaji katika biomasi kubwa na mabadiliko ya kimetaboliki kati ya glukosi na asetati huingia katika mfumo.

Kwa hiyo, katika modeli kwanza ilifafanuliwa neno la uzuiaji linalotegemea biomasi:

\[ f_{inh} = \frac{1}{1 + \left(\frac{X}{k_x}\right)^{n_x}} \]

Hapa \\(f_{inh}\\) ni kipengele cha uzuiaji wa ukuaji, \\(X\\) ni mkusanyiko wa biomasi, \\(k_x\\) ni kiwango cha biomasi ambacho uzuiaji huanza kuwa dhahiri, na \\(n_x\\) ni kipeo kinachoamua ukali wa uzuiaji. Kadiri biomasi inavyoongezeka, hali za mazingira zinazopunguza ukuaji wa seli zinaweza kutokea; neno hili huongeza athari hiyo kwenye modeli.

Kwa tabia ya lag/adaptation, kwanza ilifafanuliwa kazi hii ya kati:

\[ \theta(X) = \frac{1}{1 + \left(\frac{K_{x2}}{X}\right)^{n_{x2}}} \]

Kisha kipengele cha lag kiliandikwa hivi:

\[ f_{lag} = A_1 + (1-A_1)\exp[-\exp(-w\theta + X_\beta)] \]

Hapa \\(f_{lag}\\) inawakilisha athari ya awali ya kuzoea mazingira, \\(A_1\\) thamani ya asymptoti ya chini, \\(w\\) kigezo cha umbo, na \\(X_\\beta\\) kigezo cha uhamisho. Usemi huu unaeleza kuwa seli hazifikii kasi ya juu ya ukuaji mara moja baada ya kuingia katika mazingira, bali tabia ya ukuaji inaweza kubadilika hatua kwa hatua kulingana na biomasi na muda.

Kazi ya kubadilisha substrate ilifafanuliwa ili kudhibiti matumizi ya asetati kulingana na kiwango cha glukosi:

\[ f_{switch} = \frac{1}{1 + \left(\frac{S}{k_h}\right)^{n_h}} \]

Hapa \\(S\\) ni mkusanyiko wa glukosi, \\(k_h\\) ni konstanti inayoweka mabadiliko kutoka matumizi ya glukosi kwenda asetati, na \\(n_h\\) inaonyesha ukali wa mabadiliko hayo. Glukosi ikiwa nyingi, E. coli kwa kawaida huitumia kwa kipaumbele na matumizi ya asetati yanaweza kukandamizwa. Glukosi inapopungua, matumizi ya asetati yanaanza tena. Tabia hii inajulikana kama diauxic growth, yaani matumizi ya substrate mbili kwa mpangilio/mabadiliko ya kimetaboliki ya kufuatana.

Kasi mahususi za ukuaji kwenye glukosi na asetati ziliandikwa hivi katika utafiti:

\[ \mu_g = \mu_{max,G}\left(\frac{S}{K_s+S}\right)\left(\frac{K_a}{K_a+A}\right)f_{inh} \]

\[ \mu_a = \mu_{max,A}\left(\frac{A}{K_{a2}+A}\right)f_{switch}f_{inh} \]

Hapa \\(\\mu_g\\) ni kasi mahususi ya ukuaji inayotegemea glukosi, \\(\\mu_a\\) ni kasi mahususi inayotegemea asetati, \\(\\mu_{max,G}\\) kasi ya juu ya ukuaji kwa glukosi, \\(\\mu_{max,A}\\) kasi ya juu kwa asetati, \\(K_s\\) konstanti ya Monod ya glukosi, \\(A\\) mkusanyiko wa asetati, \\(K_a\\) konstanti ya uzuiaji wa asetati, na \\(K_{a2}\\) konstanti ya Monod ya unyonyaji wa asetati.

Jumla ya kasi mahususi yenye ufanisi ilifafanuliwa hivi:

\[ \mu_{tot} = (\mu_g + \mu_a)f_{lag} \]

Mlinganyo huu unaeleza kuwa ukuaji wa jumla unatokana na michango ya glukosi na asetati, lakini hali ya kuzoea mazingira ya seli pia huathiri ukuaji huo kwa ujumla.

Kasi za athari kwa ujazo za uundaji wa biomasi, matumizi ya glukosi na uzalishaji/matumizi ya asetati zilitolewa hivi:

\[ r_X = \mu_{tot}X \]

\[ r_S = -\left(\frac{\mu_g X}{Y_{xs}} + m_x X\right) \]

\[ r_A = \left(\frac{\mu_g X}{Y_{xa}}\right) - \left(\frac{\mu_a X}{Y_{xa2}}\right) \]

Hapa \\(r_X\\) ni kasi ya uundaji wa biomasi, \\(r_S\\) kasi ya matumizi ya glukosi, \\(r_A\\) kasi ya uzalishaji/matumizi ya asetati, \\(Y_{xs}\\) mavuno ya biomasi kutoka glukosi, \\(Y_{xa}\\) mgawo wa uundaji wa asetati unaohusiana na ukuaji kwa glukosi, \\(Y_{xa2}\\) mavuno ya biomasi yanayohusiana na matumizi ya asetati, na \\(m_x\\) ni mgawo wa matengenezo.

Kwa kuwa katika fed-batch lishe huongezwa kwenye reaktori na ujazo hubadilika, mizani ya misa inayobadilika kwa muda inajumuisha neno la mabadiliko ya ujazo:

\[ \frac{dX}{dt} = r_X - \frac{X}{V}\frac{dV}{dt} \]

\[ \frac{dS}{dt} = \frac{F_S(t)}{V}S_0 + r_S - \frac{S}{V}\frac{dV}{dt} \]

\[ \frac{dA}{dt} = r_A - \frac{A}{V}\frac{dV}{dt} \]

Hapa \\(V\\) ni ujazo wa reaktori, \\(dV/dt\\) mabadiliko ya ujazo kwa muda, \\(F_S(t)\\) kiwango cha mtiririko wa lishe ya glukosi, na \\(S_0\\) mkusanyiko wa glukosi katika suluhisho la lishe. Milinganyo hii inaonyesha kwamba katika michakato ya fed-batch si athari tu zinazopaswa kuzingatiwa, bali pia athari ya dilution inayotokana na ujazo unaoongezwa kwenye mfumo.

Ili kuunda modeli ya gradienti ya oksijeni, reaktori iligawanywa katika vyumba sita vya usawa. Kila chumba kilichukuliwa kuwa CSTR iliyochanganyika vizuri ndani yake, lakini kukiwa na mtiririko mdogo kati ya vyumba. Njia hii haihitaji hesabu nzito kama CFD kamili, lakini ni halisi zaidi kuliko modeli ya ujazo mmoja wa “well-mixed”. Jambo muhimu zaidi ni kwamba mipaka ya vyumba haikuchaguliwa kiholela. Mipaka iliwekwa kati ya maeneo ya mzunguko yaliyopatikana kutoka simuleringi za CFD.

Utafiti ulilinganisha mikakati miwili tofauti ya kugawa vyumba. Katika wa kwanza, mipaka iliwekwa kati ya maeneo ya mzunguko. Katika wa pili, mipaka iliwekwa karibu na vituo vya maeneo ya mzunguko. Matokeo yalionyesha kwamba ili kunasa gradienti sahihi za oksijeni, mipaka ilipaswa kuwa kati ya maeneo ya mzunguko. Hii ni kwa sababu viwango vya mtiririko kati ya maeneo haya ni vya chini na vinawakilisha kwa usahihi zaidi sehemu ambako uchanganyaji usiokamilika hutokea. Ugawaji usio sahihi haukuweza kutabiri kwa usahihi tofauti ya oksijeni ya juu-chini.

Viwango vya mtiririko kati ya vyumba vilitolewa kutoka CFD. Kwa mfano, mtiririko kutoka chumba 1 kwenda 2 ulikuwa 7132 L/saa, kutoka 2 kwenda 3 ulikuwa 3018 L/saa, na kutoka 3 kwenda 4 ulikuwa 905 L/saa. Ujazo wa vyumba pia ulikuwa tofauti; chumba cha kwanza 2,103 L, cha pili 1,648 L, cha tatu 3,650 L, cha nne 2,451 L, cha tano 3,386 L na chumba cha juu awali 0,8095 L. Ujazo wa chumba cha juu huongezeka kwa muda kutokana na lishe ya fed-batch.

Matumizi ya oksijeni kwa kila chumba yaliandikwa hivi:

\[ r_{O,i} = Y_{ox}\mu_i X_i \frac{O_i^{n_h}}{K_O^{n_h}+O_i^{n_h}} \]

Hapa \\(r_{O,i}\\) ni kasi ya matumizi ya oksijeni katika chumba cha i, \\(Y_{ox}\\) ni mgawo wa matumizi ya oksijeni kwa uundaji wa biomasi, \\(\\mu_i\\) kasi mahususi ya ukuaji ya eneo hilo, \\(X_i\\) mkusanyiko wa biomasi ya eneo, \\(O_i\\) mkusanyiko wa oksijeni iliyoyeyushwa ya eneo, \\(K_O\\) konstanti ya nusu-kujaa kwa oksijeni, na \\(n_h\\) ni mgawo wa Hill. Mlinganyo unaeleza kuwa oksijeni hutumiwa kuhusiana na ukuaji wa seli na kwamba katika viwango vya chini vya oksijeni, tabia ya matumizi inakuwa nyeti kwa upatikanaji wa oksijeni.

Mizani ya oksijeni iliyoyeyushwa kwa chumba i ina muundo huu:

\[ \frac{dO_i}{dt} = \frac{q_{i+1\rightarrow i}}{V_i}O_{i+1} + \frac{q_{i-1\rightarrow i}}{V_i}O_{i-1} - \frac{q_{i\rightarrow i+1}}{V_i}O_i - \frac{q_{i\rightarrow i-1}}{V_i}O_i + k_{L,i}a_i(O^* - O_i) - r_{O,i} \]

Katika mlinganyo huu, \\(q_{i\\rightarrow j}\\) ni kiwango cha mtiririko wa ujazo kutoka chumba i kwenda j, \\(V_i\\) ni ujazo wa kioevu wa chumba i, \\(k_{L,i}a_i\\) ni mgawo wa uhamishaji wa oksijeni kwa ujazo katika chumba i, \\(O^*\\) ni mkusanyiko wa oksijeni iliyoyeyushwa katika hali ya kujaa, na \\(O_i\\) ni mkusanyiko wa oksijeni iliyoyeyushwa wa eneo. Maneno ya mwanzo yanaonyesha usafirishaji kati ya vyumba, neno la \\(k_La\\) uhamishaji wa oksijeni kutoka gesi kwenda kioevu, na neno la mwisho matumizi ya oksijeni na seli.

Kwa kuwa ujazo wa chumba cha juu hubadilika kwa muda, neno la dilution pia huongezwa:

\[ -\frac{O_6}{V_6}\frac{dV_6}{dt} \]

Neno hili linaeleza jinsi mkusanyiko wa oksijeni iliyoyeyushwa katika chumba cha juu unavyoathiriwa na dilution wakati ujazo unaongezwa kutokana na lishe ya fed-batch.

Mgawo wa uhamishaji wa oksijeni ulipimwa kwa scaling kwa kutumia vigezo vya kihidrodinamiki kutoka CFD. Mgawo wa uhamishaji wa wingi upande wa kioevu ulikadiriwa hivi:

\[ k_{L,i} = C\varepsilon_i^{1/4} \]

Hapa \\(\\varepsilon_i\\) ni wastani wa kasi ya utawanyaji wa nishati ya turbulent katika chumba i na \\(C\\) ni konstanti ya uwiano wa majaribio. Turbulensi kubwa kwa kawaida inaweza kuongeza uhamishaji wa oksijeni kwa kuongeza mwingiliano kati ya viputo na kioevu.

Eneo la uso wa mwingiliano wa gesi-kioevu liliandikwa hivi:

\[ a_i = \frac{6\phi_{b,i}}{d_{b,i}} \]

Hapa \\(\\phi_{b,i}\\) ni gas holdup na \\(d_{b,i}\\) ni kipenyo cha viputo. Gas holdup inaonyesha kiasi cha awamu ya gesi kilichopo ndani ya kioevu. Eneo kubwa zaidi la viputo linamaanisha uso mkubwa zaidi wa uhamishaji wa oksijeni.

Kwa kuchukulia kipenyo cha viputo kuwa kilekile kati ya vyumba, mgawo wa uhamishaji wa wingi kwa ujazo ulirahisishwa hivi:

\[ k_{L,i}a_i = C'\eta_i \]

\[ \eta_i = \varepsilon_i^{1/4}\phi_{b,i} \]

Hapa \\(\\eta_i\\) ni kiashirio cha kihidrodinamiki cha uhamishaji wa wingi cha kila chumba kilichotokana na CFD. Katika utafiti, maadili haya yalikokotolewa kwa kila chumba na kutumiwa ku-scale mgawo wa uhamishaji wa oksijeni kati ya vyumba.

Faida kuu ya modeli hii ni kutumia taarifa za kina za mtiririko za CFD bila kulazimika kugeuza mfumo kuwa simuleringi kamili ya CFD-biochemical yenye gharama kubwa na kasi ndogo. CFD huamua mahali ambapo vyumba vinapaswa kuwekwa na ukubwa wa mtiririko kati yake. Modeli yenye vyumba kisha hutatua kwa kasi zaidi mienendo ya biomasi, glukosi, asetati na oksijeni. Kwa njia hii maana ya kimwili huhifadhiwa huku ufanisi wa kukokotoa ukiruhusu simuleringi kurudiwa mara nyingi.

Majaribio mawili ya fed-batch yalifanywa. Katika Fed-Batch 1, ujazo wa awali wa kazi ulikuwa 13,5 L. Setpoints zilitolewa kama 37°C, 200 rpm, pH 7,0, DO %30 na mtiririko wa hewa 5 SLPM. Oksijeni iliyoyeyushwa ilidhibitiwa kwa mkakati wa hatua kwa hatua kwa kuchanganya 200–500 rpm na mtiririko wa hewa 5–20 SLPM. Lishe ilianza biomasi ilipofikia takribani 0,15–0,25 g/L na ikaongezwa hatua kwa hatua.

Katika Fed-Batch 2, njia ilikuwa kwa kiasi kikubwa ileile, lakini ujazo wa awali uliwekwa kwa usahihi zaidi kuwa 14 L. OD ya awali ilikuwa 0,037 katika Fed-Batch 1 na 0,06 katika Fed-Batch 2. Mkakati wa lishe pia ulikuwa tofauti. Fed-Batch 2 ilidumu takribani saa 1,7 pungufu na ilifikia msongamano wa juu wa seli uliokuwa %78 zaidi kuliko Fed-Batch 1. Tofauti hii ilizingatiwa katika modeli kwa sababu inaweza kuleta tofauti katika matumizi ya oksijeni na tabia ya udhibiti.

Matokeo ya modeli yalieleza kwa ujumla vizuri profaili za biomasi, glukosi na asetati. Hasa, ilikamata mabadiliko kutoka matumizi ya glukosi na uzalishaji wa asetati kwenda matumizi tena ya asetati. Hii inaendana na overflow metabolism na acetate cycling zinazojulikana katika kimetaboliki ya E. coli. Katika Fed-Batch 1, ilielezwa kwamba baada ya takribani saa 14 modeli ilikadiria uzalishaji wa asetati kuwa chini; hali hii ilihusishwa na kukadiria pia matumizi ya glukosi kuwa chini katika kipindi hicho. Hata hivyo, profaili za biomasi ziliwakilishwa vizuri katika majaribio yote mawili.

Katika modeli ya oksijeni, viwango vya mtiririko kati ya vyumba kutoka CFD vilitumika moja kwa moja kwa Fed-Batch 2. Kwa Fed-Batch 1, kwa kuwa profaili ya uchanganyaji ilikuwa tofauti, viwango hivyo vilizidishwa kwa factor ya marekebisho ya 0,7. Factor hii inalingana na uwiano wa eneo la profaili ya RPM kati ya Fed-Batch 1 na 2. Kwa njia hiyo modeli ilijaribu kuwakilisha athari ya wastani ya uchanganyaji kuwa chini katika jaribio la kwanza.

Modeli ililinganisha vipimo endelevu vya oksijeni katika eneo la chini lenye sensa, vipimo vya muda mfupi vilivyopatikana kwa kuhamisha sensa kwenye urefu tofauti, na majibu ya oksijeni yanayobadilika katika majaribio ya gassing-out. Hitimisho kuu ni kwamba modeli ilinasa vizuri mwelekeo wa oksijeni kuongezeka pamoja na urefu. Kama ilivyo katika majaribio, oksijeni katika modeli ilikuwa chini zaidi katika eneo la chini na juu zaidi katika eneo la juu. Hii inaunga mkono wazi kwamba thamani ya DO inayodhibitiwa na sensa moja haiwezi lazima kuwakilisha ujazo wote wa reaktori.

Ugunduzi muhimu zaidi wa modeli ni kwamba mahali pa kugawa vyumba hubadilisha sana matokeo. Ugawaji sahihi unaoungwa mkono na CFD uliweza kueleza tofauti ya oksijeni ya juu-chini ya takribani %30 iliyoonekana katika majaribio. Ugawaji mbadala wenye msingi dhaifu wa kimwili ulitabiri mabadiliko ya oksijeni ya karibu %10 pekee na haukunasa vizuri vipimo katika eneo la juu la sensa. Hii inaleta swali muhimu zaidi kuliko “vyumba vingapi vipo?” katika modeli ya bioreaktori: “Je, mipaka ya vyumba imewekwa mahali panapoendana na fizikia ya mtiririko?”

Kuunda modeli ya majibu ya gassing-out pia ni mojawapo ya nguvu za utafiti. Baada ya uingizaji hewa kuanza tena, modeli kwa ujumla ilinasa kwamba oksijeni katika eneo la juu inaweza kuongezeka haraka na kwa kiasi kikubwa zaidi kuliko katika eneo la chini. Hii inaashiria kwamba uhamishaji wa oksijeni unaweza kuwa mkubwa zaidi juu. Katika baadhi ya majaribio, modeli ilikadiria oksijeni kuwa chini katika eneo la kati au la chini; watafiti walihusisha tofauti hiyo na mabadiliko ya kihidrodinamiki ya ndani, kutokuwa na uhakika wa mahali pa probe na urahisishaji wa kuwakilisha kila urefu wa sensa kwa chumba kimoja.

Matokeo ya kiutendaji ya utafiti ni makubwa. Ikiwa sensa iko chini katika bioreaktori na mfumo wa udhibiti unaweka DO %30 hapo, seli katika eneo la juu zinaweza kuwa katika mazingira yenye oksijeni zaidi. Vilevile, mahali tofauti pa sensa kunaweza kusababisha mfumo wa udhibiti kutoa majibu tofauti ya uingizaji hewa na uchanganyaji. Hili linaweza kuathiri kwa njia isiyo ya moja kwa moja ukuaji wa seli, uundaji wa bidhaa za kimetaboliki, uzalishaji wa protini na ubora wa bidhaa. Utafiti haukupima ubora wa bidhaa moja kwa moja, lakini unaonyesha kuwa mahali pa sensa ni kigezo muhimu cha udhibiti wa mchakato.

Matokeo pia ni muhimu kwa scale-up. Ikiwa gradienti ya oksijeni inaweza kutokea hata katika bioreaktori ya maabara au pilot, athari inaweza kutarajiwa kuwa changamano zaidi katika ujazo mkubwa wa viwandani. Katika bioreaktori kubwa, seli zinaweza kupitia maeneo tofauti ya oksijeni, substrate na pH ndani ya reaktori. Mabadiliko haya yanaweza kuathiri kimetaboliki ya seli. Kwa hiyo tafiti za aina hii zina thamani katika kuelewa kwa nini michakato iliyotengenezwa kwa kudhani “well-mixed” katika kiwango kidogo inaweza kuonyesha tabia tofauti inapoongezwa kiwango.

Kwa muda mrefu modeli za bioreaktori mara nyingi zilitumia dhana ya ujazo mmoja au mchanganyiko uliorahisishwa. Leo, kwa sababu mahitaji ya ubora, ufanisi na gharama katika uzalishaji wa dawa za kibayolojia yanaongezeka, mbinu za modeli zilizo halisi zaidi zinahitajika. CFD peke yake ni ya kina sana lakini inaweza kuwa ghali sana kukokotoa. Modeli zenye vyumba ni za haraka, lakini zinaweza kupotosha ikiwa vyumba vinawekwa vibaya kimwili. Utafiti huu unapendekeza njia ya kuunganisha mbinu hizo mbili: CFD huamua muundo wa mtiririko, na modeli yenye vyumba hutatua kwa haraka mienendo ya kibaolojia na oksijeni.

Kwa siku zijazo, njia hii inaweza kutumika kwa muundo bora wa reaktori, uchaguzi wa mahali pa sensa, uboreshaji wa mikakati ya kuchanganya na kuingiza hewa, udhibiti unaotegemea modeli, scale-up na muundo wa scale-down simulator. Hasa katika uzalishaji wa dawa za kibayolojia, ambapo hata tofauti ndogo za mchakato zinaweza kuathiri ubora wa bidhaa, vipimo vya oksijeni vya eneo na miundo ya modeli iliyochaguliwa vizuri vinaweza kuwa muhimu zaidi.

Nguvu za utafiti ni pamoja na kupima moja kwa moja gradienti za oksijeni iliyoyeyushwa katika urefu tofauti wa probe, kutumia majaribio mawili tofauti ya fed-batch, kuingiza mienendo ya gassing-out kwenye modeli, kuunganisha kinetiki ya glukosi-asetati-biomasi na mizani ya oksijeni, na kulinganisha mkakati wa ugawaji wa vyumba unaoungwa mkono na CFD na data ya majaribio. Utafiti hauishii kusema “gradienti ipo”; unajaribu kueleza kwa nini inatokea kupitia maeneo ya mtiririko, viwango vidogo vya mtiririko kati ya vyumba na uhamishaji wa oksijeni unaobadilika kwa urefu.

Mapungufu pia yanapaswa kutajwa kwa uangalifu. Utafiti ni preprint ambayo haijapitiwa na wahakiki. Majaribio yalifanywa katika fed-batch mbili tu; matokeo hayapaswi kuhamishwa moja kwa moja kwa jiometri tofauti za bioreaktori, impela tofauti, vijidudu tofauti, ujazo tofauti au mikakati tofauti ya udhibiti. Ilielezwa kuwa gradienti za pH zilionekana lakini hazikuwasilishwa kwa kina wala kuwekewa modeli katika makala hii. Kwa biomasi, glukosi na asetati gradienti zilichukuliwa kuwa ndogo; hata hivyo, kwa sababu sampuli hazikuweza kuchukuliwa kwa wakati mmoja, tofauti za muda mfupi huenda zilifichika. Aidha, uhusiano wa wazi wa kimajaribio wa kLa na kuchanganya/uingizaji hewa haukuingizwa moja kwa moja kwenye modeli; katika kipindi cha udhibiti, kLa ilishughulikiwa kama kigezo chenye ufanisi kinachobadilika kwa muda.

Utafiti unasema hivi: katika bioreaktori ya 20 L ya E. coli fed-batch, oksijeni iliyoyeyushwa inaweza kutofautiana kwa kiasi kikubwa kulingana na urefu; kipimo cha DO kutoka sehemu moja hakiwezi lazima kuwakilisha reaktori nzima; na modeli zenye vyumba zilizowekwa kwa usahihi kwa kutumia CFD zinafaa katika kueleza gradienti hizi. Utafiti hausisemi hivi: kwamba gradienti za oksijeni zenye uwiano uleule zitatokea katika bioreaktori zote za 20 L, kwamba gradienti hizi daima zitaharibu ubora wa bidhaa, au kwamba modeli iliyopendekezwa ni halali moja kwa moja kwa kila bioprocess. Kwa hiyo, kazi hii inapaswa kuonekana si kama dhamana ya jumla, bali kama onyo la kiufundi lililoandikwa vizuri kwa msingi wa majaribio na modeli.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Mbinu ya utafiti ilijengwa juu ya kupima oksijeni iliyoyeyushwa katika urefu tofauti wakati wa uchachushaji wa E. coli wa fed-batch, kulinganisha vipimo vya glukosi/asetati/biomasi, kuchunguza tabia ya uhamishaji wa oksijeni kwa majaribio ya gassing-out na kueleza uchunguzi huu kwa modeli ya mienendo yenye vyumba sita inayoungwa mkono na CFD.

Mfumo wa majaribio:

Maeneo ya kipimo:

Maeneo ya impela:

• Takribani 0,09 m
• Takribani 0,29 m
• Takribani 0,51 m

Mpangilio huu wa impela hutengeneza maeneo tofauti ya mzunguko ndani ya reaktori. Modeli ya utafiti inayoungwa mkono na CFD ilijaribu kuwakilisha gradienti za oksijeni kwa usahihi zaidi kwa kuweka mipaka ya vyumba kati ya maeneo haya ya mzunguko.

Majaribio ya fed-batch:

Vipimo vya metaboliti na biomasi:

• Biomasi ilifuatiliwa kwa OD600 na calibration ya uzito kavu wa seli ilitumika.
• Glukosi na asetati zilipimwa kwa HPLC.
• Glukosi iliamuliwa kwa refractive index detection, na asetati/asidi asetiki kwa UV 210 nm na/au refractive index detection.
• Hakukuonekana gradienti dhahiri za glukosi na asetati kati ya sehemu za sampuli za chini na juu.
• Biomasi ilionekana takribani %10 juu zaidi juu, lakini tofauti hii ilitafsiriwa kwa tahadhari kutokana na kelele ya kipimo na uwezekano wa athari za buoyancy.

Gradienti za oksijeni iliyoyeyushwa za majaribio:

Majaribio ya gassing-out:

• Uingizaji hewa ulisimamishwa kwa muda mfupi.
• Uingizaji hewa ulianzishwa tena DO iliposhuka chini ya %10.
• Majaribio haya yalitumika kutathmini kLa na mienendo ya uhamishaji wa oksijeni katika maeneo ya sensa ya chini, kati na juu.
• kLa kwa kawaida ilipatikana kuwa ya chini zaidi katika eneo la chini la reaktori.
• Uingizaji hewa ulipoanzishwa tena, ongezeko la oksijeni juu kwa kawaida lilikuwa la haraka zaidi na kubwa zaidi.

Misemo ya msingi iliyotumiwa katika modeli ya kinetiki:

Uzuiaji wa biomasi:

\[ f_{inh} = \frac{1}{1 + \left(\frac{X}{k_x}\right)^{n_x}} \]

Neno la lag/adaptation:

\[ \theta(X) = \frac{1}{1 + \left(\frac{K_{x2}}{X}\right)^{n_{x2}}} \]

\[ f_{lag} = A_1 + (1-A_1)\exp[-\exp(-w\theta + X_\beta)] \]

Kazi ya kubadilisha substrate:

\[ f_{switch} = \frac{1}{1 + \left(\frac{S}{k_h}\right)^{n_h}} \]

Kasi za ukuaji kwa glukosi na asetati:

\[ \mu_g = \mu_{max,G}\left(\frac{S}{K_s+S}\right)\left(\frac{K_a}{K_a+A}\right)f_{inh} \]

\[ \mu_a = \mu_{max,A}\left(\frac{A}{K_{a2}+A}\right)f_{switch}f_{inh} \]

Jumla ya kasi mahususi ya ukuaji:

\[ \mu_{tot} = (\mu_g + \mu_a)f_{lag} \]

Kasi za athari:

\[ r_X = \mu_{tot}X \]

\[ r_S = -\left(\frac{\mu_g X}{Y_{xs}} + m_x X\right) \]

\[ r_A = \left(\frac{\mu_g X}{Y_{xa}}\right) - \left(\frac{\mu_a X}{Y_{xa2}}\right) \]

Mizani ya misa:

\[ \frac{dX}{dt} = r_X - \frac{X}{V}\frac{dV}{dt} \]

\[ \frac{dS}{dt} = \frac{F_S(t)}{V}S_0 + r_S - \frac{S}{V}\frac{dV}{dt} \]

\[ \frac{dA}{dt} = r_A - \frac{A}{V}\frac{dV}{dt} \]

Matumizi ya oksijeni:

\[ r_{O,i} = Y_{ox}\mu_i X_i \frac{O_i^{n_h}}{K_O^{n_h}+O_i^{n_h}} \]

Mizani ya oksijeni kwa chumba:

\[ \frac{dO_i}{dt} = \frac{q_{i+1\rightarrow i}}{V_i}O_{i+1} + \frac{q_{i-1\rightarrow i}}{V_i}O_{i-1} - \frac{q_{i\rightarrow i+1}}{V_i}O_i - \frac{q_{i\rightarrow i-1}}{V_i}O_i + k_{L,i}a_i(O^* - O_i) - r_{O,i} \]

Neno la ziada la mabadiliko ya ujazo kwa chumba cha juu:

\[ -\frac{O_6}{V_6}\frac{dV_6}{dt} \]

Mahusiano ya scaling ya uhamishaji wa wingi:

\[ k_{L,i} = C\varepsilon_i^{1/4} \]

\[ a_i = \frac{6\phi_{b,i}}{d_{b,i}} \]

\[ k_{L,i}a_i = C'\eta_i \]

\[ \eta_i = \varepsilon_i^{1/4}\phi_{b,i} \]

Katika misemo hii \\(\\varepsilon_i\\) ni kasi ya utawanyaji wa nishati ya turbulent, \\(\\phi_{b,i}\\) ni gas holdup, \\(d_{b,i}\\) ni kipenyo cha viputo, na \\(\\eta_i\\) ni kiashirio cha uhamishaji wa oksijeni cha kila chumba kilichotokana na CFD.

Baadhi ya vigezo vya modeli:

Mtiririko kati ya vyumba unaoungwa mkono na CFD:

Matokeo makuu ya modeli:

• Profaili za biomasi, glukosi na asetati kwa ujumla ziliwakilishwa vizuri na modeli.
• Modeli ilinasa mabadiliko kutoka matumizi ya glukosi na uzalishaji wa asetati kwenda matumizi tena ya asetati.
• Kwa oksijeni iliyoyeyushwa, udhibiti kutoka sehemu moja haukuhakikisha kiwango kilekile cha oksijeni katika urefu mwingine.
• Ugawaji sahihi wa vyumba unaoungwa mkono na CFD ulitabiri kwa usahihi wa kimaelezo gradienti za oksijeni zilizoonekana katika majaribio.
• Mkakati usio sahihi wa kugawa vyumba haukuweza kueleza vizuri hasa vipimo vya oksijeni katika eneo la juu.
• Majaribio ya gassing-out yaliunga mkono uwezekano wa uhamishaji wa oksijeni kuwa wa haraka zaidi katika eneo la juu.

Maana ya takwimu na michoro:

• Mchoro wa bioreaktori unaonyesha jinsi sensa na sehemu za sampuli zilivyowekwa katika maeneo ya chini, kati na juu. Mchoro huu unaeleza moja kwa moja wazo kuu la utafiti kwamba “mahali pa sensa ni muhimu”.
• Mikondo ya ukuaji ya fed-batch inaonyesha kwamba majaribio mawili hayakuendelea kwa namna ileile; jaribio la pili lilidumu muda mfupi zaidi na kufikia msongamano mkubwa zaidi wa seli.
• Michoro ya kugawa vyumba kwa CFD inaonyesha kwa nini mipaka kati ya maeneo ya mzunguko ilitoa modeli sahihi zaidi. Uchaguzi mbadala wa mipaka ulipunguza makadirio ya gradienti ya oksijeni.
• Grafu za kulinganisha glukosi na asetati zinaunga mkono kwamba tofauti za juu-chini kwa metaboliti hizi zilikuwa ndogo na kwamba dhana ya usawa katika modeli ilikuwa ya kuridhisha.
• Grafu ya biomasi inaonyesha mwelekeo wa OD kuwa juu kidogo katika eneo la juu, lakini pia inaonyesha kwamba tafsiri hii inapaswa kufanywa kwa tahadhari.
• Grafu za gradienti ya oksijeni zinaonyesha wazi kwamba oksijeni iliyoyeyushwa huongezeka pamoja na urefu wa reaktori na hubaki chini katika sehemu ya chini.
• Grafu za gassing-out zinaonyesha DO ikishuka uingizaji hewa unaposimamishwa, ikipanda tena uingizaji hewa unapoanzishwa, na kasi ya kurudi kubadilika kulingana na eneo.
• Grafu za kulinganisha modeli na majaribio zinaonyesha kuwa modeli iliyopendekezwa yenye vyumba kwa ujumla inanasa vipimo endelevu vya DO na gradienti za oksijeni zinazohusiana na mabadiliko ya urefu.

Hitimisho la kiufundi kwa ujumla: Utafiti unaonyesha kwamba katika bioreaktori ya 20 L ya E. coli fed-batch, hata kama glukosi, asetati na biomasi zinaonekana kwa kiasi kikubwa kuwa sawia, oksijeni iliyoyeyushwa inaweza kutokuwa sawia. Kwa hiyo, mahali pa sensa moja ya DO katika bioreaktori kinapaswa kutazamwa kama kigezo muhimu katika udhibiti wa mchakato.

Chanzo na Dokezo la Mbinu

Makala hii imeandaliwa kwa msingi wa utafiti wenye kichwa “Probe Location Matters: Oxygen Gradient Measurements and CFD-Informed Modeling Challenge the Well-Mixed Assumption in Bench-Scale Bioreactors” ulioandaliwa na Ittisak Promma, Danny Kang, Zahra Negahban, Valerie Ward, Nasser Mohieddin Abukhdeir, Marc G. Aucoin na Hector Budman. Utafiti ulifanywa katika muktadha wa Idara ya Uhandisi wa Kemikali ya University of Waterloo.

Aina ya chanzo ni makala ya utafiti ya preprint inayopatikana kwenye SSRN. Kwa kuwa maandishi yanasema wazi “This preprint research paper has not been peer reviewed”, utafiti huu haujapitiwa na wahakiki. Kwa hiyo matokeo yanapaswa kutazamwa si kama chapisho la mwisho lililopitiwa na wahakiki, bali kama preprint inayotegemea vipimo vya majaribio na modeli.

Maudhui haya yameandaliwa kwa msingi wa majaribio ya bioreaktori, hali za E. coli fed-batch, vipimo vya oksijeni iliyoyeyushwa, majaribio ya gassing-out, milinganyo ya modeli ya kinetiki, muundo wa modeli yenye vyumba inayoungwa mkono na CFD, na matokeo ya michoro na majedwali yaliyotolewa katika utafiti. Madai ambayo hayapo katika PDF kuhusu ubora wa bidhaa, mafanikio ya uzalishaji wa kliniki, dhamana ya viwandani, matokeo yale yale katika bioreaktori zote au matumizi ya kibiashara hayajaongezwa.

Wakati utafiti unachunguza kwa kina gradienti za oksijeni iliyoyeyushwa kwa msingi wa majaribio na modeli, pia unasema kwamba gradienti za pH zilionekana lakini hazikuwasilishwa kwa kina wala kuwekewa modeli katika makala hii. Kwa hiyo uhusiano kati ya pH na oksijeni unapaswa kuonekana kama suala la kuchunguzwa zaidi siku zijazo.

Matokeo ni halali ndani ya jiometri ya bioreaktori, maeneo ya impela, strain ya E. coli, hali za fed-batch, maeneo ya sensa na dhana za modeli zilizotumiwa. Haipaswi kudhaniwa kwamba gradienti zenye viwango sawa zitatokea moja kwa moja katika skeli tofauti, miundo tofauti ya reaktori au viumbe tofauti. Hata hivyo, utafiti unatoa onyo thabiti la kiufundi kwamba mahali pa sensa hakupaswi kupuuzwa katika ufuatiliaji na udhibiti wa bioprocess.