Ин таҳқиқот нишон медиҳад, ки биореакторҳои миқёси хурд ва миёна на ҳамеша он қадаре, ки одатан тахмин мешавад, «комилан омехта» ҳастанд. Муҳаққиқон дар ферментатсияҳои fed-batch-и E. coli, ки дар биореактори синфи 15–20 L гузаронида шуданд, чен карданд, ки оксигени ҳалшуда метавонад дар тӯли баландии реактор ба таври назаррас тағйир ёбад. Тибқи натиҷаҳо, оксигени ҳалшуда дар минтақаи поёнӣ нисбат ба минтақаи болоӣ пасттар мемонад ва дар баъзе шароит фарқи боло-поён метавонад тақрибан ба %30 расад.

Ин натиҷа муҳим аст, зеро дар биореакторҳо сенсори оксигени ҳалшуда одатан танҳо дар як нуқта чен мекунад ва системаи идоракунӣ ҳаводиҳӣ ва омехтакуниро мувофиқи ҳамин ченкунӣ танзим мекунад. Агар сенсор дар минтақаи поёнӣ ҷойгир бошад, системаи идоракунӣ метавонад оксигенро дар ҳамон нуқта дар арзиши ҳадаф нигоҳ дорад; аммо ин маънои онро надорад, ки дар тамоми реактор ҳамон сатҳи оксиген ба вуҷуд меояд. Таҳқиқот нишон медиҳад, ки ҷойгиршавии сенсор метавонад бевосита ба қарорҳои мониторинги раванд, идоракунӣ, моделсозӣ ва scale-up таъсир расонад.

Дар таҳқиқот барои ченкуниҳои глюкоза, ацетат ва биомасса градиентҳои равшани ҷойгоҳӣ мушоҳида нашуданд, аммо барои оксигени ҳалшуда дар тӯли баландӣ фарқҳои маънодор пайдо шуданд. Барои шарҳи ин фарқҳо модели динамикии биореактор бо шаш compartment, ки аз ҳисобҳои CFD ба даст омадааст, таҳия карда шуд. Модел минтақаҳои гардиш дар дохили реакторро ба назар гирифта, суръатҳои ҷараён байни compartment-ҳоро муайян кард ва интиқоли оксиген, афзоиши ҳуҷайра, истеъмоли оксиген ва интиқоли байни compartment-ҳоро якҷо ҳисоб намуд.

Паёми асосии таҳқиқот чунин аст: ҳатто дар биореакторҳое, ки мисли 20 L нисбатан хурд ба ҳисоб мераванд, фарзияи он ки як сенсори оксигени ҳалшуда тамоми ҳаҷмро намояндагӣ мекунад, ҳамеша бехатар нест. Ин ҳолат махсусан барои истеҳсоли биофармасевтӣ, истеҳсоли ваксина, рекомбинант-протеин ва scale-up-и биопроцессҳои саноатӣ муҳим аст. Бо вуҷуди ин, таҳқиқот preprint мебошад ва баъзе мушоҳидаҳо, ба мисли градиентҳои pH, дар ин мақола моделсозӣ нашудаанд; бинобар ин натиҷаҳо бояд бо эҳтиёт ва дар заминаи худ хонда шаванд.

Биореакторҳо таҷҳизоти бастаи равандӣ мебошанд, ки дар онҳо микроорганизмҳо, ҳуҷайраҳо ё системаҳои биологӣ дар шароити назоратшаванда парвариш карда мешаванд. Онҳо дар истеҳсоли ваксина, рекомбинант-протеин, ферментҳо, маҳсулоти биофармасевтӣ ва ферментатсияи саноатӣ нақши калидӣ доранд. Дар ин системаҳо тағйирёбандаҳое ба мисли ҳарорат, pH, моддаҳои ғизоӣ, омехтакунӣ, ҳаводиҳӣ ва оксигени ҳалшуда ба афзоиши ҳуҷайра, ҳосили маҳсулот ва сифати маҳсулот бевосита таъсир мерасонанд.

Нуқтаи оғози таҳқиқот зери савол гузоштани як фарзияи хеле маъмул дар биореакторҳо мебошад: фарзияи он ки биореакторҳои хурд хуб омехта шудаанд ва бинобар ин консентратсияҳо дар ҳамаи нуқтаҳои реактор тақрибан яксонанд. Ин фарзия дар амал хеле қулай аст, зеро pH ё оксигени ҳалшудае, ки аз як сенсор чен шудааст, ҳамчун намояндаи тамоми реактор қабул карда мешавад. Ҳамин тавр, системаи идоракунӣ метавонад бар асоси маълумоти як нуқта қарор қабул кунад. Аммо рафтори воқеии моеъ, махсусан вақте омехтаи газ-моеъ, таъсири impeller, тақсимоти ҳубобҳо ва истеъмоли оксиген аз ҷониби ҳуҷайраҳо ба назар гирифта мешаванд, метавонад мураккабтар бошад.

Дар биореакторҳои бузурги саноатӣ кайҳо маълум аст, ки омехта комилан якхела нест. Дар ҳаҷмҳои калон вақти омехтакунӣ дароз мешавад, моддаҳои ғизоӣ ва оксиген ба ҳамаи нуқтаҳо бо суръати яксон намерасанд ва ҳуҷайраҳо аз микро-муҳитҳои гуногун мегузаранд. Баръакс, дар биореакторҳои наздик ба миқёси лабораторӣ/bench, ба мисли 15–20 L, одатан гумон мешавад, ки чунин heterogeneity-ҳоро метавон нодида гирифт. Ин таҳқиқот маҳз ҳамин андешаро месанҷад ва ба таври таҷрибавӣ ва моделсозӣ нишон медиҳад, ки ҳатто дар синфи 20 L градиентҳои оксигени ҳалшуда метавонанд ташаккул ёбанд.

Биореактори истифодашуда New Brunswick Scientific BioFlo 415 SIP Fermentation System бо иқтидори 19,5 L мебошад. Дар таҷрибаҳои fed-batch ҳаҷми корӣ тақрибан дар диапазони 13,5–14 L нигоҳ дошта шуд. Микроорганизм E. coli BL21 (DE3) pET-VP1 буд. E. coli аз он сабаб интихоб шуд, ки дар биотехнология ва истеҳсоли фармасевтӣ ҳамчун организмҳои намунавӣ ва истеҳсолӣ васеъ истифода мешавад. Ин интихоб таҳқиқотро на танҳо аз ҷиҳати механикаи моеъ, балки аз ҷиҳати истеҳсоли воқеии биопроцесс низ маънодор мекунад.

Дар таҷрибаҳо баландии сенсори оксигени ҳалшуда ва таҷҳизоти sample-taking тағйир дода мешуд. Ченкуниҳо дар се минтақаи асосии баландӣ анҷом шуданд: минтақаи поёнӣ тақрибан ба 0,14 m, минтақаи миёна тақрибан ба 0,305 m ва минтақаи болоӣ тақрибан ба 0,47 m мувофиқ буд. Impeller-ҳо дар баландии тақрибан 0,09 m, 0,29 m ва 0,51 m ҷойгир карда шуданд. Ин ҷойгиркунӣ нишон медиҳад, ки фарқҳои оксигени ҳалшуда на танҳо аз масофаи амудӣ, балки аз минтақаҳои гардише, ки impeller-ҳо ба вуҷуд меоранд, низ таъсир гирифта метавонанд.

Натиҷаи аввалини муҳими таҷрибавӣ ин аст, ки фарқҳои ҷойгоҳӣ барои глюкоза, ацетат ва биомасса хеле хурд буданд. Дар fed-batch samples аз баландии гуногун консентратсияҳои глюкоза ва ацетат асосан монанд буданд. Дар ченкуниҳои биомасса дар минтақаи болоӣ тамоюли тақрибан %10 баландтари optical density дида шуд; аммо бо эҳтиёт шарҳ дода шуд, ки ин фарқ метавонад дар ҳудуди measurement noise бошад ва эҳтимол аз таъсири buoyancy/density-и ҳуҷайраҳо ба вуҷуд ояд. Аз ин рӯ, дар моделсозӣ биомасса, глюкоза ва ацетат spatially homogeneous қабул карда шуданд.

Оксигени ҳалшуда бошад, рафтори дигар нишон дод. Дар таҷрибаҳо оксигени ҳалшуда бо баландии реактор зиёд мешуд: пасттарин сатҳ дар поён ва баландтарин сатҳ дар боло чен шуд. Дар fed-batch-и аввал, дар фосилаи 8,98–9,05 соат фарқи поён-миёна тақрибан %16 ва миёна-боло тақрибан %14 буд. Дар ҳамон таҷриба, дар фосилаи 11,07–11,12 соат фарқи поён-миёна тақрибан %17 ва миёна-боло тақрибан %21 шуд. Дар fed-batch-и дуюм баландии сенсор дар 11 вақти гуногун иваз карда шуд; фарқи миёнаи поён-миёна тақрибан %12 ва миёна-боло тақрибан %15 буд. Тамоюли умумӣ дар ҳар ду таҷриба яксон аст: оксигени ҳалшуда дар боло бештар ва дар поён камтар аст.

Ин натиҷаро бо як ташбеҳи рӯзмарра метавон фаҳмонд: чен кардани ҳарорати як нуқтаи ҳуҷра ва фарз кардани он ки тамоми ҳуҷра ҳамон ҳарорат дорад, ҳамеша дуруст нест. Аз сабаби радиатор, кондитсионер ё ҷараёни ҳаво баъзе қисмҳо гармтар ё хунуктар буда метавонанд. Дар биореактор ҳам як сенсори оксигени ҳалшуда танҳо оксигени нуқтаи ҷойгиршавии худро чен мекунад. Агар аз боло то поён фарқи оксиген вуҷуд дошта бошад, ҷойгиршавии сенсор тафсири тамоми стратегияи идоракуниро тағйир медиҳад.

Нуқтаи калидии биопроцессии таҳқиқот чунин аст: системаи назорати оксигени ҳалшуда одатан арзиши ченшуда дар нуқтаи сенсорро ба set point мерасонад. Дар ин таҳқиқот set point-и назоратӣ 30% DO муайян карда шуд ва дар модел set value-и оксигени ҳалшуда барои compartment-и сенсор чунин ифода шудааст:

\[ O_2(t) = O^{set}_2 = 0.0018 \, g/L \]

Дар ин ҷо \(O_2(t)\) консентратсияи оксигени ҳалшудаи вобаста ба вақт дар compartment-и дуюм, ки сенсор дар он аст, ва \(O^{set}_2\) set point-и назоратиро нишон медиҳад. Ин ифода маънои онро дорад, ки вақте loop-и назорат фаъол аст, оксиген дар минтақаи сенсор дар ҳадаф нигоҳ дошта мешавад. Аммо таҳқиқот нишон медиҳад, ки оксиген дар дигар compartment-ҳо метавонад аз ин арзиш фарқ кунад.

Дар таҷрибаҳо инчунин “gassing-out” tests гузаронида шуданд. Дар ин tests ҳаводиҳӣ барои муддати кӯтоҳ қатъ карда шуд ва вақте оксигени ҳалшуда аз %10 поён рафт, ҳаводиҳӣ аз нав оғоз гардид. Одатан чунин tests барои тахмини kLa, яъне volumetric oxygen transfer coefficient истифода мешаванд. kLa параметри асосии биореактор аст, ки самаранокии гузариши оксиген аз фазаи газ ба моеъро ифода мекунад. Агар kLa баланд бошад, оксиген ба моеъи реактор зудтар мерасад; агар паст бошад, қонеъ кардани талаботи оксигении ҳуҷайраҳо душвортар мешавад.

Дар таҳқиқот gassing-out experiments на танҳо барои тахмини як арзиши умумии kLa, балки барои фаҳмидани ҷавобҳои динамикии оксиген дар баландии гуногун истифода шуданд. Вақте ҳаводиҳӣ қатъ мешавад, оксигени ҳалшуда аз сабаби истеъмоли ҳуҷайраҳо ва бозтақсимшавӣ байни compartment-ҳо коҳиш меёбад. Вақте ҳаводиҳӣ аз нав оғоз мешавад, оксиген боз боло меравад. Суръати ин болоравӣ дар бораи gas-liquid mass transfer, bubble distribution, mixing ва biological oxygen consumption дар ҳамон минтақа маълумот медиҳад.

Натиҷаҳои gassing-out нишон доданд, ки арзишҳои kLa одатан дар минтақаи поёнии реактор пасттаранд. Ин бо чен шудани оксигени ҳалшудаи пасттар дар поён мувофиқ аст. Дар боло самараноктар будани gas bubbles, gas holdup ё oxygen-transfer area метавонад ба баланд мондани оксигени ҳалшуда мусоидат кунад. Модели таҳқиқот низ ҳамин тафсирро дастгирӣ карда, фарқҳои oxygen transfer-и вобаста ба баландиро ба назар мегирад.

Қисми моделсозӣ аз ду қабати асосӣ иборат аст. Қабати аввал модели кинетикиест, ки динамикаи биомасса, глюкоза ва ацетати фарҳанги E. coli-ро шарҳ медиҳад. Қабати дуюм модели compartment-и CFD-informed мебошад, ки тағйири оксигени ҳалшударо аз як compartment ба дигаре дар дохили реактор тавсиф мекунад. Ҳамин тавр, biological growth ва oxygen consumption бо hydrodynamic transport якҷо баррасӣ шудаанд.

Кинетикаи классикии Monod барои тавсифи афзоиши микроорганизм вобаста ба substrate васеъ истифода мешавад. Аммо дар таҳқиқот гуфта шудааст, ки танҳо Monod-и оддӣ динамикаи глюкоза, ацетат ва биомассаро ба қадри кофӣ шарҳ намедиҳад. Сабаб дар он аст, ки дар афзоиши E. coli механизмҳои иловагӣ ба мисли lag/adaptation, growth inhibition дар биомассаи баланд ва metabolic switching байни глюкоза ва ацетат ба кор медароянд.

Аз ин рӯ, аввал biomass-dependent inhibition term чунин таъриф шуд:

\[ f_{inh} = \frac{1}{1 + \left(\frac{X}{k_x}\right)^{n_x}} \]

Дар ин ҷо \(f_{inh}\) growth inhibition factor, \(X\) biomass concentration, \(k_x\) biomass level-е, ки inhibition намоён мешавад, ва \(n_x\) exponent-и sharpness-и inhibition мебошанд. Бо зиёд шудани биомасса шароити муҳитие пайдо шуда метавонанд, ки афзоиши ҳуҷайраро маҳдуд мекунанд; ин term ҳамин таъсирро ба модел меорад.

Барои lag/adaptation аввал функсияи мобайнӣ чунин муайян карда шуд:

\[ \theta(X) = \frac{1}{1 + \left(\frac{K_{x2}}{X}\right)^{n_{x2}}} \]

Сипас lag factor чунин дода шуд:

\[ f_{lag} = A_1 + (1-A_1)\exp[-\exp(-w\theta + X_\beta)] \]

Дар ин ҷо \(f_{lag}\) таъсири adaptation-и ибтидоии ҳуҷайраҳоро, \(A_1\) lower asymptotic value-ро, \(w\) shape parameter-ро ва \(X_\beta\) shift parameter-ро ифода мекунад. Ин ифода нишон медиҳад, ки ҳуҷайраҳо ба муҳит фавран бо суръати максималӣ мутобиқ намешаванд ва рафтори афзоиш бо таъсири биомасса ва вақт тадриҷан тағйир меёбад.

Барои танзими истифодаи ацетат вобаста ба сатҳи глюкоза substrate switching function чунин таъриф шуд:

\[ f_{switch} = \frac{1}{1 + \left(\frac{S}{k_h}\right)^{n_h}} \]

Дар ин ҷо \(S\) glucose concentration, \(k_h\) constant-и гузариш аз glucose ба acetate use ва \(n_h\) sharpness-и switching мебошанд. Вақте глюкоза баланд аст, E. coli одатан глюкозаро афзалият медиҳад ва истифодаи ацетат метавонад боздошта шавад. Вақте глюкоза кам мешавад, reuse-и ацетат оғоз мегардад. Ин рафтор diauxic growth, яъне истифодаи ду substrate/гузариши пайдарпайи метаболикӣ номида мешавад.

Specific growth rates бар glucose ва acetate чунин ифода шудаанд:

\[ \mu_g = \mu_{max,G}\left(\frac{S}{K_s+S}\right)\left(\frac{K_a}{K_a+A}\right)f_{inh} \]

\[ \mu_a = \mu_{max,A}\left(\frac{A}{K_{a2}+A}\right)f_{switch}f_{inh} \]

Дар ин ҷо \(\mu_g\) glucose-dependent specific growth rate, \(\mu_a\) acetate-dependent specific growth rate, \(\mu_{max,G}\) maximum growth rate on glucose, \(\mu_{max,A}\) maximum growth rate on acetate, \(K_s\) glucose Monod constant, \(A\) acetate concentration, \(K_a\) acetate inhibition constant ва \(K_{a2}\) Monod constant for acetate uptake-ро нишон медиҳанд.

Effective total specific growth rate чунин таъриф шудааст:

\[ \mu_{tot} = (\mu_g + \mu_a)f_{lag} \]

Ин муодила нишон медиҳад, ки total growth аз саҳми glucose ва acetate иборат аст, аммо adaptation state-и ҳуҷайраҳо низ ба ин total growth таъсир мекунад.

Volumetric reaction rates барои biomass formation, glucose consumption ва acetate production/consumption чунинанд:

\[ r_X = \mu_{tot}X \]

\[ r_S = -\left(\frac{\mu_g X}{Y_{xs}} + m_x X\right) \]

\[ r_A = \left(\frac{\mu_g X}{Y_{xa}}\right) - \left(\frac{\mu_a X}{Y_{xa2}}\right) \]

Дар ин ҷо \(r_X\) biomass formation rate, \(r_S\) glucose consumption rate, \(r_A\) acetate production/consumption rate, \(Y_{xs}\) biomass yield from glucose, \(Y_{xa}\) acetate formation coefficient associated with glucose growth, \(Y_{xa2}\) biomass yield associated with acetate consumption ва \(m_x\) maintenance coefficient мебошанд.

Дар fed-batch, азбаски feed илова мешавад ва volume тағйир меёбад, dynamic mass balances term-и volume change доранд:

\[ \frac{dX}{dt} = r_X - \frac{X}{V}\frac{dV}{dt} \]

\[ \frac{dS}{dt} = \frac{F_S(t)}{V}S_0 + r_S - \frac{S}{V}\frac{dV}{dt} \]

\[ \frac{dA}{dt} = r_A - \frac{A}{V}\frac{dV}{dt} \]

Дар ин ҷо \(V\) reactor volume, \(dV/dt\) change of volume with time, \(F_S(t)\) glucose feed flow rate ва \(S_0\) glucose concentration in feed solution мебошанд. Ин equations нишон медиҳанд, ки дар fed-batch на танҳо reactions, балки dilution effect-и volume-и илова шуда низ ба назар гирифта мешавад.

Барои модел кардани oxygen gradient реактор ба шаш compartment-и уфуқӣ тақсим шуд. Ҳар compartment дар дохили худ ҳамчун well-mixed CSTR қабул шуд, аммо байни compartment-ҳо flow маҳдуд аст. Ин approach мисли full CFD computation-heavy нест, вале нисбат ба single-volume “well-mixed” model воқеитар аст. Нуқтаи муҳим ин аст, ки boundaries-и compartment худсарона интихоб нашудаанд; онҳо байни circulation zones, ки аз CFD simulation гирифта шудаанд, ҷойгир карда шудаанд.

Дар таҳқиқот ду compartmentalization strategy муқоиса шуд. Дар якум boundaries байни circulation zones ҷойгир шуданд. Дар дуюм boundaries ба марказҳои circulation zones наздик гузошта шуданд. Натиҷаҳо нишон доданд, ки барои сабт кардани oxygen gradients-и дуруст boundaries бояд байни circulation zones бошанд, зеро flow rates байни ин zones пасттаранд ва ҷойҳои incomplete mixing-ро аз ҷиҳати физикӣ беҳтар намояндагӣ мекунанд. Compartmentalization-и нодуруст фарқи oxygen-и боло-поёнро дуруст пешгӯӣ накард.

Flow rates between compartments аз CFD гирифта шуданд. Масалан, flow from compartment 1 to 2 7132 L/соат, from 2 to 3 3018 L/соат ва from 3 to 4 905 L/соат дода шудаанд. Volumes низ фарқ мекунанд: compartment-и якум 2,103 L, дуюм 1,648 L, сеюм 3,650 L, чорум 2,451 L, панҷум 3,386 L ва compartment-и болоӣ дар оғоз 0,8095 L мебошад. Ҳаҷми compartment-и болоӣ бо fed-batch feeding бо вақт меафзояд.

Oxygen consumption барои ҳар compartment чунин ифода шудааст:

\[ r_{O,i} = Y_{ox}\mu_i X_i \frac{O_i^{n_h}}{K_O^{n_h}+O_i^{n_h}} \]

Дар ин ҷо \(r_{O,i}\) oxygen consumption rate дар compartment i, \(Y_{ox}\) oxygen consumption coefficient per biomass formation, \(\mu_i\) local specific growth rate, \(X_i\) local biomass concentration, \(O_i\) local dissolved oxygen concentration, \(K_O\) oxygen half-saturation constant ва \(n_h\) Hill coefficient мебошанд. Equation нишон медиҳад, ки oxygen consumption бо cell growth алоқаманд аст ва дар oxygen-и паст ба availability ҳассос мешавад.

Dissolved oxygen balance барои compartment i чунин аст:

\[ \frac{dO_i}{dt} = \frac{q_{i+1\rightarrow i}}{V_i}O_{i+1} + \frac{q_{i-1\rightarrow i}}{V_i}O_{i-1} - \frac{q_{i\rightarrow i+1}}{V_i}O_i - \frac{q_{i\rightarrow i-1}}{V_i}O_i + k_{L,i}a_i(O^* - O_i) - r_{O,i} \]

Дар ин equation \(q_{i\rightarrow j}\) volumetric flow rate from compartment i to j, \(V_i\) liquid volume of compartment i, \(k_{L,i}a_i\) volumetric oxygen mass-transfer coefficient in compartment i, \(O^*\) saturation dissolved oxygen concentration ва \(O_i\) local dissolved oxygen concentration мебошанд. Terms-и аввал transport байни compartment-ҳо, \(k_La\) gas-to-liquid oxygen transfer ва term-и охир cellular oxygen consumption-ро намояндагӣ мекунанд.

Азбаски volume-и compartment-и болоӣ бо вақт тағйир меёбад, dilution term низ илова мешавад:

\[ -\frac{O_6}{V_6}\frac{dV_6}{dt} \]

Ин term шарҳ медиҳад, ки вақте аз сабаби fed-batch feeding ба compartment-и болоӣ volume илова мешавад, dissolved oxygen concentration аз dilution чӣ гуна таъсир мегирад.

Oxygen mass-transfer coefficient бо hydrodynamic quantities аз CFD scaling шуд. Liquid-side mass-transfer coefficient чунин тахмин шуд:

\[ k_{L,i} = C\varepsilon_i^{1/4} \]

Дар ин ҷо \(\varepsilon_i\) average turbulence energy dissipation rate дар compartment i ва \(C\) empirical proportionality constant мебошад. Turbulence-и баландтар одатан bubble-liquid interaction-ро зиёд карда, oxygen transfer-ро қавитар карда метавонад.

Gas-liquid interfacial area чунин навишта шуд:

\[ a_i = \frac{6\phi_{b,i}}{d_{b,i}} \]

Дар ин ҷо \(\phi_{b,i}\) gas holdup ва \(d_{b,i}\) bubble diameter мебошанд. Gas holdup нишон медиҳад, ки дар моеъ чӣ қадар фазаи газӣ мавҷуд аст. Bubble area-и бештар маънои interfacial area-и бештар барои oxygen transfer дорад.

Бо фарз кардани bubble diameter-и собит байни compartment-ҳо, volumetric mass-transfer coefficient чунин содда шуд:

\[ k_{L,i}a_i = C'\eta_i \]

\[ \eta_i = \varepsilon_i^{1/4}\phi_{b,i} \]

Дар ин ҷо \(\eta_i\) CFD-derived compartment-level hydrodynamic mass-transfer indicator мебошад. Дар таҳқиқот ин арзишҳо барои ҳар compartment ҳисоб шуда, барои scaling-и oxygen-transfer coefficients истифода шуданд.

Бартарии асосии модел ин аст, ки он маълумоти муфассали flow-и CFD-ро бидуни табдил додан ба CFD-bioreaction simulation-и комилан гарон ва суст истифода мебарад. CFD муайян мекунад, ки compartment-ҳо куҷо бошанд ва flows байни онҳо чӣ қадар бошанд. Compartment model бошад biomass, glucose, acetate ва oxygen dynamics-ро зудтар ҳал мекунад. Ҳамин тавр ҳам маънои физикӣ нигоҳ дошта мешавад ва ҳам computational efficiency барои simulations-и такрорӣ таъмин мегардад.

Дар таҳқиқот ду fed-batch experiment гузаронида шуд. Дар Fed-Batch 1 initial working volume 13,5 L буд. Set values: 37°C, 200 rpm, pH 7,0, DO %30 ва air flow 5 SLPM. Dissolved oxygen тавассути cascade-control strategy бо mixing range 200–500 rpm ва air-flow range 5–20 SLPM идора шуд. Feed вақте оғоз шуд, ки biomass тақрибан ба 0,15–0,25 g/L расид ва тадриҷан зиёд карда шуд.

Дар Fed-Batch 2 method асосан ҳамон буд, вале initial volume дақиқтар ба 14 L танзим шуд. Initial OD дар Fed-Batch 1 0,037 ва дар Fed-Batch 2 0,06 буд. Feed strategy низ фарқ мекард. Fed-Batch 2 тақрибан 1,7 соат кӯтоҳтар давом кард ва нисбат ба Fed-Batch 1 ба %78 баландтари maximum cell density расид. Ин фарқ дар model ба назар гирифта шуд, зеро метавонад oxygen consumption ва control behavior-ро тағйир диҳад.

Model results biomass, glucose ва acetate profiles-ро умуман хуб шарҳ доданд. Хусусан transition аз glucose consumption ва acetate production ба reuse-и acetate сабт шуд. Ин бо overflow metabolism ва acetate cycling-и маълум дар E. coli мувофиқ аст. Дар Fed-Batch 1 гуфта шуд, ки model пас аз тақрибан 14 соат acetate production-ро паст пешгӯӣ кардааст; ин бо underprediction-и glucose consumption дар ҳамон давра алоқаманд буд. Бо вуҷуди ин biomass profiles дар ҳар ду experiment хуб намояндагӣ шуданд.

Дар oxygen model, CFD-derived intercompartment flow rates барои Fed-Batch 2 мустақим истифода шуданд. Барои Fed-Batch 1, азбаски mixing profile фарқ мекард, flow rates ба correction factor-и 0,7 зарб шуданд. Ин factor ба ratio-и area-и RPM profile байни Fed-Batch 1 ва 2 мувофиқ аст. Ҳамин тавр model кӯшиш кард lower average mixing effect-и experiment-и якумро намояндагӣ кунад.

Model continuous oxygen measurements дар lower compartment, intermittent measurements аз сенсори ба баландии гуногун кӯчонидашуда ва dynamic oxygen responses аз gassing-out experiments-ро муқоиса кард. Натиҷаи асосӣ ин аст, ки model oxygen trend-и афзоянда бо баландиро дуруст сабт кардааст. Яъне ҳам дар experiment ва ҳам дар model oxygen дар поён камтар ва дар боло бештар буд. Ин ба таври равшан дастгирӣ мекунад, ки DO-и идорашаванда бо як sensor метавонад тамоми reactor volume-ро намояндагӣ накунад.

Муҳимтарин modeling finding он аст, ки ҷойгиршавии compartment boundaries натиҷаро ҷиддӣ тағйир медиҳад. Compartmentalization-и дурусти CFD-informed тавонист фарқи таҷрибавии тақрибан %30-и oxygen-и боло-поёнро шарҳ диҳад. Alternative, physically weaker compartmentalization танҳо тақрибан %10 oxygen variation пешгӯӣ кард ва махсусан upper-sensor measurements-ро хуб сабт накард. Ин саволи муҳимро пеш мегузорад: на танҳо “чанд compartment ҳаст?”, балки “boundaries мутобиқи flow physics ҷойгир шудаанд?”

Modeling-и dynamic gassing-out responses низ ҷиҳати қавии таҳқиқот аст. Пас аз бозоғоз шудани aeration, model умуман сабт кард, ки oxygen дар upper region нисбат ба lower region зудтар ва бештар меафзояд. Ин oxygen transfer-и баландтар дар болоиро пешниҳод мекунад. Дар баъзе experiments model oxygen-ро дар middle ё lower regions кам пешгӯӣ кардааст; researchers инро ба local hydrodynamic fluctuations, probe-position uncertainty ва simplification-и намояндагии ҳар sensor height бо як compartment нисбат медиҳанд.

Натиҷаи амалии таҳқиқот калон аст. Агар sensor дар lower region бошад ва control system DO %30-ро дар он ҷо нигоҳ дорад, ҳуҷайраҳои upper region метавонанд дар oxygen-и баландтар бошанд. Sensor positions-и гуногун метавонанд control system-ро ба aeration ва mixing responses-и гуногун баранд. Ин метавонад ба cell growth, metabolic by-product formation, protein production ва product quality таъсири ғайримустақим расонад. Таҳқиқот product quality-ро мустақим чен накард, аммо критикӣ будани sensor location барои process control-ро нишон медиҳад.

Барои scale-up низ натиҷаҳо муҳиманд. Агар oxygen gradient ҳатто дар laboratory ё pilot-scale bioreactor ташаккул ёбад, дар industrial volumes-и калонтар таъсир метавонад мураккабтар шавад. Дар bioreactors-и калон ҳуҷайраҳо аз zones-и oxygen, substrate ва pH-и гуногун мегузаранд. Ин transitions метавонанд cell metabolism-ро тағйир диҳанд. Аз ин рӯ, чунин studies барои фаҳмидани он ки чаро processes-и дар small scale “well-mixed” тарҳшуда дар large scale дигар рафтор мекунанд, арзишманданд.

Дар гузашта bioreactor modeling аксаран ба single-volume ё simplified mixing assumptions такя мекард. Имрӯз, бо афзоиши фишор ба quality, productivity ва cost дар biopharmaceutical manufacturing, methods-и воқеитар лозиманд. CFD хеле муфассал аст, вале computationally expensive буда метавонад. Compartment models зуданд, вале агар physically wrong compartmentalization дошта бошанд, метавонанд misleading шаванд. Ин таҳқиқот роҳи якҷоя кардани ду approach-ро пешниҳод мекунад: CFD flow structure-ро муайян мекунад, compartment model biological ва oxygen dynamics-ро зуд ҳал мекунад.

Дар оянда ин approach метавонад барои optimal reactor design, sensor-location selection, optimization-и mixing ва aeration strategy, model-based control, scale-up ва scale-down simulator design истифода шавад. Махсусан дар biopharmaceutical manufacturing, ки ҳатто process variation-и хурд метавонад product quality-ро тағйир диҳад, local oxygen measurements ва model structures-и дуруст интихобшуда боз ҳам муҳимтар мешаванд.

Ҷиҳатҳои қавии таҳқиқот direct measurement-и dissolved-oxygen gradients дар probe heights-и гуногун, истифодаи ду separate fed-batch experiment, дохил кардани gassing-out dynamics ба model, пайваст кардани glucose-acetate-biomass kinetics бо oxygen balance ва муқоисаи CFD-informed compartment strategy бо experimental data мебошанд. Таҳқиқот танҳо намегӯяд, ки “градиент вуҷуд дорад”; он кӯшиш мекунад сабаби онро тавассути circulation zones, low intercompartment flows ва height-dependent oxygen transfer шарҳ диҳад.

Маҳдудиятҳо низ бояд бо эҳтиёт зикр шаванд. Таҳқиқот preprint аст ва peer review нашудааст. Experiments танҳо ду fed-batch run-ро фаро мегиранд; натиҷаҳоро ба geometry-и дигар, impeller-и дигар, microorganism-и дигар, volume-и дигар ё control strategy-и дигар мустақим generalize кардан лозим нест. Гуфта шудааст, ки pH gradients мушоҳида шуданд, аммо дар ин paper муфассал нишон дода ва моделсозӣ нашудаанд. Gradients-и biomass, glucose ва acetate хурд қабул шудаанд, вале sample-taking ҳамзамон набудан метавонад transient differences-ро пинҳон кунад. Ҳамчунин explicit empirical relationship-и kLa бо mixing ва aeration ба model мустақим илова нашуда, дар control periods ҳамчун effective time-dependent parameter баррасӣ шудааст.

Таҳқиқот мегӯяд: дар E. coli fed-batch bioreactors-и 20 L, dissolved oxygen метавонад дар тӯли reactor height маънодор тағйир ёбад; single-point DO measurement метавонад тамоми reactor-ро намояндагӣ накунад; CFD-informed compartment models метавонанд барои шарҳи ин gradients муфид бошанд. Таҳқиқот намегӯяд, ки ҳамаи 20 L bioreactors ҳамон oxygen-gradient ratios доранд, ин gradients ҳамеша product quality-ро вайрон мекунанд ё proposed model барои ҳар bioprocess мустақим эътибор дорад. Аз ин рӯ, корро бояд ҳамчун experimental-modeling warning-и хуб ҳуҷҷатшуда, на generalized guarantee, арзёбӣ кард.

Усул ва Натиҷаҳои Таҳқиқот

Усули таҳқиқот бар чен кардани оксигени ҳалшуда дар баландии гуногун дар E. coli fed-batch fermentations, муқоисаи ченкуниҳои glucose/acetate/biomass, омӯзиши oxygen-transfer behavior бо gassing-out experiments ва шарҳи ин мушоҳидаҳо бо dynamic six-compartment CFD-informed model асос ёфтааст.

Системаи таҷрибавӣ:

Ҷойҳои ченкунӣ:

Ҷойҳои impeller:

• Тақрибан 0,09 m
• Тақрибан 0,29 m
• Тақрибан 0,51 m

Ин ҷойгиршавии impeller дар дохили реактор минтақаҳои гардиши гуногун ба вуҷуд меорад. Модели CFD-informed кӯшиш кард oxygen gradients-ро бо ҷойгир кардани compartment boundaries байни ҳамин circulation zones воқеитар намояндагӣ кунад.

Fed-batch experiments:

Ченкуниҳои metabolite ва biomass:

• Biomass бо OD600 пайгирӣ шуда, calibration-и dry cell weight истифода шуд.
• Glucose ва acetate бо HPLC чен шуданд.
• Glucose бо refractive-index detection ва acetate/acetic acid бо UV 210 nm ва/ё refractive-index detection муайян шуданд.
• Байни lower ва upper sampling positions барои glucose ва acetate gradient-и равшан мушоҳида нашуд.
• Biomass дар боло тақрибан %10 баландтар ба назар расид, аммо ин фарқ бо эҳтиёт ҳамчун measurement noise ва possible buoyancy effects тафсир шуд.

Градиентҳои таҷрибавии оксигени ҳалшуда:

Gassing-out experiments:

• Ҳаводиҳӣ барои муддати кӯтоҳ қатъ карда шуд.
• Вақте DO аз %10 поён рафт, ҳаводиҳӣ аз нав оғоз гардид.
• Ин tests барои арзёбии kLa ва oxygen-transfer dynamics дар lower, middle ва upper sensor positions истифода шуданд.
• kLa одатан дар минтақаи поёнии реактор пасттар буд.
• Пас аз бозоғоз шудани ҳаводиҳӣ, oxygen increase дар минтақаи болоӣ одатан зудтар ва баландтар буд.

Ифодаҳои асосии модели кинетикӣ:

Biomass inhibition:

\[ f_{inh} = \frac{1}{1 + \left(\frac{X}{k_x}\right)^{n_x}} \]

Lag/adaptation term:

\[ \theta(X) = \frac{1}{1 + \left(\frac{K_{x2}}{X}\right)^{n_{x2}}} \]

\[ f_{lag} = A_1 + (1-A_1)\exp[-\exp(-w\theta + X_\beta)] \]

Substrate switching function:

\[ f_{switch} = \frac{1}{1 + \left(\frac{S}{k_h}\right)^{n_h}} \]

Glucose ва acetate growth rates:

\[ \mu_g = \mu_{max,G}\left(\frac{S}{K_s+S}\right)\left(\frac{K_a}{K_a+A}\right)f_{inh} \]

\[ \mu_a = \mu_{max,A}\left(\frac{A}{K_{a2}+A}\right)f_{switch}f_{inh} \]

Total specific growth:

\[ \mu_{tot} = (\mu_g + \mu_a)f_{lag} \]

Reaction rates:

\[ r_X = \mu_{tot}X \]

\[ r_S = -\left(\frac{\mu_g X}{Y_{xs}} + m_x X\right) \]

\[ r_A = \left(\frac{\mu_g X}{Y_{xa}}\right) - \left(\frac{\mu_a X}{Y_{xa2}}\right) \]

Mass balances:

\[ \frac{dX}{dt} = r_X - \frac{X}{V}\frac{dV}{dt} \]

\[ \frac{dS}{dt} = \frac{F_S(t)}{V}S_0 + r_S - \frac{S}{V}\frac{dV}{dt} \]

\[ \frac{dA}{dt} = r_A - \frac{A}{V}\frac{dV}{dt} \]

Oxygen consumption:

\[ r_{O,i} = Y_{ox}\mu_i X_i \frac{O_i^{n_h}}{K_O^{n_h}+O_i^{n_h}} \]

Compartment-based oxygen balance:

\[ \frac{dO_i}{dt} = \frac{q_{i+1\rightarrow i}}{V_i}O_{i+1} + \frac{q_{i-1\rightarrow i}}{V_i}O_{i-1} - \frac{q_{i\rightarrow i+1}}{V_i}O_i - \frac{q_{i\rightarrow i-1}}{V_i}O_i + k_{L,i}a_i(O^* - O_i) - r_{O,i} \]

Term-и иловагии тағйири ҳаҷм барои upper compartment:

\[ -\frac{O_6}{V_6}\frac{dV_6}{dt} \]

Mass-transfer scaling relationships:

\[ k_{L,i} = C\varepsilon_i^{1/4} \]

\[ a_i = \frac{6\phi_{b,i}}{d_{b,i}} \]

\[ k_{L,i}a_i = C'\eta_i \]

\[ \eta_i = \varepsilon_i^{1/4}\phi_{b,i} \]

Дар ин ифодаҳо \(\varepsilon_i\) turbulence energy dissipation rate, \(\phi_{b,i}\) gas holdup, \(d_{b,i}\) bubble diameter ва \(\eta_i\) CFD-derived compartment-level oxygen-transfer indicator мебошанд.

Баъзе model parameters:

CFD-informed intercompartment flows:

Натиҷаҳои асосии моделсозӣ:

• Biomass, glucose ва acetate profiles умуман аз ҷониби model хуб намояндагӣ шуданд.
• Model transition аз glucose consumption ва acetate production ба acetate reuse-ро сабт кард.
• Single-point control барои dissolved oxygen ҳамон oxygen level-ро дар дигар баландӣ кафолат надод.
• Compartmentalization-и дурусти CFD-informed experimental oxygen gradients-ро аз ҷиҳати сифатӣ дуруст пешгӯӣ кард.
• Compartmentalization-и нодуруст махсусан upper-region oxygen measurements-ро хуб шарҳ дода натавонист.
• Gassing-out experiments дастгирӣ карданд, ки oxygen transfer дар минтақаи болоӣ метавонад зудтар бошад.

Маънои шаклҳо ва графикҳо:

• Схемаи биореактор нишон медиҳад, ки sensor ва sampling points дар ҷойҳои поён, миёна ва боло чӣ гуна ҷойгир шудаанд. Ин тасвир паёми асосии таҳқиқот — “ҷойгиршавии сенсор муҳим аст” — ро бевосита шарҳ медиҳад.
• Fed-batch growth curves нишон медиҳанд, ки ду experiment яксон пеш нарафтанд; experiment-и дуюм кӯтоҳтар буд ва cell density баландтар гирифт.
• CFD compartmentalization images нишон медиҳанд, ки чаро boundaries байни circulation zones model-и дурусттар медиҳанд. Alternative boundary selection oxygen gradient-ро кам пешгӯӣ мекунад.
• Glucose ва acetate comparison graphs нишон медиҳанд, ки upper-lower differences барои ин metabolites хурд буда, homogeneous assumption дар model қобили қабул аст.
• Biomass graph тамоюли каме баландтари OD дар болоиро нишон медиҳад, вале зарурати interpretation-и эҳтиёткорона дорад.
• Oxygen-gradient graphs равшан нишон медиҳанд, ки dissolved oxygen бо reactor height меафзояд ва дар lower region пасттар мемонад.
• Gassing-out graphs нишон медиҳанд, ки ҳангоми қатъи aeration DO меафтад, пас аз бозоғоз барқарор мешавад ва recovery rate ба location вобаста аст.
• Model-experiment comparison graphs нишон медиҳанд, ки proposed compartment model ҳам continuous DO measurements ва ҳам oxygen gradients-и вобаста ба height changes-ро умуман сабт мекунад.

Натиҷаи умумии техникӣ: Таҳқиқот нишон медиҳад, ки дар E. coli fed-batch bioreactor-и 20 L, ҳатто агар glucose, acetate ва biomass асосан homogeneous ба назар расанд, dissolved oxygen метавонад homogeneous набошад. Аз ин рӯ, ҷойгиршавии як DO sensor дар process control бояд ҳамчун тағйирёбандаи критикӣ баррасӣ шавад.

Ёддошт оид ба Манбаъ ва Усул

Ин мақола бар асоси таҳқиқоти Ittisak Promma, Danny Kang, Zahra Negahban, Valerie Ward, Nasser Mohieddin Abukhdeir, Marc G. Aucoin ва Hector Budman бо унвони “Probe Location Matters: Oxygen Gradient Measurements and CFD-Informed Modeling Challenge the Well-Mixed Assumption in Bench-Scale Bioreactors” таҳия шудааст. Таҳқиқот дар заминаи Department of Chemical Engineering, University of Waterloo гузаронида шудааст.

Манбаъ як preprint research paper аст, ки дар SSRN дастрас шудааст. Азбаски дар матн ба таври равшан “This preprint research paper has not been peer reviewed” гуфта шудааст, таҳқиқот аз peer review нагузаштааст. Бинобар ин findings бояд ҳамчун preprint-и бар асоси experimental measurement ва modeling фаҳмида шаванд, на final peer-reviewed publication.

Ин мундариҷа бар асоси bioreactor experiments, E. coli fed-batch conditions, dissolved-oxygen measurements, gassing-out tests, kinetic-model equations, CFD-informed compartment model structure ва results-и figures/tables омода шудааст. Иддаоҳои дар PDF набуда, мисли product-quality guarantee, clinical-production success, industrial guarantee, same results in all bioreactors ё commercial applicability илова нашудаанд.

Таҳқиқот dissolved-oxygen gradients-ро муфассал experimental ва model-based баррасӣ мекунад ва мегӯяд, ки pH gradients мушоҳида шудаанд, аммо дар ин paper муфассал пешниҳод ва моделсозӣ нашудаанд. Аз ин рӯ, робитаи pH ва oxygen масъалаест, ки дар оянда бояд ҷудогона омӯхта шавад.

Натиҷаҳо дар доираи bioreactor geometry, impeller positions, E. coli strain, fed-batch conditions, sensor locations ва model assumptions-и истифодашуда эътибор доранд. Набояд фарз кард, ки дар scale, reactor design ё organism-и дигар ҳамон gradient values ҳатман пайдо мешаванд. Бо вуҷуди ин, таҳқиқот technical warning-и қавӣ медиҳад, ки sensor location дар bioprocess monitoring ва control набояд нодида гирифта шавад.