Katika utafiti huu, kipimo cha kingamwili cha mpangilio wa fluoresensi katika hali ya mchanganyiko mmoja (fluorescence polarization immunoassay, FPIA) kilitengenezwa kwa ajili ya utambuzi wa haraka na wa kiasi wa asidi 4-klorofenoksiasetiki (4-CPA) katika maji. Watafiti walilinganisha kingamwili monoklonali M1 na vifuatiliaji viwili tofauti vya fluoresensi vya 4-CPA; kwa kifuatiliaji 4-CPA-EDF chenye kiunganishi kifupi, uchanganuzi wa dakika 15 ulifikia kikomo cha utambuzi cha 1,2 ng/mL na masafa ya uchanganuzi ya takriban 2,3–300 ng/mL. Katika sampuli halisi za maji ya wazi zilizoongezewa 4-CPA, urejeshaji kulingana na Jedwali 4 ulikuwa kati ya %98–110. Kizuizi kikuu cha mbinu kilikuwa mwitikio mtambuka wa %48 dhidi ya 2,4-D yenye muundo unaofanana; watafiti walishughulikia hali hii kwa njia mbili, yaani uchanganuzi wa kihisabati wa FPIA mbili na kuondoa 2,4-D mapema kwa kutumia safu ya affinity. Marekebisho ya FPIA mbili yalitoa makadirio ya juu kupita kiasi, yenye urejeshaji wa %116–151 katika mchanganyiko uliojaribiwa, ilhali mbinu ya safu ya affinity ilitoa urejeshaji wa takriban %103,6–110 kwa 4-CPA chini ya hali zilizojaribiwa.

4-CPA ni derivative sintetiki ya asidi fenoksiasetiki inayoweza kuonyesha athari inayofanana na auxin katika mimea. Katika matumizi ya kilimo inaweza kutumiwa kama kidhibiti ukuaji wa mimea, na katika dozi kubwa pia inaweza kuonyesha athari ya kuua magugu. Kwa hiyo, uwezo wa kufuatilia mabaki yake kwa haraka katika maji na sampuli za kilimo ni muhimu kiuchanganuzi. Lengo la utafiti halikuwa kutengeneza mbinu rejea ya jumla itakayochukua nafasi ya mbinu za kromatografia zinazohitaji vifaa vya kiwango cha juu; bali lilikuwa kuunda mbinu ya uchunguzi wa immunokemia ambayo ni ya haraka, homogeneous na inayofaa kwa vipimo vinavyoweza kubebwa.

Moja ya ubunifu muhimu wa utafiti si tu kuanzisha FPIA ya 4-CPA, bali pia kutafuta moja kwa moja suluhisho la tatizo la kufanana kwa miundo ambalo hutokea mara nyingi katika immunoassay. Kingamwili M1 ilitambua 4-CPA kwa nguvu, lakini pia ilitoa mwitikio mkubwa dhidi ya 2,4-D. Kwa upande mwingine, kingamwili tofauti ya anti-2,4-D haikuonyesha mwitikio mtambuka wenye maana kwa 4-CPA chini ya hali za majaribio ya watafiti. Tofauti hii ilitumiwa kwa uchanganuzi wa kihisabati wa matokeo kutoka vipimo viwili na pia kwa kunasa na kuondoa 2,4-D kimwili kutoka kwenye sampuli.

Tatizo kuu la utafiti ni nini?

Katika utambuzi wa kemikali za kilimo zenye uzito mdogo wa molekuli kama 4-CPA, tatizo kuu la uchanganuzi si tu uwezo wa kupima viwango vya chini. Pia ni lazima kutofautisha molekuli lengwa na misombo mingine yenye miundo ya kemikali inayofanana sana. Hasa, kufanana kwa kimuundo kati ya 4-CPA na dawa ya magugu ya fenoksi 2,4-D inayotumiwa sana kunaweza kusababisha mwitikio mtambuka katika vipimo vinavyotegemea kingamwili.

Katika utafiti, tatizo hili lilishughulikiwa kwa hatua mbili. Lengo la kwanza lilikuwa kuanzisha FPIA yenye unyeti wa kutosha na ya haraka kwa 4-CPA. Lengo la pili lilikuwa kutengeneza mikakati ya uchanganuzi inayoweza kudhibiti mwitikio mtambuka wa FPIA kwa 2,4-D.

Kipimo cha fluorescence polarization immunoassay hufanyaje kazi?

Fluorescence polarization immunoassay hupima mabadiliko katika mwendo wa kuzunguka wa molekuli ndogo zilizoandikwa kwa fluoresensi katika suluhisho. Kifuatiliaji kidogo cha fluoresensi kilicho huru huzunguka haraka na kupoteza kwa kiwango kikubwa zaidi polarization ya mwanga uliosisimuliwa. Kifuatiliaji hicho kinapofungamana na kingamwili kubwa, tata nzima huzunguka polepole zaidi; kwa hiyo polarization ya fluoresensi inayotolewa hubaki juu zaidi.

Molekuli ndogo lengwa kama 4-CPA inapokuwapo katika sampuli, hushindana na kifuatiliaji cha 4-CPA kilichoandikwa kwa fluoresensi kwa eneo la kufungamana la kingamwili. Kiwango cha 4-CPA huru katika sampuli kinapoongezeka, kiasi cha kifuatiliaji cha fluoresensi kilichofungamana na kingamwili hupungua na ishara ya polarization inayopimwa hushuka. Hivyo, uhusiano wa kiasi unaotegemea kalibresheni unaweza kuanzishwa kati ya mkusanyiko wa 4-CPA na fluorescence polarization.

Kipengele muhimu cha mbinu hii kwa utafiti ni kwamba inaweza kufanya kazi kwa mantiki ya “changanya, incubate na pima” bila kuhitaji hatua nyingi za kuosha na kutenganisha zinazopatikana katika immunoassay za kawaida za heterogeneous.

Kwa nini asili ya kingamwili M1 inavutia?

Kuna kutokuwiana muhimu kwa kibibliografia/kimbinu katika chanzo. Katika sehemu ya muhtasari, kingamwili M1 inaelezwa kana kwamba iliundwa dhidi ya 4-CPA. Hata hivyo, katika sehemu ya mbinu imeelezwa wazi kwamba 2,4-D ilitumika wakati wa kuandaa immunogen, na katika matokeo inaelezwa kuwa M1 ilibainika wakati wa uchunguzi wa kloni za hybridoma zilizotayarishwa dhidi ya 2,4-D.

Kulingana na sehemu ya matokeo, sifa isiyotarajiwa ya M1 ni kwamba ilionyesha affinity ya juu zaidi kwa 4-CPA kuliko kwa 2,4-D ambayo ililengwa awali kwa kufungamana. Katika ulinganisho wa ELISA, thamani ya IC50 ya M1 iliripotiwa kuwa 0,71 µg/mL kwa 4-CPA na 2,22 µg/mL kwa 2,4-D. Kwa kingamwili tofauti ya anti-2,4-D, thamani ya IC50 ya 2,4-D ilikuwa 0,70 µg/mL, huku mwitikio mtambuka kwa 4-CPA haukuonekana ndani ya mipaka ya utambuzi ya jaribio.

Kwa hiyo, kumfafanua M1 kama “kingamwili yenye umaalumu wa juu iliyobuniwa tangu mwanzo kwa 4-CPA” hakulingani kikamilifu na chanzo. Ufafanuzi sahihi zaidi ni kwamba ni kloni iliyojitokeza katika utafiti wa hybridoma uliolenga 2,4-D na ikaonyesha affinity ya juu isiyotarajiwa kwa 4-CPA.

Kwa nini vifuatiliaji viwili vya fluoresensi vilisintetishwa?

Unyeti wa FPIA hautegemei tu affinity ya kingamwili, bali pia muundo wa analogi ya antijeni iliyoandikwa kwa fluoresensi. Kwa hiyo watafiti waliunganisha 4-CPA na derivatives mbili tofauti za fluoresensi:

• 4-CPA-EDF: kiunganishi kifupi chenye vikundi viwili vya CH2 kati ya 4-CPA na muundo wa fluoresensi.
• 4-CPA-6-AHF: kiunganishi kirefu zaidi chenye vikundi sita vya CH2.

Kikundi cha carboxyl cha 4-CPA kiliamilishwa kwa kemia ya carbodiimide inayotegemea DCC/NHS, na bondi ya amide iliundwa na vikundi vya amino vya derivatives za fluoresensi. Vifuatiliaji vilitakaswa kwa thin-layer chromatography. Utafiti uliripoti kwamba mavuno ya usanisi kwa kawaida yalikuwa takriban %30–40 ikilinganishwa na fluoresensi ya kuanzia.

Ilithibitishwaje kwamba vifuatiliaji vilikuwa vimesintetishwa kweli?

Kupata ishara ya fluoresensi pekee hakukuchukuliwa kuwa ushahidi wa kutosha kwamba muundo ulikuwa sahihi. Watafiti walichanganua bidhaa za 4-CPA-EDF na 4-CPA-6-AHF kwa high-performance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry (HPLC-HRMS).

Kwa 4-CPA-EDF, ioni ya molekuli iliyopoteza protoni [M−H]⁻ ilipimwa katika m/z 616,0942; kwa 4-CPA-6-AHF ilipimwa katika m/z 641,1696. Makosa ya molekuli yaliyoripotiwa yalikuwa −1,6 ppm na 0,01 ppm mtawalia. Mgawanyo wa isotopu uliopimwa uliendana na fomula za molekuli zilizohesabiwa.

Katika uchanganuzi wa fragmenti za MS/MS, fragmenti bainifu ya takriban m/z 126,994 inayounga mkono mabaki ya 4-CPA ilionekana katika vifuatiliaji vyote viwili. Uwepo pia wa fragmenti za ziada zinazowakilisha kiini cha fluoresensi na maeneo ya kiunganishi uliunga mkono hitimisho la watafiti kwamba 4-CPA ilikuwa imefungamana kwa bondi kovalenti na kibebaji cha fluoresensi.

Mkusanyiko wa kifuatiliaji uliwezaje kuboreshwa?

Ukali wa fluoresensi na polarization ya vifuatiliaji viwili vilipimwa katika viwango tofauti. Katika viwango vya chini, uwiano wa ishara/kelele ulikuwa dhaifu; karibu na masafa ya 1–10 nM, ukali wa fluoresensi uliongezeka hadi kiwango kinachoweza kutumiwa na polarization ilibaki thabiti kwa kiasi. Katika viwango vya zaidi ya 10 nM, tabia ya mstari iliripotiwa kuvurugika na mabadiliko ya polarization kuonekana.

Kwa hiyo, suluhisho la kazi la 5 nM lilichaguliwa kwa utafiti; baada ya kuchanganya, mkusanyiko wa mwisho wa kifuatiliaji katika majaribio ya kalibresheni uliripotiwa kuwa takriban 2,5 nM.

Kufungamana kwa kingamwili na kifuatiliaji kulionyesha nini?

Kufungamana kwa kingamwili M1 na vifuatiliaji viwili kulilinganishwa na kingamwili monoklonali M2 isiyo mahususi. M1 ilipoongezwa, ongezeko la haraka katika sehemu iliyofungamana na fluorescence polarization lilionekana kuanzia viwango vya chini vya kingamwili, ilhali M2 haikusababisha mabadiliko ya ishara yenye maana.

Kwa M1, viwango vya mwisho vinavyolingana na takriban %50 ya sehemu iliyofungamana vilibainishwa kuwa 2,2 ± 0,1 nM kwa 4-CPA-EDF na 3,2 ± 0,3 nM kwa 4-CPA-6-AHF.

Ni kifuatiliaji gani kilitoa utendaji bora wa uchanganuzi?

Utendaji wa uchanganuzi wa vifuatiliaji viwili katika utambuzi wa 4-CPA ulipolinganishwa moja kwa moja, 4-CPA-EDF yenye kiunganishi kifupi ilitoa kikomo cha chini zaidi cha utambuzi.

Matokeo haya yanaonyesha kwamba hakuna uhusiano rahisi wa “kiunganishi kirefu ni bora zaidi” kati ya urefu wa kiunganishi na unyeti. Watafiti wanajadili tofauti hiyo kwa kuzingatia sababu kadhaa, ikiwemo uhamaji wa ndani wa fluorophore, upatikanaji kwa kingamwili, athari za steric na kiwango ambacho mwendo wa kuzunguka huzuiwa baada ya kufungamana.

Kulingana na data ya chanzo yenyewe, mchanganyiko wenye unyeti mkubwa zaidi ulikuwa 4-CPA-EDF/M1. Hata hivyo, kutokuwa na uhakika katika thamani ya LOD ya 1,2 ± 1,2 ng/mL, ambako ni kubwa sawa na thamani ya kati, kunapaswa pia kuzingatiwa wakati wa kutafsiri utendaji wa uchanganuzi.

Kwa nini uchanganuzi huchukua dakika 15?

Wakati kinetiki ya kufungamana kwa kingamwili na kifuatiliaji cha fluoresensi ilipochunguzwa, iliripotiwa kuwa usawa ulifikiwa katika takriban dakika 15 na kwamba baada ya hapo ishara ya fluorescence polarization ilidumishwa kwa takriban dakika 60. Kwa hiyo muda wa kawaida wa kipimo ulichaguliwa kuwa dakika 15.

Vipimo vilifanywa kwa fluorimeter inayobebeka ya Sentry 200. Utafiti ulitoa urefu wa wimbi la msisimko wa 485 nm na urefu wa wimbi la utoaji wa 535 nm. Majaribio yalifanywa katika 25 °C na buffer ya borate yenye pH 8,5.

Utendaji mkuu uliopatikana kwa 4-CPA ni upi?

Kwa FPIA iliyotengenezwa kwa mchanganyiko wa 4-CPA-EDF/M1, kikomo cha utambuzi kilichoripotiwa ni 1,2 ng/mL, masafa ya upimaji yanayotegemea IC20–IC80 ni takriban 2,3–300 ng/mL na muda wa kipimo ni dakika 15. Kwa uwakilishi wa mstari wa nusu-logarithmic wa grafu ya kalibresheni, utafiti unaripoti Y = (0,91 ± 0,02) − (0,24 ± 0,01) × X na R² = 0,98.

Tatizo kuu la uteuzi: 2,4-D

Uteuzi wa FPIA ulijaribiwa dhidi ya misombo ya fenoksi yenye muundo unaofanana pamoja na glyphosate, atrazine na chlorpyrifos. 4-CPA ilipochukuliwa kama rejea ya %100, mwitikio mtambuka wa %48 ulipatikana kwa 2,4-D. Thamani za %25 kwa 2,4,5-T, %6 kwa MCPA na %0,2 kwa 3,4-D ziliripotiwa. Kwa glyphosate, atrazine na chlorpyrifos, mwitikio mtambuka ulikaa chini ya %0,1.

Data hii inaonyesha jambo muhimu kwa mbinu: ingawa FPIA hutambua 4-CPA kwa unyeti, ikiwa 2,4-D ipo katika sampuli haiwezi kudhaniwa kwamba ishara iliyopimwa inatokana na 4-CPA pekee.

Jaribio la matriki ya maji halisi lilionyesha nini?

Watafiti walifanya jaribio la recovery kwa kuongeza kiasi kinachojulikana cha 4-CPA katika sampuli za maji ya wazi ambazo zilikuwa zimechunguzwa mapema kwa HPLC kwa asidi za chlorophenoxyacetic. Viwango vinne viliripotiwa katika jedwali la matokeo:

Kulingana na jedwali, masafa ya urejeshaji yaliyoonekana katika matriki halisi ya maji ya wazi ni %98–110. Kwa kuwa sehemu za muhtasari na hitimisho zinatumia usemi wa %98–112, kuna kutokuwiana kidogo kwa nambari ndani ya chanzo; maandishi ya Verianla yametumia moja kwa moja thamani za jedwali la majaribio.

Suluhisho la kwanza kwa uingiliaji wa 2,4-D: kutumia FPIA mbili kwa pamoja

Katika suluhisho la kwanza, sampuli ileile ilipimwa kwa FPIA ya 4-CPA na FPIA ya 2,4-D iliyotengenezwa awali. Mantiki ilitegemea dhana kwamba mfumo wa 4-CPA hutoa mwitikio wa %48 kwa 2,4-D, huku mfumo wa 2,4-D uliotumiwa kwa vitendo hauonyeshi mwitikio mtambuka kwa 4-CPA.

Chanzo kinaeleza uhusiano huu kwa mfumo ufuatao wa milinganyo:

\[ C_1 = X \times A + Y \times 0.48 \times A \]

\[ C_2 = X \times 0 \times B + Y \times B \]

Hapa X ni mkusanyiko halisi wa 4-CPA, Y ni mkusanyiko halisi wa 2,4-D, A ni mwitikio wa mfumo wa kipimo cha 4-CPA kwa kitengo cha 4-CPA, B ni mwitikio wa mfumo wa kipimo cha 2,4-D kwa kitengo cha 2,4-D, C1 ni mwitikio wa jumla uliopimwa kwa mfumo wa 4-CPA, na C2 ni mwitikio wa jumla uliopimwa kwa mfumo wa 2,4-D.

Baada ya normalisasi, utafiti hurahisisha uhusiano kuwa:

\[ D_1 = X + 0.48Y \]

\[ D_2 \approx Y \]

katika muundo huo uliorahisishwa.

Hata hivyo, matokeo ya majaribio yanaonyesha kwamba mbinu ya kihisabati ilisababisha upendeleo chanya mkubwa katika mchanganyiko uliojaribiwa:

Kwa hiyo, ingawa mbinu ya FPIA mbili imeonyeshwa kuwa inaweza kutenganisha analiti mbili kwa dhana, matokeo katika Jedwali 5 yanaonyesha kwamba 4-CPA ilikadiriwa juu sana, hasa katika viwango vya juu. Tathmini ya “utambuzi sahihi” katika maandishi ya chanzo inapaswa kusomwa kwa tahadhari pamoja na nambari hizi.

Suluhisho la pili: kuondoa 2,4-D kimwili kabla ya kipimo

Katika mkakati wa pili, watafiti walitengeneza safu ya affinity kwa kuimmobilize kingamwili mahususi za 2,4-D kwenye Sepharose 4B iliyoamilishwa na BrCN. Sampuli ilipopitishwa kwenye safu hii, lengo lilikuwa 2,4-D ishikwe kwenye safu huku 4-CPA ikibaki katika suluhisho kwa FPIA inayofuata.

Baada ya sampuli zilizo na 2,4-D pekee kupitishwa kwenye safu, hakuna tofauti dhahiri iliyoonekana katika ishara ya FPIA ya 4-CPA ambayo ingeashiria uingiliaji wa 2,4-D. Watafiti walieleza hali hii kwa adsorpsheni ya 2,4-D kwenye safu chini ya hali zilizojaribiwa.

Kisha sampuli zenye 2,4-D na 4-CPA kwa pamoja zilijaribiwa. Baada ya safu na dilution ya sampuli, Jedwali 6 lilitoa matokeo yafuatayo katika uwepo wa 30 ng/mL 2,4-D:

Katika mfululizo huu wa majaribio, mbinu ya safu ya affinity ilitoa thamani za urejeshaji zilizo na usawa zaidi kuliko marekebisho ya kihisabati ya FPIA mbili. Hata hivyo, matokeo haya yanahusu hali maalumu za maabara, safu ya kingamwili iliyotumiwa na viwango vilivyojaribiwa; haijaonyeshwa kwamba utendaji huo huo utadumishwa moja kwa moja katika matriki tofauti za maji au katika profaili pana zaidi za viingiliaji.

Ni zipi nguvu za utafiti?

• FPIA mpya haikuachwa katika kiwango cha kalibresheni pekee; miundo ya vifuatiliaji vya fluoresensi ilithibitishwa kwa HPLC-HRMS na MS/MS.
• Urefu mbili tofauti wa viunganishi ulilinganishwa kwa majaribio.
• Mwingiliano wa kingamwili-kifuatiliaji, kinetiki na viwango vya kazi viliboreshwa kwa majaribio tofauti.
• Uteuzi haukujaribiwa tu kwa analiti lengwa, bali pia kwa analogi kadhaa za kimuundo na dawa zisizohusiana za kuua wadudu.
• Uthibitishaji wa spike/recovery ulifanywa katika matriki halisi ya maji ya wazi.
• Mwitikio mtambuka muhimu wa 2,4-D haukufichwa; njia mbili tofauti za suluhisho zilijaribiwa kwa majaribio.

Ni zipi mipaka ya utafiti?

• FPIA ya msingi ya 4-CPA ina mwitikio mtambuka wa %48 kwa 2,4-D; ikiwa 2,4-D ipo kwenye sampuli, kipimo cha moja kwa moja hakiwezi kuchukuliwa kama utambuzi mahususi wa 4-CPA.
• Urejeshaji wa %116–151 ulioripotiwa katika mbinu ya kihisabati ya FPIA mbili unaonyesha upendeleo chanya mkubwa.
• Ingawa suluhisho la safu ya affinity linaonekana kuahidi, limeonyeshwa kwa idadi ndogo ya viwango na katika muktadha mmoja wa maji ya majaribio.
• Utafiti hautoi seti kubwa ya uthibitishaji inayojumuisha aina tofauti za maji asilia, matriki za chakula au sampuli halisi za shambani kutoka maeneo mengi ya kijiografia.
• Thamani ya LOD ya 1,2 ± 1,2 ng/mL iliyotolewa ina kutokuwa na uhakika kwa kiasi kikubwa.
• Kuripoti majaribio kama marudio mawili katika baadhi ya sehemu za mbinu na kama n = 3 katika takwimu na majedwali husababisha ukosefu wa uwazi kuhusu mpangilio wa marudio.
• Chanzo kina kutokuwiana kwa uhariri kuhusu asili ya kingamwili, baadhi ya namba za majedwali/milinganyo, masafa ya recovery na marejeo ya ulinganisho wa mbinu.

Matokeo yana maana gani kwa Uturuki?

Utafiti haukufanywa kama ufuatiliaji wa mazingira katika maji ya uso ya Uturuki, wala hautoi data mahususi ya Uturuki kuhusu mara ya matumizi ya 4-CPA, viwango vya maji au viwango vya kisheria. Kwa hiyo, utendaji wa uchanganuzi uliopatikana hauwezi kuhamishiwa moja kwa moja kwa sampuli halisi za shambani nchini Uturuki.

Hata hivyo, mbinu ya FPIA iliyo ya haraka, inayobebeka na yenye hatua chache inaweza kuchunguzwa kwa uchunguzi wa awali wa mazingira, mradi ithibitishwe kando katika matriki za maji za eneo husika, profaili ya dawa zinazoweza kuwapo kwa pamoja na mbinu rejea zinazohitajika. Hasa pale analogi za kimuundo zinazofanana na 2,4-D zinaweza kuwapo katika sampuli hiyo hiyo, suluhisho la uteuzi linapaswa kuwa kiini cha uthibitishaji.

Utafiti unaunga mkono nini?

• Kwamba mchanganyiko wa 4-CPA-EDF na M1 unaweza kutoa ishara ya haraka ya FPIA kwa 4-CPA.
• Kwamba chini ya hali za majaribio ya utafiti, LOD yenye thamani ya kati ya 1,2 ng/mL na masafa ya utambuzi ya takriban 2,3–300 ng/mL yalipatikana.
• Kwamba katika sampuli za maji ya wazi zilizoongezewa 4-CPA, urejeshaji wa %98–110 ulipatikana kulingana na Jedwali 4.
• Kwamba 2,4-D ni interferent muhimu kwa FPIA ya 4-CPA.
• Kwamba kuondoa 2,4-D mapema kwa safu ya affinity ya anti-2,4-D kunaweza kuboresha kipimo cha 4-CPA katika mchanganyiko uliojaribiwa.

Utafiti hauthibitishi nini?

• Hauthibitishi kwamba FPIA ni bora kwa kila hali kuliko mbinu zote za kromatografia au immunokemia.
• Hauonyeshi kwamba mbinu itatoa usahihi uleule katika matriki zote za maji asilia, chakula au mazao ya kilimo.
• Hauonyeshi kwamba marekebisho ya kihisabati ya FPIA mbili hufanya kazi kwa usahihi wa juu; matokeo ya recovery yaliyowasilishwa yana makadirio ya juu kupita kiasi.
• Hauonyeshi kwamba safu ya affinity itaondoa viingiliaji vyote vinavyowezekana katika sampuli halisi za mazingira.
• Hauonyeshi kwamba muda wa uchanganuzi wa dakika 15 pekee ni uthibitishaji wa shambani wa kutosha kuchukua nafasi ya mbinu rejea ya kawaida ya udhibiti.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Uzalishaji wa kingamwili monoklonali

Katika sehemu ya mbinu ya chanzo, imeripotiwa kwamba wakati wa kutayarisha immunogen 2,4-D iliunganishwa na BSA, huku antijeni ya coating ikiunganishwa na OVA kupitia kemia ya EDC/NHS. Panya wa BALB/c walipewa immunization ya mwanzo na nyongeza nne. Baada ya kuchagua mnyama mwenye titer ya juu zaidi ya kingamwili katika serum na kiwango cha juu zaidi cha inhibition, splenocytes ziliunganishwa na seli za myeloma SP2/0 kwa fusion inayosaidiwa na PEG. Kingamwili monoklonali M1 ilipatikana kwa teknolojia ya kawaida ya hybridoma na usafishaji wa affinity wa Protein G ulitumika.

Maelezo haya ya mbinu hayalingani kikamilifu na usemi wa “M1 iliyoundwa dhidi ya 4-CPA” katika muhtasari. Sehemu ya matokeo inaeleza kwamba M1 ilitokana na uchunguzi wa hybridoma uliolenga 2,4-D na ikaonyesha affinity ya juu isiyotarajiwa kwa 4-CPA.

Utayarishaji wa vifuatiliaji vya fluoresensi

Kikundi cha carboxyl cha 4-CPA kiliamilishwa kwa DCC na NHS. Baada ya uamilishaji, EDF na 6-AHF ziliongezwa mtawalia katika sehemu mbili za mchanganyiko wa mmenyuko. Bidhaa zilitenganishwa kwa TLC kwa kutumia CHCl3:CH3OH 4:1 kama mobile phase na zikaelutiwa kwa methanol.

4-CPA-EDF ilikuwa na kiunganishi kifupi chenye vikundi viwili vya CH2, ilhali 4-CPA-6-AHF ilikuwa na kiunganishi kirefu zaidi chenye vikundi sita vya CH2.

Hali za HPLC-HRMS

Kwa uthibitishaji wa muundo, kromatografi ya kioevu Dionex Ultimate 3000 na spektromita ya molekuli ya high-resolution ya mseto Q Exactive zilitumiwa. Safu ya uchanganuzi iliripotiwa kuwa HypersilGold aQ, 2,1 × 100 mm na 3 µm. Kiwango cha mtiririko kilikuwa 0,50 mL/dakika, joto la safu 40 °C na ujazo wa sindano 1 µL.

Mobile phase A ilikuwa %5 acetonitrile/maji yenye %0,1 formic acid; mobile phase B ilikuwa %0,1 formic acid katika acetonitrile. Data za MS zilikusanywa katika hali za 100–1000 m/z Full MS na 90–900 m/z AIF kwa ionization chanya na hasi; ionization hasi ilionekana kuwa yenye taarifa zaidi kwa tafsiri ya muundo.

Hali za kipimo cha FPIA

Modeli ya kalibresheni ya vigezo vinne

Uhusiano kati ya fluorescence polarization na mkusanyiko wa analiti ulifanyiwa modeli katika chanzo kwa kutumia kazi ya logistic ya vigezo vinne:

\[ Y = B + \frac{A-B}{1+\left(\frac{x}{C}\right)^D} \]

Hapa x ni mkusanyiko wa analiti, Y ni thamani ya fluorescence polarization iliyopimwa, A ni thamani ya juu ya asymptotic FP, B ni thamani ya chini ya asymptotic au background, C ni sehemu ya inflection katika curve ya nusu-logarithmic na mkusanyiko unaolingana na inhibition ya %50, na D inaeleza mteremko wa curve katika sehemu ya inflection.

Hesabu ya mwitikio mtambuka

Mwitikio mtambuka ulihesabiwa katika chanzo kwa uhusiano ufuatao:

\[ CR = \frac{IC50_{4-CPA}}{IC50_{cr}}\times100\% \]

IC50_4-CPA ni mkusanyiko wa 4-CPA unaozuia kufungamana kwa kingamwili-kifuatiliaji kwa %50; IC50_cr ni mkusanyiko wa kiwanja cha mwitikio mtambuka kinachojaribiwa unaosababisha kiwango hicho hicho cha inhibition. Thamani kubwa ya CR inaonyesha kwamba kiwanja kisicho lengwa kinaingilia kipimo kwa nguvu zaidi.

Hesabu ya urejeshaji

Katika uthibitishaji wa spike/recovery:

\[ Recovery(\%)=\frac{C_{found}}{C_{added}}\times100\% \]

ilitumiwa. C_found ni mkusanyiko uliopatikana kwa FPIA, na C_added ni mkusanyiko wa 4-CPA ulioongezwa kwa kiasi kinachojulikana kwenye sampuli.

Hesabu ya sehemu iliyofungamana

Katika uboreshaji wa kingamwili, sehemu iliyofungamana ya kifuatiliaji cha fluoresensi ilihesabiwa kwa:

\[ F_b=\frac{mP-mP_{free}}{mP_{max}-mP_{free}} \]

Hapa mP ni polarization iliyopimwa, mP_free ni polarization ya kifuatiliaji huru, na mP_max ni polarization katika kufungamana kwa kiwango cha juu kati ya kingamwili na kifuatiliaji.

Muhtasari wa matokeo makuu ya kiasi

Maelezo ya Chanzo na Mbinu

Jina kamili la kazi asilia: Fluorescence Polarization Immunoassay with Modulated Selectivity for Effective Detection of the Agrochemical 4-Chlorophenoxyacetic Acid

Waandishi: Marya K. Kolokolova; Liliya I. Mukhametova; Boris S. Tupertsev; Anatoly V. Zherdev; Xinxin Xu; Chuanlai Xu; Sergei A. Eremin.

Mpangilio wa waandishi: Chanzo kinaorodhesha waandishi kwa mpangilio huo hapo juu. Hakuna tamko wazi la waandishi wenza wa kwanza/mchango sawa lililobainika.

Mwandishi wa mawasiliano: Sergei A. Eremin.

Taasisi: Faculty of Chemistry, M. V. Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia; A. N. Bach Institute of Biochemistry, Research Center of Biotechnology of the Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia; N. N. Semenov Federal Research Center for Chemical Physics, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia; State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi, China.

Aina ya chanzo: Makala asilia ya utafiti iliyopitiwa na wataalamu (Article).

Jarida: Biosensors.

Mchapishaji: MDPI, Basel, Switzerland.

Juzuu / toleo / namba ya makala: 16 / 6 / 343.

DOI: 10.3390/bios16060343.

Kiungo rasmi:https://doi.org/10.3390/bios16060343

Tarehe: Ilipokelewa 29 Aprili 2026; ilirekebishwa 8 Juni 2026; ilikubaliwa 13 Juni 2026; ilichapishwa 18 Juni 2026.

Hali ya mapitio ya kitaalamu: Kulingana na taarifa rasmi ya mchapishaji, utafiti ni makala ya utafiti iliyochapishwa katika jarida la Biosensors linalopitiwa na wataalamu.

Leseni: Creative Commons Attribution (CC BY); ufikiaji wazi.

Ufadhili: Russian Science Foundation, grant 24-43-00196.

Kamati ya maadili: Imeripotiwa kwamba majaribio ya wanyama yalifanywa kwa mujibu wa kanuni za wanyama wa maabara nchini China na yaliidhinishwa na Jiangnan University Animal Ethics Committee.

Ridhaa yenye taarifa: Haitumiki.

Upatikanaji wa data: Imeelezwa kwamba data zinaweza kupatikana kutoka kwa waandishi kwa ombi.

Mgongano wa maslahi: Waandishi walitangaza kutokuwa na mgongano wa maslahi.

Michango ya waandishi: Uundaji wa dhana A.V.Z. na S.A.E.; mbinu L.I.M.; uthibitishaji M.K.K., B.S.T. na L.I.M.; uchanganuzi rasmi B.S.T.; utafiti M.K.K., B.S.T., C.X., X.X. na L.I.M.; usimamizi wa data M.K.K. na A.V.Z.; rasimu ya kwanza L.I.M. na M.K.K.; mapitio/uhariri A.V.Z. na S.A.E.; uwasilishaji wa kuona C.X.; usimamizi A.V.Z. na S.A.E.; usimamizi wa mradi A.V.Z. na C.X.; kupata ufadhili S.A.E.

Kutokuwiana ndani ya chanzo

Asili ya kingamwili M1: Muhtasari unaieleza M1 kama kingamwili iliyoundwa dhidi ya 4-CPA, ilhali sehemu za mbinu na matokeo zinaeleza kuwa M1 ilitokana na utafiti wa hybridoma uliolenga 2,4-D na ilionyesha affinity ya juu isiyotarajiwa kwa 4-CPA. Makala ya Verianla imeweka msingi kwenye maelezo ya mbinu/matokeo na imeacha mkanganyiko huu uonekane.

Masafa ya recovery: Ingawa sehemu za muhtasari na hitimisho zinatumia %98–112, Jedwali la majaribio 4 lina thamani nne za %98, %102, %103 na %110. Maandishi makuu ya kisayansi yametumia masafa ya %98–110 kutoka Jedwali 4.

Recovery ya FPIA mbili: Jedwali 5 linatoa %116, %138 na %151, ilhali maandishi yanayofuata yanaeleza masafa kama %99–151. Maandishi ya Verianla yametumia thamani halisi za jedwali.

Idadi za sampuli/viwango: Sehemu ya mbinu inaeleza kwamba sampuli za maji ya wazi ziliwekewa spike katika viwango vya 2,5; 5; 10; 50; 200 na 500 ng/mL, lakini sehemu ya matokeo inatumia usemi “sampuli saba” na Jedwali 4 linatoa tu viwango vya 5, 10, 50 na 200 ng/mL. Hakuna data iliyobuniwa kwa viwango vinavyokosekana.

Marejeo ya msalaba ya milinganyo na majedwali: Katika baadhi ya sehemu, maandishi yanarejelea mwitikio mtambuka au milinganyo ya analiti mbili kwa namba za awali. Milinganyo imewasilishwa katika makala hii kulingana na maudhui yake ya kihisabati, na kosa la namba katika chanzo halijageuzwa kimya kimya kuwa mabadiliko ya data ya kisayansi.

Sehemu ya vifupisho: Ufafanuzi wa 2,4-D katika orodha ya vifupisho umeandikwa kwa namna isiyoendana na jina la “2,4-dichlorophenoxyacetic acid” katika maandishi makuu. Vilevile kuna tofauti ya istilahi katika jina la 2,4,5-T ikilinganishwa na maandishi makuu.

Jedwali la kulinganisha mbinu: Baadhi ya ulinganifu wa mbinu–rejea katika Jedwali 7 la chanzo hauendani kikamilifu na bibliografia. Zaidi ya hayo, ingawa utangulizi wa makala unataja baadhi ya mifano ya kromatografia yenye LOD ya chini sana, sehemu ya hitimisho inatoa tathmini pana zaidi kwamba FPIA ilifanya vizuri kuliko mbinu nyingi za ala. Kwa hiyo, makala ya Verianla haikubali hitimisho la “FPIA ni bora kuliko mbinu zote za ala”.

Kikomo cha kisayansi: Utafiti unaunga mkono maendeleo ya FPIA ya haraka kwa 4-CPA na uthibitishaji wake katika sampuli maalumu za maji. Hata hivyo, uthibitishaji wa shambani kwa kiwango kikubwa katika mitandao halisi ya ufuatiliaji wa mazingira, uwezo wa kurudiwa katika vituo vingi au utendaji wa jumla katika matriki tofauti za maji/chakula haujaonyeshwa.

Maelezo ya chanzo ya Verianla: Maudhui ya kisayansi yaliandaliwa baada ya kuchunguza sehemu za mbinu, fomula, majedwali, grafu, spectra za HPLC-HRMS/MS, data za kalibresheni, majaribio ya recovery, majaribio ya mwitikio mtambuka, tafiti za safu ya affinity, hitimisho, ufadhili, maadili, upatikanaji wa data na michango ya waandishi katika utafiti wa kurasa 22 uliopakiwa. Vyanzo vya nje vilitumiwa tu kuthibitisha utambulisho wa kibibliografia na hali ya uchapishaji; hakuna matokeo mapya ya majaribio kutoka nje yaliyoongezwa katika maelezo makuu ya kisayansi.