Kronik böbrek hastalığının ilerleyerek böbrek yetmezliğine dönüşmesinde ortak son yolaklardan biri böbrek fibrozisidir. Fibrozis sırasında normal böbrek dokusunun yerini giderek kollajen ve diğer hücre dışı matriks bileşenleri alır; işlevsel doku mimarisi bozulur ve böbreğin süzme kapasitesi azalır. Bu süreç yalnızca fibroblastların aşırı çalışmasıyla açıklanamaz. Hücresel metabolizma, böbrek tübül hücreleri, bağışıklık hücreleri ve inflamatuvar sinyaller birbirini besleyen bir mikroçevre oluşturur.

İncelenen çalışma, kronik böbrek hasarında metabolik değişimin nasıl uzun süreli bir bağışıklık yanıtına ve fibrozise dönüştüğünü açıklayan bir mekanizma önermektedir. Araştırmacılara göre hasarlı böbrekte heksozamin biyosentez yolu, yani HBP etkinleşmekte ve hücre içinde UDP-GlcNAc üretimini artırmaktadır. UDP-GlcNAc, proteinlere O-bağlı N-asetilglukozamin eklenmesi için kullanılan temel substrattır.

Çalışmanın önerdiği genel mekanizma şu şekilde özetlenebilir:

\[ \mathrm{HBP}\uparrow \rightarrow \mathrm{UDP\!-\!GlcNAc}\uparrow \rightarrow \mathrm{STAT3\!-\!T717\ O\!-\!GlcNAc}\uparrow \rightarrow \mathrm{SMURF1\ bağlanması}\downarrow \rightarrow \mathrm{STAT3\ yıkımı}\downarrow \]

\[ \mathrm{STAT3\ kararlılığı}\uparrow \rightarrow \mathrm{CXCL10}\uparrow \rightarrow \mathrm{CD4^+\ T\ hücresi\ göçü}\uparrow \rightarrow \mathrm{Th17/IL\!-\!17A}\uparrow \rightarrow \mathrm{böbrek\ fibrozisi}\uparrow \]

Araştırmada insan kronik böbrek hastalığı verilerinde OGT ve OGA ekspresyonunda belirgin değişiklik görülmezken HBP’nin temel enzimleri olan GFPT1, GNPNAT1, PGM3 ve UAP1’in arttığı bildirilmiştir. İnsan böbrek biyopsilerinde ve iki ayrı fare modelinde genel protein O-GlcNAc düzeylerinin yükseldiği gözlenmiştir.

Farelerde kullanılan iki fibrozis modeli şunlardır:

• Üreterin bağlanmasıyla oluşturulan tek taraflı üreter obstrüksiyonu modeli — UUO
• 250 mg/kg folik asit enjeksiyonuyla oluşturulan folik asit nefropatisi modeli — FA

HBP’nin hız sınırlayıcı enzimi GFPT1’i baskılamak amacıyla kullanılan DON, fare böbreklerinde O-GlcNAc düzeyini azaltmış; kollajen I ve α-SMA gibi fibrozis belirteçlerini, histolojik kollajen birikimini ve inflamatuvar hücre infiltrasyonunu düşürmüştür. Serum kreatinin ve kan üre azotu değerlerinde de iyileşme bildirilmiştir.

RNA dizileme analizinde böbrek hasarıyla yükselen, DON tedavisiyle yeniden düşen 97 gen belirlenmiştir. Bu genlerin kemokin reseptörü aktivitesi, T hücresi göçü ve bağışıklık yanıtlarıyla ilişkili olduğu görülmüştür. Özellikle CXCL10–CXCR3 ekseni, CD4+ T hücrelerinin böbreğe çekilmesinde merkezi bir bağlantı olarak öne çıkmıştır.

Çalışmada O-GlcNAc düzeyinin artırılması böbrek tübül hücrelerinde CXCL10 ekspresyonunu yükseltmiştir. CXCR3 antagonisti AMG487’nin kullanılması ise CD4+ T hücresi infiltrasyonunu, fibrozis belirteçlerini ve böbrek işlevindeki bozulmayı azaltmıştır.

İkinci bağışıklık basamağı Th17 hücreleridir. Akım sitometrisiyle böbrekteki canlı CD4+ T hücreleri arasında IL-17A üreten Th17 hücrelerinin oranı ölçülmüştür. HBP’nin DON ile baskılanması Th17 oranını ve böbrekteki IL-17A düzeyini azaltmıştır. IL-17’nin sekukinumab ile doğrudan nötralize edilmesi de hayvan modelinde hasarı ve fibrozisi hafifletmiştir.

Moleküler deneyler, bu metabolik ve immünolojik değişimin merkezine STAT3 proteinini yerleştirmektedir. Araştırmacılar STAT3’ün treonin 717, yani T717 bölgesine O-GlcNAc eklenmesinin proteinin hücre içindeki ömrünü uzattığını bildirmiştir. Bu modifikasyon STAT3’ün gen düzeyini artırmamış; proteinin yıkılmasını engellemiştir.

Normal koşullarda SMURF1 adlı E3 ubikuitin ligazın STAT3’e bağlanarak proteinin ubikuitinlenmesini ve proteazomda parçalanmasını kolaylaştırdığı öne sürülmektedir. T717 bölgesine O-GlcNAc eklendiğinde SMURF1’in STAT3’e bağlanması azalmakta, STAT3 daha az ubikuitinlenmekte ve hücrede daha uzun süre kalmaktadır.

\[ \mathrm{STAT3 + SMURF1} \rightarrow \mathrm{STAT3\!-\!Ub_n} \rightarrow \mathrm{proteazomal\ yıkım} \]

O-GlcNAc modifikasyonu bu zincirin ilk basamağını engelleyerek STAT3’ü kararlı hâle getirmektedir. T717 alaninin alanine dönüştürüldüğü STAT3-T717A mutantında protein yarı ömrünün kısaldığı ve ubikuitinlenmenin arttığı bildirilmiştir.

Araştırmacılar daha sonra STAT3’ün T717 bölgesini hedefleyebilecek bileşikler için yapı temelli sanal tarama yapmıştır. “FDA onaylı bileşik kütüphanesi” olarak tanımlanan 3.158 bileşik taranmış, 38 aday seçilmiş ve en yüksek sıralamadaki inositol nikotinat, sakinavir ve rutin hidrat deneysel olarak incelenmiştir.

Bu üç aday içinde yalnızca rutin hidratın STAT3 O-GlcNAc modifikasyonunu ve STAT3 protein düzeyini azalttığı bildirilmiştir. Rutin hidrat STAT3 mRNA’sını değiştirmemiş, fakat CXCL10 ekspresyonunu düşürmüştür. T717 mutasyonu taşıyan STAT3 üzerinde aynı etkinin görülmemesi, yazarlar tarafından T717 bölgesine özgü mekanizmayı destekleyen veri olarak yorumlanmıştır.

UUO farelerinde ağızdan 5 mg/kg/gün rutin hidrat uygulanması; STAT3 ve fosforile STAT3 düzeylerini, CD4+ T hücresi infiltrasyonunu, Th17 farklılaşmasını, böbrek hasarı belirteçlerini ve histolojik fibrozisi azaltmıştır. Serum kreatinin ve BUN değerlerinde de iyileşme bildirilmiştir.

Bu sonuçlar rutin hidratın insanlarda kronik böbrek hastalığını tedavi ettiğini göstermemektedir. Bulgular hücre kültürü ve küçük hayvan gruplarına dayanmaktadır. İlacın insanlardaki emilimi, uygun dozu, böbrek hastalarında güvenliği, uzun dönem toksisitesi ve klinik etkinliği araştırılmamıştır.

Çalışmanın temel problemi nedir?

Kronik böbrek hastalığında farklı başlangıç nedenleri bulunabilir: hipertansiyon, metabolik hastalıklar, immünolojik hasar, toksik etkiler veya tekrarlayan akut böbrek yaralanmaları. Başlangıç nedeni değişse de ilerleyen hastalıklarda ortak bir patolojik sonlanım ortaya çıkar: böbrek fibrozisi.

Fibroziste:

• normal böbrek dokusu zarar görür,
• miyofibroblast benzeri hücreler etkinleşir,
• kollajen ve hücre dışı matriks birikir,
• böbrek tübülleri ve damar çevresi yeniden şekillenir,
• işlev gören nefron sayısı azalır.

Bilinen inflamatuvar ve hemodinamik mekanizmalar bu sürecin yalnızca bir bölümünü açıklar. Çalışmanın odaklandığı boşluk, hücresel metabolizmadaki değişimin nasıl kalıcı bir bağışıklık tepkisine dönüştüğü ve bu tepkinin fibrozisi nasıl sürdürdüğüdür.

Heksozamin biyosentez yolu nedir?

Heksozamin biyosentez yolu, glikoz metabolizmasının küçük fakat düzenleyici açıdan önemli bir koludur. Hücredeki glikoz, glutamin, yağ asidi ve nükleotid metabolizmasından gelen girdileri bir araya getirerek UDP-GlcNAc üretir.

Yolun sadeleştirilmiş akışı, çalışmanın mantığını açıklamak için şöyle gösterilebilir:

\[ \mathrm{Fruktoz\!-\!6\!-\!fosfat + Glutamin} \xrightarrow{\mathrm{GFPT1}} \mathrm{Glukozamin\!-\!6\!-\!fosfat} \]

\[ \mathrm{Glukozamin\!-\!6\!-\!fosfat} \xrightarrow{\mathrm{GNPNAT1,\ PGM3,\ UAP1}} \mathrm{UDP\!-\!GlcNAc} \]

Bu denklemler makalede tek bir reaksiyon dizisi olarak verilmemiştir; HBP enzimlerinin işlevsel sırasını anlaşılır hâle getirmek amacıyla gösterilmiştir.

Çalışmada incelenen temel HBP enzimleri şunlardır:

HBP, yalnızca enerji üretim yolu değildir. Hücrenin besin ve stres durumunu proteinlerin işlevini değiştiren kimyasal bir sinyale dönüştürmektedir.

O-GlcNAc modifikasyonu nedir?

O-GlcNAc modifikasyonu, hücre içindeki proteinlerin serin veya treonin kalıntılarına tek bir N-asetilglukozamin grubunun eklenmesidir. Fosforilasyona benzer biçimde hızlı ve geri dönüşümlü bir protein düzenleme yöntemidir.

O-GlcNAc transferaz, yani OGT, şeker grubunu proteine ekler:

\[ \mathrm{Protein\!-\!OH + UDP\!-\!GlcNAc} \xrightarrow{\mathrm{OGT}} \mathrm{Protein\!-\!O\!-\!GlcNAc + UDP} \]

O-GlcNAcase, yani OGA ise bu grubu proteinden uzaklaştırır:

\[ \mathrm{Protein\!-\!O\!-\!GlcNAc} \xrightarrow{\mathrm{OGA}} \mathrm{Protein\!-\!OH + GlcNAc} \]

Bu temel denklemler çalışmanın biyokimyasal mantığını açıklamak amacıyla verilmiştir.

Protein üzerindeki O-GlcNAc değişikliği:

• proteinin hücre içindeki yerini,
• diğer proteinlerle etkileşimini,
• aktivitesini,
• fosforilasyonunu,
• ubikuitinlenmesini,
• yarı ömrünü

değiştirebilir.

Çalışmanın ilk temel bulgusu: Sorun OGT/OGA miktarından çok substrat akışı olabilir

İnsan kronik böbrek hastalığına ait Nephroseq verilerinde OGT ve OGA ekspresyonunun sağlıklı böbreklerden anlamlı biçimde farklı olmadığı bildirilmiştir. Buna karşılık GFPT1, GNPNAT1, PGM3 ve UAP1 ekspresyonu yükselmiştir.

İnsan CKD biyopsilerinde yapılan immünohistokimyasal incelemede genel O-GlcNAc düzeyinin arttığı belirtilmiştir. Şekil açıklamasında bu analiz için n = 20 verilmektedir; ancak örneklerin CKD evrelerine veya sağlıklı kontrol gruplarına nasıl dağıldığı ana metinde ayrıntılı olarak açıklanmamıştır.

UUO ve folik asit nefropatisi modellerinde de:

• HBP enzimlerinin mRNA düzeyleri artmış,
• HBP enzimlerinin protein düzeyleri artmış,
• genel O-GlcNAc modifikasyonu yükselmiş,
• OGT ekspresyonunda belirgin değişiklik görülmemiştir.

Yazarlar bu örüntüyü HBP akışının ve UDP-GlcNAc substrat arzının artmasıyla açıklamaktadır.

Önemli ayrım: OGT ve OGA ekspresyonunun değişmemesi, bu enzimlerin katalitik aktivitelerinin kesin olarak değişmediğini kanıtlamaz. Çalışmada OGT/OGA miktarı incelenmiş, fakat ana metinde doğrudan enzim aktivitesi ölçümü raporlanmamıştır. Bu nedenle bulgular HBP’nin güçlü bir açıklama olduğunu destekler; OGT veya OGA aktivitesinin hiçbir katkısı bulunmadığını kesinleştirmez.

İnsan verisinde böbrek işleviyle ilişki

İnsan verilerinde GFPT1, PGM3 ve GNPNAT1 ekspresyonunun daha bozuk glomerüler filtrasyonla ilişkili olduğu bildirilmiştir. OGT ve OGA için aynı ilişki görülmemiştir.

Şekil 2 açıklamasında bozulmuş böbrek işlevi:

\[ \mathrm{GFR} < 60\ \mathrm{mL/dakika/1{,}73\ m^2} \]

olarak tanımlanmıştır.

Bu insan verisi gözlemseldir. HBP enziminin yüksek olması böbrek işlevinin bozulmasına neden olmuş olabilir; böbrek hasarı HBP enzimlerini artırmış olabilir veya her iki değişiklik üçüncü bir süreçten kaynaklanmış olabilir. Nedensellik hayvan ve hücre deneyleriyle araştırılmıştır.

Birinci hayvan modeli: Tek taraflı üreter obstrüksiyonu

8–10 haftalık erkek BALB/c farelerde sol üreter iki noktadan bağlanmış ve aradan kesilmiştir. Kontrol hayvanlarında aynı cerrahi işlem yapılmış, fakat üreter bağlanmamıştır. Böbrekler ameliyattan yedi gün sonra toplanmıştır.

UUO modeli hızlı gelişen tübülointerstisyel hasar, inflamasyon ve fibrozis üretmektedir. Bu model, insan CKD’sinin bütün nedenlerini temsil etmez; fibrozis mekanizmalarını kısa süre içinde incelemek için kullanılan deneysel bir modeldir.

İkinci hayvan modeli: Folik asit nefropatisi

Erkek BALB/c farelere:

\[ 250\ \mathrm{mg/kg\ folik\ asit} \]

tek doz intraperitoneal olarak uygulanmıştır. Kontroller yalnızca taşıyıcı çözelti almıştır. Hayvanlar 28. günde değerlendirilmiştir.

Folik asit modeli tübüler hasar, inflamasyon ve zamanla gelişen fibrozis oluşturur. İki ayrı modelin kullanılması, mekanizmanın yalnızca üreter tıkanıklığına özgü olmadığını desteklemektedir. Bununla birlikte her iki model de insanlarda yıllar içinde gelişen karmaşık CKD sürecini tam olarak taklit etmez.

HBP’nin DON ile baskılanması

Çalışmada GFPT1 ve HBP akışını baskılamak amacıyla 6-diazo-5-oxo-L-norleucine, yani DON kullanılmıştır:

\[ 20\ \mathrm{mg/kg/gün,\ intraperitoneal} \]

DON uygulamasından sonra:

• böbrek O-GlcNAc düzeyi azalmış,
• kollajen I düzeyi düşmüş,
• α-SMA düzeyi düşmüş,
• Masson boyamasında kollajen birikimi azalmış,
• PAS boyamasında doku hasarı ve inflamatuvar infiltrasyon hafiflemiş,
• serum kreatinin ve BUN artışı azalmıştır.

Bu sonuçlar hem UUO hem de folik asit modelinde tekrarlandığı için yazarlar HBP kaynaklı O-GlcNAc artışının fibrozis ve işlev kaybına katkıda bulunduğu sonucuna varmıştır.

Ancak ana metinde yalnızca farmakolojik HBP baskılanması gösterilmiştir. GFPT1’in böbrek hücrelerinde genetik olarak silindiği veya aşırı ifade edildiği bir deney raporlanmamıştır. Bu nedenle DON’un bütün etkilerinin yalnızca GFPT1 üzerinden gerçekleştiği kesin olarak kanıtlanmış değildir.

RNA dizileme hangi yolu gösterdi?

UUO, sham ve DON uygulanmış UUO böbreklerinde transkriptom analizi yapılmıştır. Böbrek hasarıyla yükselen ve DON ile tekrar düşen 97 gen belirlenmiştir.

Gen Ontolojisi analizinde:

• C-X-C kemokin reseptörü aktivitesi,
• bağışıklık yanıtları,
• T hücresi ilişkili sinyaller

öne çıkmıştır.

Cd4, Cxcr3 ve Cxcr6 temel genler arasında bildirilmiştir. KEGG analizi ise Th17 hücre farklılaşmasıyla ilişkili yolakların zenginleştiğini göstermiştir.

CXCL10–CXCR3 ekseni ne yapıyor?

CXCL10, belirli bağışıklık hücrelerini kimyasal bir yoğunluk farkı boyunca hasarlı dokuya çeken bir kemokindir. CXCR3 ise özellikle aktive T hücrelerinde bulunan reseptörlerden biridir.

Çalışmanın önerdiği hücresel akış şöyledir:

\[ \mathrm{Böbrek\ tübül\ hücresi\ CXCL10}\uparrow \rightarrow \mathrm{CXCR3^+\ CD4^+\ T\ hücresi\ göçü}\uparrow \]

DON uygulaması böbrekte Cxcl10 ve Cd4 mRNA düzeylerini ve CD4+ T hücresi infiltrasyonunu azaltmıştır.

HK-2 insan proksimal tübül hücrelerinde OGA inhibitörü Thiamet G kullanılarak O-GlcNAc düzeyi yükseltildiğinde CXCL10 ekspresyonu artmıştır. Böylece O-GlcNAc sinyalinin yalnızca bağışıklık hücrelerini değil, bağışıklık hücrelerini çağıran böbrek epitel hücrelerini de etkileyebileceği gösterilmek istenmiştir.

AMG487 deneyi neyi test etti?

CXCR3’ün işlevsel rolünü değerlendirmek amacıyla UUO farelerine:

\[ 5\ \mathrm{mg/kg/gün\ AMG487,\ intraperitoneal} \]

uygulanmıştır.

CXCR3 antagonizması:

• CD4+ T hücrelerinin böbreğe girişini azaltmış,
• kollajen I ve α-SMA düzeylerini düşürmüş,
• serum kreatinin ve BUN sonuçlarını iyileştirmiştir.

Bu deney, CXCL10–CXCR3 hattının yalnızca RNA analizinde görülen bir işaret olmadığını, fibrozis fenotipine işlevsel olarak katkıda bulunduğunu desteklemektedir.

Th17 hücreleri neden önemlidir?

Th17 hücreleri, IL-17A başta olmak üzere inflamatuvar sitokinler üreten CD4+ yardımcı T hücreleridir. Böbrek hasarı sırasında bu hücrelerin ürettiği sinyaller:

• epitel hücrelerinde stres ve hasarı artırabilir,
• TGF-β gibi profibrotik faktörleri yükseltebilir,
• epitel-mezenkimal özellik değişimini destekleyebilir,
• hücre dışı matriks birikimini hızlandırabilir.

Akım sitometrisinde Th17 hücreleri, canlı CD4+ T lenfosit kapısı içindeki IL-17A pozitif hücreler olarak tanımlanmıştır:

\[ \mathrm{Th17\ oranı} = \frac{\mathrm{IL\!-\!17A^+\ CD4^+\ T\ hücreleri}}{\mathrm{toplam\ canlı\ CD4^+\ T\ hücreleri}} \times 100 \]

DON tedavisi Th17 oranını, Il17a mRNA’sını ve IL-17A proteinini azaltmıştır.

IL-17’nin nötralizasyonu

Çalışmada IL-17 yolunu doğrudan kesmek için sekukinumab:

\[ 20\ \mathrm{mg/kg/gün,\ intraperitoneal} \]

uygulanmıştır. Ek şekil açıklamasına göre IL-17 nötralizasyonu böbrek hasarını ve fibrozisi azaltmıştır.

Bu veri, Th17/IL-17 bileşeninin yalnızca HBP inhibisyonuna eşlik eden ikincil bir değişiklik olmadığını, fibrotik sonuçlara katkı sunabileceğini desteklemektedir. Ancak sekukinumab deneyinin ayrıntıları ana PDF’de yer almayan ek materyale bırakılmıştır.

STAT3 neden merkezi molekül olarak seçildi?

STAT3, hücre dışından gelen sitokin ve büyüme faktörü sinyallerini çekirdekte gen ekspresyonuna dönüştüren bir transkripsiyon faktörüdür. Th17 hücre farklılaşması için temel düzenleyicilerden biridir ve CXCL10 gibi kemokinlerin ekspresyonunu da etkileyebilir.

İmmünofloresan deneylerinde STAT3 sinyali ile O-GlcNAc sinyalinin aynı hücresel bölgelerde birlikte bulunduğu bildirilmiştir.

DON tedavisi:

• STAT3 proteinini azaltmış,
• fosforile STAT3 düzeyini azaltmış,
• STAT3 mRNA’sını değiştirmemiştir.

Bu ayrım, düzenlemenin gen transkripsiyonundan sonra, yani post-translasyonel düzeyde gerçekleştiğini düşündürmektedir.

STAT3 inhibisyonu

STAT3 inhibitörü Stattic:

\[ 10\ \mathrm{mg/kg/gün,\ intraperitoneal} \]

farelerde kullanılmış; hücre deneylerinde de STAT3 sinyalini baskılamak amacıyla uygulanmıştır.

STAT3 inhibisyonu:

• CXCL10 transkripsiyonunu,
• CD4+ T hücresi infiltrasyonunu,
• Th17 farklılaşmasını,
• fibrozis belirteçlerini

azaltmıştır. Bu sonuçlar, STAT3’ün HBP/O-GlcNAc sinyali ile immün fibrozis arasındaki bağlantıda işlevsel bir ara düğüm olduğunu desteklemektedir.

Protein yarı ömrü nasıl ölçüldü?

HK-2 hücrelerinde yeni protein sentezini durdurmak için sikloheksimid, yani CHX kullanılmıştır. Hücreler 0, 3, 6, 9, 12 ve 24 saatlerde incelenmiş; mevcut STAT3 proteininin ne kadar hızlı kaybolduğu değerlendirilmiştir.

Protein azalması sadeleştirilmiş olarak şu ilişkiyle açıklanabilir:

\[ P(t) = P_0 e^{-kt} \]

\[ t_{1/2} = \frac{\ln 2}{k} \]

Burada:

• P(t), t zamanındaki STAT3 miktarını,
• P₀, başlangıç STAT3 miktarını,
• k, yıkım hız sabitini,
• t_1/2, proteinin yarı ömrünü

ifade eder.

Bu denklemler makalede verilmemiştir; CHX yarı ömür deneyinin matematiksel mantığını açıklamak amacıyla eklenmiştir.

DON uygulandığında STAT3 proteininin daha hızlı kaybolduğu ve yarı ömrünün kısaldığı bildirilmiştir.

T717 bölgesi nasıl belirlendi?

Araştırmacılar STAT3 üzerinde altı olası O-GlcNAc modifikasyon bölgesi öngörmüş ve bu bölgelerde amino asit değişiklikleri oluşturan mutant proteinler üretmiştir.

T717, S719, T721 ve S727 mutasyonları STAT3 O-GlcNAc düzeyini azaltmıştır. Ancak yalnızca T717 mutasyonu STAT3 yarı ömrünü belirgin biçimde kısaltmıştır.

Bu nedenle çalışma:

• birden fazla bölgenin O-GlcNAc modifikasyonu alabileceğini,
• protein kararlılığı açısından belirleyici bölgenin T717 olduğunu

öne sürmektedir.

Ubikuitin–proteazom sistemi

Hücre, işlevi sona eren veya hasarlı proteinleri ubikuitin adlı küçük proteinlerle işaretleyerek proteazoma gönderir.

\[ \mathrm{STAT3} \xrightarrow{\mathrm{E3\ ligaz}} \mathrm{STAT3\!-\!Ub_n} \xrightarrow{\mathrm{proteazom}} \mathrm{parçalanmış\ ürünler} \]

MG132 ile proteazom baskılandığında DON’un normal STAT3 proteinini azaltan etkisi geri çevrilmiştir. T717A mutantında ise MG132 aynı örüntüyü göstermemiştir.

T717 mutasyonu STAT3 ubikuitinlenmesini artırmıştır. T717A mutantının ubikuitinlenmesi, O-GlcNAc düzeyini yükselten veya düşüren uygulamalardan belirgin biçimde etkilenmemiştir. Bu sonuçlar T717’nin O-GlcNAc ile ubikuitinlenme arasındaki ana düzenleme noktası olduğunu desteklemektedir.

SMURF1 nasıl bulundu?

Normal STAT3 ile T717A mutantına bağlanan proteinleri karşılaştırmak için ko-immünopresipitasyon, SDS-PAGE ve kütle spektrometrisi kullanılmıştır.

T717A mutasyonunda STAT3’e daha fazla bağlanan proteinlerden biri E3 ubikuitin ligaz SMURF1 olmuştur.

Sonraki deneylerde:

• STAT3 ve SMURF1’in fiziksel etkileşimi ko-immünopresipitasyonla doğrulanmış,
• SMURF1’in aşırı ekspresyonu STAT3 proteinini azaltmış,
• CXCL10 mRNA’sını düşürmüş,
• O-GlcNAc düzeyinin artırılması SMURF1 etkisini azaltmış,
• T717A mutasyonu SMURF1–STAT3 bağlanmasını artırmıştır.

Önerilen moleküler model şöyledir:

STAT3’ün kararlı kalması fibrozisi nasıl etkiliyor?

Daha uzun süre hücrede kalan STAT3, böbrek tübül hücresindeki profibrotik transkripsiyon programını sürdürebilir. Çalışmaya göre bunun iki temel sonucu vardır:

1. CXCL10 artışı: CXCR3 taşıyan CD4+ T hücreleri böbreğe çekilir.
2. Th17 farklılaşması: Böbreğe gelen CD4+ T hücreleri IL-17A üreten Th17 fenotipine yönelir.

Bu iki mekanizma birbirini tamamlar. Birincisi bağışıklık hücresini hasarlı böbreğe getirir; ikincisi gelen hücrenin fibrozisi güçlendiren bir bağışıklık alt tipine dönüşmesini sağlar.

Rutin hidrat nasıl bulundu?

STAT3 T717 bölgesinin üç boyutlu yapısına dayalı sanal tarama yapılmıştır. Çalışmada kullanılan bileşik kütüphanesi 3.158 maddeden oluşmaktadır.

Tarama basamakları sonunda:

• 38 aday bileşik seçilmiş,
• en yüksek sıralamadaki üç bileşik deneysel incelemeye alınmıştır.

Bu üç bileşik:

1. İnositol nikotinat
2. Sakinavir
3. Rutin hidrat

olarak bildirilmiştir.

Rutin hidrat bir flavonoiddir. Çalışmanın temel iddiası, bu bileşiğin yalnızca genel antioksidan veya inflamasyon azaltıcı özellik göstermediği; STAT3’ün T717 bölgesindeki O-GlcNAc modifikasyonunu hedeflediğidir.

Rutin hidratın hücre deneylerindeki etkisi

Rutin hidrat:

• normal STAT3’ün O-GlcNAc modifikasyonunu azaltmış,
• STAT3 protein düzeyini düşürmüş,
• STAT3 mRNA düzeyini değiştirmemiş,
• CXCL10 ekspresyonunu azaltmıştır.

T717A mutantı taşıyan STAT3’te aynı etkinin görülmemesi, yazarlar tarafından T717 bölgesine yönelik özgüllüğün kanıtı olarak yorumlanmıştır.

Bununla birlikte ana metinde rutin hidratın STAT3’e bağlanma gücünü doğrudan ölçen yüzey plazmon rezonansı, izotermal titrasyon kalorimetrisi veya benzeri nicel bir biyofiziksel bağlanma deneyi raporlanmamıştır. Bulgular sanal modelleme, mutasyon bağımlılığı, immünopresipitasyon ve protein ekspresyonu sonuçlarına dayanmaktadır.

Rutin hidratın hayvan deneyindeki etkisi

UUO farelerine ağızdan:

\[ 5\ \mathrm{mg/kg/gün\ rutin\ hidrat} \]

uygulanmıştır. Şekil 6 açıklamasında tedavinin bir hafta sürdüğü belirtilmektedir.

Rutin hidrat sonrasında:

• STAT3 ve p-STAT3 düzeyi azalmış,
• serum kreatinin ve BUN değerleri iyileşmiş,
• KIM-1 hasar belirteci azalmış,
• CD4+ T hücresi infiltrasyonu azalmış,
• Th17 hücresi oranı düşmüş,
• HE, PAS, Sirius Red ve Masson boyamalarında doku hasarı ve kollajen birikimi azalmıştır.

Bu bulgular rutin hidratı yeni bir araştırma adayı hâline getirmektedir. Ancak tek bir kısa süreli hayvan dozunun etkili bulunması, ilacın insanlarda güvenli veya etkili olacağı anlamına gelmez.

Şekil 1’in anlattığı süreç

Şekil 1 açıklamasına göre çalışma:

• insan veri tabanlarında OGT, OGA ve HBP enzimlerini karşılaştırmış,
• 20 insan CKD böbrek biyopsisinde O-GlcNAc immünohistokimyası yapmış,
• UUO ve folik asit modellerinin deney akışını göstermiş,
• her iki modelde HBP enzimlerini RT-qPCR, Western blot ve immünohistokimyayla incelemiştir.

Yüklenen PDF’de Şekil 1’in gerçek görüntü panelleri bulunmamaktadır; yalnızca şeklin açıklama metni yer almaktadır. Bu nedenle boyama yoğunlukları, bant görüntüleri, dağılım grafikleri ve hata çubukları görsel olarak bağımsız biçimde değerlendirilememiştir.

Şekil 2’nin anlattığı süreç

Şekil 2 açıklamasına göre:

• HBP enzimleri ile GFR ilişkisi incelenmiş,
• DON’un O-GlcNAc düzeyine etkisi ölçülmüş,
• kollajen I ve α-SMA Western blotları yapılmış,
• BUN ve kreatinin değerlendirilmiş,
• PAS, Masson ve immünohistokimya görüntüleri kullanılmıştır.

UUO ve FA modellerindeki böbrek işlevi ölçümlerinde bazı gruplar için n = 4, doku analizlerinde çoğunlukla n = 5 olarak belirtilmiştir.

Şekil 3’ün anlattığı süreç

Şekil 3:

• RNA dizileme fark analizlerini,
• DON ile geri dönen 97 geni,
• GO ve KEGG zenginleşmesini,
• CD4 ve CXCL10 ölçümlerini,
• AMG487 deneylerini,
• Th17 akım sitometrisini,
• IL-17A mRNA ve protein sonuçlarını

bir araya getirmektedir.

Şekil 4’ün anlattığı süreç

Şekil 4’te:

• STAT3–O-GlcNAc ortak yerleşimi,
• STAT3 protein ve mRNA karşılaştırması,
• CHX yarı ömür deneyi,
• STAT3 bölge mutasyonları,
• MG132 proteazom deneyi,
• STAT3 ubikuitinlenmesi

incelenmiştir.

Şekil 5’in anlattığı süreç

Şekil 5, SMURF1’in belirlenmesini ve STAT3 ile etkileşimini gösteren:

• kütle spektrometrisi,
• ko-immünopresipitasyon,
• SMURF1 aşırı ekspresyonu,
• CXCL10 ölçümü,
• normal STAT3 ve T717A mutantı ubikuitinlenme deneylerini

içermektedir.

Şekil 6’nın anlattığı süreç

Şekil 6, rutin hidratın:

• STAT3 O-GlcNAc modifikasyonuna,
• T717A mutantına,
• CXCL10 ve CXCR3 ekspresyonuna,
• kreatinin ve BUN değerlerine,
• KIM-1 ve CD4 ekspresyonuna,
• böbrek histolojisine,
• Th17 hücre oranına

etkisini özetlemektedir.

Ancak Şekil 1–6’nın gerçek deney panelleri yüklenen 36 sayfalık PDF’de bulunmamaktadır. PDF, sonuç metninin ardından şekil açıklamalarıyla sona ermektedir. Bu nedenle makale içindeki görsel sonuçların büyüklüğü, dağılımı ve ham görüntü kalitesi yalnızca açıklamalardan hareketle değerlendirilebilmiştir.

Çalışmanın güçlü yönleri

• Çok katmanlı deney tasarımı: İnsan verisi, insan böbrek dokusu, iki hayvan modeli ve iki hücre hattı birlikte kullanılmıştır.
• İki farklı fibrozis modeli: Bulgular yalnızca üreter obstrüksiyonu modeline dayanmamaktadır.
• Yolak boyunca çoklu müdahale: HBP, CXCR3, STAT3 ve IL-17 ayrı farmakolojik araçlarla hedeflenmiştir.
• Transkriptom analizi: Önceden seçilmiş birkaç gen yerine daha geniş bağışıklık örüntüsü araştırılmıştır.
• Mutasyon deneyleri: STAT3 üzerindeki özgül T717 alanı test edilmiştir.
• Protein yıkım mekanizması: CHX, MG132 ve ubikuitin deneyleri birlikte kullanılmıştır.
• E3 ligazın belirlenmesi: Kütle spektrometrisi ve ko-immünopresipitasyonla SMURF1 bağlantısı araştırılmıştır.
• Mekanizmadan aday bileşiğe geçiş: Yapı temelli tarama sonrasında rutin hidrat hücre ve hayvan deneylerinde değerlendirilmiştir.
• İnsan böbrek dokusu doğrulaması: Mekanizma yalnızca hücre kültürü veya fare verisine dayandırılmamıştır.
• Veri paylaşım planı: RNA-seq verisi PRJNA14422936 BioProject erişim numarasıyla bildirilmektedir.

Çalışmanın sınırlılıkları

• Hakem değerlendirmesi yoktur: Çalışma bir preprinttir.
• Klinik çalışma değildir: Hiçbir CKD hastasına DON, AMG487, Stattic, sekukinumab veya rutin hidrat verilmemiştir.
• Küçük hayvan grupları: Çoğu deney grubunda n = 5, bazı böbrek işlevi analizlerinde n = 4 kullanılmıştır.
• Yalnızca erkek fareler: Cinsiyete bağlı biyolojik farklılıklar değerlendirilememiştir.
• Kısa süreli modeller: UUO yedi gün, folik asit modeli 28 gün izlenmiştir.
• İnsan CKD’sini tam temsil etmez: İnsan hastalığı genellikle yıllar içinde ve çok sayıda eşlik eden faktörle gelişir.
• Genetik HBP doğrulaması sınırlıdır: GFPT1’in böbreğe özgü silinmesi veya aşırı ekspresyonu ana metinde gösterilmemiştir.
• Farmakolojik özgüllük sorunu: DON’un bütün etkilerinin yalnızca GFPT1/HBP üzerinden gerçekleştiği kesinleştirilmemiştir.
• OGT/OGA aktivitesi ölçülmemiştir: Ekspresyonun değişmemesi enzim aktivitesinin değişmediğini kanıtlamaz.
• İnsan örnek özellikleri eksiktir: Hastaların yaşı, cinsiyeti, CKD nedeni, evresi, diyabet durumu ve tedavileri ayrıntılı biçimde sunulmamıştır.
• Şekiller PDF’de bulunmamaktadır: Yalnızca şekil açıklamaları yer almaktadır.
• Ek yöntemler mevcut değildir: Metin, kalan yöntemlerin ek materyalde olduğunu belirtmekte; bu materyal yüklenen dosyada bulunmamaktadır.
• Rastgeleleştirme ve körleme açıklanmamıştır: Hayvanların gruplara nasıl atandığı ve histolojik değerlendirmelerin kör yapılıp yapılmadığı belirtilmemiştir.
• Örneklem büyüklüğü hesabı verilmemiştir: Hayvan sayılarının istatistiksel gerekçesi sunulmamıştır.
• Deney tekrarları sınırlı raporlanmıştır: Deneylerin en az iki kez tekrarlandığı belirtilmiş; biyolojik ve teknik tekrarların ayrıntısı verilmemiştir.
• İstatistiksel raporlama sınırlıdır: Temel olarak tek yönlü ANOVA, ortalama ± SEM ve yıldızlı p eşikleri verilmiştir.
• Etki büyüklüğü ve güven aralıkları eksiktir: Birçok sonuç için kesin sayısal farklar, güven aralıkları ve ham veriler ana metinde sunulmamıştır.
• Çoklu karşılaştırma düzeltmesi açıklanmamıştır: Çok sayıda gen, protein ve tedavi grubu değerlendirilmiştir.
• Rutin hidrat için doz-yanıt analizi yoktur: Farklı dozların etkinlik ve toksisitesi karşılaştırılmamıştır.
• Farmakokinetik veri yoktur: Emilim, kandaki düzey, böbrek dokusuna geçiş ve yarı ömür incelenmemiştir.
• Uzun dönem güvenlik bilinmemektedir: Kronik kullanım, karaciğer etkileri, ilaç etkileşimleri ve immünolojik yan etkiler araştırılmamıştır.
• Doğrudan bağlanma testi sınırlıdır: Rutin hidrat–STAT3 bağlanması nicel bir biyofiziksel yöntemle ana metinde gösterilmemiştir.
• Standart tedaviyle karşılaştırma yoktur: Rutin hidrat mevcut CKD veya antifibrotik yaklaşımlarla karşılaştırılmamıştır.
• Figür ve ek materyal numaralandırmasında editoryal sorunlar vardır: Bazı şekil açıklamalarında panel harfleri tekrar edilmiş ve deney ayrıntıları eksik bırakılmıştır.

Çalışma ne söylüyor?

• İncelenen insan CKD dokularında ve iki fare modelinde genel protein O-GlcNAc düzeyi yükselmiştir.
• Bu yükselişe HBP enzimlerinin artışı eşlik etmiştir.
• OGT ve OGA ekspresyonunda belirgin değişiklik bildirilmemiştir.
• HBP’nin DON ile baskılanması farelerde fibrozis ve böbrek işlev bozukluğunu azaltmıştır.
• HBP/O-GlcNAc sinyali CXCL10–CXCR3 yoluyla CD4+ T hücrelerini böbreğe çekmektedir.
• Bu sinyal Th17 farklılaşması ve IL-17A üretimiyle ilişkilidir.
• STAT3, metabolik sinyal ile immün yanıt arasında merkezi bir molekül olarak belirlenmiştir.
• STAT3 T717 bölgesindeki O-GlcNAc modifikasyonu proteinin yarı ömrünü uzatmıştır.
• O-GlcNAc, SMURF1’in STAT3’e bağlanmasını ve STAT3 ubikuitinlenmesini azaltmıştır.
• Rutin hidrat hücre deneylerinde STAT3 O-GlcNAc modifikasyonunu azaltmıştır.
• Rutin hidrat kısa süreli UUO fare modelinde fibrozis ve bağışıklık infiltrasyonunu azaltmıştır.

Çalışma ne söylemiyor?

• Rutin hidratın insanlarda CKD’yi tedavi ettiğini göstermemektedir.
• Rutin içeren gıdaların veya takviyelerin böbrek fibrozisini önlediğini göstermemektedir.
• İnsanlar için etkili veya güvenli bir doz belirlememektedir.
• Rutin hidratın diyaliz gereksinimini veya böbrek yetmezliğini önlediğini göstermemektedir.
• HBP’nin bütün CKD türlerinde aynı ölçüde etkin olduğunu göstermemektedir.
• OGT ve OGA’nın CKD’de hiçbir rolü bulunmadığını kanıtlamamaktadır.
• STAT3’ün fibroziste etkili tek O-GlcNAc hedefi olduğunu göstermemektedir.
• Th17 hücrelerinin böbrek fibrozisindeki tek bağışıklık hücresi olduğunu göstermemektedir.
• DON’un insanlarda güvenle kullanılabilecek bir antifibrotik tedavi olduğunu göstermemektedir.
• Rutin hidratın STAT3 T717’ye doğrudan ve yüksek seçicilikle bağlandığını tek başına kesinleştirmemektedir.
• Kısa süreli fare iyileşmesinin uzun dönem CKD ilerlemesini durduracağını kanıtlamamaktadır.

Geçmiş açısından önemi

Böbrek fibrozisi araştırmaları uzun süre TGF-β, fibroblast aktivasyonu, hemodinamik stres ve inflamatuvar sitokinlere odaklanmıştır. Son yıllarda hasarlı böbrek hücrelerinin metabolik programlarının da fibrozisi yönlendirdiği anlaşılmaya başlanmıştır.

Bu çalışma, metabolik yeniden programlanmayı yalnızca hücrenin enerji kullanımıyla ilişkilendirmemekte; metabolik akışın protein modifikasyonu üzerinden bağışıklık hücrelerinin davranışına çevrilebileceğini göstermeye çalışmaktadır.

Bugün açısından önemi

Çalışmanın temel kavramsal katkısı, böbrek fibrozisini ayrı ayrı “metabolik hastalık” veya “inflamatuvar hastalık” olarak görmek yerine bütünleşik bir immünometabolik bozukluk olarak ele almasıdır.

HBP:

• hücrenin besin durumunu algılamakta,
• UDP-GlcNAc üretimini değiştirmekte,
• STAT3 protein kararlılığını düzenlemekte,
• kemokin üretimini ve T hücresi göçünü etkilemekte,
• Th17 yanıtını ve fibrozisi güçlendirmektedir.

Bu tür bir yolak, tek bir hücre tipini değil böbrek tübül hücresi, T lenfositi ve fibrotik mikroçevre arasındaki iletişimi hedefleme olanağı sunabilir.

Gelecek açısından önemi

İleri çalışmaların şu soruları yanıtlaması gerekmektedir:

• CKD’de HBP’yi başlatan en üst sinyal nedir?
• Hipoksi, endoplazmik retikulum stresi veya belirli sitokinler HBP’yi nasıl etkinleştirir?
• STAT3 dışında hangi profibrotik proteinler O-GlcNAc ile kararlı hâle gelir?
• T717 modifikasyonu insan böbrek dokusunda doğrudan ve nicel olarak doğrulanabilir mi?
• HBP’nin böbrek hücrelerine özgü genetik baskılanması fibrozisi azaltır mı?
• Rutin hidratın böbrek dokusundaki gerçek konsantrasyonu nedir?
• Rutin hidrat uzun süreli ve daha yavaş gelişen CKD modellerinde etkili midir?
• İlacın bağışıklık sistemi, karaciğer ve diğer organlar üzerindeki uzun dönem etkileri nelerdir?
• Daha seçici ve güçlü T717 hedefli türevler geliştirilebilir mi?
• İnsanlarda güvenli doz aralığı bulunabilir mi?

Gündelik yaşam ve hasta açısından ne anlama geliyor?

Çalışma, böbrek hastalarının rutin içeren gıdaları veya takviyeleri tedavi amacıyla kullanmasını önermemektedir. Rutin hidrat yalnızca hücre kültürlerinde ve deneysel fare modellerinde değerlendirilmiştir.

Kronik böbrek hastalarında besin destekleri ve bitkisel ürünler:

• böbrek işlevine göre vücutta birikebilir,
• reçeteli ilaçlarla etkileşebilir,
• ürünün saflığına ve dozuna göre farklı etkiler gösterebilir,
• potasyum veya başka maddeler içerebilir.

Bu nedenle çalışma, kendi kendine rutin takviyesi başlanması için klinik kanıt oluşturmaz. İnsan tedavisine geçilebilmesi için toksisite, farmakokinetik, doz belirleme ve kontrollü klinik deneyler gereklidir.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Araştırma yaklaşımının teknik özeti

Kullanılan farmakolojik müdahaleler

Hücre deneylerinde kullanılan temel araçlar

Deney zincirinin teknik mantığı

1. İnsan ve fare böbreğinde HBP ve O-GlcNAc artışı gösterildi.
2. HBP’nin baskılanmasıyla fibrozis ve böbrek işlevi sonuçları değerlendirildi.
3. RNA-seq ile immün yanıt ve kemokin ekseni belirlendi.
4. CXCR3, STAT3 ve IL-17 ayrı müdahalelerle test edildi.
5. STAT3 protein yarı ömrünün O-GlcNAc durumuna bağlı olduğu gösterildi.
6. Mutasyonlarla T717 bölgesi işlevsel alan olarak tanımlandı.
7. SMURF1’in STAT3 yıkımını sağlayan E3 ligaz olduğu öne sürüldü.
8. Sanal taramayla T717 bölgesini hedefleyebilecek adaylar seçildi.
9. Rutin hidrat hücre ve fare deneylerinde doğrulandı.

Ana moleküler model

Müdahale sonuçlarının teknik özeti

Rutin hidrat taramasının özeti

Teknik olarak en önemli sonuç

Çalışmanın en önemli bilimsel önerisi, böbrek fibrozisinde metabolik sinyal ile bağışıklık yanıtının tek bir moleküler zincir üzerinden bağlanabileceğidir.

HBP’nin artması yalnızca hücre içindeki şeker metabolizmasını değiştirmemektedir. UDP-GlcNAc miktarını yükselterek STAT3 proteinine T717 bölgesinden kimyasal bir işaret eklemekte, bu işaret STAT3’ü hücresel yıkımdan korumakta ve daha uzun süre etkin kalmasını sağlamaktadır.

Kararlı STAT3 daha fazla CXCL10 üretimini, CD4+ T hücresi göçünü ve Th17 yanıtını desteklemektedir. Böylece kısa süreli bir metabolik değişiklik, kendini sürdüren bir immün-fibrotik mikroçevreye dönüşebilmektedir.

Rutin hidrat bu zincirin T717 modifikasyonu düzeyinde kesilebileceğini gösteren bir araştırma aracı ve aday bileşik olarak sunulmuştur. Ancak henüz bir CKD ilacı olarak değerlendirilmemelidir.

Kaynak ve Yöntem Notu

Bu içerik, Hongxia Yang, Bin Liu, Guangtao Li, Dan Zhang, Shangguo Wang, Zehua Zhang, Xiaodong Zhao, Jiaxin Liu, Qianhui Li, Yifan Song, Yang Tan, Shuyue Ma, Honglan Zhou, Yishu Wang ve Yanghe Zhang tarafından hazırlanan “Hexosamine Biosynthesis Pathway Driven O-GlcNAcylation of STAT3 Orchestrates Renal Fibrosis via a T cell Mediated Immune Pathway in CKD” başlıklı çalışmaya dayanmaktadır.

Çalışma; insan böbrek dokusu, kamuya açık insan ekspresyon verileri, erkek BALB/c farelerde UUO ve folik asit nefropatisi modelleri, HK-2 ve 293T hücreleri, RNA dizileme, mutasyon, immünopresipitasyon, ubikuitinlenme ve yapı temelli sanal tarama yöntemlerini birleştiren preklinik mekanizma ve ilaç adayı keşif preprintidir.

Metinde açıkça “This preprint research paper has not been peer reviewed” ve “Preprint not peer reviewed” ifadeleri bulunmaktadır. Dolayısıyla çalışma hakem değerlendirmesinden geçmemiştir. PDF’de nihai dergi kabulü veya hakemli yayın statüsü doğrulanmamaktadır.

Hayvan deneylerinin Jilin Üniversitesi College of Basic Medical Sciences IACUC kurulu tarafından 2025-530 numaralı protokolle onaylandığı belirtilmiştir. İnsan böbrek dokusu çalışmaları için First Hospital of Jilin University etik kurulundan 2024-1151 numaralı onay alındığı ve katılımcılardan yazılı bilgilendirilmiş onam sağlandığı bildirilmiştir.

RNA-seq verilerinin NCBI Sequence Read Archive içinde PRJNA14422936 BioProject numarasıyla paylaşıldığı belirtilmiştir. Diğer verilerin makale, ek dosyalar veya makul talep üzerine sorumlu yazardan sağlanabileceği ifade edilmiştir.

Araştırma National Natural Science Foundation of China, Jilin Province Natural Science Foundation ve metinde listelenen diğer kurumsal fonlar tarafından desteklenmiştir. Yazarlar çıkar çatışması bildirmemiştir.

Yüklenen 36 sayfalık PDF’de Şekil 1–6’nın deneysel görüntüleri ve grafik panelleri bulunmamakta, yalnızca şekil açıklamaları yer almaktadır. Ana yöntem bölümünde kalan deney yöntemlerinin ek materyalde sunulacağı belirtilmesine rağmen ek materyal yüklenen dosyada bulunmamaktadır.

Rutin hidrat yalnızca hücre kültürü ve kısa süreli fare deneylerinde değerlendirilmiştir. İnsanlarda doz, farmakokinetik, güvenlik, etkililik veya klinik sonuç verisi yoktur. Çalışma rutin takviyesi kullanımını, mevcut CKD tedavilerinin bırakılmasını veya rutin hidratın tedavi amacıyla kullanılmasını desteklememektedir.

Çalışmanın “ilk sınıf hedefli inhibitör” ifadesi yazarların preklinik veriler üzerinden yaptığı tanımlamadır. Bu ifade klinik olarak onaylanmış ilaç, kanıtlanmış tedavi veya insanlarda gösterilmiş hedef özgüllüğü anlamına gelmemektedir.

Bu makale yalnızca yüklenen PDF’deki yöntemler, şekil açıklamaları, deney sonuçları ve yazarların yorumlarına dayanılarak hazırlanmıştır. PDF’de bulunmayan klinik etkinlik, insan dozu, tedavi üstünlüğü, güvenlik garantisi veya böbrek hastalığını iyileştirme iddiası eklenmemiştir.