Sembada Hitam кара күрүч кебегинин хлороформ экстракты (chloroform extract of black rice bran; CBRB) бул изилдөөдө Oryza sativa L. ‘Sembada Hitam’ сортунун кебегин хлороформ менен экстракциялоо аркылуу даярдалган жана HepG2 боор рагынын клеткаларында in vitro шартта сыналган өсүмдүк экстракты болуп саналат. Изилдөөчүлөр CBRBнин таасирин үч эксперименттик багытта изилдешкен: MTT тести менен клетканын жашоо жөндөмдүүлүгү/цитотоксикалуулук, wound-healing тести менен клетка миграциясы жана Annexin V-FITC flow cytometry менен клетка өлүмүнүн формасы. CBRBнин айкын таасирлери негизинен жогорку концентрацияларда байкалган. CBRB үчүн IC₅₀ 24 саатта 1.265 μg/mL жана 48 саатта 1.868 μg/mL болсо, doxorubicin үчүн тиешелүүлүгүнө жараша 0,44 жана 0,18 μg/mL болгон. CBRB 1.500 μg/mL концентрациясында HepG2 миграциясын олуттуу азайтып, flow cytometry анализинде %60,35±0,01 эрте апоптоз көрсөткөн. Ошого карабастан, изилдөө HepG2 клетка культурасы менен гана жүргүзүлгөн; ал адамдарда рактын алдын аларын же дарылай турганын, клиникалык коопсуздугун же белгилүү бир молекулалык жолду далилдебейт.

48 сааттык MTT тестинде CBRB 2.000 μg/mL концентрациясында HepG2 жашоо жөндөмдүүлүгүн %30,39±12,23кө, 3.000 μg/mL концентрациясында %4,9±0,67ге түшүргөн. Ал эми doxorubicin кыйла төмөн концентрацияларда күчтүү цитотоксикалык таасир көрсөткөн. Ошондуктан булак CBRB doxorubicinге салыштырмалуу төмөн цитотоксикалык потенциалга ээ экенин баса белгилейт.

Клетка миграциясы экспериментинде 250, 500, 1.000 жана 1.500 μg/mL CBRB сыналган. Gap closure жана migration velocity көрсөткүчтөрү концентрация жогорулаган сайын төмөндөө тенденциясын көрсөткөн; статистикалык жактан айкын миграцияны басаңдатуу 1.500 μg/mL CBRBде байкалган. Doxorubicin 2 μg/mL да күчтүү migration inhibition көрсөткөн.

Flow cytometry экспериментинде CBRBнин 500, 1.000 жана 1.500 μg/mL концентрациялары 48 саат бою сыналган. CBRB 1.500 μg/mL концентрациясында эрте апоптоз %60,35±0,01ге жеткен; ошол эле топто некроз %2,45±0,06 деп билдирилген. Изилдөөчүлөр клетка өлүмү негизинен apoptosis менен шайкеш экенин белгилешкени менен, intrinsic же extrinsic apoptotic pathway учурдагы эксперименттер менен аныкталбаганын ачык моюнга алышат.

Изилдөөнүн негизги көйгөйү

Изилдөө Индонезияда өстүрүлгөн жергиликтүү кара күрүч сортторунун бири болгон ‘Sembada Hitam’ кебегинен алынган хлороформ экстракты гепатоцеллюлярдык карцинома тектүү HepG2 клеткаларында биологиялык активдүүлүк көрсөтөбү деген суроону карайт.

Кара күрүч кебеги булак адабиятында anthocyaninдер, γ-oryzanol, polyphenolдор, vitamin E изоформалары жана hydroxycinnamic acid сыяктуу биологиялык жактан кызыктуу компоненттер менен байланыштуу деп сүрөттөлөт. Бирок бул изилдөө CBRBнин химиялык курамын түздөн-түз талдаган эмес. Ошондуктан байкалган клеткалык таасирге кайсы конкреттүү кошулма жооптуу экени эксперименттик түрдө көрсөтүлгөн эмес.

Булактын негизги изилдөө суроосу үч бөлүккө бөлүнөт:

• CBRB HepG2 клеткаларынын жашоо жөндөмдүүлүгүн азайтабы?
• CBRB HepG2 клеткаларынын беттеги миграциясын азайтабы?
• CBRB таасиринен пайда болгон клетка өлүмү apoptosis менен байланыштуубу?

HepG2 Клеткалары Бул Изилдөөдө Эмнени Билдирет?

HepG2 бул изилдөөдө кара күрүч кебегинин экстрактынын антирак потенциалын лабораториялык шартта баалоо үчүн колдонулган hepatoma/гепатоцеллюлярдык карцинома тектүү адам клетка линиясы; HepG2де алынган жыйынтыктар клетка культурасынын моделинин реакциясын көрсөтөт жана түздөн-түз адам бейтаптарындагы дарылоонун натыйжалуулугун же коопсуздугун билдирбейт.

Изилдөөнүн мөөнөтү жана биологиялык материал

Изилдөө 2022-жылдын декабрынан 2023-жылдын октябрына чейин жүргүзүлгөн.

HepG2 клеткалары Laboratory of Parasitology, Faculty of Medicine, Public Health, and Nursing, Universitas Gadjah Mada мекемесинде өстүрүлгөн.

Sembada Hitam кара күрүчү Ngaglik, Sleman, Special Region of Yogyakarta аймагындагы жергиликтүү фермерлерден алынган. Булак сорттун nomenclature маалыматын Indonesian Minister of Agriculture Decree No. 125/HK.540/C/03/2019 менен байланыштырат.

Хлороформ экстракты кантип даярдалган?

Булакта экстракция кадамдары төмөнкүдөй берилген:

1. 10 g Sembada Hitam кара күрүч кебегинин порошогу колдонулган.
2. Кебек 100 mL chloroform ичинде эритилген/таратылган.
3. Аралашма мезгил-мезгили менен аралаштырылып, 48 саат maceration процессине калтырылган.
4. Экстракт Whatman No.1 filter paper менен чыпкаланган.
5. Фильтрат overnight remaceration процессине алынган.
6. Андан кийин solvent чыгарылып, paste-like solid экстракт алынган.
7. Сыноо эритмеси CBRBни %1 DMSO ичинде эритүү менен даярдалган.

Maceration — өсүмдүк материалын белгилүү убакыт solvent ичинде кармап, solventте эрүүчү компоненттерди материалдан экстракциялоо процесси.

Хлороформ бул жерде экстракция solventи болуп саналат. Изилдөөнүн discussion бөлүмү хлороформду nonpolar extraction solvent деп сүрөттөп, polar solventтерге салыштырмалуу айрым phytochemical компоненттерди экстракциялоодо азыраак натыйжалуу болушу мүмкүн экенин талкуулайт.

Булак extraction yield пайызын бербейт. Ошондой эле даярдалган CBRBнин anthocyanin, cyanidin-3-glucoside, peonidin-3-glucoside же башка компоненттеринин концентрациялары бул изилдөөдө аналитикалык ыкмалар менен өлчөнгөн эмес.

MTT үчүн колдонулган CBRB концентрациялары

CBRB төмөнкү концентрацияларда даярдалган:

7,8; 15,6; 31,25; 62,5; 125; 250; 500; 1.000; 1.500; 2.000 жана 3.000 μg/mL.

Бул кең концентрация диапазону клетканын жашоо жөндөмдүүлүгүнүн дозага жараша өзгөрүшүн жана IC₅₀ маанисин изилдөө үчүн колдонулган.

MTT Тести жана IC50 Эмнени Өлчөйт?

MTT тести метаболизмдик активдүү клеткалардын MTT деп аталган tetrazolium кошулмасын түстүү formazan продуктуларына айландыруу жөндөмүн пайдаланып, тирүү клеткалардын санын кыйыр баалаган клетка жашоосунун тести; IC₅₀ болсо белгиленген эксперименттик шартта клетканын өсүшүн же жашоо жөндөмдүүлүгүн болжол менен %50 азайтуу үчүн талап кылынган сыноо затынын концентрациясын билдирет жана төмөн IC₅₀ адатта жогорку цитотоксикалык потенциалды көрсөтөт.

MTT эксперименттик түзүлүшү

HepG2 клеткалары 96-well plateке:

\[ 1\times10^4\ \text{hücre/well} \]

тыгыздыкта себилген.

Культура чөйрөсү Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) болуп:

• %10 fetal bovine serum (FBS),
• %2 penicillin–streptomycin,
• %0,5 amphotericin B

камтыган.

Клеткалар адегенде %5 CO₂ incubator ичинде 24 саат инкубацияланган.

Андан кийин культура чөйрөсү CBRB тест эритмелери менен алмаштырылган.

Контролдук топтор эмне үчүн маанилүү?

MTT экспериментинде үч негизги салыштыруу түрү бар:

• Cell control: Дарыланбаган клеткалардын негизги жашоо деңгээлин көрсөтөт.
• %1 DMSO control: Экстрактты эритүү үчүн колдонулган DMSOнун өзүнүн таасирин ажыратууга жардам берет.
• Doxorubicin: Антирак таасири белгилүү оң салыштыруу заты катары колдонулган.

Doxorubicin:

0,25; 0,5; 1; 2; 4 жана 8 μg/mL

концентрацияларында сыналган.

Бардык treatment жана control топтору 24 жана 48 сааттык шарттарда бааланган.

MTT реакциясы кантип жүргүзүлгөн?

Инкубациянын аягында ар бир wellге 100 μL MTT эритмеси кошулуп, төрт саат инкубацияланган.

Андан кийин реакция:

100 μL %10 sodium dodecyl sulfate (SDS)

кошуу менен токтотулуп, үлгүлөр overnight инкубацияланган.

Натыйжалар inverted microscope менен байкалган, absorbance өлчөөсү ELISA microplate reader менен:

\[ 595\ \text{nm} \]

толкун узундугунда жүргүзүлгөн.

Клетканын жашоо жөндөмдүүлүгүнүн формуласы

Булакта колдонулган формула:

\[ \%\ \text{Cell Viability} = \frac{ A_{\text{treatment}}-A_{\text{medium}} }{ A_{\text{cell control}}-A_{\text{medium}} } \times100 \]

Бул жерде:

• \(A_{\text{treatment}}\): treatment кудугунун absorbance мааниси,
• \(A_{\text{medium}}\): клеткасыз medium/background absorbance мааниси,
• \(A_{\text{cell control}}\): untreated cell-control absorbance мааниси.

Алымда mediumдан келип чыккан background сигналы treatment өлчөөсүнөн алынат. Бөлүмдө болсо untreated cell controlдун background-corrected сигналы турат. Ошентип treatment клетка жашоосу controlго салыштырмалуу пайыз менен нормалдаштырылат.

Мисалы, натыйжа %100гө жакын болсо, treatment тобунун метаболизмдик сигналы untreated controlго жакын. Төмөн көрсөткүчтөр treatment шартында клетканын жашоо жөндөмдүүлүгү төмөн экенине шайкеш келет.

Бирок MTT түздөн-түз “канча клетка өлдү” деген эсеп эмес; ал метаболизмдик активдүүлүккө негизделген viability өлчөөсү.

IC50 кантип аныкталган?

Булак IC₅₀ маанилери probit analysis менен эсептелгенин билдирет.

Probit analysis — белгилүү доза/концентрация менен бинардык же үлүш түрүндөгү биологиялык жооптун ортосундагы байланышты моделдөө үчүн колдонулган статистикалык ыкма. Бул жерде максат болжол менен %50 growth inhibition деңгээлине туура келген концентрацияны баалоо.

Doxorubicinдин IC₅₀ маанилеринин CBRBден кыйла төмөн болушу булактын эксперименттик шарттарында doxorubicin HepG2 жашоо жөндөмдүүлүгүн азайтууда кыйла жогорку potency көрсөткөнүн көрсөтөт.

Булактагы эки башка цитотоксикалуулук классификациясы эмне үчүн көңүл бурууну талап кылат?

Метод бөлүмү эки башка чечмелөө алкагын берет.

ISO 10993-5 негизиндеги түшүндүрмөдө cell-growth inhibition даражасы боюнча non-cytotoxic, slight, mild, moderate жана severe cytotoxicity класстары сүрөттөлөт.

Ошол эле бөлүмдө булак US National Cancer Instituteка таянып IC₅₀ маанилерин:

• <20 μg/mL: жогорку cytotoxicity,
• 21–200 μg/mL: moderate cytotoxicity,
• 201–500 μg/mL: low cytotoxicity,
• >500 μg/mL: non-cytotoxic activity

деп классификациялайт.

CBRBнин IC₅₀ маанилери 1.265 жана 1.868 μg/mL болгондуктан, бул экинчи чектик системада >500 μg/mL диапазонуна туура келет. Ошого карабастан, Results бөлүмү 1.500–3.000 μg/mLдеги айкын клетка жашоосунун азайышын “moderate cytotoxicity” деп сүрөттөйт.

Бул эки билдирүү ар башка метрикаларга негизделгендиктен, бири-биринин ордуна колдонулбашы керек: бири IC₅₀ potency классификациясы, экинчиси белгилүү жогорку концентрацияларда байкалган viability inhibition даражасы.

MTT тестинин негизги сандык жыйынтыктары

Wound-Healing Тести Клетка Миграциясын Кантип Өлчөйт?

Wound-healing же scratch assay бири-бирине жакын өскөн клетка катмарында жасалма боштук түзүп, бул боштуктун убакыт өткөн сайын клеткалар тарабынан канчалык жабыларын байкоо аркылуу клеткалык миграция жүрүмүн баалаган in vitro ыкма; бул изилдөөдө баштапкы scratch кеңдиги менен 24 жана 48 сааттан кийинки кеңдик салыштырылып, gap closure пайызы жана migration velocity эсептелген.

Scratch assay эксперименттик түзүлүшү

HepG2 клеткалары 24-well plateке:

\[ 7.5\times10^3\ \text{hücre/well} \]

тыгыздыкта себилген.

Клеткалар 24 саат же болжол менен %80 confluence алынганга чейин инкубацияланган.

Confluence клеткалар культура бетинин канча бөлүгүн каптаганын билдирет. %80 confluence беттин чоң бөлүгү бири-бирине жакын клеткалар менен капталган, бирок толук жабылбаган абалды түшүндүрөт.

Андан кийин культура бетинде sterile yellow pipette tip колдонулуп тик scratch түзүлгөн.

Баштапкы сүрөт 0 сааттык маалымат катары inverted microscope астында 4×10 magnification менен жазылган.

Эксперимент сегиз топту камтыган:

• Control,
• %1 DMSO,
• Doxorubicin 1 μg/mL,
• Doxorubicin 2 μg/mL,
• CBRB 250 μg/mL,
• CBRB 500 μg/mL,
• CBRB 1.000 μg/mL,
• CBRB 1.500 μg/mL.

Сүрөттөр 24 жана 48 сааттын аягында кайра алынган.

Gap closure формуласы

\[ \text{Gap Closure} = \frac{i_l-i_f}{i_l}\times100\% \]

Бул жерде:

• \(i_l\): 0 сааттагы баштапкы scratch/gap өлчөмү,
• \(i_f\): тиешелүү инкубация мөөнөтүнүн аягында калган gap өлчөмү.

Баштапкы боштук көп жабылса, \(i_f\) кичирейип, gap closure пайызы өсөт. Клеткалардын боштукту жабуусу басаңдаса, \(i_f\) чоңураак калып, gap closure төмөн болот.

Migration velocity формуласы

\[ \text{Velocity} = \frac{i_l-i_f}{\text{total time}} \]

Бул формула scratch кеңдигиндеги өзгөрүүнү өткөн убакытка бөлөт.

Булак velocity графигинде бирдикти μm/h деп көрсөтөт.

Клетка миграциясынын жыйынтыгы

CBRB тобунда концентрация жогорулаган сайын gap closure жана migration velocity маанилери төмөндөө тенденциясын көрсөткөн.

250–1.000 μg/mL диапазонунда булак маанилүү эмес салыштырууларды билдирет.

1.500 μg/mL CBRB болсо gap closure жана migration velocity боюнча олуттуу төмөндөө көрсөткөн:

\[ p\le0.05 \]

Doxorubicin 2 μg/mL да 24 жана 48 саат шарттарында төмөн gap closure жана migration velocity жараткан.

Бул жыйынтык CBRB жогорку концентрацияда HepG2 клеткаларынын scratch аймагын жабуу жөндөмүнө байланышкан миграция жүрүмүн азайта аларын көрсөтөт.

Бирок scratch assay таза cell migration гана өлчөгөн тест эмес; клетканын жашоо жөндөмдүүлүгүндөгү жана пролиферациядагы күчтүү өзгөрүүлөр да gap closure жыйынтыгына таасир этиши мүмкүн. Бул изилдөөдө CBRB 1.500 μg/mL ошол эле учурда цитотоксикалык таасир пайда боло баштаган концентрация диапазонунда турат. Ошондуктан migration inhibition менен cytotoxicity толугу менен көз карандысыз механизмдер деп кабыл алынбашы керек.

Flow Cytometry Менен Апоптоз Анализи Эмнени Көрсөтөт?

Flow cytometry анализи Annexin V-FITC белгилөөсү аркылуу клетка популяциясын viable, necrotic, early-apoptotic жана late-apoptotic аймактарга бөлүп, CBRB колдонулгандан кийин клетка өлүмү кайсы фенотип менен байланыштуу экенин баалаган; булактын эң айкын жыйынтыгы 1.500 μg/mL CBRBде %60,35±0,01 эрте апоптоз байкалганы.

Flow cytometry эксперименттик шарттары

HepG2 клеткалары 6-well plateке:

\[ 3\times10^5\ \text{hücre/well} \]

тыгыздыкта себилген.

Баштапкы инкубация шарттары:

• 37°C,
• %5 CO₂,
• 24 саат.

Андан кийин культура чөйрөсү төмөнкү treatment топтору менен алмаштырылган:

• %1 DMSO,
• Doxorubicin 2 μg/mL,
• CBRB 500 μg/mL,
• CBRB 1.000 μg/mL,
• CBRB 1.500 μg/mL.

Treatment мөөнөтү 48 саат.

Клеткаларга болжол менен 30 мүнөт Annexin V-FITC колдонулуп, өлчөөлөр FACS Calibur flow cytometer менен жүргүзүлгөн.

Төрт flow-cytometry аймагы

Булак төрт quadrantты төмөнкүдөй атайт:

• Quadrant 1: Necrosis cells,
• Quadrant 2: Late apoptosis cells,
• Quadrant 3: Live cells,
• Quadrant 4: Early apoptosis cells.

Эрте апоптоз

CBRB концентрациясы жогорулаган сайын early-apoptotic cell үлүшүнүн өсүү тенденциясы байкалган.

1.500 μg/mL CBRBде:

\[ Early\ apoptosis=60.35\pm0.01\% \]

деп билдирилип, булак бул жыйынтыкты башка топтордон олуттуу айырмаланган деп берген:

\[ p\le0.05 \]

Некроз

Булак:

Doxorubicin 2 μg/mL үчүн:

\[ Necrosis=6.10\pm0.04\% \]

CBRB 1.500 μg/mL үчүн:

\[ Necrosis=2.45\pm0.06\% \]

деп билдирет.

Бирок ошол эле абзац бул жыйынтыктарды “significant differences (p>0.05)” деп сүрөттөйт. Статистикалык терминология жагынан “significant” менен p>0,05 бири-бирине шайкеш келбейт. Булакта exact corrected p-value жок болгондуктан, Verianla муну p≤0,05 деп өзгөртпөйт.

Кеч апоптоз

Doxorubicin 2 μg/mL тобу:

\[ Late\ apoptosis=32.5\pm0.13\% \]

менен булактагы эң жогорку маанини көрсөткөн.

CBRB топторунда концентрация жогорулаган сайын late apoptosis мааниси өскөнү айтылат; бирок Results бөлүмү топтордун ортосундагы late-apoptosis айырмачылыктары:

\[ p>0.05 \]

экенин билдирет.

Abstract менен Results ортосундагы апоптоз айырмасы

Abstract CBRB 1.000 μg/mLден жогору концентрацияларда “enhanced late apoptosis” көрсөткөнүн айтат.

Ал эми кеңири Results:

• 1.500 μg/mLде early apoptosis үчүн күчтүү жана маанилүү өсүү,
• late apoptosis үчүн өсүү тенденциясы, бирок p>0,05

деп билдирет.

Ошондуктан изилдөөнүн эң күчтүү жана түз статистикалык апоптоз жыйынтыгы 1.500 μg/mL CBRBдеги early apoptosis өсүшү.

Flow cytometry кайсы жолду далилдебейт?

Flow cytometry жыйынтыгы apoptosis менен шайкеш клетка өлүмүн көрсөтсө да, изилдөөдө:

• Bax,
• Bcl-2,
• Bcl-xL,
• caspase-3,
• caspase-7,
• caspase-9,
• p53,
• PI3K/Akt,
• Erk

өлчөнгөн эмес.

Бул молекулалык механизмдер Discussion бөлүмүндө мурунку изилдөөлөрдүн негизинде түшүндүрүлөт. Азыркы изилдөө CBRB intrinsic же extrinsic apoptosis pathwayлеринин кайсынысын активдештирерин аныктаган эмес.

Үч эксперименттик багытты бирге кантип окуу керек?

Булак үч жыйынтыктын ортосунда окшош концентрациялык үлгүнү көрөт:

1. Жогорку CBRB концентрацияларында клетканын жашоо жөндөмдүүлүгү азаят.
2. 1.500 μg/mL чамасында cell migration төмөндөйт.
3. 1.500 μg/mLде early apoptosis айкын өсөт.

Бул жыйынтыктар биологиялык жактан бири-бирине шайкеш.

Бирок булак өзүнчө correlation coefficient же formal correlation analysis берген эмес. Ошондуктан “correlation” бул жерде үч assayдагы окшош үлгүнү сүрөттөгөн автордук чечмелөө катары каралышы керек.

Статистикалык анализ

Cytotoxicity, migration жана apoptosis маалыматтары:

• One-way Analysis of Variance (ANOVA),
• маанилүүлүк чеги p≤0,05,
• маанилүү ANOVAдан кийин Tukey Honestly Significant Difference (Tukey HSD),
• SPSS version 25

менен талданган.

One-way ANOVA бир нече treatment тобунун орточо маанилеринин ортосунда жалпы маанилүү айырма бар-жогун текшерет.

Tukey HSD ANOVA жалпы айырманы көрсөткөндөн кийин кайсы топ жуптары бири-биринен айырмаланарын баалаган post-hoc multiple-comparison тест.

Figure 1–3 captionдарында:

\[ n=3 \]

деп билдирилип, ар башка тамгалар p≤0,05 деңгээлиндеги маанилүү топтук айырмачылыктарды көрсөтөт.

Булак n=3 кайталоолор биологиялык көз карандысыз кайталообу, техникалык кайталообу же башка replication түзүлүшүбү — муну кеңири түшүндүрбөйт.

Бул Изилдөө Кара Күрүч Кебеги Адамдардагы Ракты Дарылай Турганын Көрсөтөбү?

Жок. Изилдөө лабораториялык шарттагы HepG2 клетка линиясында гана CBRB жогорку концентрацияларда клетканын жашоо жөндөмдүүлүгүн, миграциясын жана апоптотикалык клеткалардын үлүшүн өзгөртө аларын көрсөтөт; адамдарда сиңүү, метаболизм, натыйжалуу доза, уулуулук, шишиктин жообу, клиникалык коопсуздук же дарылоонун ийгилиги изилденбегендиктен, жыйынтыктар адамдардагы ракты дарылоонун же рактын алдын алуунун далили катары чечмеленбейт.

“Chemopreventive potential” эмнени билдирет?

Авторлор жыйынтыктарды табигый chemopreventive-agent изилдөөсүнүн алкагында талкуулашат.

Бирок HepG2 культурасындагы cytotoxic, antimigratory жана apoptotic activity талапкер экстракттын биологиялык активдүүлүгүнө байланыштуу алгачкы лабораториялык далил болуп саналат.

Бул изилдөө:

• рактын өнүгүшүнүн алдын алууну тирүү организмде өлчөгөн эмес,
• metastasis пайда болушун жаныбар же адам моделинде өлчөгөн эмес,
• oral bioavailabilityди изилдеген эмес,
• pharmacokinetic изилдөө жүргүзгөн эмес,
• нормалдуу боор клеткалары менен selectivity тестин билдирген эмес,
• адам коопсуздугун баалаган эмес.

Ошондуктан “potential” сөзү өтө маанилүү.

“Safe for further development” билдирүүсүнүн чеги

Discussion бөлүмүндө apoptosis аркылуу клетка өлүмү экстракттын табигый chemopreventive agent катары мындан ары өнүктүрүү үчүн коопсуз экенине ишарат кылат деген чечмелөө бар.

Бирок учурдагы эксперимент:

• normal hepatocyte cytotoxicity,
• organ toxicity,
• genotoxicity,
• animal toxicity,
• human adverse effects

өлчөбөйт.

Ошондуктан Verianla көз карашында учурдагы маалыматтар “коопсуз экени көрсөтүлдү” деген жыйынтыкты колдобойт. Коопсуздук өзүнчө эксперименттер менен ырасталышы керек.

Экстракттын кайсы компоненти таасирге жооптуу?

Бул изилдөө муну аныктаган эмес.

Discussion anthocyanins жана башка phytochemical compoundsтарды мүмкүн болгон түшүндүрмөлөр катары талкуулайт; бирок CBRBнин:

• anthocyanin concentration,
• cyanidin-3-glucoside өлчөмү,
• peonidin-3-glucoside өлчөмү,
• башка активдүү compound профили

өлчөнгөн эмес.

Ошондуктан авторлор solvent fractionation, phytochemical characterization жана molecular-mechanism studies сунушташат.

Экстракция ыкмасы эмне үчүн чектөө жаратат?

Discussion бөлүмүндө хлороформ nonpolar solvent болгондуктан айрым phytochemical компоненттерди polar solventтерге салыштырмалуу төмөн натыйжалуулук менен бөлүп чыгарышы мүмкүн экени талкууланат.

Булак ошондой эле экстракт 4°Cде сакталганын, extraction процесси room temperatureда жана аба менен түз байланышта жүргүзүлгөнүн билдирет.

Авторлор anthocyaninдер жарык, ным, pH, температура жана кычкылтектен таасирлениши мүмкүн экенин; extraction жана storage шарттары phytochemical stabilityге таасир эткен болушу мүмкүн экенин талкуулашат.

Бирок anthocyanin өлчөмү экспериментке чейин жана андан кийин түздөн-түз өлчөнбөгөндүктөн, бул түшүндүрмө өлчөнгөн degradation жыйынтыгы эмес, адабиятка негизделген чечмелөө.

Изилдөөнүн Ыкмасы жана Жыйынтыктары

Эксперименттик дизайндын жалпы көрүнүшү

Figure 1 эмнени көрсөтөт?

Булак Figure 1 HepG2 cell viabilityни 24 сааттык panel A жана 48 сааттык panel B болуп эки панелде көрсөтөт.

Графикте:

• Control,
• %1 DMSO,
• алты doxorubicin concentration,
• он бир CBRB concentration

салыштырылат.

Y огу Cell Viability (%) мааниси.

Barлар mean±standard deviation форматында.

n=3.

Barлардын үстүндөгү ар башка тамгалар p≤0,05 деңгээлиндеги статистикалык айырмачылыктарды билдирет.

Figure 1дин негизги илимий билдирүүсү CBRBнин төмөн жана орточо концентрациялары HepG2 viabilityге чектелүү таасир көрсөтүп, айкын жашоо төмөндөшү өзгөчө 1.500–3.000 μg/mL аймагында пайда болору. Doxorubicin болсо μg/mL деңгээлинде кыйла төмөн концентрацияларда жашоону азайтат.

Figure 2 эмнени көрсөтөт?

Булак Figure 2 төрт панелди камтыйт:

• A: 24 саат Gap closure (%),
• B: 24 саат Velocity (μm/h),
• C: 48 саат Gap closure (%),
• D: 48 саат Velocity (μm/h).

Control жана %1 DMSO топторунда scratch аймагынын жабылышы жогору.

Doxorubicin 2 μg/mL менен CBRB 1.500 μg/mL төмөн gap closure жана velocity көрсөтөт.

CBRB концентрациясы жогорулаган сайын клетка migration көрсөткүчтөрүндө төмөндөө тенденциясы байкалат.

Figure 2деги бардык barлардын так сандык маанилери Results proseда берилбегендиктен, Verianla графиктен болжолдуу маанилерди так өлчөм катары кайра чыгарбайт.

Figure 3 эмнени көрсөтөт?

Figure 3 flow-cytometry жыйынтыктарынын төрт өзүнчө чыгышын көрсөтөт:

• A: viable cells,
• B: necrosis,
• C: early apoptosis,
• D: late apoptosis.

Figure 3 сүрөтүндө CBRB 1.500 μg/mL тобунда viable-cell barы төмөн, early-apoptosis barы эң жогорку деңгээлде.

Булак prose бул эрте-апоптоз маанисин так:

\[ 60.35\pm0.01\% \]

деп билдирет.

Изилдөө колдогон жыйынтыктар

• CBRB HepG2 клеткаларында төмөн концентрацияларда doxorubicinге караганда кыйла төмөн cytotoxic potency көрсөткөн.
• CBRBнин айкын cell-viability төмөндөшү өзгөчө 1.500–3.000 μg/mL сыяктуу жогорку концентрацияларда пайда болгон.
• 48 саатта 2.000 μg/mL CBRB viabilityни %30,39±12,23кө түшүргөн.
• 48 саатта 3.000 μg/mL CBRB viability %4,9±0,67ге түшкөн.
• CBRB IC50 мааниси 24 саатта 1.265 μg/mL, 48 саатта 1.868 μg/mL.
• Doxorubicin IC50 мааниси 24 саатта 0,44 μg/mL, 48 саатта 0,18 μg/mL.
• 1.500 μg/mL CBRB HepG2 gap closure жана migration velocity маанилерин олуттуу азайткан.
• 1.500 μg/mL CBRBде early apoptosis %60,35±0,01ге чейин айкын өскөн.
• CBRB колдонуудагы cell death pattern apoptosis менен шайкеш.

Изилдөө түздөн-түз колдобогон жыйынтыктар

• CBRB адамдарда боор рагын дарылай турганы көрсөтүлгөн эмес.
• CBRB адамдарда рактын алдын алары көрсөтүлгөн эмес.
• Адам үчүн коопсуз доза аныкталган эмес.
• Нормалдуу боор клеткаларына карата selectivity түздөн-түз сыналган эмес.
• Жаныбар модели колдонулган эмес.
• Clinical pharmacokinetics же bioavailability изилденген эмес.
• CBRBнин кайсы chemical compoundу таасирге жооптуу экени аныкталган эмес.
• Anthocyanin concentration бул изилдөөдө өлчөнгөн эмес.
• Intrinsic же extrinsic apoptosis pathway ырасталган эмес.
• Microtubule disruption түздөн-түз өлчөнгөн эмес.
• RAS/RAF/MAPK, PI3K/Akt, Erk же caspase pathways учурдагы эксперимент менен ырасталган эмес.
• “Correlation” үчүн өзүнчө correlation coefficient жарыяланган эмес.

Булактагы көңүл бурууну талап кылган отчеттук пункттар

Изилдөөнүн негизги күчтүү жактары

Изилдөө бир assay менен эле чектелбестен, клетканын жашоо жөндөмдүүлүгү, cell migration жана cell-death phenotype сыяктуу үч биологиялык деңгээлди бирге баалаган.

Doxorubicin жана solvent-control топтору колдонулган.

24 жана 48 сааттык убакыт чекиттери cytotoxicity жана migration эксперименттеринде бирге изилденген.

Viability үчүн IC₅₀, migration үчүн gap closure/velocity жана apoptosis үчүн flow-cytometric cell-state бөлүштүрүлүшү сыяктуу ар башка өлчөө түрлөрү колдонулган.

Негизги чектөөлөр

Бир гана клетка линиясы: Жыйынтыктар HepG2 клетка линиясында гана алынган.

Нормалдуу клетка салыштыруусу жок: Cancer-cell selectivity жөнүндө түз жыйынтык чыгарууга болбойт.

Жогорку CBRB концентрациялары: Айкын activity негизинен 1.500 μg/mL жана андан жогорку концентрацияларда пайда болгон.

Phytochemical characterization жок: Экстракттагы активдүү компоненттер сандык аныкталган эмес.

Nonpolar extraction: Авторлор хлороформ экстракциясы айрым phytochemicals үчүн чектөөчү болушу мүмкүн экенин белгилешет.

Molecular pathway analysis жок: Apoptosis жана migration үчүн кайсы конкреттүү молекулалык жол жооптуу экени аныкталган эмес.

In vitro чеги: Absorption, metabolism, systemic toxicity жана in vivo tumor response бааланган эмес.

Replication деталдары: Figureлер n=3 деп көрсөтөт, бирок кайталоолордун техникалык/биологиялык түзүлүшү толук түшүндүрүлгөн эмес.

Extract yield берилген эмес: 10 g кебектен алынган акыркы экстракттын көлөмү/пайызы берилген эмес.

Cell-line reproducibility деталдары: Булак HepG2 culture location маалыматын берет; cell-line catalog number, authentication же mycoplasma-testing маалыматы берилген эмес.

Булак ичиндеги статистикалык тил: Necrosis бөлүмүндө “significant” жана p>0,05 бир сүйлөмдө колдонулган.

Келечектеги изилдөө багыты

Авторлор түз сунуштаган кийинки изилдөөлөр:

• solvent fractionation,
• active compound isolation,
• phytochemical characterization,
• molecular mechanism analysis

багыттарына топтолот.

Максат CBRB ичиндеги байкалган biological activityге кайсы компоненттер жооптуу экенин аныктоо жана Sembada Hitam кара күрүч кебегинин chemopreventive potentialын көзөмөлдөнгөн түрдө баалоо.

Булак жана Ыкма Жөнүндө Эскертүү

Түпнуска изилдөө: Anticancer Potential of Chloroform Extract from Black Rice (Oryza sativa L. ‘Sembada Hitam’) Bran Against HepG2 Liver Cancer Cells.

Авторлор: Bima Mahendra, Nabila Ramiza Puteri, Yekti Asih Purwestri, Sekar Rahayu, Ardaning Nuriliani.

Авторлордун тартиби: Булак PDF жана учурдагы расмий журнал metadataсындагы тартип сакталган.

Тең салым: Булакта equal-contribution билдирүүсү жок.

Жооптуу автор: Ardaning Nuriliani.

Мекеме 1: Department of Tropical Biology, Faculty of Biology, Universitas Gadjah Mada, Sleman, Yogyakarta 55281, Indonesia.

Мекеме 2: Department of Biomedical Science, Faculty of Medicine, Public Health, and Nursing, Universitas Gadjah Mada, Sleman, Yogyakarta 55281, Indonesia.

Мекеме 3: Master Program, Faculty of Biology, Universitas Gadjah Mada, Sleman, Yogyakarta 55281, Indonesia.

Журнал: HAYATI Journal of Biosciences.

Басма түзүмү: Department of Biology, Bogor Agricultural University/IPB University жана Indonesian Society for Biology.

Том / саны: Vol. 33 No. 6.

Сан датасы: November 2026.

Беттер: 1403–1413.

DOI: 10.4308/hjb.33.6.1403-1413.

ISSN: 1978-3019.

EISSN: 2086-4094.

Булак түрү: Short Communication.

Рецензиялоо: HAYATI Journal of Biosciences double-blind peer review колдонот. Журнал саясаты Short Communication түрү Research Article менен бирдей тереңдикте review аларын билдирет.

Received: September 19, 2025.

Received in revised form: July 17, 2026.

Accepted: September 8, 2026.

PDF Available Online: October 1, 2026.

Расмий web metadataдагы Published датасы: November 1, 2026.

Дата эскертүүсү: PDFдеги Available Online датасы менен журналдын issue/publication metadata датасы ар башка жарыялоо баскычтарын көрсөтөт.

Лицензия: Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License (CC BY-NC 4.0).

Preprint: Булак PDF жана текшерилген расмий жазууда өзүнчө preprint көрсөтүлгөн эмес.

Изилдөө мөөнөтү: December 2022 – October 2023.

Изилдөө түрү: Experimental in vitro cell-culture study.

Клетка линиясы: HepG2.

Өсүмдүк материалы: Oryza sativa L. ‘Sembada Hitam’ black rice bran.

Материал булагы: Local farmers, Ngaglik, Sleman, Special Region of Yogyakarta, Indonesia.

Экстракция: 10 g bran powder + 100 mL chloroform; 48 саат maceration; Whatman No.1 filtration; overnight remaceration; evaporation to paste-like solid.

Сыноо solventи: %1 DMSO.

MTT CBRB концентрациялары: 7,8; 15,6; 31,25; 62,5; 125; 250; 500; 1.000; 1.500; 2.000; 3.000 μg/mL.

Doxorubicin MTT концентрациялары: 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8 μg/mL.

MTT cell seeding: 1×10⁴ cells/well, 96-well plate.

MTT culture medium: DMEM + %10 FBS + %2 penicillin–streptomycin + %0,5 amphotericin B.

MTT reaction: 100 μL MTT, 4 саат; 100 μL %10 SDS, overnight.

Absorbance: 595 nm, ELISA microplate reader.

IC50 ыкмасы: Probit analysis.

CBRB IC50: 1.265 μg/mL at 24 h; 1.868 μg/mL at 48 h.

Doxorubicin IC50: 0,44 μg/mL at 24 h; 0,18 μg/mL at 48 h.

48 h CBRB viability: 2.000 μg/mL → %30,39±12,23; 3.000 μg/mL → %4,9±0,67.

Wound-healing cell seeding: 7,5×10³ cells/well, 24-well plate.

Wound-healing CBRB: 250, 500, 1.000, 1.500 μg/mL.

Wound-healing doxorubicin: 1 жана 2 μg/mL.

Migration өлчөөлөрү: Gap closure (%) жана velocity (μm/h).

Migration жыйынтыгы: 1.500 μg/mL CBRBде маанилүү reduction; p≤0,05.

Flow-cytometry cell seeding: 3×10⁵ cells/well, 6-well plate.

Flow-cytometry treatment: %1 DMSO, doxorubicin 2 μg/mL жана CBRB 500, 1.000, 1.500 μg/mL.

Flow-cytometry treatment мөөнөтү: 48 саат.

Reagent: Annexin V-FITC; болжол менен 30 мүнөт.

Аспап: FACS Calibur flow cytometer.

CBRB 1.500 μg/mL early apoptosis: %60,35±0,01.

CBRB 1.500 μg/mL necrosis: %2,45±0,06.

Doxorubicin 2 μg/mL necrosis: %6,10±0,04.

Doxorubicin 2 μg/mL late apoptosis: %32,5±0,13.

Статистика: One-way ANOVA, p≤0,05; significant result кийин Tukey HSD; SPSS version 25.

Replication: Figure 1–3 captionдары n=3 деп көрсөтөт; техникалык же биологиялык кайталоо түзүлүшү кеңири түшүндүрүлбөйт.

Funding: Doctoral Competency Grant (Hibah Kompetensi Doktor) 2023, Universitas Gadjah Mada; Assignment Letter No. 7743/UN1.P.II/Dit-Lit/PT.01.03/2023.

Ethical approval: Ethics Committee of the Faculty of Medicine, Public Health, and Nursing, Universitas Gadjah Mada; Ref. No. KE/FK/1299/EC/2022.

Data Availability: Булак PDFде өзүнчө data-availability statement жок.

Conflict of Interest: Булак PDFде өзүнчө conflict-of-interest statement жок.

CRediT / Author Contributions: Булак PDFде өзүнчө author-contribution/CRediT бөлүмү жок.

Phytochemical quantification: Изилдөөдө CBRBнин anthocyanin же башка активдүү compound өлчөмдөрү түздөн-түз өлчөнгөн эмес.

Molecular pathway analysis: Жүргүзүлгөн эмес; intrinsic/extrinsic apoptosis pathway аныкталган эмес.

Normal-cell selectivity: Булакта normal hepatocyte comparison билдирилбейт.

In vivo / clinical validation: Жок.

Негизги чечмелөө чеги: Жыйынтыктар колдонулган HepG2 in vitro шарттарына гана тиешелүү; адамдардагы рак дарылоосу, рактан коргонуу же коопсуз керектөө/доза тууралуу жыйынтык бербейт.

Булак ичиндеги отчет эскертүүсү 1: Abstract late-apoptosis өсүшүн баса белгилесе, Results эң күчтүү маанилүү жыйынтыкты early apoptosis үчүн берет; late apoptosis үчүн p>0,05 билдирилген.

Булак ичиндеги отчет эскертүүсү 2: Necrosis Results сүйлөмүндө “significant differences (p>0.05)” деген билдирүү бар.

Булак ичиндеги отчет эскертүүсү 3: CBRB жогорку концентрациялардагы viability inhibition жагынан “moderate cytotoxicity” деп мүнөздөлсө, булак берген IC50 классификациясында >500 μg/mL өзүнчө potency категориясына туура келет.

Булак ичиндеги отчет эскертүүсү 4: Discussion бир жерде HeLaны “breast cancer cells” деп атаса, Introduction HeLaны human cervical cancer cell line деп сүрөттөйт.