Influenza A вирусу көбөйүшү үчүн вирустук белокторго гана эмес, өзү жуктурган клетканын ташуу жана ген экспрессиясы системаларына да көз каранды. Вирус клеткага киргенден кийин вирустук геномду алып жүргөн рибонуклеопротеин комплекстери, башкача айтканда vRNPлер, клетканын ядросуна жетиши керек. Бул этап ишке ашпаса, вирустук РНКнын транскрипциясы жана геномдун көбөйүшү натыйжалуу башталбайт.

Каралып жаткан изилдөө клетканын өз белокторунун бири болгон циклинге көз каранды киназа 7нин, башкача айтканда CDK7нин, influenza A вирусунун көбөйүшү үчүн зарыл же зарыл эместигин изилдеген. Изилдөөчүлөр CDK7ни эки өзүнчө ыкма менен басаңдатышкан:

• CDK7 mRNAсын бутага алган siRNA аркылуу генетикалык басаңдатуу
• THZ2, Mevociclib жана LDC4297 аттуу кичине молекулалуу CDK7 ингибиторлору аркылуу фармакологиялык басаңдатуу

CDK7 басаңдатылганда же ингибирленгенде вирустун клетканын бетине жабышуусу, клеткага кириши жана эндосоманын мембранасынан цитоплазмага өтүшү олуттуу бузулган эмес. Анын ордуна вирустук рибонуклеопротеин комплекстеринин цитоплазмадан ядроого ташылышы бөгөттөлгөн.

Изилдөө сунуштаган негизги механизм төмөнкүдөй:

\[ \mathrm{CDK7\ etkinliği} \rightarrow \mathrm{Importin\!-\alpha\ proteinlerinin\ korunması} \rightarrow \mathrm{vRNP\ çekirdek\ taşınması} \rightarrow \mathrm{viral\ RNA\ sentezi} \rightarrow \mathrm{IAV\ çoğalması} \]

Ал эми CDK7 басаңдатылганда:

\[ \mathrm{CDK7}\downarrow \rightarrow \mathrm{Importin\!-\alpha1,\alpha3,\alpha5,\alpha7}\downarrow \rightarrow \mathrm{vRNP\ çekirdek\ girişi}\downarrow \rightarrow \mathrm{viral\ NP,\ mRNA,\ cRNA,\ vRNA}\downarrow \rightarrow \mathrm{enfeksiyöz\ virüs\ üretimi}\downarrow \]

Importin-α белоктору ядроого жөнөтүлө турган чоң молекулалык түзүлүштөрдү тааныган ташуучу адаптерлер. Алар influenza вирусунун NP белогундагы ядролук локализация сигналдарын таанып, importin-β менен бирге vRNPлердин ядролук кабыкчадагы тешикчелерден өтүшүнө ортомчулук кылат.

CDK7ни генетикалык жол менен басаңдатуу текшерилген төрт influenza A вирус штаммынын баарында вирустук титрди азайткан:

Эселик эквиваленттер изилдөөдө түз берилген эмес. Кабарланган log₁₀ өзгөрүүлөрүн күнүмдүк түшүнүктө көрсөтүү үчүн төмөнкү негизги байланыш менен эсептелген:

\[ \mathrm{Kat\ azalma} = 10^{\Delta \log_{10}} \]

CDK7 басаңдатылган учурда клеткалардын жашоого жөндөмдүүлүгүндө олуттуу жоготуу кабарланган эмес; ошол эле учурда вирустук M2 mRNA, вирустук нуклеопротеин NP жана жугуштуу вирус өндүрүшү азайган. Бул жыйынтык байкалган антивирустук таасир клеткалардын жалпы өлүп калышы менен гана түшүндүрүлбөй турганын колдойт.

Фармакологиялык тажрыйбаларда THZ2, Mevociclib жана LDC4297 адамдын A549 өпкө эпителий клеткаларында да, MDCK ит бөйрөк клеткаларында да PR8дин көбөйүшүн дозага көз каранды түрдө басаңдаткан. Колдонулган антивирустук дозалар 2-сүрөттө төмөнкүдөй көрсөтүлгөн:

• THZ2: 0,15, 0,30 жана 0,60 µM
• Mevociclib: 1,2, 2,4 жана 4,8 µM
• LDC4297: 1,2, 2,4 жана 4,8 µM
• Ribavirin оң контролу: 120 µM

THZ2 башка эки CDK7 ингибиторуна салыштырмалуу клеткалык чыдамдуулугу жакшыраак болгон. Изилдөөнүн талкуу бөлүмүндө A549 клеткаларындагы THZ2 үчүн:

\[ \mathrm{IC}_{50} = 0{,}2\ \mu M \]

жана:

\[ \mathrm{SI} > 1600 \]

деп кабарланган.

Бул жерде IC₅₀ вирустун көбөйүшүн пайыз 50 азайткан концентрацияны, ал эми тандалмалуулук индекси антивирустук таасир клеткалык уулуулуктан канчалык айырмаланарын көрсөтөт:

\[ \mathrm{SI} = \frac{\mathrm{CC}_{50}} {\mathrm{IC}_{50}} \]

CC₅₀ клетканын жашоого жөндөмдүүлүгүн пайыз 50 азайткан концентрация. IC₅₀ мааниси 0,2 µM жана SI мааниси 1600дөн жогору болушу математикалык жактан CC₅₀ мааниси 320 µMден жогору болушун талап кылат.

Бирок PDFде маанилүү бирдик шайкешсиздиги бар. Жыйынтык тексти THZ2 A549 клеткаларында 320 nMге, MDCK клеткаларында 80 nMге чейин олуттуу уулуулук көрсөтпөгөнүн жазса, 2-сүрөттөгү цитоуулуулук графиктеринин горизонталдык огу 5–320 µM деп көрсөтүлгөн. IC₅₀ жана SI эсептери сүрөттөрдөгү µM бирдигине көбүрөөк шайкеш көрүнөт; ошентсе да эмгек оңдолмоюнча, бул бирдик айырмасы ачык отчеттук көйгөй катары каралышы керек.

Убакыт боюнча жүргүзүлгөн тажрыйбалар THZ2 вирус клеткага киргенден кийинки эрте этапты бутага аларын көрсөткөн. THZ2 инфекция башталган учурда же инфекциядан эки саат өткөндөн кийин кошулганда вирустук NP топтолушун күчтүү басаңдаткан. Төртүнчү саатта же андан кийин кошулганда ошол эле айкын таасир байкалган эмес.

Бул жыйынтык CDK7ге көз каранды маанилүү терезе болжол менен:

\[ 2\ \mathrm{saat} < \mathrm{kritik\ basamak} < 4\ \mathrm{saat} \]

аралыгында жайгашарын болжолдойт.

Конфокалдык микроскопия тажрыйбалары вирустун жабышуу, клеткага кирүү жана мембрана менен биригүү этаптары CDK7 басаңдатуусунан таасирленбегенин көрсөткөн. Контролдук клеткаларда вирустук NP сигналы 4., 6. жана 8. сааттарда ядродо топтолсо, THZ2 берилген же CDK7си басаңдатылган клеткаларда NP негизинен цитоплазмада калган.

CDK7 менен вирустук NPнин ортосунда түз физикалык байланыш бар-жогу изилденген; ко-иммунопреципитация тажрыйбасында CDK7 NP менен кошо чөкпөгөнү кабарланган. Ошондуктан изилдөөчүлөр CDK7 vRNP ташылышына NPге түз байланып эмес, клеткалык ташуу системасын жөнгө салуу аркылуу таасир этет деп сунушташкан.

THZ2 жана CDK7 siRNA колдонулганда importin-α1, importin-α3, importin-α5 жана importin-α7 белоктору азайган, ал эми importin-β1 деңгээли олуттуу өзгөргөн эмес. Бул тандалма көрүнүш vRNPнин ядроого ташылышы эмне үчүн бузуларын түшүндүргөн негизги эксперименттик байланыш болуп саналат.

Изилдөөнүн кошумча маалыматтары CDK7 басаңдатуу РНК полимераза IIнин фосфорланышын жана influenza M2 генине тиешелүү mRNA, cRNA жана vRNA деңгээлдерин да азайтканын көрсөткөн. Ошондуктан CDK7 вирустун көбөйүшүн өз ара байланышкан эки функция аркылуу колдойт деп эсептелет:

1. Importin-α деңгээлин сактоо аркылуу vRNPлердин ядроого киришин жеңилдетүү
2. РНК полимераза II активдүүлүгүн колдоо аркылуу вирустук mRNA транскрипциясы үчүн зарыл болгон кожоюн-клетканын транскрипциялык чөйрөсүн сактоо

THZ2 андан кийин өлүмгө алып келүүчү PR8 инфекциясы түзүлгөн ургаачы BALB/c чычкандарында текшерилген. Дарылоо инфекциядан төрт саат өткөндөн кийин башталып, төрт күн бою күнүнө эки жолу жүргүзүлгөн.

Он төртүнчү күндөгү жашап калуу жыйынтыктары:

Жогорку дозадагы THZ2 ташуучу топко салыштырмалуу жашап калууну пайыз 20дан пайыз 70ке көтөргөн. Бул абсолюттук 50 пайыздык пунктка өсүү. Oseltamivir болсо колдонулган моделде пайыз 100 жашап калууну камсыздаган.

THZ2нин 20 mg/kg/күн дозасы өпкөдөгү вирустук жүктү үчүнчү күнү 3,3 log₁₀, бешинчи күнү 2,6 log₁₀ азайткан. Бул логарифмдик айырмалар түшүндүрүү үчүн болжол менен:

• Үчүнчү күн: болжол менен 1.995 эсе азайуу
• Бешинчи күн: болжол менен 398 эсе азайуу

дегенди билдирет.

Өпкө гистологиясында ташуучу берилген инфекцияланган чычкандарда сезгенүүчү клеткалардын инфильтрациясы, альвеола дубалдарынын калыңдашы жана экссудат байкалса, THZ2 берилген чычкандарда бул көрүнүштөр жеңилирээк болгону кабарланган.

Ошентсе да бул жыйынтыктар THZ2 адамдарда гриппти дарылоочу каражат экенин көрсөтпөйт. THZ2 клетка маданиятында жана чычкан моделинде гана бааланган. Адамдар үчүн ылайыктуу доза, берүү жолу, дарылоону баштоо убактысы, фармакокинетика, узак мөөнөттүү коопсуздук жана клиникалык натыйжалуулук белгисиз.

Изилдөөнүн негизги көйгөйү эмнеде?

Учурдагы influenza антивирустарынын олуттуу бөлүгү түздөн-түз вирустун өз белокторун бутага алат. Oseltamivir нейраминидазаны, baloxavir болсо вирустук полимеразанын cap-көз каранды эндонуклеаза активдүүлүгүн бутага алган дары-дармектерге мисал болот.

Вирустук белоктор мутацияга учурай алгандыктан, антивирустук каражаттарды узак мөөнөттүү же кеңири колдонгондо дарыга азыраак сезгич вирустар тандалып калышы мүмкүн. Каралып жаткан изилдөө бул көйгөйгө башка тараптан мамиле кылат: вирустун өзүн эмес, вирус көбөйүү үчүн колдонгон кожоюн-клетканын белогун бутага алуу.

Бул ыкманын болжолдуу артыкчылыгы — клеткалык гендер вирустук геномго салыштырмалуу жайыраак өзгөрөт. Бирок клеткалык буталар нормалдуу адам физиологиясында да кызмат кылгандыктан, коопсуздук жагынан маанилүү тобокелдик бар. CDK7 клетка цикли жана РНК полимераза II аркылуу жүргөн транскрипция үчүн маанилүү болгондуктан, антивирустук таасир менен кожоюн уулуулугунун ортосундагы тең салмак өзгөчө кылдат бааланышы керек.

Influenza A вирусу эмне үчүн клетка ядросуна кириши керек?

Influenza A вирусунун терс маанилүү, сегменттелген РНК геному бар. Вирустук РНК сегменттери NP белогу жана вирустук полимеразанын суббирдиктери менен бирге vRNP комплекстерин түзөт.

Вирус клеткага киргенден кийинки негизги агым төмөнкүдөй:

1. Вирус клетканын бетине жабышат.
2. Эндоцитоз аркылуу клеткага кирет.
3. Эндосоманын ичинде кычкылдануу жүрөт.
4. Вирустук мембрана эндосома мембранасы менен биригет.
5. vRNP комплекстери цитоплазмага бошотулат.
6. vRNPлер ядролук тешикчелер аркылуу ядроого ташылат.
7. Вирустук РНК транскрипциясы жана геномдун көбөйүшү ядродо жүрөт.

Изилдөө бутага алган маанилүү өтүү бешинчи жана алтынчы этаптын ортосунда. Вирус клеткага кирип, эндосомадан чыга алат, бирок vRNPлер ядроого натыйжалуу жете албайт.

vRNP деген эмне?

vRNP — англис тилиндеги viral ribonucleoprotein complex деген сөз айкашынын кыскартылышы. Ар бир influenza РНК сегменти:

• вирустук РНК,
• көп сандагы NP молекулалары,
• PB1, PB2 жана PA суббирдиктеринен турган вирустук полимераза

менен бирге таңгакталат.

vRNP генетикалык материалдын жөн гана таңгакталган формасы эмес. Ал вирустук РНКны коргоо, окуу, көчүрүү жана жаңы вирустарга өткөрүү үчүн иштеген молекулалык машина.

Importin-α/β системасы кандай иштейт?

Клетка ядросу кош катмарлуу мембрана менен курчалган. Кичине молекулалар белгилүү деңгээлде пассивдүү өтө алганы менен, vRNP сыяктуу чоң комплекстердин ядроого кириши үчүн активдүү ташуу керек.

Классикалык ядролук ташуу системасын жөнөкөйлөштүрүп төмөнкүдөй көрсөтүүгө болот:

\[ \mathrm{Kargo\!-\!NLS} + \mathrm{Importin\!-\alpha} + \mathrm{Importin\!-\beta} \rightarrow \mathrm{Çekirdek\ gözenek\ kompleksi} \rightarrow \mathrm{Çekirdek} \]

Бул жерде:

• NLS — ядролук локализация сигналы.
• Importin-α — жүктөгү NLSти тааныган адаптер.
• Importin-β — комплекстин ядролук тешикче системасы менен өз ара аракеттенишине ортомчулук кылат.

Influenza NP белогундагы NLS аймактарын importin-α тааныйт. Importin-α көлөмү азайганда vRNPлердин ядроого кирүү мүмкүнчүлүгү төмөндөшү мүмкүн.

CDK7 кадимки шартта эмне кылат?

CDK7 циклинге көз каранды киназалар үй-бүлөсүнүн мүчөсү. Клеткада анын эки негизги функциясы бар:

• Клетка циклин жөнгө салган башка CDKлардын активдешишине салым кошуу
• TFIIH комплексинин бир бөлүгү катары РНК полимераза IIнин C-терминалдык аймагын фосфорлоо

РНК полимераза IIнин фосфорланышы ген транскрипциясын баштоо жана улантуу үчүн маанилүү. Influenza вирусу вирустук mRNA өндүргөндө клетканын РНК полимераза II системасын пайдаланат.

Изилдөө CDK7 жалпы транскрипция аркылуу гана эмес, importin-α белокторунун деңгээлин сактоо менен вирустук геномдун ядроого ташылышын да колдойт деп сунуштайт.

Генетикалык басаңдатуу тажрыйбасы кандай жүргүзүлгөн?

Адамдын A549 өпкө эпителий клеткалары CDK7 mRNAсын бутага алган кичине интерференциялык РНКлар менен трансфекцияланган. Башында үч өзүнчө siRNA бааланган, алардын ичинен эң күчтүү басаңдатууну көрсөткөн si-CDK7-1 кийинки тажрыйбаларда колдонулган.

Негизги колдонуу:

• siRNA концентрациясы: 50 nM
• Lipofectamine 3000: 5 µL
• Контрол: бутага багытталбаган si-NC

1-сүрөттө si-CDK7 колдонуу клетканын жашоого жөндөмдүүлүгүн олуттуу азайтпастан CDK7 mRNA жана белок деңгээлин төмөндөткөн.

Эмне үчүн бир нече вирус штаммы колдонулган?

CDK7нин таасири лабораторияда көптөн бери колдонулуп келген PR8 вирусуна гана тиешелүү же жок экенин текшерүү үчүн төрт influenza A вирусу колдонулган:

• A/Puerto Rico/8/1934 — PR8, H1N1
• A/Human/Hubei/1/2009 — пандемиялык H1N1
• Oseltamivirге туруктуу PR8 туундусу — H1N1-Ost-R
• A/Human/Hubei/3/2005 — H3N2

Вирустар төмөн инфекция көптүгүндө:

\[ \mathrm{MOI} = 0{,}05 \]

колдонулган.

MOI бир клеткага туура келген орточо жугуштуу вирус көлөмүн билдирет. MOI 0,05 — башында ар бир клетка вирус менен жолукпаган төмөн интенсивдүү инфекция режими. Бул түзүлүш вирустун бир нече көбөйүү цикли ичинде жайылышын баалоого мүмкүндүк берет.

1-сүрөт эмнени көрсөтөт?

1-сүрөт CDK7 басаңдатуунун ар түрдүү influenza штаммдарына тийгизген натыйжаларын бириктирип көрсөтөт:

• Клеткалардын жашоого жөндөмдүүлүгү сакталган.
• CDK7 mRNA жана белок деңгээли азайган.
• Вирустук NP белок тилкелери алсыраган.
• M2 mRNA деңгээлдери төмөндөгөн.
• Жугуштуу вирус титрлери төрт штаммдын баарында азайган.

Oseltamivirге туруктуу H1N1 штаммында да 2,17 log₁₀ титр азайышы байкалганы бутанын oseltamivir байланыша турган вирустук нейраминидазадан көз каранды эмес экенин колдойт.

Бирок oseltamivirге туруктуу вирус клетка маданиятында гана бааланган. THZ2 oseltamivirге туруктуу influenza инфекциясын жаныбарларда же адамдарда дарылары көрсөтүлгөн эмес.

Генди басаңдатуу тажрыйбасынын механисттик чеги

Башында үч siRNA бааланганы менен, кийинки тажрыйбаларда негизинен бир siRNA колдонулган. Бир siRNAнын бутадан тышкаркы таасирлерин толук четтетүүгө болбойт.

Изилдөөдө siRNAга туруктуу CDK7 генин кайра киргизип, антивирустук фенотиптин калыбына келишин текшерген куткаруу тажрыйбасы жок. Мындай тажрыйба байкалган натыйжа түздөн-түз CDK7 жоголушуна байланыштуу экенин күчтүүрөөк тастыктамак.

Үч CDK7 ингибиторун салыштыруу

Изилдөөчүлөр генетикалык жыйынтыкты фармакологиялык жол менен ырастоо үчүн үч кошулманы колдонушкан:

Үч кошулма тең A549 жана MDCK клеткаларында вирустук титрди жана NP белогун дозага көз каранды түрдө азайткан. Химиялык түзүлүшү ар башка үч ингибитор окшош натыйжа бергени CDK7 бутасынын маанилүүлүгүн колдойт.

Ошол эле учурда ингибиторлордун бутадан тышкаркы киназалык таасирлери кеңири изилденген эмес. Фармакологиялык жыйынтыктардын генетикалык басаңдатуу менен шайкеш келиши ишенимди күчөтөт, бирок толук бута-спецификалуулукту далилдебейт.

2-сүрөттүн көрсөткөн жыйынтыгы

2-сүрөттө:

• THZ2, Mevociclib жана LDC4297нин химиялык түзүлүштөрү,
• A549 жана MDCK клеткаларындагы доза–жашоого жөндөмдүүлүк графиктери,
• вирустук титр тилкелери,
• NP жана GAPDH Western blotтору

берилген.

THZ2 төмөн микромолярдык-асты концентрацияларда олуттуу антивирустук таасир көрсөткөн. Mevociclib жана LDC4297 жогорку дозаларда клетканын жашоого жөндөмдүүлүгүн көбүрөөк азайткан.

Сүрөттүн айрым аталыштарында THZ2 ордуна “TH2” деп жазылган. Мындан тышкары цитоуулуулук окторундагы µM бирдиги менен жыйынтык текстиндеги nM көрсөткүчтөрү шайкеш эмес. Бул отчеттук айырмачылык терапиялык терезени так чечмелөөнү кыйындатат.

Убакытка жараша кошуу тажрыйбасы эмне үчүн маанилүү?

Антивирустук кошулма кайсы этапта иштей турганын түшүнүү үчүн дарыны инфекциянын ар башка мезгилдеринде кошуу керек.

Изилдөөдө THZ2 төмөнкү убакыт режими менен берилген:

• Инфекцияга чейин
• Вирус менен бир убакта
• Инфекциядан кийинки биринчи сааттын ичинде
• Инфекциядан кийин үзгүлтүксүз

Бул колдонмолордун баарында 24. саатта вирус өндүрүшү азайган. Көбүрөөк деталдаштырылган тажрыйбада THZ2:

• 0. саатта берилгенде натыйжалуу,
• 2. саатта берилгенде натыйжалуу,
• 4. саатта же андан кийин берилгенде байкаларлык деңгээлде натыйжасыз

болгон.

Бул CDK7 вирустук жашоо циклинде эрте, бирок жабышуу жана кирүүдөн кийинки окуя үчүн зарыл экенин болжолдоого негиз берген.

3-сүрөт эмнени көрсөтөт?

3-сүрөттүн жогорку панелдери ар башка дарылоо убакыттарын жана 24. сааттагы вирус титрлерин көрсөтөт. Төмөнкү Western blot панелдери THZ2 же si-CDK7 берилгенден кийин NP белогунун убакыт ичинде өзгөрүшүн берет.

Экинчи саатта NP деңгээли THZ2 же CDK7 басаңдатуудан олуттуу таасирленген эмес. Төртүнчү сааттан тартып NP топтолушу азая баштаган; алтынчы жана сегизинчи сааттарда айырма күчөгөн.

Бул көрүнүш вирустун алгачкы кирүү процесси бүтүшү мүмкүн экенин, бирок жаңы вирустук РНК жана белок өндүрүшү башталышы үчүн керек болгон ядролук этап бузуларын колдойт.

Вирустун клеткага жабышуусу таасирленеби?

Жабышуу тажрыйбасында клеткалар 4 °Cге чейин муздатылган. Төмөн температура вирустун клеткага киришин жайлатат, бирок анын беттик рецепторлорго жабышуусуна мүмкүндүк берет.

THZ2 же si-CDK7 берилген клеткалардын бетинде контролдук клеткалардагыдай NP сигналы байкалган. Ошондуктан CDK7 басаңдатуу вирустун клетканын бетине кармалышын бөгөттөбөйт деген жыйынтык чыгарылган.

Вирустун клеткага кириши таасирленеби?

Жабышкан вирустар 37 °Cде эки саат кармалып, клеткага кириши бааланган. THZ2 же CDK7 басаңдатуу NP сигналынын клеткага өтүшүн олуттуу азайткан эмес.

Эндосомалык биригүү таасирленеби?

Вирустук мембрана менен эндосома мембранасынын биригүүсү R18 жана DiO деп аталган флуоресценттик белгилегичтер колдонулган эки түстүү тажрыйба менен изилденген.

Биригүүнү бөгөттөөчү катары колдонулган Bafilomycin A1 биригүү сигналын олуттуу азайткан. THZ2 жана si-CDK7 топторунда болсо контролдук топко окшош биригүү белгилери байкалган.

Ошентип, изилдөөнүн маалыматтарына ылайык CDK7:

• жабышуу үчүн зарыл эмес,
• эндосомалык кирүү үчүн зарыл эмес,
• мембраналык биригүү үчүн зарыл эмес.

Негизги бөгөт: vRNPнин ядроого кириши

Вирустук NPнин клетка ичиндеги жайгашуусу 4., 6. жана 8. сааттарда конфокалдык микроскоп менен байкалган.

Контролдук шартта NP сигналы көк DAPI сигналы менен белгиленген ядролордун ичине жайгашкан. THZ2 же si-CDK7 колдонулганда NP сигналы ядронун айланасында жана цитоплазмада калган.

Бул жыйынтык CDK7 басаңдатылганда vRNP комплекси клеткага кире аларын, бирок ядролук тешикче системасынан натыйжалуу өтө албай турганын көрсөтөт.

4-сүрөттүн визуалдык билдирүүсү

4-сүрөттүн биринчи бөлүгүндө жабышуу, кирүү жана биригүү сүрөттөрү салыштырылат. Бул панелдерде THZ2 жана si-CDK7 топтору контролго негизинен окшош.

Кийинки беттеги ядролук ташуу панелдеринде болсо ачык айырма пайда болот:

• Контролдук клеткаларда жашыл NP сигналы ядролор менен дал келет.
• THZ2 тобунда NP көбүнчө ядродон тышкары калат.
• si-CDK7 тобунда окшош цитоплазмалык топтолуу байкалат.
• Айырма 4., 6. жана 8. сааттарда сакталат.

Сүрөттөр сапаттык жактан күчтүү визуалдык айырманы көрсөтөт, бирок негизги фигурада ядро/цитоплазма флуоресценция катышынын кеңири сандык бөлүштүрүлүшү берилген эмес.

CDK7 вирустук NPге түз байланыша алабы?

Ко-иммунопреципитация тажрыйбасында NP антителосу менен тартылган белоктордун арасында CDK7 көрсөтүлгөн эмес. Изилдөөчүлөр муну түз CDK7–NP өз ара аракеттенүүсү жок деп чечмелешкен.

Терс ко-иммунопреципитация натыйжасы күчтүү же туруктуу байланыш жоктугун колдойт. Бирок өтө кыска мөөнөттүү, алсыз же эксперименттик шартта бузулуучу өз ара аракеттенүүлөрдү толук четтетпейт.

Importin-α белокторунун азайышы

THZ2 дозасы жогорулаган сайын төмөнкү белок тилкелери алсыраган:

• Importin-α1
• Importin-α3
• Importin-α5
• Importin-α7

Importin-β1 тилкеси болсо негизинен өзгөргөн эмес. Ушундай эле тандалма көрүнүш CDK7 siRNA колдонулганда да байкалган.

Бул жыйынтык бардык ядролук ташуу белоктору жоголуп кетпегенин; изилдөөнүн чегинде өзгөчө importin-α изоформалары CDK7ге сезгич экенин болжолдойт.

5-сүрөт көрсөткөн механизм

5-сүрөт төмөнкү эксперименттик чынжырды көрсөтөт:

1. CDK7 NP менен кошо чөккөн эмес.
2. THZ2 дозага көз каранды түрдө CDK7 жана importin-α белокторун азайткан.
3. Importin-β1 негизинен сакталган.
4. CDK7 басаңдатуу ошол эле importin-α жоголушун кайра жараткан.
5. Importin-α азайышы вирустук NP азайышы менен коштолгон.

Бирок importin-α белокторунун сандык интенсивдүүлүк анализи негизги сүрөттө берилген эмес. Жыйынтыктар негизинен Western blot тилкелерин салыштырууга таянат.

Механизм толук далилденгенби?

Изилдөө CDK7 басаңдатуу, importin-α азайышы, vRNPнин ядроого киришинин бузулушу жана вирус өндүрүшүнүн төмөндөшүнүн ортосунда ырааттуу байланыш көрсөтөт.

Бирок механисттик чынжырды толук жаба турган төмөнкү тажрыйбалар жүргүзүлгөн эмес:

• CDK7 басаңдатылган клеткаларга importin-αны кайра киргизүү
• Importin-α калыбына келтирүү vRNPнин ядроого киришин калыбына келтиреби-жокпу текшерүү
• CDK7 importin-α гендеринин транскрипциясын түз жөнгө саларын көрсөтүү
• Importin-α mRNA деңгээлдерин системалуу өлчөө
• Importin-α белогунун бузулуу ылдамдыгын өлчөө

Ошондуктан изилдөө күчтүү механисттик байланышты сунуштайт, бирок CDK7–importin-α–vRNP чынжырынын бардык баскычтарында түз себептик ырастоону бербейт.

РНК полимераза II жана вирустук транскрипция

CDK7 TFIIH комплексинин ичинде РНК полимераза IIнин C-терминалдык домениндеги серин калдыктарынын фосфорланышына салым кошот.

Изилдөөнүн логикасын түшүндүрүү үчүн байланышты төмөнкүдөй жыйынтыктоого болот:

\[ \mathrm{CDK7} \rightarrow \mathrm{RNA\ Pol\ II\ CTD\ fosforilasyonu} \rightarrow \mathrm{konak\ mRNA\ transkripsiyonu} \]

Influenza вирусу вирустук mRNAларга баштапкы калпакча берүү үчүн клеткалык РНК полимераза II транскрипттеринен кыска калпакчалуу бөлүктөрдү алат. Бул процесс cap-snatching деп аталат.

Кошумча 3-сүрөттө THZ2 же si-CDK7 колдонуу РНК полимераза IIнин фосфорланышын азайткан; вирустук M2 mRNA, cRNA жана vRNA деңгээлдери да төмөндөгөн.

РНК полимераза II түздөн-түз вирустук mRNA транскрипциясы менен байланыштуу. cRNA жана vRNAдагы азайуу болсо vRNPнин ядроого киришинин, вирустук белок синтезинин жана жалпы вирустук көбөйүү циклинин бузулушунун кеңири натыйжасы болушу мүмкүн.

Чычкан тажрыйбасынын түзүлүшү

Алты–сегиз жумалык ургаачы BALB/c чычкандары колдонулган. Чычкандар мурун жолу менен чычканга адаптацияланган PR8 вирусунун:

\[ 2 \times \mathrm{LD}_{50} \]

дозасы менен инфекцияланган.

LD₅₀ — дарыланбаган жаныбарлардын пайыз 50синде өлүм жаратышы күтүлгөн доза. Эки LD₅₀ оор жана өлүмгө алып келүүчү инфекция түзүү үчүн колдонулган эксперименттик сыноо дозасы.

Дарылоо инфекциядан төрт саат өткөндөн кийин башталып, төрт күнгө созулган:

• THZ2: 10 же 20 mg/kg/күн
• Oseltamivir: 20 mg/kg/күн
• Ташуучу контролу

Жашап калуу жана дене салмагы 14 күн көзөмөлдөнгөн. Өпкөдөгү вирустук титрлер үчүнчү жана бешинчи күндөрү, ал эми өпкө гистологиясы изилдөөнүн жыйынтык жана сүрөт бөлүмдөрүнө ылайык бешинчи күнү бааланган.

THZ2 уулуулук боюнча алдын ала тажрыйбасы

Инфекцияланбаган чычкандарга төрт күн бою:

• 20 mg/kg/күн
• 40 mg/kg/күн
• 80 mg/kg/күн

THZ2 берилген. Жети күндүк байкоодо өлүм же олуттуу дене салмагы жоготуусу байкалган эмес.

Бул жыйынтык кыска мөөнөттө айкын уулуулук болбогонун көрсөтөт. Бирок баалоо негизинен:

• жашап калуу,
• дене салмагы,
• бүкүрөйгөн туруш,
• жүндүн үрпөйүшү сыяктуу көрүнөө белгилерге

таянган.

Кан биохимиясы, гематология, органдардын гистологиясы, иммундук басаңдатуу, репродуктивдик уулуулук же узак мөөнөттүү коопсуздук бааланган эмес.

Берүү жолу боюнча шайкешсиздик

Метод бөлүмүндө токсикологиялык тажрыйба үчүн THZ2 интраперитонеалдык жол менен берилгени жазылган. Жыйынтык бөлүмүндө жана 6-сүрөттүн түшүндүрмөсүндө болсо ошол эле тажрыйба тери астына инъекция катары сүрөттөлгөн.

Дарылоо тажрыйбаларында жыйынтык жана сүрөт түшүндүрмөлөрү THZ2ни тери астына, oseltamivirди ооз аркылуу/интрагастралдык берүү катары көрсөтөт.

Бул айырма өзгөчө фармакокинетика жана кайталануучулук үчүн маанилүү. Интрапериitoneалдык жана тери астына берүү бирдей сиңүү профилин түзбөйт.

6-сүрөттөгү жашап калуу жыйынтыктары

Ташуучу берилген инфекцияланган чычкандарда үчүнчү күндөн тартып айкын салмак жоготуу башталып, 14. күнү жашап калуу пайыз 20га түшкөн.

THZ2 дозага көз каранды коргоо көрсөткөн:

• 10 mg/kg/күн: %40 жашап калуу
• 20 mg/kg/күн: %70 жашап калуу

Oseltamivir тобу пайыз 100 жашап калууну көрсөткөн. Ошондуктан колдонулган эксперименттик шарттарда THZ2 күчтүү, бирок oseltamivirге караганда төмөн жашап калуу натыйжасын берген.

Өпкөдөгү вирустук жүк

Жогорку дозадагы THZ2 үчүнчү жана бешинчи күндөрү өпкөдөгү вирустук титрди азайткан:

Oseltamivir тобунда бешинчи күнү вирус өлчөө чегинен төмөн көрсөтүлгөнү көрүнөт. THZ2 вирустук жүктү күчтүү азайтса да, oseltamivirдин таасири жогоруураак көрүнөт.

Өпкө гистологиясы

Ташуучу берилген PR8 тобунда:

• интенсивдүү сезгенүүчү клеткалардын инфильтрациясы,
• альвеола дубалдарынын калыңдашы,
• альвеола боштуктарындагы экссудат,
• нормалдуу өпкө архитектурасынын бузулушу

байкалган.

THZ2 берилген топтордо, өзгөчө 20 mg/kg/күн дозасында, сезгенүү жана түзүлүштүк зыян азыраак экени кабарланган.

Гистология сүрөттөрү сапаттык айырманы көрсөтөт; негизги сүрөттө сокур патологиялык балл же кеңири сандык өпкө зыян индекси берилген эмес.

Жаныбар тажрыйбасындагы убакыт эмне үчүн маанилүү?

Дарылоо инфекциядан болгону төрт саат өткөндөн кийин башталган. Бул вирус али эрте көбөйүү баскычында турган эксперименттик убакыт.

Адамдарда гриппти дарылоо көп учурда инфекциядан сааттар же күндөр өткөндөн кийин, белгилер башталгандан соң башталат. Клетка тажрыйбасында THZ2нин төртүнчү сааттан кийин айкын натыйжалуулугун жоготушу реалдуу клиникалык колдонуу терезеси тар болушу мүмкүн экенин болжолдойт.

Чычкандарда төрт сааттан кийин башталган дарылоо натыйжалуу болгону, белгилер чыккандан кийин кечигип башталган дарылоо да натыйжалуу болот дегенди далилдебейт.

7-сүрөттөгү жалпы механизм

Изилдөөнүн акыркы схемасы бири-бири менен байланышкан эки CDK7 функциясын бирге көрсөтөт:

1. Ядролук ташуу: CDK7 importin-α деңгээлин сактайт; importin-α/β комплекси vRNPлерди ядроого ташыйт.
2. Транскрипция: CDK7 РНК полимераза IIни фосфорлойт; вирустук mRNA өндүрүшүндө колдонулган клеткалык транскрипциялык чөйрөнү колдойт.

THZ2 берилгенде importin-α азаят, vRNPнин ядроого кириши бөгөттөлөт, РНК полимераза IIнин фосфорланышы төмөндөйт жана вирустук РНК синтези басаңдайт.

Изилдөөнүн күчтүү жактары

• Генетикалык жана фармакологиялык ырастоо бирге колдонулган: siRNA жана үч өзүнчө CDK7 ингибитору окшош антивирустук жыйынтык берген.
• Бир нече influenza A штаммы текшерилген: H1N1, пандемиялык H1N1, H3N2 жана oseltamivirге туруктуу H1N1 бааланган.
• Эки клетка линиясы колдонулган: Адамдын A549 жана иттин MDCK клеткалары изилденген.
• Инфекция цикли этаптарга бөлүнгөн: Жабышуу, кирүү, биригүү жана ядролук ташуу өзүнчө тажрыйбалар менен бааланган.
• Убакытка жараша дары кошуу тажрыйбасы жүргүзүлгөн: Маанилүү 2–4 сааттык терезе аныкталган.
• Конфокалдык микроскопия колдонулган: NPнин цитоплазма жана ядродогу бөлүштүрүлүшү визуалдык көрсөтүлгөн.
• Importin изоформалары өзүнчө изилденген: α1, α3, α5, α7 жана β1 салыштырылган.
• Түз CDK7–NP өз ара аракеттенүүсү изилденген: Ко-иммунопреципитация жүргүзүлгөн.
• РНК полимераза II байланышы бааланган: Кошумча тажрыйбаларда Pol II фосфорланышы жана вирустук РНК түрлөрү өлчөнгөн.
• Тирүү жаныбар модели колдонулган: Жашап калуу, дене салмагы, өпкөдөгү вирустук жүк жана гистология бааланган.
• Oseltamivir менен салыштыруу жүргүзүлгөн: THZ2 жыйынтыктары учурдагы антивирустук контрол менен бирге көрсөтүлгөн.

Изилдөөнүн чектөөлөрү

• Рецензиядан өтө элек: Изилдөө SSRN preprint болуп саналат.
• Клиникалык изилдөө эмес: Адамдарга THZ2 берилген эмес.
• Бейтаптан алынган үлгү жок: Биринчилик адамдын дем алуу жолдорунун клеткалары, өпкө органоиддери же бейтаптан алынган вирус изоляттары колдонулган эмес.
• In vivo шартта PR8 гана текшерилген: Oseltamivirге туруктуу штаммдын чычкандардагы жообу бааланган эмес.
• Ургаачы BALB/c чычкандары гана колдонулган: Жыныс жана генетикалык фон айырмачылыктары изилденген эмес.
• Дарылоо өтө эрте башталган: Инфекциядан төрт саат өткөндөгү баштоо клиникалык кечигүүнү чагылдырбашы мүмкүн.
• Берүү формасы клиникалык жактан чектелүү: THZ2 тери астына инъекция аркылуу берилген; ооз аркылуу же ингаляциялык колдонуу изилденген эмес.
• Узак мөөнөттүү коопсуздук жок: Уулуулукту баалоо төрт күндүк колдонуу жана жети күндүк байкоо менен чектелген.
• Уулуулук өлчөөлөрү чектелүү: Кан, орган функциясы жана кеңири гистопатология кабарланган эмес.
• CDK7 негизги кожоюн белогу: Узак мөөнөттүү же системалык ингибирлөөнүн нормалдуу транскрипция жана клетка циклине таасири жетиштүү бааланган эмес.
• Фармакокинетикалык маалымат жок: THZ2нин кандагы жана өпкөдөгү концентрациясы, жарым ажыроо мөөнөтү жана ткандарга таралышы өлчөнгөн эмес.
• Доза–жооп маалыматы чектелүү: Чычкан натыйжалуулук тажрыйбасында THZ2нин эки гана дозасы колдонулган.
• Кечигип башталган дарылоо тажрыйбасы жок: 12, 24 же 48 сааттан кийин башталган дарылоо бааланган эмес.
• Айкалышкан дарылоо жок: THZ2 менен oseltamivir же башка антивирустардын бирге таасири изилденген эмес.
• Туруктуулуктун өнүгүшү эксперименттик өлчөнгөн эмес: Кожоюнду бутага алуу туруктуулук коркунучун азайтат деп сунушталган, бирок сериялык пассаж тажрыйбасы жүргүзүлгөн эмес.
• Негизинен бир siRNA колдонулган: Бутадан тышкаркы таасирлер жана генетикалык куткаруу толук бааланган эмес.
• Importin-α куткаруу тажрыйбасы жок: Importin-α кайра берилгенде vRNP ташылышы калыбына келери көрсөтүлгөн эмес.
• Importin-α жөнгө салуу механизми белгисиз: CDK7 importin гендеринин транскрипциясына же белок туруктуулугуна таасир этери аныкталган эмес.
• Western blot сандык талдоосу чектелүү: Негизги importin фигурасында кеңири интенсивдүүлүк графиктери берилген эмес.
• Конфокалдык жыйынтыктар негизинен сапаттык: Ядро/цитоплазма NP катыштары кеңири кабарланган эмес.
• Клетка тажрыйбаларындагы так биологиялык кайталоо саны чектелүү берилген: Тажрыйбалар кеминде үч жолу кайталанганы жазылган.
• THZ2 бирдик шайкешсиздиги бар: Текст nM, сүрөт µM колдонот.
• Берүү жолу карама-каршы: Токсикологиялык тажрыйбада интраперитонеалдык жана тери астына берүү деген эки башка маалымат бар.
• Өпкө гистологиясы күнү карама-каршы: Метод бөлүмүндө жетинчи күн, жыйынтык жана сүрөт түшүндүрмөсүндө бешинчи күн деп жазылган.
• Этикалык уруксат номерлери ар башка: Методдо 20230601-0010, этика бөлүмүндө 20230606-0013 берилген.
• Чычкан натыйжалуулук топторунун баштапкы үлгү көлөмү так эмес: Жаныбарлардын саны жашап калуу сүрөтүнүн түшүндүрмөсүндө деталдуу көрсөтүлгөн эмес.
• Oseltamivir THZ2ге караганда жогору жашап калууну камсыздаган: Колдонулган моделде oseltamivir %100, жогорку дозадагы THZ2 %70 жашап калууну көрсөткөн.

Изилдөө эмнени айтат?

• CDK7 текшерилген клетка маданияты шарттарында influenza A вирусунун көбөйүшү үчүн маанилүү кожоюн фактору.
• CDK7 басаңдатуу төрт башка IAV штаммынын титрин азайткан.
• Oseltamivirге туруктуу H1N1 штаммы да CDK7 басаңдатууга сезгич болгон.
• Үч башка CDK7 ингибитору PR8 көбөйүшүн дозага көз каранды түрдө азайткан.
• THZ2нин таасири вирус клеткага жабышкандан кийин, болжол менен 2–4 сааттык эрте мезгилде пайда болгон.
• CDK7 басаңдатуу вирустун жабышуусун, клеткага киришин же эндосомалык биригүүсүн олуттуу бөгөттөгөн эмес.
• CDK7 басаңдатуу vRNPлердин ядроого киришин азайткан.
• THZ2 жана si-CDK7 importin-α1, α3, α5 жана α7 белокторун азайткан.
• Importin-β1 деңгээли негизинен сакталган.
• CDK7 менен вирустук NPнин ортосунда туруктуу түз өз ара аракеттенүү көрсөтүлгөн эмес.
• CDK7 басаңдатуу РНК полимераза II фосфорланышын жана вирустук РНК синтезин азайткан.
• THZ2 чычкандарда PR8ден улам өлүмдү, өпкөдөгү вирустук жүктү жана өпкө патологиясын азайткан.

Изилдөө эмнени айтпайт?

• THZ2 адамдарда гриппти дарылай турганын көрсөтпөйт.
• THZ2 клиникалык жактан бекитилген influenza дарысы экенин көрсөтпөйт.
• Адамдар үчүн натыйжалуу же коопсуз доза аныктабайт.
• THZ2 белгилер башталгандан бир нече күн өткөндөн кийин натыйжалуу экенин көрсөтпөйт.
• THZ2ни ооз аркылуу же ингаляция жолу менен колдонууга болорун көрсөтпөйт.
• Кожоюнду бутага алган дарылоодо туруктуулук эч качан өнүкпөйт деп так далилдебейт.
• CDK7 ингибирлөө узак мөөнөттүү колдонууда коопсуз экенин көрсөтпөйт.
• Importin-α азайышы антивирустук таасирдин жалгыз себеби экенин далилдебейт.
• CDK7 importin-α гендерин түз фосфорлоо же транскрипция жолу менен жөнгө саларын көрсөтпөйт.
• THZ2 бардык influenza A штаммдарына, influenza Bге же куш influenza вирустарына натыйжалуу экенин көрсөтпөйт.
• Oseltamivirге туруктуу инфекцияны жаныбарларда дарылары көрсөтүлгөн эмес.
• THZ2 oseltamivirден артык экенин көрсөтпөйт.
• Бейтаптар өз алдынча колдоно турган дарылоо же алдын алуу ыкмасын сунуштабайт.

Өткөн учур жагынан мааниси

Influenza изилдөөлөрү узак убакыт бою вирустук нейраминидаза, M2 ион каналы жана вирустук полимераза сыяктуу түз вируска таандык буталарга багытталган. Бул ыкма натыйжалуу дарыларды жаратса да, вирустук мутациялар дарыга сезгичтикти өзгөртүшү мүмкүн.

Кожоюн-клетка факторлоруна багытталган изилдөөлөр вирустун өзгөрбөгөн же жайыраак өзгөргөн клеткалык көз карандылыктарын табууну көздөйт. CDK1, CDK4, CDK8/19 жана CDK9 сыяктуу ар башка циклинге көз каранды киназалар influenza көбөйүшү менен байланыштуу экенин көрсөткөн иштерден кийин бул изилдөө CDK7ни да ошол алкакка кошот.

Бүгүнкү күн үчүн мааниси

Изилдөөнүн негизги илимий салымы — CDK7ни жалпы транскрипциялык фермент катары гана эмес, vRNPнин ядроого ташылышын колдогон жөнгө салгыч катары сүрөттөшү.

Сунушталган CDK7–importin-α байланышы вирустук жашоо циклинде дары менен кийлигишүүгө мүмкүн болгон жаңы кожоюн-клетка түйүнүн көрсөтөт. Өзгөчө oseltamivirге туруктуу вирустун клетка маданиятында басаңдашы вирустук нейраминидазадан көз каранды эмес механизм колдонуларын көрсөтөт.

Келечек үчүн мааниси

Жыйынтыктарды клиникалык өнүктүрүүгө өткөрүү үчүн төмөнкү иштер керек:

• CDK7 importin-α гендерин кандай жөнгө саларын аныктоо
• Importin-α куткаруу тажрыйбалары
• siRNAга туруктуу CDK7 менен генетикалык куткаруу
• Адамдын биринчилик дем алуу жолдорунун клеткалары жана өпкө органоиддери
• Бейтаптан алынган influenza вирус изоляттары
• Oseltamivir жана baloxavirге туруктуу штаммдардын жаныбар тажрыйбалары
• Influenza B жана ар башка жаныбар тектүү influenza штаммдары
• THZ2 үчүн өпкө ткандарындагы концентрация жана фармакокинетикалык изилдөөлөр
• Ооз аркылуу жана ингаляциялык формулалар
• Кечигип башталган дарылоо тажрыйбалары
• Oseltamivir же baloxavir менен айкалыштыруу тажрыйбалары
• Сериялык пассаж аркылуу туруктуулуктун өнүгүшүн талдоо
• Узак мөөнөттүү гематологиялык, иммунологиялык жана органдык уулуулук
• CDK7ге көбүрөөк тандалма жана кыска мөөнөттүү таасир эткен туундуларды иштеп чыгуу
• Чоңураак жана адамдын дем алуу системасына жакыныраак жаныбар моделдери
• Жетиштүү преклиникалык коопсуздуктан кийин көзөмөлдөнгөн адам изилдөөлөрү

Күнүмдүк жашоо жана бейтап үчүн мааниси

Бул изилдөө учурдагы грипп дарылоосун өзгөртө турган клиникалык жыйынтык бербейт. THZ2 — изилдөөчү кошулма жана грипп менен ооругандар колдоно ала турган бекитилген дары эмес.

Изилдөөнүн күнүмдүк жашоо үчүн мүмкүн болгон узак мөөнөттүү мааниси — вирустук белоктордун ордуна вируска керек болгон клеткалык ташуу системаларын бутага алган жаңы дары класстарын иштеп чыгуу мүмкүнчүлүгү.

Мунун ишке ашышы үчүн антивирустук таасир менен нормалдуу клетка функцияларын сактоонун ортосунда өтө кылдат тең салмак керек. CDK7 нормалдуу ген транскрипциясы жана клетка цикли үчүн маанилүү болгондуктан, көзөмөлсүз же узак мөөнөттүү ингибирлөө коопсуз деп эсептелбейт.

Изилдөөнүн Ыкмасы жана Жыйынтыктары

Изилдөө дизайнынын техникалык кыскача мазмуну

Текшерилген influenza A вирустары

CDK7 басаңдатуунун вирустук титрге таасири

Логарифмдик вирустук титр кантип чечмеленет?

Вирустук титрлер log₁₀ масштабында берилгенде бир бирдик азайуу он эселик өзгөрүүнү билдирет:

\[ 1\ \log_{10}\ \mathrm{azalma} = 10\ \mathrm{kat\ azalma} \]

\[ 2\ \log_{10}\ \mathrm{azalma} = 100\ \mathrm{kat\ azalma} \]

\[ 3\ \log_{10}\ \mathrm{azalma} = 1000\ \mathrm{kat\ azalma} \]

Ошондуктан 2,36 log₁₀ төмөндөө жөн гана пайыз 2,36 азайуу эмес, болжол менен 229 эсе аз жугуштуу вирус өндүрүшүн билдирет.

Инфекция этаптарын техникалык салыштыруу

Importin жыйынтыктары

Чычкан тажрыйбасынын техникалык жыйынтыктары

Отчеттук шайкешсиздиктер

Статистикалык ыкма

• Тажрыйбалар кеминде үч жолу кайталанганы көрсөтүлгөн.
• Жыйынтыктар орточо ± стандарттык ката — SEM түрүндө берилген.
• Эки топту салыштырууда Student t тести колдонулган.
• Экиден көп топ үчүн бир багыттуу ANOVA колдонулган.
• Жашап калуу ийри сызыктары үчүн 6-сүрөт түшүндүрмөсүндө log-rank тести көрсөтүлгөн.
• Маанилүүлүк чеги p < 0,05 деп кабыл алынган.

Клетка тажрыйбаларынын айрым графиктеринде так биологиялык кайталоо саны көрсөтүлгөн эмес. Чычкандардын жашап калуу тажрыйбасындагы жалпы баштапкы жаныбар саны да негизги метод жана сүрөт түшүндүрмөлөрүндө так берилген эмес.

Техникалык жактан эң маанилүү жыйынтык

Изилдөөнүн эң маанилүү техникалык табылгасы — CDK7 influenza A вирусу клеткага киргенге чейин эмес, клеткага киргенден кийин vRNPлер ядроого ташылган маанилүү этапта зарыл экенинин көрсөтүлүшү.

Генетикалык басаңдатуу, үч башка фармакологиялык ингибитор, убакыт тажрыйбасы, конфокалдык микроскопия жана importin белок анализи бирдей жалпы моделди көрсөтөт:

\[ \mathrm{CDK7} \rightarrow \mathrm{Importin\!-\alpha\ homeostazı} \rightarrow \mathrm{vRNP\ çekirdek\ girişi} \rightarrow \mathrm{viral\ transkripsiyon\ ve\ çoğalma} \]

THZ2 бул чынжырды клетка маданиятында жана чычкан моделинде басаңдаткан. Бирок дары кожоюн-клетканын транскрипциясында негизги ролу бар CDK7ни бутага алгандыктан, клиникалык колдонуу жагынан антивирустук натыйжалуулук сыяктуу эле коопсуздук жана дарылоо убактысы да чечүүчү мааниге ээ болот.

Булак жана Ыкма Жөнүндө Эскертүү

Бул мазмун Mingxin Zhang, Xiaoqin Lian, Yarou Gao, Yang Yu, Zhuogang Li, Lefang Jiang, Haonan Zhang, Yue Su, Jiaxin Ke, Xingjian Zhu, Qun Peng, Weisan Chen жана Xulin Chen тарабынан даярдалган “Inhibition of CDK7 Suppresses Influenza A Virus Replication: Insights into Host-Dependent Antiviral Mechanisms” аттуу изилдөөгө негизделген.

Изилдөө A549 адамдын өпкө эпителий клеткаларын, MDCK ит бөйрөк клеткаларын, төрт influenza A вирус штаммын, CDK7 siRNAсын, THZ2, Mevociclib жана LDC4297 ингибиторлорун, вирустук титр өлчөөлөрүн, Western blot, qRT-PCR, конфокалдык микроскопия, ко-иммунопреципитация жана өлүмгө алып келүүчү PR8 инфекциясы түзүлгөн BALB/c чычкандарын бириктирген преклиникалык in vitro жана жаныбар изилдөөсү.

Изилдөө адамдарда жүргүзүлгөн клиникалык изилдөө эмес. Грипп менен ооруган адам, адам дарылоо тобу, клиникалык симптомдордун узактыгы, ооруканага жаткыруу, татаалдашуулар же адамдагы коопсуздук боюнча маалымат жок.

Текстте ачык түрдө “This preprint research paper has not been peer reviewed” жана “Preprint not peer reviewed” деген сөздөр бар. Демек, изилдөө рецензиядан өтө элек. PDFде DOI же ырасталган акыркы журналдык кабыл алуу маалыматы жок.

Жаныбар тажрыйбалары үчүн метод бөлүмүндө Jinan University IACUC бекитүү номери 20230601-0010, ал эми этикалык билдирүүдө 20230606-0013 деп берилген. Бул эки номер эмне үчүн ар башка экени түшүндүрүлгөн эмес.

THZ2нин токсикологиялык тажрыйбадагы берүү жолу метод бөлүмүндө интраперитонеалдык, жыйынтык жана сүрөт түшүндүрмөлөрүндө тери астына деп жазылган. Өпкө гистологиясы методдо жетинчи күнү, жыйынтык жана сүрөт түшүндүрмөсүндө бешинчи күнү жасалганы көрсөтүлгөн.

THZ2 цитоуулуулук жыйынтыктарында nM жана µM бирдиктеринин ортосунда айкын шайкешсиздик бар. Изилдөөнүн IC₅₀ жана тандалмалуулук индекси чечмеленгенде бул отчеттук айырма эске алынышы керек.

Изилдөө кожоюн факторун бутага алуу антивирустук туруктуулук тобокелдигин азайтышы мүмкүн деп сунуштайт, бирок сериялык вирустук пассаж, туруктуулук тандалышы же эволюциялык качуу тажрыйбасы жүргүзүлгөн эмес.

THZ2нин адамдардагы фармакокинетикасы, ылайыктуу антивирустук дозасы, узак мөөнөттүү коопсуздугу, иммундук таасирлери жана дарылоо терезеси изилденген эмес. Чычкандарда дарылоонун инфекциядан төрт саат өткөндөн кийин башталышы адамдарда белгилер башталгандан кийинки колдонуу натыйжалуу болорун көрсөтпөйт.

Importin-α белокторунун азайышы менен vRNPнин ядроого киришинин бузулушунун ортосунда ырааттуу байланыш көрсөтүлгөн, бирок importin-α кайра экспрессияланган куткаруу тажрыйбасы жок. CDK7 importin-α деңгээлдерин кайсы транскрипциялык же белок туруктуулугу механизми аркылуу жөнгө салаары аныкталган эмес.

Бул макала жүктөлгөн PDFдеги методдорго, формулаларга, графиктерге, микроскопия сүрөттөрүнө, Western blot жыйынтыктарына, жаныбар тажрыйбаларына жана авторлордун чечмелөөлөрүнө гана таянып даярдалган. PDFде жок адамдагы натыйжалуулук, клиникалык дарылоо, так коопсуздук, туруктуулук кепилдиги же бекитилген дары деген дооматтар кошулган эмес.