Вируси Influenza A барои афзоиши худ на танҳо ба сафедаҳои вирусӣ, балки ба низомҳои интиқол ва ифодаи генҳои ҳуҷайраи сирояткардааш низ вобаста аст. Пас аз ворид шудани вирус ба ҳуҷайра, маҷмуаҳои рибонуклеопротеинии вирусӣ, яъне vRNP-ҳо, ки геноми вирусиро мебаранд, бояд ба ядрои ҳуҷайра расанд. Агар ин марҳила иҷро нашавад, транскрипсияи RNA-и вирусӣ ва такроршавии геном ба таври муассир оғоз шуда наметавонад.

Таҳқиқоти баррасишуда санҷидааст, ки оё яке аз сафедаҳои худи ҳуҷайра — киназаи вобаста ба сиклин 7, яъне CDK7 — барои афзоиши вируси Influenza A зарур аст ё не. Муҳаққиқон CDK7-ро бо ду усули ҷудогона боздоштанд:

• Хомӯшкунии генетикӣ бо siRNA, ки mRNA-и CDK7-ро ҳадаф мегирад
• Боздории фармакологӣ бо ингибиторҳои хурдмолекулаи CDK7 бо номи THZ2, Mevociclib ва LDC4297

Ҳангоми хомӯш ё боздошта шудани CDK7, пайвастшавии вирус ба сатҳи ҳуҷайра, ворид шудани он ба ҳуҷайра ва гузариш аз мембранаи эндосома ба ситоплазма ба таври назаррас халалдор нашуд. Баръакс, интиқоли маҷмуаҳои рибонуклеопротеинии вирусӣ аз ситоплазма ба ядро монеъ шуд.

Механизми асосие, ки таҳқиқот пешниҳод мекунад, чунин аст:

\[ \mathrm{CDK7\ etkinliği} \rightarrow \mathrm{Importin\!-\alpha\ proteinlerinin\ korunması} \rightarrow \mathrm{vRNP\ çekirdek\ taşınması} \rightarrow \mathrm{viral\ RNA\ sentezi} \rightarrow \mathrm{IAV\ çoğalması} \]

Ҳангоми боздории CDK7 бошад:

\[ \mathrm{CDK7}\downarrow \rightarrow \mathrm{Importin\!-\alpha1,\alpha3,\alpha5,\alpha7}\downarrow \rightarrow \mathrm{vRNP\ çekirdek\ girişi}\downarrow \rightarrow \mathrm{viral\ NP,\ mRNA,\ cRNA,\ vRNA}\downarrow \rightarrow \mathrm{enfeksiyöz\ virüs\ üretimi}\downarrow \]

Сафедаҳои Importin-α адаптерҳои интиқолӣ мебошанд, ки сохторҳои калони молекулавиро, ки бояд ба ядро фиристода шаванд, мешиносанд. Онҳо сигналҳои ҷойгиршавии ядроиро дар сафедаи NP-и вируси Influenza мешиносанд ва ҳамроҳ бо importin-β ба гузариши vRNP-ҳо аз сӯрохиҳои пардаи ядро мусоидат мекунанд.

Хомӯшкунии генетикии CDK7 титри вирусиро дар ҳамаи чор штамми Influenza A-и санҷидашуда коҳиш дод:

Муодилҳои маротибавӣ бевосита дар таҳқиқот дода нашудаанд. Барои фаҳмо кардани тағйироти гузоришшудаи log₁₀ дар шакли рӯзмарра, онҳо бо робитаи асосии зерин ҳисоб карда шуданд:

\[ \mathrm{Kat\ azalma} = 10^{\Delta \log_{10}} \]

Ҳангоми хомӯшкунии CDK7 коҳиши назарраси зиндамонии ҳуҷайра гузориш нашуд; баръакс, mRNA-и вирусии M2, нуклеопротеини вирусии NP ва истеҳсоли вируси сирояткунанда кам шуданд. Ин натиҷа дастгирӣ мекунад, ки таъсири зиддивирусии мушоҳидашуда танҳо аз марги умумии ҳуҷайраҳо ба вуҷуд наомадааст.

Дар таҷрибаҳои фармакологӣ THZ2, Mevociclib ва LDC4297 афзоиши PR8-ро ҳам дар ҳуҷайраҳои эпителиалии шуши инсонии A549 ва ҳам дар ҳуҷайраҳои гурдаи саги MDCK ба таври вобаста ба доза боздоштанд. Дозаҳои зиддивирусии истифодашуда дар Шакли 2 чунин нишон дода шудаанд:

• THZ2: 0,15, 0,30 ва 0,60 µM
• Mevociclib: 1,2, 2,4 ва 4,8 µM
• LDC4297: 1,2, 2,4 ва 4,8 µM
• Назорати мусбати Ribavirin: 120 µM

THZ2 нисбат ба ду ингибитори дигари CDK7 таҳаммулпазирии ҳуҷайравии мусоидтар нишон дод. Дар қисми муҳокимаи таҳқиқот барои THZ2 дар ҳуҷайраҳои A549:

\[ \mathrm{IC}_{50} = 0{,}2\ \mu M \]

ва:

\[ \mathrm{SI} > 1600 \]

гузориш шудааст.

Дар ин ҷо IC₅₀ консентратсияеро ифода мекунад, ки афзоиши вирусиро панҷоҳ дарсад %50 коҳиш медиҳад; индекси интихобпазирӣ бошад нишон медиҳад, ки таъсири зиддивирусӣ то чӣ андоза аз заҳролудшавии ҳуҷайравӣ ҷудо аст:

\[ \mathrm{SI} = \frac{\mathrm{CC}_{50}} {\mathrm{IC}_{50}} \]

CC₅₀ консентратсияест, ки зиндамонии ҳуҷайраро %50 коҳиш медиҳад. IC₅₀ = 0,2 µM ва SI аз 1600 калон будан аз ҷиҳати математикӣ талаб мекунад, ки CC₅₀ аз 320 µM калон бошад.

Аммо дар PDF номувофиқии муҳими воҳидҳо мавҷуд аст. Матни натиҷаҳо менависад, ки THZ2 то 320 nM дар ҳуҷайраҳои A549 ва то 80 nM дар ҳуҷайраҳои MDCK заҳролудшавии назаррас нишон надодааст, дар ҳоле ки меҳвари уфуқии графикҳои ситотоксикӣ дар Шакли 2 ҳамчун 5–320 µM нишон дода шудааст. Қиматҳои IC₅₀ ва ҳисоби SI ба воҳиди µM дар шаклҳо мувофиқтар менамоянд; бо вуҷуди ин, бе ислоҳи таҳқиқот, ин фарқи воҳид бояд ҳамчун масъалаи ошкорои гузоришдиҳӣ арзёбӣ шавад.

Таҷрибаҳои вақтбандӣ нишон доданд, ки THZ2 марҳилаи барвақти пас аз ворид шудани вирус ба ҳуҷайраро ҳадаф мегирад. Вақте THZ2 дар лаҳзаи сироят ё ду соат пас аз сироят илова шуд, ҷамъшавии NP-и вирусӣ ба таври қавӣ боздошта шуд. Вақте дар соати чорум ё дертар илова гардид, чунин таъсири равшан дида нашуд.

Ин натиҷа нишон медиҳад, ки равзанаи муҳимми вобаста ба CDK7 тақрибан:

\[ 2\ \mathrm{saat} < \mathrm{kritik\ basamak} < 4\ \mathrm{saat} \]

дар ҳамин фосила қарор дорад.

Таҷрибаҳои микроскопияи конфокалӣ нишон доданд, ки марҳилаҳои пайвастшавӣ, воридшавӣ ва омезиши мембранаи вирус аз боздории CDK7 таъсир нагирифтаанд. Дар ҳуҷайраҳои назоратӣ сигнали NP-и вирусӣ дар соатҳои 4., 6. ва 8. дар ядро ҷамъ мешуд, дар ҳоле ки дар ҳуҷайраҳои бо THZ2 коркардшуда ё CDK7-и онҳо хомӯшшуда NP асосан дар ситоплазма боқӣ монд.

Пайвастшавии мустақими физикӣ байни CDK7 ва NP-и вирусӣ ҷустуҷӯ шуд; дар таҷрибаи ко-иммунопреципитатсия гузориш шуд, ки CDK7 ҳамроҳ бо NP таҳшин нашудааст. Аз ин рӯ, муҳаққиқон пешниҳод карданд, ки CDK7 интиқоли vRNP-ро на бо пайвастшавии мустақим ба NP, балки тавассути танзими низоми интиқоли ҳуҷайравӣ таъсир медиҳад.

Коркарди THZ2 ва siRNA-и CDK7 сафедаҳои importin-α1, importin-α3, importin-α5 ва importin-α7-ро коҳиш дод, аммо сатҳи importin-β1-ро ба таври назаррас тағйир надод. Ин намунаи интихобӣ пайванди асосии таҷрибавӣ аст, ки мефаҳмонад чаро интиқоли vRNP ба ядро халалдор мешавад.

Маълумоти иловагии таҳқиқот нишон дод, ки боздории CDK7 фосфорилатсияи RNA polymerase II ва сатҳҳои mRNA, cRNA ва vRNA-и гени influenza M2-ро низ коҳиш медиҳад. Аз ин рӯ, эҳтимол меравад CDK7 тавассути ду вазифаи ба ҳам пайваст афзоиши вирусиро дастгирӣ кунад:

1. Бо нигоҳ доштани сатҳи Importin-α воридшавии vRNP-ҳоро ба ядро осон кардан
2. Бо дастгирии фаъолияти RNA polymerase II муҳити транскрипсионии мизбонро, ки барои транскрипсияи mRNA-и вирусӣ зарур аст, нигоҳ доштан

THZ2 баъдан дар мушҳои модинаи BALB/c, ки бо PR8 сирояти марговар гирифта буданд, санҷида шуд. Табобат чор соат пас аз сироят оғоз гардида, дар давоми чор рӯз ҳар рӯз ду маротиба дода шуд.

Натиҷаҳои зиндамонӣ дар рӯзи чордаҳум:

Дозаи баланди THZ2 нисбат ба гурӯҳи интиқолдиҳанда зиндамониро аз %20 то %70 баланд кард. Ин афзоиши мутлақи 50 банди фоизӣ аст. Oseltamivir бошад дар модели истифодашуда %100 зиндамонӣ таъмин кард.

Дозаи 20 mg/kg/gün-и THZ2 бори вирусии шушро дар рӯзи сеюм 3,3 log₁₀ ва дар рӯзи панҷум 2,6 log₁₀ коҳиш дод. Барои шарҳ, ин фарқҳои логарифмӣ тақрибан:

• Рӯзи сеюм: тақрибан 1.995 маротиба коҳиш
• Рӯзи панҷум: тақрибан 398 маротиба коҳиш

маъно доранд.

Дар гистологияи шуш, дар мушҳои сироятшудаи гирандаи интиқолдиҳанда инфилтратсияи ҳуҷайраҳои илтиҳобӣ, ғафсшавии деворҳои алвеола ва экссудат дида шуд; дар мушҳои гирандаи THZ2 ин нишонаҳо сабуктар гузориш шуданд.

Бо вуҷуди ин, ин натиҷаҳо нишон намедиҳанд, ки THZ2 табобати грипп дар инсон аст. THZ2 танҳо дар фарҳанги ҳуҷайра ва модели муш арзёбӣ шудааст. Дозаи мувофиқ барои инсон, роҳи воридкунӣ, вақти оғоз кардани табобат, фармакокинетика, амнияти дарозмуддат ва самаранокии клиникӣ маълум нестанд.

Мушкилоти асосии таҳқиқот чист?

Қисми муҳими зиддивирусҳои мавҷудаи influenza мустақиман сафедаҳои худи вирусро ҳадаф мегиранд. Oseltamivir neuraminidase-ро ҳадаф мегирад, baloxavir бошад намунаи доруест, ки фаъолияти cap-dependent endonuclease-и polymerase-и вирусиро ҳадаф мекунад.

Азбаски сафедаҳои вирусӣ метавонанд мутация кунанд, истифодаи дарозмуддат ё васеи зиддивирусҳо метавонад вирусҳои камтар ҳассос ба доруро интихоб кунад. Таҳқиқоти баррасишуда ба ин мушкил аз самти дигар наздик мешавад: ба ҷои вирус, сафедаи ҳуҷайраи мизбонро ҳадаф мегирад, ки вирус барои афзоиш аз он истифода мебарад.

Бартарии назариявии ин равиш он аст, ки генҳои ҳуҷайравӣ нисбат ба геноми вирус сусттар тағйир меёбанд. Аммо азбаски ҳадафҳои ҳуҷайравӣ дар физиологияи муқаррарии инсон низ вазифа доранд, ин барои амният хатарест муҳим. Азбаски CDK7 барои даври ҳуҷайра ва транскрипсияи миёнаравии RNA polymerase II муҳим аст, тавозуни байни таъсири зиддивирусӣ ва заҳролудии мизбон бояд махсусан бодиққат арзёбӣ шавад.

Чаро вируси Influenza A бояд ба ядрои ҳуҷайра ворид шавад?

Influenza A дорои геноми RNA-и сегментшудаи маънои манфӣ аст. Сегментҳои RNA-и вирусӣ ҳамроҳ бо сафедаи NP ва зервоҳидҳои polymerase-и вирусӣ маҷмуаҳои vRNP-ро ташкил медиҳанд.

Пас аз ворид шудани вирус ба ҳуҷайра, ҷараёни асосӣ чунин аст:

1. Вирус ба сатҳи ҳуҷайра пайваст мешавад.
2. Бо эндоситоз ба ҳуҷайра гирифта мешавад.
3. Дар дохили эндосома муҳит турш мешавад.
4. Пардаи вирус бо пардаи эндосома омехта мешавад.
5. Маҷмуаҳои vRNP ба ситоплазма озод мешаванд.
6. vRNP-ҳо аз сӯрохиҳои ядро ба ядро интиқол меёбанд.
7. Транскрипсияи RNA-и вирусӣ ва такроршавии геном дар ядро анҷом мегирад.

Гузариши муҳиме, ки таҳқиқот ҳадаф гирифтааст, байни марҳилаҳои панҷум ва шашум аст. Вирус метавонад ба ҳуҷайра ворид шавад ва аз эндосома барояд, аммо vRNP-ҳо ба ядро ба таври муассир расида наметавонанд.

vRNP чист?

vRNP ихтисораи ибораи англисии viral ribonucleoprotein complex аст. Ҳар сегменти RNA-и influenza:

• RNA-и вирусӣ,
• молекулаҳои зиёди NP,
• polymerase-и вирусӣ аз зервоҳидҳои PB1, PB2 ва PA

ҳамроҳ бастабандӣ мешавад.

vRNP танҳо бастаи маводи генетикӣ нест. Он мошини молекулавии функсионалӣ аст, ки барои муҳофизат, хондан, нусхабардорӣ ва интиқоли RNA-и вирусӣ ба вирусҳои нав зарур мебошад.

Низоми Importin-α/β чӣ гуна кор мекунад?

Ядрои ҳуҷайра бо пардаи дуқабата иҳота шудааст. Молекулаҳои хурд то ҳадде метавонанд ғайрифаъол гузаранд, аммо барои маҷмуаҳои калон мисли vRNP интиқоли фаъол зарур аст.

Низоми классикии интиқоли ядроиро ба таври содда чунин нишон додан мумкин аст:

\[ \mathrm{Kargo\!-\!NLS} + \mathrm{Importin\!-\alpha} + \mathrm{Importin\!-\beta} \rightarrow \mathrm{Çekirdek\ gözenek\ kompleksi} \rightarrow \mathrm{Çekirdek} \]

Дар ин ҷо:

• NLS сигнали ҷойгиршавии ядроист.
• Importin-α адаптерест, ки NLS-и рӯйи борро мешиносад.
• Importin-β ба ҳамкории маҷмуа бо низоми сӯрохиҳои ядро мусоидат мекунад.

Минтақаҳои NLS-и сафедаи NP-и influenza аз ҷониби importin-α шинохта мешаванд. Ҳангоми кам шудани миқдори importin-α, қобилияти воридшавии vRNP-ҳо ба ядро метавонад коҳиш ёбад.

CDK7 одатан чӣ кор мекунад?

CDK7 узви оилаи киназаҳои вобаста ба сиклин аст. Дар ҳуҷайра ду вазифаи асосӣ дорад:

• Мусоидат ба фаъолшавии CDK-ҳои дигаре, ки даври ҳуҷайраро танзим мекунанд
• Ҳамчун қисми маҷмуаи TFIIH фосфорилатсия кардани қисми C-terminal-и RNA polymerase II

Фосфорилатсияи RNA polymerase II барои оғоз ва идомаи транскрипсияи ген муҳим аст. Вируси Influenza ҳангоми истеҳсоли mRNA-и вирусӣ аз низоми RNA polymerase II-и ҳуҷайра истифода мебарад.

Таҳқиқот пешниҳод мекунад, ки CDK7 на танҳо тавассути транскрипсияи умумӣ, балки бо нигоҳ доштани сатҳи сафедаҳои importin-α интиқоли геноми вирусиро ба ядро дастгирӣ мекунад.

Таҷрибаи хомӯшкунии генетикӣ чӣ гуна анҷом дода шуд?

Ҳуҷайраҳои эпителиалии шуши инсонии A549 бо RNA-ҳои хурди дахолаткунанда, ки mRNA-и CDK7-ро ҳадаф мегирифтанд, трансфексия шуданд. Дар оғоз се siRNA-и ҷудогона арзёбӣ шуда, si-CDK7-1, ки қавитарин хомӯшкуниро нишон дод, дар таҷрибаҳои баъдӣ истифода шуд.

Тартиби асосӣ:

• Консентратсияи siRNA: 50 nM
• Lipofectamine 3000: 5 µL
• Назорат: si-NC-и бе ҳадаф

Дар Шакли 1, коркарди si-CDK7 сатҳи mRNA ва сафедаи CDK7-ро бе коҳиши назарраси зиндамонии ҳуҷайра паст кардааст.

Чаро чанд штамми вирус истифода шуд?

Барои муайян кардани он ки таъсири CDK7 танҳо ба вируси PR8, ки муддати дароз дар лаборатория истифода мешавад, хос аст ё не, чор вируси Influenza A истифода шуд:

• A/Puerto Rico/8/1934 — PR8, H1N1
• A/Human/Hubei/1/2009 — пандемии H1N1
• Туъмаи PR8-и ба oseltamivir тобовар — H1N1-Ost-R
• A/Human/Hubei/3/2005 — H3N2

Вирусҳо бо multiplicity of infection-и паст:

\[ \mathrm{MOI} = 0{,}05 \]

истифода шуданд.

MOI миқдори миёнаи вируси сирояткунанда барои ҳар ҳуҷайраро ифода мекунад. MOI 0,05 низоми сирояти зичии паст аст, ки дар он дар оғоз на ҳар ҳуҷайра бо вирус рӯ ба рӯ мешавад. Ин сохтор имкон медиҳад паҳншавии вирус дар чанд даври афзоиш арзёбӣ шавад.

Шакли 1 чӣ нишон медиҳад?

Шакли 1 натиҷаҳои хомӯшкунии CDK7-ро дар штаммҳои гуногуни influenza ҷамъ меорад:

• Зиндамонии ҳуҷайра нигоҳ дошта шудааст.
• Сатҳи mRNA ва сафедаи CDK7 коҳиш ёфтааст.
• Бандҳои сафедаи NP-и вирусӣ заиф шудаанд.
• Сатҳи mRNA-и M2 коҳиш ёфтааст.
• Титри вируси сирояткунанда дар ҳамаи чор штамм кам шудааст.

Коҳиши 2,17 log₁₀-и титр дар штамми H1N1-и ба oseltamivir тобовар низ дастгирӣ мекунад, ки ҳадаф аз neuraminidase-и вирусӣ, ки oseltamivir ба он мепайвандад, мустақил аст.

Аммо вируси ба oseltamivir тобовар танҳо дар фарҳанги ҳуҷайра арзёбӣ шудааст. Нишон дода нашудааст, ки THZ2 сирояти influenza-и ба oseltamivir тобоварро дар ҳайвон ё инсон табобат мекунад.

Маҳдудияти механистии таҷрибаи хомӯшкунии ген

Гарчанде дар аввал се siRNA арзёбӣ шуд, дар таҷрибаҳои баъдӣ асосан як siRNA истифода гардид. Таъсирҳои берун аз ҳадафи як siRNA пурра истисно карда намешаванд.

Дар таҳқиқот таҷрибаи rescue мавҷуд нест, ки дар он CDK7-и ба siRNA тобовар дубора дода шуда, фенотипи зиддивирусӣ барқарор карда шавад. Чунин таҷриба метавонист қавитар нишон диҳад, ки натиҷаи мушоҳидашуда мустақиман ба аз даст рафтани CDK7 вобаста аст.

Муқоисаи се ингибитори CDK7

Барои тасдиқи фармакологии натиҷаи генетикӣ, муҳаққиқон се пайвастагиро истифода карданд:

Ҳар се пайвастагӣ ҳам дар ҳуҷайраҳои A549 ва ҳам MDCK титри вирус ва сафедаи NP-ро ба таври вобаста ба доза коҳиш доданд. Натиҷаи монанд аз се ингибитори дорои сохтори химиявии гуногун аҳамияти ҳадафи CDK7-ро дастгирӣ мекунад.

Бо вуҷуди ин, таъсирҳои берун аз ҳадафи киназии ингибиторҳо ба таври муфассал омӯхта нашудаанд. Мутобиқати натиҷаҳои фармакологӣ бо хомӯшкунии генетикӣ эътимодро зиёд мекунад, аммо specificity-и комили ҳадафро исбот намекунад.

Натиҷаи Шакли 2

Дар Шакли 2:

• сохторҳои химиявии THZ2, Mevociclib ва LDC4297,
• графикҳои dose–viability дар ҳуҷайраҳои A549 ва MDCK,
• сутунҳои титри вирусӣ,
• Western blot-ҳои NP ва GAPDH

ҷой доранд.

THZ2 дар консентратсияҳои пасти субмикромолярӣ таъсири равшани зиддивирусӣ нишон дод. Mevociclib ва LDC4297 дар дозаҳои баландтар зиндамонии ҳуҷайраро бештар коҳиш доданд.

Дар баъзе сарлавҳаҳои шакл ба ҷои THZ2 “TH2” навишта шудааст. Илова бар ин, воҳиди µM дар меҳварҳои ситотоксикӣ бо ифодаҳои nM дар матни натиҷаҳо мувофиқат намекунад. Ин фарқи гузоришдиҳӣ тафсири дақиқи равзанаи табобатиро душвор мекунад.

Чаро таҷрибаи илова кардани дору вобаста ба вақт муҳим аст?

Барои фаҳмидани он ки пайвастагии зиддивирусӣ дар кадом марҳила таъсир мекунад, дору бояд дар лаҳзаҳои гуногуни сироят илова шавад.

Дар таҳқиқот THZ2 бо тартибҳои вақтбандии зерин истифода шуд:

• Пеш аз сироят
• Ҳамзамон бо вирус
• Дар соати аввали пас аз сироят
• Пайваста пас аз сироят

Дар ҳамаи ин тартибҳо истеҳсоли вирус дар соати 24 кам шуд. Дар таҷрибаи муфассалтар THZ2:

• ҳангоми додан дар соати 0 муассир буд,
• ҳангоми додан дар соати 2 муассир буд,
• ҳангоми додан дар соати 4 ё дертар ба таври назаррас камтаъсир буд

ёфт шуд.

Ин ҳолат нишон дод, ки CDK7 барои воқеаи барвақт, вале пас аз пайвастшавӣ ва воридшавии вирус дар даври зиндагии вирус зарур аст.

Шакли 3 чӣ нишон медиҳад?

Панелҳои болоии Шакли 3 вақтбандии гуногуни табобат ва титри вирусро дар соати 24 нишон медиҳанд. Панелҳои Western blot-и поёнӣ тағйироти сафедаи NP-ро пас аз THZ2 ё si-CDK7 дар тӯли вақт пешниҳод мекунанд.

Дар соати дуюм сатҳи NP аз THZ2 ё хомӯшкунии CDK7 ба таври назаррас таъсир нагирифт. Аз соати чорум ҷамъшавии NP коҳиш ёфт; дар соатҳои шашум ва ҳаштум фарқ қавитар шуд.

Ин намуна дастгирӣ мекунад, ки раванди аввали воридшавии вирус анҷом ёфта метавонад, аммо марҳилаи ядроие, ки барои оғоз шудани истеҳсоли RNA ва сафедаи нави вирусӣ лозим аст, халалдор мешавад.

Оё пайвастшавии вирус ба ҳуҷайра таъсир мегирад?

Дар таҷрибаи пайвастшавӣ ҳуҷайраҳо то 4 °C хунук карда шуданд. Ҳарорати паст воридшавии вирусро ба ҳуҷайра суст мекунад, аммо ба пайвастшавӣ ба ретсепторҳои сатҳӣ иҷозат медиҳад.

Дар сатҳи ҳуҷайраҳои бо THZ2 ё si-CDK7 коркардшуда сигнали NP ба ҳуҷайраҳои назоратӣ монанд буд. Аз ин рӯ, хулоса шуд, ки боздории CDK7 пайвастшавии вирусро ба сатҳи ҳуҷайра манъ намекунад.

Оё воридшавии вирус ба ҳуҷайра таъсир мегирад?

Вирусҳои пайвастшуда дар 37 °C ду соат нигоҳ дошта шуда, воридшавии онҳо ба ҳуҷайра арзёбӣ шуд. THZ2 ё хомӯшкунии CDK7 гузариши сигнали NP ба дохили ҳуҷайраро ба таври назаррас кам накард.

Оё омезиши эндосомалӣ таъсир мегирад?

Омезиши пардаи вирус бо пардаи эндосома бо таҷрибаи дурангаи флуоресцентӣ бо нишондиҳандаҳои R18 ва DiO арзёбӣ шуд.

Bafilomycin A1, ки ҳамчун ингибитори fusion истифода шуд, сигнали fusion-ро ба таври назаррас коҳиш дод. Дар гурӯҳҳои THZ2 ва si-CDK7 бошад, нишонаҳои fusion ба гурӯҳи назоратӣ монанд буданд.

Ҳамин тавр, тибқи маълумоти таҳқиқот CDK7:

• барои пайвастшавӣ зарур нест,
• барои воридшавии эндосомалӣ зарур нест,
• барои омезиши мембрана зарур нест.

Блоки асосӣ: воридшавии vRNP ба ядро

Ҷойгиршавии NP-и вирусӣ дар дохили ҳуҷайра дар соатҳои 4., 6. ва 8. бо микроскопияи конфокалӣ пайгирӣ шуд.

Дар шароити назоратӣ сигнали NP дар дохили ядроҳое ҷой гирифт, ки бо сигнали кабуди DAPI нишон дода шуда буданд. Дар коркарди THZ2 ё si-CDK7, сигнали NP дар атрофи ядро ва ситоплазма боқӣ монд.

Ин натиҷа нишон медиҳад, ки ҳангоми боздории CDK7 маҷмуаи vRNP метавонад ба ҳуҷайра ворид шавад, аммо аз низоми сӯрохиҳои ядро ба таври муассир гузашта наметавонад.

Паёми визуалии Шакли 4

Қисми аввали Шакли 4 тасвирҳои пайвастшавӣ, воридшавӣ ва fusion-ро муқоиса мекунад. Дар ин панелҳо гурӯҳҳои THZ2 ва si-CDK7 асосан ба назорат монанданд.

Дар панелҳои интиқоли ядро дар саҳифаи идома бошад, фарқи равшан пайдо мешавад:

• Дар ҳуҷайраҳои назоратӣ сигнали сабзи NP бо ядроҳо ҳампӯш мешавад.
• Дар гурӯҳи THZ2 NP асосан берун аз ядро мемонад.
• Дар гурӯҳи si-CDK7 ҷамъшавии монанди ситоплазмӣ дида мешавад.
• Фарқ дар соатҳои 4., 6. ва 8. идома меёбад.

Гарчанде шаклҳо фарқи сифатии визуалии қавӣ медиҳанд, дар шакли асосӣ тақсимоти муфассали миқдории таносуби fluorescence-и ядро/ситоплазма нишон дода нашудааст.

Оё CDK7 мустақиман ба NP-и вирусӣ мепайвандад?

Дар таҷрибаи ко-иммунопреципитатсия CDK7 дар байни сафедаҳои бо antibody-и NP кашидашуда нишон дода нашуд. Муҳаққиқон инро ҳамчун набудани ҳамкории мустақими CDK7–NP тафсир карданд.

Натиҷаи манфии ко-иммунопреципитатсия набудани пайванди қавӣ ё устуворро дастгирӣ мекунад. Аммо он ҳамкориҳои хеле кӯтоҳ, заиф ё дар шароити таҷриба вайроншавандаро пурра истисно намекунад.

Коҳиши сафедаҳои Importin-α

Бо баланд шудани дозаи THZ2, бандҳои сафедаҳои зерин заиф шуданд:

• Importin-α1
• Importin-α3
• Importin-α5
• Importin-α7

Банди Importin-β1 бошад асосан тағйир наёфт. Ҳамин намунаи интихобӣ ҳангоми истифодаи siRNA-и CDK7 низ дида шуд.

Ин натиҷа нишон медиҳад, ки ҳамаи сафедаҳои интиқоли ядро ба таври умум нобуд намешаванд; дар доираи таҳқиқот махсусан isoform-ҳои importin-α ба CDK7 ҳассос мебошанд.

Механизме, ки Шакли 5 нишон медиҳад

Шакли 5 занҷири таҷрибавии зеринро нишон медиҳад:

1. CDK7 ҳамроҳ бо NP таҳшин нашудааст.
2. THZ2 ба таври вобаста ба доза CDK7 ва сафедаҳои importin-α-ро коҳиш додааст.
3. Importin-β1 асосан нигоҳ дошта шудааст.
4. Хомӯшкунии CDK7 ҳамон коҳиши importin-α-ро такрор кардааст.
5. Коҳиши Importin-α бо коҳиши NP-и вирусӣ ҳамроҳ шудааст.

Аммо дар шакли асосӣ таҳлили миқдории зичии сафедаҳои importin-α дода нашудааст. Натиҷаҳо асосан ба муқоисаи бандҳои Western blot такя мекунанд.

Оё механизм пурра исбот шудааст?

Таҳқиқот байни боздории CDK7, коҳиши importin-α, халалдор шудани воридшавии vRNP ба ядро ва кам шудани истеҳсоли вирус робитаи мутобиқ нишон медиҳад.

Аммо таҷрибаҳои зерин, ки метавонистанд занҷири механистиро пурра банданд, анҷом дода нашудаанд:

• Дубора додани importin-α ба ҳуҷайраҳои CDK7-боздошташуда
• Санҷидани он ки барқарор кардани Importin-α воридшавии vRNP ба ядроиро наҷот медиҳад ё не
• Нишон додани он ки CDK7 транскрипсияи генҳои importin-α-ро мустақим танзим мекунад
• Ченкунии мунтазами сатҳи mRNA-и Importin-α
• Ченкунии суръати вайроншавии сафедаи Importin-α

Аз ин рӯ, таҳқиқот робитаи механистии қавӣ пешниҳод мекунад, аммо дар ҳамаи марҳилаҳои занҷири CDK7–importin-α–vRNP тасдиқи мустақими сабабият намедиҳад.

RNA polymerase II ва транскрипсияи вирусӣ

CDK7 дар дохили маҷмуаи TFIIH ба фосфорилатсияи боқимондаҳои serine дар домени C-terminal-и RNA polymerase II мусоидат мекунад.

Барои шарҳи мантиқи таҳқиқот робитаро чунин ҷамъбаст кардан мумкин аст:

\[ \mathrm{CDK7} \rightarrow \mathrm{RNA\ Pol\ II\ CTD\ fosforilasyonu} \rightarrow \mathrm{konak\ mRNA\ transkripsiyonu} \]

Вируси Influenza барои таъмин кардани cap-и ибтидоӣ ба mRNA-и вирусӣ порчаҳои кӯтоҳи capped-ро аз транскриптҳои RNA polymerase II-и ҳуҷайра мегирад. Ин раванд cap-snatching ном дорад.

Дар Шакли иловагии 3, THZ2 ё si-CDK7 фосфорилатсияи RNA polymerase II-ро кам карданд; сатҳҳои mRNA, cRNA ва vRNA-и вирусии M2 низ коҳиш ёфтанд.

RNA polymerase II мустақиман бо транскрипсияи mRNA-и вирусӣ алоқаманд аст. Коҳиши cRNA ва vRNA бошад метавонад натиҷаи васеътари халалдор шудани воридшавии vRNP ба ядро, синтези сафедаҳои вирусӣ ва тамоми даври афзоиши вирус бошад.

Тарҳи таҷрибаи муш

Мушҳои модинаи BALB/c-и шаш–ҳаштҳафта истифода шуданд. Мушҳо аз роҳи бинӣ бо вируси PR8-и мутобиқшуда ба муш бо дозаи:

\[ 2 \times \mathrm{LD}_{50} \]

сироят дода шуданд.

LD₅₀ дозаест, ки интизор меравад дар %50-и ҳайвоноти бетаъоб марг ба вуҷуд орад. Ду LD₅₀ дозаи таҷрибавии challenge барои эҷоди сирояти шадид ва марговар аст.

Табобат чор соат пас аз сироят оғоз шуда, чор рӯз идома кард:

• THZ2: 10 ё 20 mg/kg/gün
• Oseltamivir: 20 mg/kg/gün
• Назорати интиқолдиҳанда

Зиндамонӣ ва вазни бадан 14 рӯз пайгирӣ шуданд. Титри вирусии шуш дар рӯзҳои сеюм ва панҷум, гистологияи шуш бошад мувофиқи қисматҳои натиҷа ва шакл дар рӯзи панҷум арзёбӣ шуд.

Таҷрибаи пешакии заҳролудии THZ2

Ба мушҳои сироятнашуда дар давоми чор рӯз:

• 20 mg/kg/gün
• 40 mg/kg/gün
• 80 mg/kg/gün

THZ2 дода шуд. Дар пайгирии ҳафтрӯза марг ё коҳиши равшани вазни бадан дида нашуд.

Ин натиҷа нишон медиҳад, ки заҳролудии шадиди кӯтоҳмуддат дида нашудааст. Аммо арзёбӣ асосан ба:

• зиндамонӣ,
• вазни бадан,
• ҳолати хамшуда,
• пашми бархоста барин нишонаҳои зоҳирӣ

такя кардааст.

Биохимияи хун, гематология, гистологияи узвҳо, супрессияи иммунӣ, reproductive toxicity ё амнияти дарозмуддат арзёбӣ нашудаанд.

Номувофиқии роҳи воридкунӣ

Дар қисми усулҳо барои таҷрибаи токсикологӣ навишта шудааст, ки THZ2 intraperitoneal дода шудааст. Дар қисми натиҷаҳо ва тавзеҳи Шакли 6 бошад ҳамон таҷриба ҳамчун тазриқи subcutaneous тавсиф шудааст.

Дар таҷрибаҳои табобатӣ натиҷаҳо ва тавзеҳҳои шакл THZ2-ро subcutaneous, oseltamivir-ро даҳонӣ/intragastric нишон медиҳанд.

Ин фарқ махсусан барои фармакокинетика ва такроршавандагӣ муҳим аст. Воридкунии intraperitoneal ва subcutaneous як профили ҷаббиш намедиҳанд.

Натиҷаҳои зиндамонӣ дар Шакли 6

Дар мушҳои сироятшудаи гирандаи интиқолдиҳанда аз рӯзи сеюм коҳиши равшани вазн оғоз шуд ва дар рӯзи 14 зиндамонӣ то %20 паст шуд.

THZ2 муҳофизати вобаста ба доза нишон дод:

• 10 mg/kg/gün: %40 зиндамонӣ
• 20 mg/kg/gün: %70 зиндамонӣ

Гурӯҳи Oseltamivir %100 зиндамонӣ нишон дод. Аз ин рӯ, дар шароити таҷрибавии истифодашуда THZ2 муҳофизати қавӣ, вале аз oseltamivir пасттар фароҳам овард.

Бори вирусии шуш

Дозаи баланди THZ2 дар рӯзҳои сеюм ва панҷум титри вирусии шушро коҳиш дод:

Дар гурӯҳи Oseltamivir, дар рӯзи панҷум вирус зери ҳадди ченкунӣ нишон дода шудааст. Гарчанде THZ2 бори вирусиро қавӣ коҳиш дод, таъсири oseltamivir баландтар менамояд.

Гистологияи шуш

Дар гурӯҳи PR8-и гирандаи интиқолдиҳанда:

• инфилтратсияи зичи ҳуҷайраҳои илтиҳобӣ,
• ғафсшавии деворҳои алвеола,
• экссудат дар фазоҳои алвеолӣ,
• вайроншавии меъмории муқаррарии шуш

дида шуд.

Дар гурӯҳҳои гирандаи THZ2, махсусан дар дозаи 20 mg/kg/gün, илтиҳоб ва осеби сохторӣ камтар гузориш шуданд.

Тасвирҳои гистологӣ фарқҳои сифатӣ нишон медиҳанд; дар шакли асосӣ blinded pathology score ё quantitative lung injury index-и муфассал пешниҳод нашудааст.

Чаро вақтбандӣ дар таҷрибаи ҳайвон муҳим аст?

Табобат ҳамагӣ чор соат пас аз сироят оғоз шуд. Ин вақтбандии таҷрибавиест, ки вирус ҳанӯз дар марҳилаи барвақти афзоиш қарор дорад.

Дар инсон табобати грипп аксаран соатҳо ё рӯзҳо пас аз сироят, баъди оғоз шудани нишонаҳо оғоз мешавад. Аз даст рафтани таъсири равшани THZ2 баъд аз соати чорум дар таҷрибаи ҳуҷайра нишон медиҳад, ки равзанаи эҳтимолии истифодаи клиникӣ метавонад танг бошад.

Самаранокии табобате, ки дар муш чор соат пас аз сироят оғоз шудааст, исбот намекунад, ки табобати дертар баъди оғози нишонаҳо низ муассир хоҳад буд.

Механизми умумӣ дар Шакли 7

Шакли ниҳоии таҳқиқот ду вазифаи ба ҳам пайвасти CDK7-ро якҷоя нишон медиҳад:

1. Интиқоли ядро: CDK7 сатҳи importin-α-ро нигоҳ медорад; маҷмуаи importin-α/β vRNP-ҳоро ба ядро мебарад.
2. Транскрипсия: CDK7 RNA polymerase II-ро фосфорилатсия мекунад; муҳити транскрипсияи ҳуҷайравиро, ки дар истеҳсоли mRNA-и вирусӣ истифода мешавад, дастгирӣ мекунад.

Ҳангоми истифодаи THZ2 importin-α коҳиш меёбад, воридшавии vRNP ба ядро монеъ мешавад, фосфорилатсияи RNA polymerase II кам мешавад ва синтези RNA-и вирусӣ боздошта мешавад.

Ҷиҳатҳои қавии таҳқиқот

• Тасдиқи генетикӣ ва фармакологӣ якҷоя истифода шудааст: siRNA ва се ингибитори ҷудогонаи CDK7 натиҷаҳои монанди зиддивирусӣ доданд.
• Якчанд штамми Influenza A санҷида шуд: H1N1, H1N1 пандемӣ, H3N2 ва H1N1-и ба oseltamivir тобовар арзёбӣ шуданд.
• Ду хатти ҳуҷайра истифода шуд: Ҳуҷайраҳои A549-и инсон ва MDCK-и саг омӯхта шуданд.
• Даври сироят ба марҳилаҳо ҷудо шуд: Пайвастшавӣ, воридшавӣ, fusion ва интиқоли ядроӣ дар таҷрибаҳои ҷудогона арзёбӣ шуданд.
• Таҷрибаи иловаи дору вобаста ба вақт анҷом шуд: Равзанаи муҳими 2–4 соат муайян гардид.
• Микроскопияи конфокалӣ истифода шуд: Тақсимоти NP байни ситоплазма ва ядро ба таври визуалӣ нишон дода шуд.
• Изоформаҳои Importin ҷудогона омӯхта шуданд: α1, α3, α5, α7 ва β1 муқоиса шуданд.
• Ҳамкории мустақими CDK7–NP санҷида шуд: Ко-иммунопреципитатсия анҷом дода шуд.
• Пайванди RNA polymerase II арзёбӣ шуд: Дар таҷрибаҳои иловагӣ фосфорилатсияи Pol II ва намудҳои RNA-и вирусӣ чен шуданд.
• Модели ҳайвони зинда истифода шуд: Зиндамонӣ, вазни бадан, бори вирусии шуш ва гистология арзёбӣ шуданд.
• Муқоиса бо Oseltamivir анҷом шуд: Натиҷаҳои THZ2 ҳамроҳ бо назорати зиддивирусии мавҷуда нишон дода шуданд.

Маҳдудиятҳои таҳқиқот

• Peer review нест: Таҳқиқот SSRN preprint аст.
• Клиникӣ нест: THZ2 ба инсон дода нашудааст.
• Намунаи аз бемор гирифташуда нест: Ҳуҷайраҳои ибтидоии роҳи нафаси инсон, organoid-и шуш ё isolate-ҳои вирусии беморон истифода нашудаанд.
• In vivo танҳо PR8 санҷида шудааст: Ҷавоби штамми ба oseltamivir тобовар дар муш арзёбӣ нашудааст.
• Танҳо мушҳои модинаи BALB/c истифода шудаанд: Тафовутҳои ҷинсӣ ва заминаи генетикӣ омӯхта нашудаанд.
• Табобат хеле барвақт оғоз шудааст: Оғоз чор соат пас аз сироят таъхири клиникиро ифода карда наметавонад.
• Роҳи истифода аз ҷиҳати клиникӣ маҳдуд аст: THZ2 бо тазриқи subcutaneous дода шудааст; истифодаи даҳонӣ ё inhalation омӯхта нашудааст.
• Амнияти дарозмуддат нест: Арзёбии заҳролудӣ бо истифодаи чоррӯза ва назорати ҳафтрӯза маҳдуд аст.
• Ченкуниҳои заҳролудӣ маҳдуданд: Хун, вазифаи узвҳо ва гистопатологияи муфассал гузориш нашудаанд.
• CDK7 сафедаи асосии мизбон аст: Таъсири боздории дарозмуддат ё системавӣ ба транскрипсияи муқаррарӣ ва даври ҳуҷайра кофӣ арзёбӣ нашудааст.
• Маълумоти фармакокинетикӣ нест: Консентратсия, half-life ва tissue distribution-и THZ2 дар хун ва шуш чен нашудааст.
• Маълумоти dose–response маҳдуд аст: Дар таҷрибаи самаранокии муш танҳо ду доза истифода шуд.
• Таҷрибаи табобати дер вуҷуд надорад: Табобати оғозшуда дар соатҳои 12, 24 ё 48 арзёбӣ нашудааст.
• Combination therapy нест: Таъсири THZ2 бо oseltamivir ё дигар antiviral-ҳо омӯхта нашудааст.
• Пайдоиши resistance таҷрибавӣ чен нашудааст: Пешниҳод шудааст, ки ҳадафи мизбон risk-и resistance-ро кам мекунад, аммо serial passage experiment анҷом дода нашудааст.
• Асосан як siRNA истифода шудааст: Таъсирҳои берун аз ҳадаф ва genetic rescue пурра арзёбӣ нашудаанд.
• Importin-α rescue experiment нест: Нишон дода нашудааст, ки дубора додани importin-α интиқоли vRNP-ро барқарор мекунад.
• Механизми танзими Importin-α номаълум аст: Муайян нашудааст, ки CDK7 транскрипсияи генҳои importin-ро таъсир медиҳад ё устувории сафедаро.
• Western blot quantification маҳдуд аст: Дар шакли асосии importin графикҳои муфассали зичӣ нестанд.
• Натиҷаҳои конфокалӣ асосан сифатӣ ҳастанд: Таносуби NP-и ядро/ситоплазма ба таври васеъ гузориш нашудааст.
• Шумораи дақиқи biological replicates дар баъзе таҷрибаҳои ҳуҷайра маҳдуд дода шудааст: Гуфта шудааст, ки таҷрибаҳо ҳадди ақал се маротиба такрор шудаанд.
• Номувофиқии воҳиди THZ2 вуҷуд дорад: Матн nM, шакл µM истифода мекунад.
• Роҳи воридкунӣ номувофиқ аст: Дар toxicology experiment ҳам intraperitoneal ва ҳам subcutaneous навишта шудааст.
• Рӯзи гистологияи шуш номувофиқ аст: Дар усул рӯзи ҳафтум, дар натиҷа ва тавзеҳи шакл рӯзи панҷум навишта шудааст.
• Рақамҳои иҷозати ахлоқӣ фарқ мекунанд: Дар усул 20230601-0010, дар қисми ахлоқӣ 20230606-0013 дода шудааст.
• Шумораи ибтидоии ҳайвоноти гурӯҳҳои самаранокии муш равшан нест: Шумораи ҳайвонот дар тавзеҳи шакли зиндамонӣ муфассал нишон дода нашудааст.
• Oseltamivir зиндамонии баландтар аз THZ2 фароҳам овардааст: Дар модели истифодашуда oseltamivir %100 ва THZ2-и дозаи баланд %70 зиндамонӣ нишон додааст.

Таҳқиқот чӣ мегӯяд?

• CDK7 дар шароити фарҳанги ҳуҷайраи санҷидашуда барои афзоиши вируси Influenza A омили муҳими мизбон аст.
• Хомӯшкунии CDK7 титри чор штамми гуногуни IAV-ро кам кардааст.
• Штамми H1N1-и ба oseltamivir тобовар низ ба хомӯшкунии CDK7 ҳассос будааст.
• Се ингибитори гуногуни CDK7 афзоиши PR8-ро вобаста ба доза кам кардаанд.
• Таъсири THZ2 пас аз ворид шудани вирус ба ҳуҷайра, дар давраи барвақти тақрибан 2–4 соат пайдо шудааст.
• Боздории CDK7 пайвастшавӣ, воридшавӣ ё fusion-и эндосомалии вирусро ба таври назаррас бознадоштааст.
• Боздории CDK7 воридшавии vRNP-ҳоро ба ядро коҳиш додааст.
• THZ2 ва si-CDK7 сафедаҳои importin-α1, α3, α5 ва α7-ро коҳиш додаанд.
• Сатҳи Importin-β1 асосан нигоҳ дошта шудааст.
• Ҳамкории мустақими устувор байни CDK7 ва NP-и вирусӣ нишон дода нашудааст.
• Боздории CDK7 фосфорилатсияи RNA polymerase II ва синтези RNA-и вирусиро кам кардааст.
• THZ2 дар мушҳо марги вобаста ба PR8, бори вирусии шуш ва патологияи шушро коҳиш додааст.

Таҳқиқот чӣ намегӯяд?

• Нишон намедиҳад, ки THZ2 гриппро дар инсон табобат мекунад.
• Нишон намедиҳад, ки THZ2 доруи клиникии тасдиқшудаи influenza аст.
• Барои инсон дозаи муассир ё бехатар муайян намекунад.
• Нишон намедиҳад, ки THZ2 рӯзҳо пас аз оғози нишонаҳо муассир аст.
• Нишон намедиҳад, ки THZ2 метавонад даҳонӣ ё бо inhalation истифода шавад.
• Ба таври қатъӣ исбот намекунад, ки дар host-targeted therapy resistance пайдо намешавад.
• Нишон намедиҳад, ки боздории CDK7 дар истифодаи дарозмуддат бехатар аст.
• Исбот намекунад, ки коҳиши importin-α ягона сабаби таъсири зиддивирусӣ аст.
• Нишон намедиҳад, ки CDK7 генҳои importin-α-ро мустақим бо phosphorylation ё transcription танзим мекунад.
• Нишон намедиҳад, ки THZ2 бар ҳамаи штаммҳои Influenza A, Influenza B ё вирусҳои influenza-и паранда таъсир дорад.
• Нишон намедиҳад, ки сирояти ба oseltamivir тобоварро дар ҳайвон табобат мекунад.
• Нишон намедиҳад, ки THZ2 аз oseltamivir беҳтар аст.
• Ягон усули табобат ё пешгирии худистифодашаванда барои беморон пешниҳод намекунад.

Аҳамият аз нуқтаи назари гузашта

Таҳқиқоти influenza муддати дароз ба ҳадафҳои мустақими вирусӣ, аз қабили viral neuraminidase, M2 ion channel ва viral polymerase равона буд. Гарчанде ин равиш доруҳои муассир дод, мутацияҳои вирусӣ метавонанд ҳассосият ба доруро тағйир диҳанд.

Таҳқиқоти равонашуда ба омилҳои ҳуҷайраи мизбон кӯшиш мекунанд вобастагиҳои ҳуҷайравиро пайдо кунанд, ки вирус истифода мебарад ва онҳо тағйир намеёбанд ё сусттар тағйир меёбанд. Пас аз таҳқиқоти вобаста ба CDK1, CDK4, CDK8/19 ва CDK9 дар афзоиши influenza, ин таҳқиқот CDK7-ро ба ҳамин чаҳорчӯба илова мекунад.

Аҳамияти имрӯз

Мушоҳидаи асосии илмии таҳқиқот CDK7-ро на танҳо ҳамчун enzyme-и умумии transcription, балки ҳамчун танзимгари дастгиркунандаи vRNP nuclear transport муайян мекунад.

Пайванди пешниҳодшудаи CDK7–importin-α ба гиреҳи нави ҳуҷайраи мизбон ишора мекунад, ки метавонад дар даври зиндагии вирус бо дору ҳадаф гирифта шавад. Махсусан, боздошта шудани вируси ба oseltamivir тобовар дар фарҳанги ҳуҷайра нишон медиҳад, ки механизм аз neuraminidase-и вирусӣ мустақил аст.

Аҳамият барои оянда

Барои интиқоли натиҷаҳо ба рушди клиникӣ таҳқиқоти зерин лозиманд:

• Муайян кардани он ки CDK7 генҳои importin-α-ро чӣ гуна танзим мекунад
• Importin-α rescue experiments
• Genetic rescue бо CDK7-и ба siRNA тобовар
• Ҳуҷайраҳои ибтидоии роҳи нафаси инсон ва lung organoids
• Isolate-ҳои influenza аз беморон
• Таҷрибаҳои ҳайвонот бо штаммҳои ба oseltamivir ва baloxavir тобовар
• Influenza B ва штаммҳои influenza аз ҳайвоноти гуногун
• Таҳқиқоти консентратсияи THZ2 дар бофтаи шуш ва фармакокинетика
• Формулятсияҳои даҳонӣ ва inhalation
• Таҷрибаҳои оғози деркардаи табобат
• Таҷрибаҳои якҷоя бо oseltamivir ё baloxavir
• Таҳлили пайдоиши resistance бо serial passage
• Long-term hematological, immunological ва organ toxicity
• Таҳияи derivatives-и бештар selective ва short-acting барои CDK7
• Моделҳои калонтари ҳайвонот, ки ба низоми нафаскашии инсон наздиктаранд
• Пас аз preclinical safety-и кофӣ, controlled human studies

Маъно барои зиндагии рӯзмарра ва бемор

Ин таҳқиқот натиҷаи клиникиеро пешниҳод намекунад, ки табобати мавҷудаи гриппро тағйир диҳад. THZ2 пайвастагии таҳқиқотӣ аст ва доруи тасдиқшуда барои истифодаи беморони грипп нест.

Аҳамияти эҳтимолии дарозмуддати таҳқиқот барои зиндагии рӯзмарра дар имкони таҳияи синфҳои нави доруҳоест, ки ба ҷои сафедаҳои вирусӣ низомҳои интиқоли ҳуҷайравиро ҳадаф мегиранд, ки вирус ба онҳо ниёз дорад.

Барои амалӣ шудани ин, байни таъсири зиддивирусӣ ва нигоҳ доштани вазифаҳои муқаррарии ҳуҷайра тавозуни хеле нозук лозим аст. Азбаски CDK7 барои транскрипсияи муқаррарии ген ва даври ҳуҷайра муҳим аст, боздории беназорат ё дарозмуддат бехатар ҳисобида шуда наметавонад.

Усул ва Натиҷаҳои Таҳқиқот

Хулосаи техникии тарҳи таҳқиқот

Вирусҳои Influenza A-и санҷидашуда

Таъсири хомӯшкунии CDK7 ба титри вирусӣ

Титри логарифмии вирус чӣ гуна тафсир мешавад?

Вақте титрҳои вирусӣ дар миқёси log₁₀ дода мешаванд, коҳиши як воҳид тағйироти даҳмаротибаро ифода мекунад:

\[ 1\ \log_{10}\ \mathrm{azalma} = 10\ \mathrm{kat\ azalma} \]

\[ 2\ \log_{10}\ \mathrm{azalma} = 100\ \mathrm{kat\ azalma} \]

\[ 3\ \log_{10}\ \mathrm{azalma} = 1000\ \mathrm{kat\ azalma} \]

Аз ин рӯ, коҳиши 2,36 log₁₀ на коҳиши ҳамагӣ 2,36 дарсад, балки тақрибан 229 маротиба кам шудани истеҳсоли вируси сирояткунанда мебошад.

Муқоисаи техникии марҳилаҳои сироят

Натиҷаҳои Importin

Натиҷаҳои техникии таҷрибаи муш

Номувофиқиҳои гузоришдиҳӣ

Равиши оморӣ

• Гуфта шудааст, ки таҷрибаҳо ҳадди ақал се маротиба такрор шудаанд.
• Натиҷаҳо ҳамчун миёна ± standard error — SEM пешниҳод шудаанд.
• Барои муқоисаи ду гурӯҳ Student t test истифода шудааст.
• Барои зиёда аз ду гурӯҳ one-way ANOVA истифода шудааст.
• Барои survival curves дар тавзеҳи Шакли 6 log-rank test гузориш шудааст.
• Ҳадди аҳамияти оморӣ p < 0,05 қабул шудааст.

Дар баъзе графикҳои таҷрибаҳои ҳуҷайра шумораи дақиқи biological replicates нишон дода нашудааст. Шумораи умумии ибтидоии ҳайвонот дар таҷрибаи зиндамонии муш низ дар усули асосӣ ва тавзеҳҳои шакл равшан дода нашудааст.

Муҳимтарин натиҷаи техникӣ

Муҳимтарин натиҷаи техникии таҳқиқот нишон додани он аст, ки CDK7 на пеш аз воридшавии вируси Influenza A ба ҳуҷайра, балки дар марҳилаи муҳимме, ки баъди воридшавӣ vRNP-ҳо ба ядро интиқол меёбанд, зарур аст.

Хомӯшкунии генетикӣ, се ингибитори гуногуни фармакологӣ, таҷрибаи вақтбандӣ, микроскопияи конфокалӣ ва таҳлили сафедаҳои importin ба як модели умумӣ ишора мекунанд:

\[ \mathrm{CDK7} \rightarrow \mathrm{Importin\!-\alpha\ homeostazı} \rightarrow \mathrm{vRNP\ çekirdek\ girişi} \rightarrow \mathrm{viral\ transkripsiyon\ ve\ çoğalma} \]

THZ2 ин занҷирро дар фарҳанги ҳуҷайра ва модели муш боздоштааст. Аммо азбаски дору CDK7-ро ҳадаф мегирад, ки дар транскрипсияи ҳуҷайраи мизбон нақши асосӣ дорад, барои истифодаи клиникӣ амният ва вақтбандии табобат ба андозаи таъсири зиддивирусӣ муҳим хоҳанд буд.

Ёддошт оид ба Манбаъ ва Усул

Ин мундариҷа ба таҳқиқоти Mingxin Zhang, Xiaoqin Lian, Yarou Gao, Yang Yu, Zhuogang Li, Lefang Jiang, Haonan Zhang, Yue Su, Jiaxin Ke, Xingjian Zhu, Qun Peng, Weisan Chen ва Xulin Chen бо унвони “Inhibition of CDK7 Suppresses Influenza A Virus Replication: Insights into Host-Dependent Antiviral Mechanisms” асос ёфтааст.

Таҳқиқот preclinical in vitro ва animal research аст, ки ҳуҷайраҳои эпителиалии шуши инсонии A549, ҳуҷайраҳои гурдаи саги MDCK, чор штамми Influenza A, siRNA-и CDK7, ингибиторҳои THZ2, Mevociclib ва LDC4297, ченкунии титри вирусӣ, Western blot, qRT-PCR, микроскопияи конфокалӣ, ко-иммунопреципитатсия ва мушҳои BALB/c бо сирояти марговари PR8-ро якҷо мекунад.

Ин клиникӣ дар инсон анҷомёфта нест. Маълумот оид ба бемори грипп, гурӯҳи табобати инсон, давомнокии нишонаҳои клиникӣ, бистаришавӣ, оризаҳо ё амнияти инсон вуҷуд надорад.

Дар матн ифодаҳои “This preprint research paper has not been peer reviewed” ва “Preprint not peer reviewed” ба таври равшан ҷой доранд. Аз ин рӯ, таҳқиқот аз peer review нагузаштааст. Дар PDF DOI ё қабули ниҳоии тасдиқшудаи маҷалла мавҷуд нест.

Барои таҷрибаҳои ҳайвонот рақами иҷозати IACUC-и Jinan University дар қисми усулҳо 20230601-0010 ва дар изҳороти ахлоқӣ 20230606-0013 дода шудааст. Сабаби фарқи ин ду рақам шарҳ дода нашудааст.

Роҳи воридкунии THZ2 дар таҷрибаи токсикологӣ дар қисми усулҳо intraperitoneal, дар натиҷа ва тавзеҳи шакл subcutaneous навишта шудааст. Гистологияи шуш дар усул рӯзи ҳафтум, дар натиҷа ва тавзеҳи шакл рӯзи панҷум нишон дода шудааст.

Дар натиҷаҳои ситотоксикии THZ2 байни воҳидҳои nM ва µM номувофиқии равшан вуҷуд дорад. Ҳангоми тафсири IC₅₀ ва selectivity index-и таҳқиқот ин фарқи гузоришдиҳӣ бояд ба назар гирифта шавад.

Таҳқиқот пешниҳод мекунад, ки ҳадаф гирифтани host factor метавонад risk-и antiviral resistance-ро кам кунад; аммо serial viral passage, resistance selection ё evolutionary escape experiment анҷом дода нашудааст.

Фармакокинетикаи THZ2 дар инсон, дозаи мувофиқи зиддивирусӣ, амнияти дарозмуддат, таъсирҳои иммунӣ ва treatment window омӯхта нашудаанд. Оғози табобат чор соат пас аз сироят дар муш нишон намедиҳад, ки истифода дар инсон баъди оғози нишонаҳо низ муассир хоҳад буд.

Байни коҳиши сафедаҳои importin-α ва халалдор шудани воридшавии vRNP ба ядро робитаи мутобиқ нишон дода шудааст; аммо rescue experiment бо дубора ифода кардани importin-α вуҷуд надорад. Муайян нашудааст, ки CDK7 сатҳи importin-α-ро тавассути кадом механизми transcriptional ё protein stability танзим мекунад.

Ин мақола танҳо дар асоси усулҳо, формулаҳо, графикҳо, тасвирҳои микроскопӣ, натиҷаҳои Western blot, таҷрибаҳои ҳайвонот ва тафсирҳои муаллифони PDF-и боршуда омода шудааст. Ягон иддаои human efficacy, clinical treatment, definite safety, resistance guarantee ё approved drug, ки дар PDF нест, илова нашудааст.