Virusi vya Influenza A havitegemei tu protini zake za virusi kwa ajili ya kujizalisha, bali pia hutegemea mifumo ya usafirishaji na uelezaji wa jeni ya seli inayoiambukiza. Baada ya virusi kuingia ndani ya seli, kompleksii za ribonukleoproteini za virusi, yaani vRNP, zinazobeba jenomu ya virusi lazima zifikie kiini cha seli. Hatua hii isipofanyika, unakili wa RNA ya virusi na urudufishaji wa jenomu hauwezi kuanza kwa ufanisi.

Utafiti uliochunguzwa ulitathmini kama cyclin-dependent kinase 7, yaani CDK7, ambayo ni mojawapo ya protini za seli yenyewe, ni muhimu kwa uzalianaji wa virusi vya influenza A. Watafiti walikandamiza CDK7 kwa njia mbili tofauti:

• Kunyamazisha jeni kwa siRNA inayolenga mRNA ya CDK7
• Kuzuia kifamasia kwa vizuizi vya molekuli ndogo vya CDK7 vinavyoitwa THZ2, Mevociclib na LDC4297

CDK7 iliponyamazishwa au kuzuiwa, kufungamana kwa virusi kwenye uso wa seli, kuingizwa ndani ya seli na kuvuka kutoka kwenye utando wa endosomu kwenda sitoplazimu hakukuharibika kwa kiwango kinachoonekana. Kinyume chake, usafirishaji wa kompleksii za ribonukleoproteini za virusi kutoka sitoplazimu kwenda kiini ulizuiliwa.

Utaratibu mkuu unaopendekezwa na utafiti ni huu:

\[ \mathrm{CDK7\ etkinliği} \rightarrow \mathrm{Importin\!-\alpha\ proteinlerinin\ korunması} \rightarrow \mathrm{vRNP\ çekirdek\ taşınması} \rightarrow \mathrm{viral\ RNA\ sentezi} \rightarrow \mathrm{IAV\ çoğalması} \]

CDK7 inapokandamizwa:

\[ \mathrm{CDK7}\downarrow \rightarrow \mathrm{Importin\!-\alpha1,\alpha3,\alpha5,\alpha7}\downarrow \rightarrow \mathrm{vRNP\ çekirdek\ girişi}\downarrow \rightarrow \mathrm{viral\ NP,\ mRNA,\ cRNA,\ vRNA}\downarrow \rightarrow \mathrm{enfeksiyöz\ virüs\ üretimi}\downarrow \]

Protini za Importin-α ni adapta za usafirishaji zinazotambua miundo mikubwa ya molekuli inayopaswa kupelekwa kiini. Hutambua ishara za uelekezaji wa kiini kwenye protini ya NP ya influenza na, pamoja na importin-β, hupatanisha kupita kwa vRNP kupitia matundu ya utando wa kiini.

Kunyamazishwa kwa CDK7 kijeni kulipunguza tita ya virusi katika aina zote nne za virusi vya influenza A zilizojaribiwa:

Uwiano huu haukutolewa moja kwa moja katika utafiti. Ili mabadiliko ya log₁₀ yaliyoripotiwa yaeleweke kwa urahisi zaidi, yalihesabiwa kwa uhusiano huu wa msingi:

\[ \mathrm{Kat\ azalma} = 10^{\Delta \log_{10}} \]

Wakati CDK7 iliponyamazishwa, hakuna upungufu dhahiri wa uhai wa seli ulioripotiwa; hata hivyo, mRNA ya virusi ya M2, nukleoproteini NP ya virusi na uzalishaji wa virusi vya kuambukiza vilipungua. Matokeo haya yanaunga mkono kwamba athari ya antiviral iliyozingatiwa haikutokana tu na seli kufa kwa ujumla.

Katika majaribio ya kifamasia, THZ2, Mevociclib na LDC4297 zilikandamiza uzalianaji wa PR8 kwa kutegemea dozi katika seli za epitheliamu ya mapafu ya binadamu A549 na seli za figo za mbwa MDCK. Dozi za antiviral zilizotumiwa zimeonyeshwa katika Kielelezo 2 kama ifuatavyo:

• THZ2: 0,15, 0,30 na 0,60 µM
• Mevociclib: 1,2, 2,4 na 4,8 µM
• LDC4297: 1,2, 2,4 na 4,8 µM
• Udhibiti chanya wa ribavirin: 120 µM

THZ2 ilionyesha ustahimilivu bora wa seli kuliko vizuizi vingine viwili vya CDK7. Katika sehemu ya majadiliano ya utafiti, kwa THZ2 katika seli za A549 iliripotiwa:

\[ \mathrm{IC}_{50} = 0{,}2\ \mu M \]

na:

\[ \mathrm{SI} > 1600 \]

iliripotiwa.

Hapa IC₅₀ ni mkusanyiko unaopunguza uzalianaji wa virusi kwa asilimia 50, huku fahirisi ya uteuzi ikionyesha kiwango ambacho ufanisi wa antiviral umetenganishwa na sumu kwa seli:

\[ \mathrm{SI} = \frac{\mathrm{CC}_{50}} {\mathrm{IC}_{50}} \]

CC₅₀ ni mkusanyiko unaopunguza uhai wa seli kwa asilimia 50. Kwa IC₅₀ ya 0,2 µM na SI kubwa kuliko 1600, kihisabati CC₅₀ inapaswa kuwa kubwa kuliko 320 µM.

Hata hivyo, kuna kutolingana muhimu kwa vitengo katika PDF. Maandishi ya matokeo yanasema THZ2 haikuonyesha sumu ya maana hadi 320 nM katika seli za A549 na hadi 80 nM katika seli za MDCK, ilhali mhimili mlalo wa grafu za sitotoksisiti katika Kielelezo 2 umeonyeshwa kama 5–320 µM. Hesabu za IC₅₀ na SI zinaonekana kuendana zaidi na kitengo cha µM katika vielelezo; hata hivyo, bila kuurekebisha utafiti, tofauti hii ya kitengo inapaswa kuchukuliwa kama tatizo la wazi la uripoti.

Majaribio ya muda yalionyesha kwamba THZ2 inalenga hatua ya mapema baada ya virusi kuingia ndani ya seli. THZ2 ilipoongezwa wakati wa maambukizi au saa mbili baada ya maambukizi, ilikandamiza kwa nguvu mkusanyiko wa NP ya virusi. Ilipoongezwa saa ya nne au baadaye, athari hiyo kubwa haikuonekana.

Matokeo haya yanaonyesha kuwa dirisha muhimu linalotegemea CDK7 liko takriban kati ya:

\[ 2\ \mathrm{saat} < \mathrm{kritik\ basamak} < 4\ \mathrm{saat} \]

inaonyesha kuwa iko kati ya muda huo.

Majaribio ya hadubini konfokali yalionyesha kwamba hatua za kufungamana kwa virusi, kuingizwa ndani ya seli na kuungana kwa utando hazikuathiriwa na ukandamizaji wa CDK7. Katika seli za udhibiti, ishara ya NP ya virusi ilijikusanya ndani ya kiini katika saa ya 4., 6. na 8.; katika seli zilizotibiwa kwa THZ2 au zilizonyamazishwa CDK7, NP ilibaki kwa kiasi kikubwa katika sitoplazimu.

Ufungamanaji wa moja kwa moja wa kimaumbile kati ya CDK7 na NP ya virusi ulitafutwa; katika jaribio la ko-immunoprecipitation iliripotiwa kwamba CDK7 haikuvutwa pamoja na NP. Kwa hiyo watafiti walipendekeza kwamba CDK7 huathiri usafirishaji wa vRNP si kwa kufungamana moja kwa moja na NP, bali kwa kudhibiti mfumo wa usafirishaji wa seli.

Matibabu ya THZ2 na CDK7 siRNA yalipunguza protini za importin-α1, importin-α3, importin-α5 na importin-α7, lakini hayakubadilisha sana kiwango cha importin-β1. Muundo huu wa kuchagua ndio kiungo kikuu cha majaribio kinachoeleza kwa nini usafirishaji wa vRNP kwenda kiini ulivurugika.

Data za ziada za utafiti zilionyesha pia kwamba ukandamizaji wa CDK7 ulipunguza fosforilesheni ya RNA polymerase II na viwango vya mRNA, cRNA na vRNA vya jeni ya influenza M2. Kwa hiyo, CDK7 inadhaniwa kusaidia uzalianaji wa virusi kupitia kazi mbili zinazohusiana:

1. Kudumisha kiwango cha importin-α na hivyo kuwezesha vRNP kuingia kiini
2. Kusaidia shughuli ya RNA polymerase II na hivyo kudumisha mazingira ya unakili wa mwenyeji yanayohitajika kwa unakili wa mRNA ya virusi

THZ2 ilijaribiwa baadaye katika panya jike BALB/c walioambukizwa PR8 kwa kiwango cha kuua. Matibabu yalianza saa nne baada ya maambukizi na yalitolewa mara mbili kwa siku kwa siku nne.

Matokeo ya uhai siku ya kumi na nne yalikuwa:

Dozi kubwa ya THZ2 iliongeza uhai kutoka asilimia 20 hadi asilimia 70 ikilinganishwa na kundi la kibebaji. Hili ni ongezeko kamili la pointi 50 za asilimia. Oseltamivir, katika modeli iliyotumiwa, ilitoa uhai wa asilimia 100.

Dozi ya THZ2 ya 20 mg/kg/gün ilipunguza mzigo wa virusi kwenye mapafu kwa 3,3 log₁₀ siku ya tatu na 2,6 log₁₀ siku ya tano. Kwa maelezo, tofauti hizi za logarithimu zina maana takriban:

• Siku ya tatu: takriban kupungua mara 1.995
• Siku ya tano: takriban kupungua mara 398

ndivyo maana yake.

Katika histolojia ya mapafu, panya walioambukizwa waliopokea kibebaji walionyesha uingizaji wa seli za uchochezi, unene wa kuta za alveoli na eksudati, ilhali katika panya waliopokea THZ2, mabadiliko haya yaliripotiwa kuwa mepesi zaidi.

Hata hivyo, matokeo haya hayaonyeshi kwamba THZ2 ni tiba ya mafua kwa binadamu. THZ2 imetathminiwa tu katika utamaduni wa seli na modeli ya panya. Dozi inayofaa kwa binadamu, njia ya utoaji, muda wa kuanza matibabu, farmakokinetiki, usalama wa muda mrefu na ufanisi wa kliniki havijulikani.

Tatizo la msingi la utafiti ni lipi?

Sehemu kubwa ya antivirals za influenza zinazopatikana hulenga moja kwa moja protini za virusi. Oseltamivir hulenga neuraminidase, huku baloxavir ikiwa mfano wa dawa inayolenga shughuli ya endonuclease inayotegemea cap ya polymerase ya virusi.

Kwa sababu protini za virusi zinaweza kubadilika kwa mutasheni, matumizi ya muda mrefu au yaliyoenea ya antiviral yanaweza kuchagua virusi vyenye unyeti mdogo kwa dawa. Utafiti huu unalifikia tatizo hilo kwa mwelekeo tofauti: kulenga si virusi yenyewe, bali protini ya seli mwenyeji ambayo virusi huitumia kuzaliana.

Faida inayodhaniwa ya mkabala huu ni kwamba jeni za seli hubadilika polepole zaidi kuliko jenomu ya virusi. Hata hivyo, kwa kuwa malengo ya seli pia yana majukumu katika fiziolojia ya kawaida ya binadamu, usalama ni hatari muhimu. CDK7 ni muhimu kwa mzunguko wa seli na unakili unaoendeshwa na RNA polymerase II, hivyo uwiano kati ya athari ya antiviral na sumu kwa mwenyeji lazima utathminiwe kwa uangalifu mkubwa.

Kwa nini virusi vya Influenza A lazima viingie kwenye kiini cha seli?

Virusi vya Influenza A vina jenomu ya RNA yenye maana hasi na iliyogawanywa katika segmenti. Segmenti za RNA ya virusi huunda kompleksii za vRNP pamoja na protini ya NP na vitengo vidogo vya polymerase ya virusi.

Baada ya virusi kuingia kwenye seli, mfuatano wa msingi ni huu:

1. Virusi hufungamana na uso wa seli.
2. Hujiingiza ndani ya seli kwa endocytosis.
3. Endosomu huingia katika hali ya tindikali.
4. Utando wa virusi huungana na utando wa endosomu.
5. Kompleksii za vRNP huachiliwa kwenye sitoplazimu.
6. vRNP husafirishwa kupitia matundu ya kiini hadi ndani ya kiini.
7. Unakili wa RNA ya virusi na urudufishaji wa jenomu hufanyika ndani ya kiini.

Mpito muhimu unaolengwa na utafiti uko kati ya hatua ya tano na ya sita. Virusi vinaweza kuingia kwenye seli na kutoka kwenye endosomu, lakini vRNP haziwezi kufika kwa ufanisi kwenye kiini.

vRNP ni nini?

vRNP ni kifupi cha Kiingereza cha viral ribonucleoprotein complex. Kila segmenti ya RNA ya influenza hufungwa pamoja na:

• RNA ya virusi,
• molekuli nyingi za NP,
• polymerase ya virusi yenye vitengo vidogo PB1, PB2 na PA

hufungwa pamoja.

vRNP si kifungashio cha nyenzo ya kijeni tu. Ni mashine ya molekuli inayofanya kazi katika kulinda RNA ya virusi, kuisoma, kuinakili na kuipitisha kwenye virusi vipya.

Mfumo wa Importin-α/β hufanya kazi vipi?

Kiini cha seli kimezungukwa na utando wenye tabaka mbili. Molekuli ndogo zinaweza kwa kiwango fulani kupita kwa usambazaji usio hai, lakini kompleksii kubwa kama vRNP zinahitaji usafirishaji hai ili kuingia kiini.

Mfumo wa kawaida wa usafirishaji wa kiini unaweza kuonyeshwa kwa urahisi hivi:

\[ \mathrm{Kargo\!-\!NLS} + \mathrm{Importin\!-\alpha} + \mathrm{Importin\!-\beta} \rightarrow \mathrm{Çekirdek\ gözenek\ kompleksi} \rightarrow \mathrm{Çekirdek} \]

Hapa:

• NLS ni ishara ya uelekezaji wa kiini.
• Importin-α ni adapta inayotambua NLS kwenye kargo.
• Importin-β hupatanisha mwingiliano wa kompleksii na mfumo wa matundu ya kiini.

Maeneo ya NLS kwenye protini ya NP ya influenza hutambuliwa na importin-α. Kiasi cha importin-α kinapopungua, uwezo wa vRNP kuingia kiini unaweza kushuka.

CDK7 hufanya nini kwa kawaida?

CDK7 ni mwanachama wa familia ya cyclin-dependent kinase. Ina kazi mbili kuu ndani ya seli:

• Kuchangia uanzishaji wa CDK nyingine zinazodhibiti mzunguko wa seli
• Kama sehemu ya kompleksii ya TFIIH, kufosforilisha eneo la C-terminal la RNA polymerase II

Fosforilesheni ya RNA polymerase II ni muhimu kwa kuanzishwa na kuendelea kwa unakili wa jeni. Virusi vya influenza hutumia mfumo wa RNA polymerase II wa seli wakati wa kuzalisha mRNA ya virusi.

Utafiti unapendekeza kwamba CDK7 haisaidii virusi kupitia unakili wa jumla tu, bali pia kwa kudumisha viwango vya protini za importin-α na hivyo kusaidia usafirishaji wa jenomu ya virusi hadi kiini.

Jaribio la kunyamazisha jeni lilifanywaje?

Seli za epitheliamu ya mapafu ya binadamu A549 zilitransfektiwa kwa RNA ndogo zinazoingilia zinazolenga mRNA ya CDK7. siRNA tatu tofauti zilitathminiwa mwanzoni, na si-CDK7-1, iliyoonyesha ukandamizaji mkubwa zaidi, ikatumika katika majaribio yaliyofuata.

Matumizi ya msingi:

• Mkusanyiko wa siRNA: 50 nM
• Lipofectamine 3000: 5 µL
• Udhibiti: si-NC isiyolenga

Katika Kielelezo 1, si-CDK7 ilipunguza mRNA na protini ya CDK7 bila kupunguza kwa kiasi kikubwa uhai wa seli.

Kwa nini aina nyingi za virusi zilitumika?

Ili kuona kama athari ya CDK7 ilikuwa maalum tu kwa PR8, virusi vya maabara vilivyotumika kwa muda mrefu, aina nne za virusi vya influenza A zilitumika:

• A/Puerto Rico/8/1934 — PR8, H1N1
• A/Human/Hubei/1/2009 — pandemik H1N1
• Derivati ya PR8 sugu kwa oseltamivir — H1N1-Ost-R
• A/Human/Hubei/3/2005 — H3N2

Virusi vilitumika kwa wingi mdogo wa maambukizi:

\[ \mathrm{MOI} = 0{,}05 \]

zilitumika.

MOI huonyesha wastani wa kiasi cha virusi vya kuambukiza kwa kila seli. MOI 0,05 ni mpangilio wa maambukizi ya chini ambapo si kila seli hukutana na virusi mwanzoni. Hii huruhusu kuenea kwa virusi kutathminiwa katika mizunguko kadhaa ya uzalianaji.

Kielelezo 1 kinaonyesha nini?

Kielelezo 1 kinakusanya matokeo ya kunyamazishwa kwa CDK7 katika aina tofauti za influenza:

• Uhai wa seli ulihifadhiwa.
• Kiwango cha mRNA na protini ya CDK7 kilipungua.
• Bendi za protini ya NP ya virusi zilidhoofika.
• Viwango vya M2 mRNA vilipungua.
• Tita za virusi vya kuambukiza zilipungua katika aina zote nne.

Kupungua kwa tita kwa 2,17 log₁₀ katika H1N1 sugu kwa oseltamivir kunaunga mkono kwamba lengo ni huru na neuraminidase ya virusi inayolengwa na oseltamivir.

Hata hivyo, virusi sugu kwa oseltamivir vilitathminiwa tu katika utamaduni wa seli. Haijaonyeshwa kwamba THZ2 hutibu maambukizi ya influenza sugu kwa oseltamivir katika wanyama au binadamu.

Kikomo cha kimakanika cha jaribio la kunyamazisha jeni

Ingawa siRNA tatu zilitathminiwa mwanzoni, majaribio ya baadaye yalitegemea hasa siRNA moja. Athari zisizo lengwa za siRNA moja haziwezi kuondolewa kabisa.

Utafiti haukujumuisha jaribio la uokoaji ambapo jeni ya CDK7 isiyoathiriwa na siRNA ingerudishwa ili kuona kama fenotipu ya antiviral ingerudi nyuma. Jaribio kama hilo lingeweza kuthibitisha kwa nguvu zaidi kwamba matokeo yaliyotazamwa yalitokana moja kwa moja na upotevu wa CDK7.

Ulinganisho wa vizuizi vitatu vya CDK7

Watafiti walitumia misombo mitatu kuthibitisha kifamasia matokeo ya kijeni:

Misombo yote mitatu ilipunguza kwa kutegemea dozi tita ya virusi na protini ya NP katika seli za A549 na MDCK. Matokeo yanayofanana kutoka kwa vizuizi vitatu vya miundo tofauti ya kemikali yanaunga mkono umuhimu wa CDK7 kama lengo.

Hata hivyo, athari za vizuizi hivi kwa kinase nyingine zisizolengwa hazikuchunguzwa kwa kina. Ulinganifu wa matokeo ya kifamasia na kunyamazishwa kwa jeni huongeza imani, lakini hauonyeshi uteuzi kamili wa lengo.

Kielelezo 2 kinaonyesha nini?

Kielelezo 2 kina:

• Miundo ya kemikali ya THZ2, Mevociclib na LDC4297,
• Grafu za dozi–uhai katika seli za A549 na MDCK,
• Nguzo za tita ya virusi,
• Western blot za NP na GAPDH

vimejumuishwa.

THZ2 ilionyesha athari kubwa ya antiviral katika mikusanyiko ya chini ya mikromola. Mevociclib na LDC4297 zilipunguza uhai wa seli kwa nguvu zaidi katika dozi za juu.

Katika baadhi ya vichwa vya Kielelezo, “TH2” imeandikwa badala ya THZ2. Aidha, kitengo cha µM kwenye mihimili ya sitotoksisiti hakilingani na maelezo ya nM kwenye maandishi ya matokeo. Tofauti hii ya uripoti hufanya tafsiri sahihi ya dirisha la tiba kuwa ngumu.

Kwa nini jaribio la kuongeza dawa kwa nyakati tofauti ni muhimu?

Ili kuelewa ni hatua gani inayolengwa na kiambatanisho cha antiviral, dawa lazima iongezwe katika nyakati tofauti za maambukizi.

Katika utafiti, THZ2 ilitumika kwa mipangilio hii:

• Kabla ya maambukizi
• Wakati mmoja na virusi
• Ndani ya saa ya kwanza baada ya maambukizi
• Kwa kuendelea baada ya maambukizi

Katika mipangilio hii yote, uzalishaji wa virusi saa ya 24. ulipungua. Katika jaribio la kina zaidi, THZ2:

• Ilikuwa na ufanisi ilipotolewa saa ya 0.,
• Ilikuwa na ufanisi ilipotolewa saa ya 2.,
• Haikuwa na ufanisi mkubwa ilipotolewa saa ya 4. au baadaye

ndivyo ilivyopatikana.

Hili lilipendekeza kwamba CDK7 inahitajika kwa tukio la mapema la mzunguko wa maisha ya virusi, lakini baada ya hatua za kufungamana na kuingia.

Kielelezo 3 kinaonyesha nini?

Paneli za juu za Kielelezo 3 zinaonyesha muda tofauti wa matibabu na tita ya virusi saa ya 24. Paneli za chini za Western blot zinaonyesha mabadiliko ya NP kwa muda baada ya THZ2 au si-CDK7.

Saa ya pili, kiwango cha NP hakikuathiriwa sana na THZ2 au kunyamazishwa kwa CDK7. Kuanzia saa ya nne, mkusanyiko wa NP ulianza kupungua; tofauti iliongezeka saa ya sita na ya nane.

Muundo huu unaunga mkono kwamba hatua za awali za kuingia kwa virusi zinaweza kukamilika, lakini hatua ya kiini inayohitajika kwa kuanza kwa uzalishaji mpya wa RNA na protini za virusi imevurugika.

Je, kufungamana kwa virusi na seli kunaathiriwa?

Katika jaribio la kufungamana, seli zilipozwa hadi 4 °C. Joto la chini hupunguza kuingizwa kwa virusi ndani ya seli huku likiruhusu kufungamana na vipokezi vya uso.

Ishara ya NP kwenye uso wa seli zilizotibiwa kwa THZ2 au si-CDK7 ilikuwa sawa na ya seli za udhibiti. Hivyo ilihitimishwa kwamba ukandamizaji wa CDK7 haukuzuia virusi kushikamana na uso wa seli.

Je, kuingizwa kwa virusi ndani ya seli kunaathiriwa?

Virusi vilivyofungamana vilihifadhiwa kwa saa mbili katika 37 °C na kuingizwa ndani ya seli kulipimwa. THZ2 au kunyamazishwa kwa CDK7 hakukupunguza kwa kiasi kikubwa kuingia kwa ishara ya NP ndani ya seli.

Je, muungano wa endosomu unaathiriwa?

Muungano kati ya utando wa virusi na utando wa endosomu ulitathminiwa kwa jaribio la rangi mbili lenye alama za floresan R18 na DiO.

Bafilomycin A1, iliyotumika kama kizuizi cha muungano, ilipunguza sana ishara ya muungano. Katika makundi ya THZ2 na si-CDK7, ishara za muungano zilikuwa sawa na udhibiti.

Kwa hiyo, kwa mujibu wa data ya utafiti, CDK7:

• haihitajiki kwa kufungamana,
• haihitajiki kwa kuingizwa kupitia endosomu,
• haihitajiki kwa muungano wa utando.

Kizuizi kikuu: kuingia kwa vRNP kwenye kiini

Mahali pa NP ya virusi ndani ya seli palifuatiliwa kwa hadubini konfokali saa ya 4., 6. na 8.

Katika hali ya udhibiti, ishara ya NP iliingia ndani ya viini vilivyowekwa alama kwa DAPI ya buluu. Katika THZ2 au si-CDK7, ishara ya NP ilibaki karibu na kiini na katika sitoplazimu.

Matokeo haya yanaonyesha kwamba, CDK7 inapokandamizwa, kompleksii za vRNP zinaweza kuingia kwenye seli lakini haziwezi kuvuka kwa ufanisi mfumo wa matundu ya kiini.

Ujumbe wa kuona wa Kielelezo 4

Sehemu ya kwanza ya Kielelezo 4 inalinganisha picha za kufungamana, kuingizwa na muungano. Katika paneli hizi, makundi ya THZ2 na si-CDK7 yanafanana kwa kiasi kikubwa na udhibiti.

Katika paneli za usafirishaji wa kiini kwenye ukurasa unaofuata, tofauti kubwa inaonekana:

• Katika seli za udhibiti, ishara ya kijani ya NP inaingiliana na viini.
• Katika kundi la THZ2, NP hubaki kwa kiasi kikubwa nje ya kiini.
• Katika kundi la si-CDK7, mkusanyiko sawa wa sitoplazimu huonekana.
• Tofauti inaendelea saa ya 4., 6. na 8.

Ingawa vielelezo vinatoa tofauti kubwa ya kimaono, usambazaji wa kina wa uwiano wa floresan ya kiini/sitoplazimu haujaonyeshwa katika kielelezo kikuu.

Je, CDK7 hufungamana moja kwa moja na NP ya virusi?

Katika jaribio la ko-immunoprecipitation, CDK7 haikuonekana miongoni mwa protini zilizovutwa na kingamwili ya NP. Watafiti walitafsiri hili kama kutokuwepo kwa mwingiliano wa moja kwa moja CDK7–NP.

Matokeo hasi ya ko-immunoprecipitation yanaunga mkono kutokuwepo kwa muunganisho imara au thabiti. Hata hivyo, hayaondoi kabisa mwingiliano wa muda mfupi, dhaifu au unaovunjika chini ya hali za majaribio.

Kupungua kwa protini za Importin-α

Dozi ya THZ2 ilipoongezeka, bendi za protini zifuatazo zilidhoofika:

• Importin-α1
• Importin-α3
• Importin-α5
• Importin-α7

Bendi ya Importin-β1 ilibaki kwa kiasi kikubwa bila kubadilika. Muundo huo huo wa kuchagua ulionekana wakati CDK7 siRNA ilipotumika.

Hii inaonyesha kwamba si protini zote za usafirishaji wa kiini hupotea kwa ujumla; katika mipaka ya utafiti, hasa isoformu za importin-α zinaonekana kuwa nyeti kwa CDK7.

Utaratibu unaoonyeshwa na Kielelezo 5

Kielelezo 5 kinaonyesha mlolongo huu wa majaribio:

1. CDK7 haikuvutwa pamoja na NP.
2. THZ2 ilipunguza CDK7 na protini za importin-α kwa kutegemea dozi.
3. Importin-β1 ilihifadhiwa kwa kiasi kikubwa.
4. Kunyamazishwa kwa CDK7 kulizalisha upya upotevu huo wa importin-α.
5. Kupungua kwa importin-α kuliambatana na kupungua kwa NP ya virusi.

Hata hivyo, uchambuzi wa kiasi wa msongamano wa protini za importin-α haukuwasilishwa kwenye kielelezo kikuu. Matokeo yanategemea hasa ulinganisho wa bendi za Western blot.

Je, utaratibu umethibitishwa kikamilifu?

Utafiti unaonyesha uhusiano unaolingana kati ya ukandamizaji wa CDK7, kupungua kwa importin-α, kuharibika kwa kuingia kwa vRNP kwenye kiini na kupungua kwa uzalishaji wa virusi.

Hata hivyo, majaribio yafuatayo ambayo yangefunga kikamilifu mnyororo wa kimakanika hayakufanyika:

• Kurejesha importin-α katika seli zilizokandamizwa CDK7
• Kupima kama urejeshaji wa importin-α unaokoa kuingia kwa vRNP kwenye kiini
• Kuonyesha kwamba CDK7 hudhibiti moja kwa moja unakili wa jeni za importin-α
• Kupima kwa utaratibu viwango vya mRNA vya importin-α
• Kupima kiwango cha uharibifu wa protini za importin-α

Kwa hiyo, utafiti unatoa uhusiano mkubwa wa kimakanika, lakini hauonyeshi sababu ya moja kwa moja katika kila hatua ya mnyororo CDK7–importin-α–vRNP.

RNA polymerase II na unakili wa virusi

CDK7, kama sehemu ya kompleksii ya TFIIH, huchangia kufosforilisha mabaki ya serini katika eneo la C-terminal la RNA polymerase II.

Kwa kueleza mantiki ya utafiti, uhusiano unaweza kufupishwa hivi:

\[ \mathrm{CDK7} \rightarrow \mathrm{RNA\ Pol\ II\ CTD\ fosforilasyonu} \rightarrow \mathrm{konak\ mRNA\ transkripsiyonu} \]

Virusi vya influenza huchukua vipande vifupi vyenye cap kutoka kwenye transkripti za RNA polymerase II za seli ili kutoa cap ya mwanzo kwa mRNA ya virusi. Mchakato huu huitwa cap-snatching.

Katika Kielelezo cha Ziada 3, THZ2 au si-CDK7 ilipunguza fosforilesheni ya RNA polymerase II; viwango vya mRNA, cRNA na vRNA vya M2 ya virusi pia vilipungua.

RNA polymerase II inahusiana moja kwa moja na unakili wa mRNA ya virusi. Kupungua kwa cRNA na vRNA kunaweza kuwa matokeo mapana ya kuvurugika kwa kuingia kwa vRNP kwenye kiini, usanisi wa protini za virusi na mzunguko mzima wa uzalianaji wa virusi.

Muundo wa jaribio la panya

Panya jike BALB/c wenye umri wa wiki sita–nane walitumiwa. Panya waliambukizwa kupitia pua kwa PR8 iliyorekebishwa kwa panya katika dozi ya:

\[ 2 \times \mathrm{LD}_{50} \]

ndiyo dozi iliyotumika kuambukiza.

LD₅₀ ni dozi inayotarajiwa kusababisha kifo kwa asilimia 50 ya wanyama wasiopata matibabu. Mbili LD₅₀ ni dozi ya majaribio ya changamoto iliyotumiwa kuunda maambukizi makali na ya kuua.

Matibabu yalianza saa nne baada ya maambukizi na yaliendelea kwa siku nne:

• THZ2: 10 au 20 mg/kg/gün
• Oseltamivir: 20 mg/kg/gün
• Udhibiti wa kibebaji

Uhai na uzito wa mwili ulifuatiliwa kwa siku 14. Tita ya virusi kwenye mapafu ilipimwa siku ya tatu na ya tano, na histolojia ya mapafu ilitathminiwa, kulingana na sehemu za matokeo na vielelezo, siku ya tano.

Jaribio la awali la sumu ya THZ2

Panya wasioambukizwa walipewa THZ2 kwa siku nne katika:

• 20 mg/kg/gün
• 40 mg/kg/gün
• 80 mg/kg/gün

Katika ufuatiliaji wa siku saba, hakuna kifo au kupungua dhahiri kwa uzito wa mwili kulikoonekana.

Hili linaonyesha kutokuwepo kwa sumu kubwa ya muda mfupi. Hata hivyo, tathmini ilitegemea hasa:

• uhai,
• uzito wa mwili,
• mkao wa kujikunja,
• ishara zinazoonekana kama manyoya kusimama

imejikita katika vipengele hivyo.

Hakukuwa na tathmini ya biokemia ya damu, hematolojia, histolojia ya viungo, ukandamizaji wa kinga, sumu ya uzazi au usalama wa muda mrefu.

Kutolingana kwa njia ya utoaji

Katika sehemu ya mbinu, THZ2 katika jaribio la toksikolojia imeelezwa kutolewa intraperitoneal. Katika sehemu ya matokeo na maelezo ya Kielelezo 6, jaribio hilo hilo linaelezwa kama sindano ya subcutaneous.

Katika majaribio ya matibabu, matokeo na maelezo ya vielelezo yanaonyesha THZ2 ikitolewa kwa subcutaneous, na oseltamivir kwa mdomo/intragastric.

Tofauti hii ni muhimu hasa kwa farmakokinetiki na uwezo wa kurudia utafiti. Njia za intraperitoneal na subcutaneous hazitoi wasifu sawa wa ufyonzwaji.

Matokeo ya uhai katika Kielelezo 6

Katika panya walioambukizwa waliopokea kibebaji, kupungua kwa uzito kulianza kwa wazi kuanzia siku ya tatu na uhai ulipungua hadi asilimia 20 siku ya 14.

THZ2 ilionyesha ulinzi unaotegemea dozi:

• 10 mg/kg/gün: %40 uhai
• 20 mg/kg/gün: %70 uhai

Kundi la oseltamivir lilionyesha uhai wa asilimia 100. Kwa hiyo, katika hali za majaribio zilizotumiwa, THZ2 ilitoa ulinzi mkubwa lakini wa chini kuliko oseltamivir.

Mzigo wa virusi kwenye mapafu

THZ2 ya dozi kubwa ilipunguza tita ya virusi ya mapafu siku ya tatu na ya tano:

Katika kundi la oseltamivir, siku ya tano virusi vinaonekana kuwa chini ya kikomo cha kipimo. THZ2 ilipunguza sana mzigo wa virusi, lakini athari ya oseltamivir inaonekana kuwa kubwa zaidi.

Histolojia ya mapafu

Katika kundi la PR8 lililopewa kibebaji, kulionekana:

• uingizaji mkubwa wa seli za uchochezi,
• unene wa kuta za alveoli,
• eksudati katika nafasi za alveoli,
• kuvurugika kwa usanifu wa kawaida wa mapafu

vilionekana.

Katika makundi yaliyopokea THZ2, hasa 20 mg/kg/gün, uchochezi na uharibifu wa muundo uliripotiwa kuwa mdogo.

Picha za histolojia zinaonyesha tofauti za kimaelezo; kwenye kielelezo kikuu hakuna alama ya upofu ya patholojia au fahirisi ya kiasi ya uharibifu wa mapafu iliyowasilishwa.

Kwa nini muda wa matibabu katika jaribio la wanyama ni muhimu?

Matibabu yalianza saa nne tu baada ya maambukizi. Huu ni muda wa majaribio ambapo virusi bado viko katika hatua ya mapema ya uzalianaji.

Kwa binadamu, matibabu ya mafua mara nyingi huanza saa au siku baada ya maambukizi, baada ya dalili kuanza. Katika jaribio la seli, kupotea kwa athari kubwa ya THZ2 baada ya saa ya nne kunaonyesha kuwa dirisha la matumizi ya kliniki linaweza kuwa jembamba.

Ufanisi wa matibabu yaliyoanza saa nne baada ya maambukizi kwa panya hauonyeshi kwamba matibabu yaliyocheleweshwa baada ya dalili kuanza yatakuwa na ufanisi.

Utaratibu wa jumla katika Kielelezo 7

Mchoro wa mwisho wa utafiti unaonyesha kazi mbili zinazohusiana za CDK7:

1. Usafirishaji wa kiini: CDK7 hudumisha kiwango cha importin-α; kompleksii ya importin-α/β husafirisha vRNP kwenda kiini.
2. Unakili: CDK7 hufosforilisha RNA polymerase II; huendeleza mazingira ya unakili wa seli yanayotumiwa kwa uzalishaji wa mRNA ya virusi.

THZ2 inapopewa, importin-α hupungua, kuingia kwa vRNP kwenye kiini huzuiwa, fosforilesheni ya RNA polymerase II hupungua na usanisi wa RNA ya virusi hukandamizwa.

Nguvu za utafiti

• Uthibitisho wa kijeni na kifamasia ulitumika pamoja: siRNA na vizuizi vitatu tofauti vya CDK7 vilitoa matokeo ya antiviral yanayofanana.
• Aina nyingi za influenza A zilijaribiwa: H1N1, H1N1 ya janga, H3N2 na H1N1 sugu kwa oseltamivir zilitathminiwa.
• Mistari miwili ya seli ilitumika: Seli za binadamu A549 na seli za mbwa MDCK zilichunguzwa.
• Mzunguko wa maambukizi uligawanywa katika hatua: Kufungamana, kuingizwa, muungano na usafirishaji wa kiini vilitathminiwa kwa majaribio tofauti.
• Jaribio la muda wa kuongeza dawa lilifanywa: Dirisha muhimu la saa 2–4 lilibainishwa.
• Hadubini konfokali ilitumika: Usambazaji wa NP kati ya sitoplazimu na kiini ulionyeshwa kwa picha.
• Isoformu za importin zilichunguzwa mmoja mmoja: α1, α3, α5, α7 na β1 zililinganishwa.
• Mwingiliano wa moja kwa moja CDK7–NP ulitafutwa: Ko-immunoprecipitation ilifanywa.
• Muunganiko wa RNA polymerase II ulitathminiwa: Katika majaribio ya ziada, fosforilesheni ya Pol II na aina za RNA ya virusi zilipimwa.
• Modeli ya mnyama hai ilitumika: Uhai, uzito wa mwili, mzigo wa virusi wa mapafu na histolojia vilitathminiwa.
• Ulinganisho na oseltamivir ulifanywa: Matokeo ya THZ2 yalionyeshwa pamoja na udhibiti wa antiviral uliopo.

Mapungufu ya utafiti

• Hakuna mapitio ya rika: Utafiti ni preprint ya SSRN.
• Sio utafiti wa kliniki: THZ2 haijatolewa kwa binadamu.
• Hakuna sampuli za mgonjwa: Seli za msingi za njia ya hewa ya binadamu, organoid za mapafu au izolati za virusi kutoka kwa wagonjwa hazikutumika.
• In vivo PR8 pekee ilijaribiwa: Mwitikio wa aina sugu kwa oseltamivir haukutathminiwa kwa panya.
• Panya jike BALB/c pekee walitumika: Tofauti za jinsia na msingi wa kijeni hazikuchunguzwa.
• Matibabu yalianza mapema sana: Saa nne baada ya maambukizi hazionyeshi ucheleweshaji wa kliniki.
• Njia ya utoaji ina ukomo wa kliniki: THZ2 ilitolewa kwa sindano ya subcutaneous; matumizi ya mdomo au kuvuta hewa hayakuchunguzwa.
• Hakuna usalama wa muda mrefu: Tathmini ya sumu ilikuwa siku nne za matumizi na siku saba za ufuatiliaji.
• Vipimo vya sumu ni vichache: Damu, kazi za viungo na histopatholojia ya kina havikuripotiwa.
• CDK7 ni protini ya msingi ya mwenyeji: Athari za ukandamizaji wa muda mrefu au wa mfumo mzima kwenye unakili wa kawaida na mzunguko wa seli hazijachunguzwa vya kutosha.
• Hakuna data ya farmakokinetiki: Mkusanyiko wa THZ2 katika damu na mapafu, nusu-uishi na usambazaji wa tishu haukupimwa.
• Data ya dozi–mwitikio ni ndogo: Katika jaribio la ufanisi kwa panya, dozi mbili tu za THZ2 zilitumika.
• Hakuna jaribio la matibabu yaliyocheleweshwa: Matibabu yaliyoanza saa 12, 24 au 48 hayakutathminiwa.
• Hakuna tiba mchanganyiko: Athari ya THZ2 pamoja na oseltamivir au antivirals nyingine haikuchunguzwa.
• Ukuaji wa usugu haukupimwa moja kwa moja: Ilipendekezwa kuwa kulenga mwenyeji kunaweza kupunguza hatari ya usugu, lakini hakuna jaribio la serial passage lililofanywa.
• siRNA moja ilitumika kwa kiasi kikubwa: Athari zisizo lengwa na uokoaji wa kijeni hazikutathminiwa kikamilifu.
• Hakuna jaribio la uokoaji la Importin-α: Haijaonyeshwa kuwa kurejesha importin-α hurejesha usafirishaji wa vRNP.
• Utaratibu wa udhibiti wa Importin-α haujulikani: Haijabainishwa kama CDK7 inaathiri unakili wa jeni za importin au uthabiti wa protini.
• Uquantification wa Western blot ni mdogo: Kielelezo kikuu cha importin hakina grafu za kina za msongamano.
• Matokeo ya konfokali ni ya kimaelezo kwa kiasi kikubwa: Uwiano wa NP ya kiini/sitoplazimu haujaripotiwa kwa upana.
• Idadi kamili ya marudio ya kibiolojia katika baadhi ya grafu za seli ni ndogo: Imeandikwa kwamba majaribio yalirudiwa angalau mara tatu.
• Kuna kutolingana kwa kitengo cha THZ2: Maandishi yanatumia nM, kielelezo kinatumia µM.
• Njia ya utoaji haitabiriki: Maelezo ya intraperitoneal na subcutaneous yote yanapatikana katika jaribio la toksikolojia.
• Siku ya histolojia ya mapafu haitabiriki: Mbinu zinasema siku ya saba, matokeo na maelezo ya kielelezo yanasema siku ya tano.
• Nambari za kibali cha maadili ni tofauti: Mbinu zina 20230601-0010, sehemu ya maadili ina 20230606-0013.
• Ukubwa wa sampuli ya awali wa makundi ya ufanisi kwa panya hauko wazi: Idadi ya wanyama haijaelezwa kwa kina katika maelezo ya kielelezo cha uhai.
• Oseltamivir ilitoa uhai wa juu kuliko THZ2: Katika modeli hii, oseltamivir ilitoa %100 na dozi kubwa ya THZ2 %70 uhai.

Utafiti unasema nini?

• CDK7 ni kipengele muhimu cha mwenyeji kwa uzalianaji wa virusi vya influenza A katika hali za utamaduni wa seli zilizojaribiwa.
• Kunyamazishwa kwa CDK7 kulipunguza tita ya aina nne tofauti za IAV.
• Aina ya H1N1 sugu kwa oseltamivir pia ilikuwa nyeti kwa kunyamazishwa kwa CDK7.
• Vizuizi vitatu tofauti vya CDK7 vilipunguza uzalianaji wa PR8 kwa kutegemea dozi.
• Athari ya THZ2 ilitokea baada ya virusi kuingia kwenye seli, katika kipindi cha mapema cha takriban saa 2–4.
• Ukandamizaji wa CDK7 haukuzuia sana kufungamana kwa virusi, kuingizwa ndani ya seli au muungano wa endosomu.
• Ukandamizaji wa CDK7 ulipunguza kuingia kwa vRNP kwenye kiini.
• THZ2 na si-CDK7 zilipunguza protini za importin-α1, α3, α5 na α7.
• Kiwango cha importin-β1 kilibaki kwa kiasi kikubwa.
• Hakukuonyeshwa mwingiliano thabiti wa moja kwa moja kati ya CDK7 na NP ya virusi.
• Ukandamizaji wa CDK7 ulipunguza fosforilesheni ya RNA polymerase II na usanisi wa RNA ya virusi.
• THZ2 ilipunguza vifo, mzigo wa virusi wa mapafu na patholojia ya mapafu inayosababishwa na PR8 katika panya.

Utafiti hausimi nini?

• Hauonyeshi kwamba THZ2 hutibu mafua kwa binadamu.
• Hauonyeshi kwamba THZ2 ni dawa ya influenza iliyoidhinishwa kliniki.
• Haubaini dozi yenye ufanisi au salama kwa binadamu.
• Hauonyeshi kwamba THZ2 huwa na ufanisi siku kadhaa baada ya dalili kuanza.
• Hauonyeshi kwamba THZ2 inaweza kutumika kwa mdomo au kwa kuvuta hewa.
• Haithibitishi kikamilifu kwamba usugu hautatokea katika tiba inayolenga mwenyeji.
• Hauonyeshi kwamba ukandamizaji wa CDK7 ni salama katika matumizi ya muda mrefu.
• Haithibitishi kwamba kupungua kwa importin-α ndicho sababu pekee ya athari ya antiviral.
• Hauonyeshi kwamba CDK7 hudhibiti moja kwa moja jeni za importin-α kupitia fosforilesheni au unakili.
• Hauonyeshi kwamba THZ2 ina ufanisi dhidi ya aina zote za influenza A, influenza B au virusi vya influenza ya ndege.
• Hauonyeshi kwamba hutibu maambukizi sugu kwa oseltamivir kwa wanyama.
• Hauonyeshi kwamba THZ2 ni bora kuliko oseltamivir.
• Hauwasilishi tiba au njia ya kujikinga ambayo wagonjwa wanaweza kutumia wenyewe.

Umuhimu wake kwa mtazamo wa zamani

Utafiti wa influenza kwa muda mrefu umejikita katika malengo ya moja kwa moja ya virusi kama neuraminidase, chaneli ya ioni M2 na polymerase ya virusi. Mkabala huu umezaa dawa zenye ufanisi, lakini mutasheni za virusi zinaweza kubadilisha unyeti kwa dawa.

Utafiti unaolenga vipengele vya seli mwenyeji unatafuta utegemezi wa seli ambao virusi huhitaji na ambao hubadilika polepole au hauwezi kubadilika kwa urahisi. Baada ya tafiti kuhusisha CDK1, CDK4, CDK8/19 na CDK9 na uzalianaji wa influenza, utafiti huu unaongeza CDK7 katika mfumo huo.

Umuhimu wake leo

Mchango mkuu wa kisayansi wa utafiti ni kutambua CDK7 si tu kama kimeng’enya cha jumla cha unakili, bali pia kama mdhibiti anayeunga mkono usafirishaji wa vRNP hadi kiini.

Kiungo kinachopendekezwa cha CDK7–importin-α kinaashiria nodi mpya ya seli mwenyeji inayoweza kulengwa kwa dawa katika mzunguko wa maisha ya virusi. Hasa, kukandamizwa kwa virusi sugu kwa oseltamivir katika utamaduni wa seli kunaonyesha matumizi ya utaratibu huru na neuraminidase ya virusi.

Umuhimu wake kwa siku zijazo

Ili matokeo yaweze kusogezwa kuelekea maendeleo ya kliniki, tafiti zifuatazo zinahitajika:

• Kubaini jinsi CDK7 inavyodhibiti jeni za importin-α
• Majaribio ya uokoaji ya Importin-α
• Uokoaji wa kijeni kwa CDK7 sugu kwa siRNA
• Seli za msingi za njia ya hewa ya binadamu na organoid za mapafu
• Izolati za virusi vya influenza kutoka kwa wagonjwa
• Majaribio ya wanyama kwa aina sugu kwa oseltamivir na baloxavir
• Influenza B na aina tofauti za influenza za asili ya wanyama
• Tafiti za mkusanyiko wa THZ2 katika tishu za mapafu na farmakokinetiki
• Formulesheni za mdomo na za kuvuta hewa
• Majaribio ya kuanza matibabu kwa kuchelewa
• Majaribio ya mchanganyiko na oseltamivir au baloxavir
• Uchambuzi wa ukuaji wa usugu kwa serial passage
• Sumu ya muda mrefu ya hematolojia, kinga na viungo
• Uendelezaji wa derivati zinazochagua zaidi CDK7 na zenye muda mfupi wa athari
• Modeli kubwa za wanyama zilizo karibu zaidi na mfumo wa upumuaji wa binadamu
• Baada ya usalama wa kutosha wa preclinical, tafiti za binadamu zilizodhibitiwa

Maana yake kwa maisha ya kila siku na mgonjwa

Utafiti huu hautoi matokeo ya kliniki yanayobadilisha matibabu ya sasa ya mafua. THZ2 ni kiambatanisho cha utafiti na si dawa iliyoidhinishwa ambayo wagonjwa wa mafua wanaweza kutumia.

Umuhimu wake unaowezekana kwa muda mrefu katika maisha ya kila siku ni uwezekano wa kuendeleza madarasa mapya ya dawa yanayolenga mifumo ya usafirishaji ya seli ambayo virusi huhitaji, badala ya kulenga protini za virusi.

Ili hilo litokee, lazima kuwe na uwiano makini sana kati ya athari ya antiviral na uhifadhi wa kazi za kawaida za seli. Kwa kuwa CDK7 ni muhimu kwa unakili wa kawaida wa jeni na mzunguko wa seli, ukandamizaji usiodhibitiwa au wa muda mrefu hauwezi kuchukuliwa kuwa salama.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Muhtasari wa kiufundi wa muundo wa utafiti

Virusi vya Influenza A vilivyojaribiwa

Athari ya kunyamazishwa kwa CDK7 kwenye tita ya virusi

Tita ya virusi ya logarithimu inatafsiriwaje?

Tita ya virusi inapowasilishwa kwa kipimo cha log₁₀, kupungua kwa kitengo kimoja humaanisha mabadiliko ya mara kumi:

\[ 1\ \log_{10}\ \mathrm{azalma} = 10\ \mathrm{kat\ azalma} \]

\[ 2\ \log_{10}\ \mathrm{azalma} = 100\ \mathrm{kat\ azalma} \]

\[ 3\ \log_{10}\ \mathrm{azalma} = 1000\ \mathrm{kat\ azalma} \]

Kwa hiyo, kupungua kwa 2,36 log₁₀ si kupungua kwa asilimia 2,36, bali ni takriban uzalishaji wa virusi vya kuambukiza uliopungua mara 229.

Ulinganisho wa kiufundi wa hatua za maambukizi

Matokeo ya Importin

Matokeo ya kiufundi ya jaribio la panya

Kutolingana kwa uripoti

Mbinu ya takwimu

• Imeelezwa kwamba majaribio yalirudiwa angalau mara tatu.
• Matokeo yaliwasilishwa kama wastani ± kosa la kawaida — SEM.
• Student t test ilitumika kulinganisha makundi mawili.
• One-way ANOVA ilitumika kwa zaidi ya makundi mawili.
• Log-rank test iliripotiwa kwa mikunjo ya uhai katika maelezo ya Kielelezo 6.
• Kizingiti cha umuhimu kilikubaliwa kuwa p < 0,05.

Katika baadhi ya grafu za majaribio ya seli, idadi kamili ya marudio ya kibiolojia haijaonyeshwa. Idadi ya wanyama mwanzoni mwa jaribio la uhai wa panya pia haijaelezwa wazi katika mbinu kuu na maelezo ya kielelezo.

Matokeo muhimu zaidi kiufundi

Ugunduzi muhimu zaidi ni kuonyesha kwamba CDK7 haihitajiki kabla ya virusi kuingia seli, bali inahitajika katika hatua muhimu baada ya kuingia, wakati vRNP husafirishwa kwenda kiini.

Kunyamazishwa kwa jeni, vizuizi vitatu tofauti vya kifamasia, jaribio la muda, hadubini konfokali na uchambuzi wa protini za importin vinaelekeza kwenye modeli moja ya jumla:

\[ \mathrm{CDK7} \rightarrow \mathrm{Importin\!-\alpha\ homeostazı} \rightarrow \mathrm{vRNP\ çekirdek\ girişi} \rightarrow \mathrm{viral\ transkripsiyon\ ve\ çoğalma} \]

THZ2 ilikandamiza mnyororo huu katika utamaduni wa seli na modeli ya panya. Hata hivyo, kwa kuwa dawa inalenga CDK7, ambayo ina jukumu la msingi katika unakili wa seli mwenyeji, usalama na muda wa matibabu vitakuwa muhimu sawa na ufanisi wa antiviral katika matumizi yoyote ya kliniki.

Maelezo ya Chanzo na Mbinu

Maudhui haya yanategemea utafiti wa Mingxin Zhang, Xiaoqin Lian, Yarou Gao, Yang Yu, Zhuogang Li, Lefang Jiang, Haonan Zhang, Yue Su, Jiaxin Ke, Xingjian Zhu, Qun Peng, Weisan Chen na Xulin Chen wenye kichwa “Inhibition of CDK7 Suppresses Influenza A Virus Replication: Insights into Host-Dependent Antiviral Mechanisms”.

Utafiti huu ni utafiti wa preclinical wa in vitro na wanyama unaounganisha seli za epitheliamu ya mapafu ya binadamu A549, seli za figo za mbwa MDCK, aina nne za virusi vya influenza A, CDK7 siRNA, vizuizi THZ2, Mevociclib na LDC4297, vipimo vya tita ya virusi, Western blot, qRT-PCR, hadubini konfokali, ko-immunoprecipitation na panya BALB/c waliowekewa maambukizi ya PR8 ya kuua.

Huu si utafiti wa kliniki uliofanywa kwa binadamu. Hakuna data ya wagonjwa wa mafua, kundi la matibabu la binadamu, muda wa dalili za kliniki, kulazwa hospitalini, matatizo au usalama kwa binadamu.

Maandishi yana kauli wazi “This preprint research paper has not been peer reviewed” na “Preprint not peer reviewed”. Kwa hiyo utafiti haujapitia mapitio ya rika. Hakuna DOI au uthibitisho wa kukubaliwa kwa mwisho na jarida katika PDF.

Kwa majaribio ya wanyama, sehemu ya mbinu inatoa nambari ya kibali ya IACUC ya Jinan University kama 20230601-0010, huku taarifa ya maadili ikitoa 20230606-0013. Sababu ya tofauti kati ya nambari hizi mbili haijaelezwa.

Njia ya utoaji wa THZ2 katika jaribio la toksikolojia imeandikwa kama intraperitoneal katika mbinu, lakini kama subcutaneous katika matokeo na maelezo ya kielelezo. Histolojia ya mapafu imetajwa kufanywa siku ya saba katika mbinu, na siku ya tano katika matokeo na maelezo ya kielelezo.

Kuna kutolingana dhahiri kati ya nM na µM katika matokeo ya sitotoksisiti ya THZ2. Tofauti hii ya uripoti lazima izingatiwe wakati wa kutafsiri IC₅₀ na fahirisi ya uteuzi.

Utafiti unapendekeza kwamba kulenga kipengele cha mwenyeji kunaweza kupunguza hatari ya usugu wa antiviral; hata hivyo, hakuna jaribio la serial passage, uteuzi wa usugu au kutoroka kwa mageuzi lililofanywa.

Farmakokinetiki ya THZ2 kwa binadamu, dozi sahihi ya antiviral, usalama wa muda mrefu, athari kwa kinga na dirisha la matibabu havijachunguzwa. Kuanzishwa kwa matibabu saa nne baada ya maambukizi kwa panya hakumaanishi kuwa matumizi baada ya dalili kuanza kwa binadamu yatakuwa na ufanisi.

Uhusiano thabiti umeonyeshwa kati ya kupungua kwa protini za importin-α na kuvurugika kwa kuingia kwa vRNP kwenye kiini, lakini hakuna jaribio la uokoaji kwa kurejesha importin-α. Haijabainishwa CDK7 hudhibiti viwango vya importin-α kupitia utaratibu gani wa unakili au uthabiti wa protini.

Makala haya yameandaliwa kwa kutegemea tu mbinu, fomula, grafu, picha za hadubini, matokeo ya Western blot, majaribio ya wanyama na tafsiri za waandishi zilizoripotiwa katika PDF iliyopakiwa. Hakuna madai ya ufanisi kwa binadamu, tiba ya kliniki, usalama wa uhakika, dhamana dhidi ya usugu au dawa iliyoidhinishwa ambayo hayapo kwenye PDF yaliyoingizwa.