Көрүнгөн амилоза курамы — Apparent Amylose Content (AAC) — күрүч бышырылганда жумшак, жабышчаак же кургураак жана данектүү болуп калышын аныктаган эң маанилүү крахмалдык касиеттердин бири. Күрүч эндоспермасында амилоза синтезинин негизги жөнгө салуучуларынын бири Waxy (Wx) гени коддогон Granule-Bound Starch Synthase I (GBSSI) ферменти болуп саналат.

Бул изилдөө күрүч селекциясында колдонулган учурдагы ДНК маркерлеринин AAC деңгээлин канчалык жакшы божомолдой аларын баалап, айрыкча %24,5 деңгээлинен жогору амилозалуу генотиптерди ишенимдүүрөөк тандоо үчүн GBSSI/Waxy генинен жаңы генетикалык варианттарды издеген.

Жалпысынан 127 күрүч аксессиясы — 125 japonica жана 2 indica — изилденген. Биринчи интрондогу G/T SNP жалгыз өзү AAC вариациясынын %77,5 өлчөмүндөгү бөлүгүн түшүндүрсө, exon 6 бөлүгүндөгү A/C SNP менен бирге колдонулганда түшүндүрүлгөн вариация %79,5 деңгээлине жеткен. Бул эки SNPге RM190 микросателлитин кошуу көрсөткүчтү болгону %79,6 деңгээлине жогорулаткан.

Учурдагы маркердик гаплотиптер AAC мааниси %24,5 деңгээлинен жогору аксессияларды ишенимдүү ажырата албагандыктан, бардык AAC класстарын көрсөткөн 21 генотипте GBSSI гени жана болжол менен 1 kb upstream жөнгө салуучу аймак кайра секвенирленген. Жалпысынан 32 SNP аныкталып, алардын төртөө жаңы dCAPS молекулалык маркерлерин иштеп чыгууда колдонулган.

Жаңы маркерлер AAC вариациясынын жалпы түшүндүрүлүшүн чектелүү гана көбөйткөнү менен, RM190 CT20, exon 6 A жана −1514 G аллелдери бирге кездешкен гаплотип изилдөө коллекциясында туруктуу түрдө AAC > %24,5 менен байланышкан. Ошондуктан жаңы маркерлердин эң маанилүү салымы жалпы вариацияны кескин көбөйтүү эмес, жогорку амилозалуу белгилүү генотиптерди тандоо үчүн өзгөчөрөөк молекулалык курал берүү болуп саналат.

Амилоза күрүчтүн бышуу касиетин эмне үчүн өзгөртөт?

Күрүч крахмалы негизинен амилоза жана амилопектинден турат. Алардын катышы бышкан күрүчтүн текстурасына жана дандардын бири-бирине жабышуу ыктымалдыгына күчтүү таасир этет.

Жогорку AAC менен мүнөздөлгөн сорттор адатта кургураак, катуураак жана бири-биринен бөлүнгөн дандарды түзсө, төмөн AACлуу сорттор жумшагыраак, жылтырак жана жабышчаак болушу мүмкүн.

Изилдөөдө колдонулган жалпы классификацияда AAC топтору waxy, төмөн, орто жана жогорку амилозалуу топторго бөлүнгөн. Коммерциялык классификацияларда болжол менен %26–33 деңгээлиндеги AAC адатта жогорку амилоза классы катары бааланат.

GBSSI жана Waxy гени деген эмне?

Waxy гени 6-хромосомада жайгашып, GBSSI ферментин коддойт. GBSSI күрүч эндоспермасында амилоза синтезинин негизги ферменттеринин бири.

Waxy локусунда кеңири таралган эки аллель өзгөчө маанилүү:

• Wxa:жалпысынан жогорку AAC менен байланышкан.
• Wxb:көбүнчө төмөн жана орто AAC менен байланышкан.

Wxb аллелинде биринчи интрондун 5′ splice аймагындагы G→T SNP mRNA иштетилишине таасир берип, функционалдык GBSSI көлөмүнүн азайышына алып келиши мүмкүн. Ошондуктан бир эле гендин ар түрдүү аллелдери күрүч данындагы амилозанын көлөмүнүн өзгөрүшүндө маанилүү роль ойнойт.

Учурдагы ДНК Маркерлери Амилоза Курамын Канча Деңгээлде Так Божомолдоду?

Изилдөөчүлөр адегенде күрүч селекциясында мурда колдонулган RM190 микросателлитинин жана Waxy гениндеги маанилүү SNPлердин AAC божомолундагы күчүн 127 аксессияда баалашкан.

Бул натыйжа өзгөчө биринчи интрондогу SNPнин күчтүү таасирин көрсөтөт. Intron 1 SNP жалгыз өзү AAC вариациясынын %77,5 өлчөмүндөгү бөлүгүн түшүндүргөн.

Exon 6 SNP жалгыз колдонулганда түшүндүрүү күчү төмөнүрөөк болгону менен, intron 1 менен бирге колдонулганда AAC божомолу %79,5 деңгээлине жеткен.

RM190 маркерин бул комбинацияга кошуу болгону %0,1 кошумча түшүндүрүү берген. Ошондуктан изилдөөнүн гермплазма коллекциясында RM190, intron 1 жана exon 6 SNPлеринен тышкары олуттуу кошумча божомол артыкчылыгын жараткан эмес.

Эмне Үчүн Жаңы Молекулалык Маркерлер Керек Болду?

Учурдагы маркер комбинациялары төмөн, орто жана жалпы жогорку AAC класстарын бири-биринен ажырата алганы менен, айрыкча AAC мааниси %24,5 деңгээлинен жогору болгон генотиптерди ишенимдүү тандоодо жетишсиз болгон.

Бул маселе өзгөчө жогорку амилозалуу күрүч артык көрүлгөн рыноктор жана селекциялык программалар үчүн маанилүү. Селекционер «жогорку болушу мүмкүн» деген классты гана эмес, өтө жогорку AACга ээ белгилүү ата-энелерди же линияларды эрте муундарда тандагысы келиши мүмкүн.

Ошондуктан изилдөөчүлөрallel miningыкмасын колдонушкан. Аллелдерди издөө — бир гендин ар башка генотиптердеги ДНК тизмектерин салыштыруу аркылуу мурда белгисиз же жетиштүү мүнөздөлбөгөн варианттарды табуу.

GBSSI Аллелдерин Издөөдө Эмне Табылды?

Бардык AAC класстарын көрсөткөн 21 генотип тандалып, GBSSI генинин толук бөлүгү жана болжол менен 1 kb upstream жөнгө салуучу аймак кайра секвенирленген.

Тизмектердин көпчүлүгүндө жогорку окшоштук болгонуна карабастан, жалпысынан32 SNPаныкталган.

Жаңы варианттардын маанилүү бөлүгү белок коддогон exonдордон көрө promoter жана intron сыяктуу коддобогон аймактарда табылган. Бул натыйжа GBSSIнин белок коддогон бөлүгү маанилүү функциясынан улам салыштырмалуу жакшы сакталган болушу мүмкүн экенин көрсөтөт.

Аныкталган жаңы SNPлердин ичинен молекулалык маркер иштеп чыгуу үчүн төрт позиция тандалган:

• −1514 — promoter аймагы,
• +1801 — exon 9,
• +2282 — intron 10,
• +2806 — intron 12.

Бул SNPлер үчүн dCAPS маркерлери иштелип чыгып, 127 аксессия кайра скринингден өткөрүлгөн.

Жаңы Маркерлер Жогорку Амилозалуу Күрүчтү Жакшыраак Ажырата Алдыбы?

Ооба, бирок салымдын мүнөзү маанилүү.

−1514 SNPни учурдагы intron 1 жана exon 6 SNPлерине кошуу түшүндүрүлгөн AAC вариациясын %79,5 деңгээлинен болжол менен %80,1 деңгээлине көбөйткөн. RM190 да моделге киргизилгенде көрсөткүч %80,3 болгон.

Бул өсүш аз. Демек, жаңы маркерлердин ийгилиги «AAC божомол күчүн чоң өлчөмдө көбөйтүү» эмес.

Негизги маанилүү натыйжа — белгилүү бир гаплотиптин жогорку AAC менен күчтүү байланышта болушу.

RM190 CT20 + exon 6 A + −1514 Gкомбинациясы изилдөө коллекциясында туруктуу түрдөAAC > %24,5менен байланыштуу деп табылган.

Ошентип, изилдөөчүлөр жогорку амилозалуу күрүчтөрдү marker-assisted selection программаларында өзгөчөрөөк тандоо үчүн жаңы генетикалык курал сунушташкан.

+1801, +2282 жана +2806 SNPлери түзгөн белгилүү аллелдик үлгүлөр да кээ бир жогорку AAC донорлорун ажыратууда пайдалуу болушу мүмкүн болгон кошумча диагностикалык маалымат берген.

Изилдөөнүн Ыкмасы жана Жыйынтыктары

Өсүмдүк материалы

Изилдөө 127 Oryza sativa аксессиясынан турган коллекцияда жүргүзүлгөн. Алардын 40 аксессия Италиядагы маанилүү japonica сорттору, 87 аксессия ар кайсы өлкөлөрдөн тандалган эл аралык гермплазма болгон.

Жалпы коллекцияда 125 japonica жана 2 indica аксессиясы бар.

Ар бир аксессия эки жыл бою үч кайталанма талаа тажрыйбасында өстүрүлгөн.

AAC кантип өлчөндү?

Жыйналган күрүчтүн көрүнгөн амилоза курамы майдаланган данда йод байланышуусуна негизделген спектрометриялык ыкма менен өлчөнгөн.

FOSS FIAstar 5000 системасында үлгүгө NaOH эритмеси жана йод кошулуп, пайда болгон түс 720 nm абсорбанс боюнча бааланган.

Калибрлөө үчүн AACси %15,40, %23,10 жана %27,7 болгон сертификатталган референстик күрүч үлгүлөрү колдонулган.

Молекулалык анализ

Геномдук ДНК жаш өсүмдүк жалбырактарынан бөлүнүп алынган. RM190 микросателлити жана ар түрдүү Waxy аллелдерин көрсөткөн SNPлер PCR жана секвенирлөөгө негизделген ыкмалар менен аныкталган.

Жаңы SNPлер үчүн dCAPS ыкмасында mismatched primerлер колдонулуп, PCR продуктулары ылайыктуу рестрикциялык ферменттер менен кесилип, аллелдер ажыратылган.

Кайра секвенирлөө

Тандалган 21 генотипте болжол менен 800–2500 bp узундуктагы бири-бирин каптаган алты PCR аймагы амплификацияланып, GBSSI гени жана 1 kb upstream жөнгө салуучу аймак камтылган.

Nipponbare геном тизмеги референс катары колдонулган.

Эң маанилүү AAC жыйынтыктары

• RM190 жалгыз өзү AAC вариациясынын %74,9 өлчөмүндөгү бөлүгүн түшүндүргөн.
• Intron 1 G/T SNP %77,5 түшүндүрүү берген.
• Intron 1 + exon 6 комбинациясы %79,5 менен негизги маркерлер арасындагы эң күчтүү моделди түзгөн.
• Жаңы −1514 SNP жалпы түшүндүрүлгөн вариацияны аз гана көбөйткөн.
• Жаңы маркерлер айрыкча AAC > %24,5 генотиптерин тандоодо өзгөчөрөөк гаплотиптерди аныктоого мүмкүндүк берген.

Дан формасы менен байланыш

126 non-glutinous аксессияда AAC менен дан формасынын ортосунда маанилүү байланыштар табылган.

• AAC көбөйгөн сайын дан узундугу жалпысынан өскөн.
• AAC көбөйгөн сайын узундук/тууралык катышы өскөн.
• AAC көбөйгөн сайын дан туурасы азайуу тенденциясын көрсөткөн.

Intron 1 SNP дан туурасындагы вариациянын %49,7 өлчөмүндөгү бөлүгүн, узундук/тууралык катышынын %47,7 өлчөмүндөгү бөлүгүн жана дан узундугунун %30,8 өлчөмүндөгү бөлүгүн түшүндүргөн.

Изилдөөчүлөр бул генетикалык байланышты GBSSI дан формасын түздөн-түз көзөмөлдөйт деп түшүндүрүшпөйт. Жогорку амилоза жана белгилүү дан формаларынын узак мөөнөттүү селекция жана керектөөчү тандоолорунда бирге тандалышы Waxy аллелдери менен дан формасынын ортосундагы байланышты түзгөн болушу мүмкүн.

Изилдөө колдогон жыйынтыктар

• GBSSI/Waxy локусу AAC вариациясынын маанилүү бөлүгүн түшүндүрөт.
• Биринчи интрондогу G/T SNP изилденген гермплазмадагы эң күчтүү жалгыз маркерлердин бири.
• Intron 1 жана exon 6 SNPлеринин комбинациясы AAC вариациясынын %79,5 өлчөмүндөгү бөлүгүн түшүндүргөн.
• 21 генотипте жүргүзүлгөн аллелдерди издөө 32 SNPни аныктаган.
• Төрт жаңы dCAPS маркери иштелип чыккан.
• Белгилүү CT20/exon 6/−1514 гаплотиби изилдөө коллекциясында AAC > %24,5 менен күчтүү байланышта.
• Waxy гаплотиптери менен дан формасынын белгилеринин ортосунда маанилүү статистикалык байланыштар бар.

Изилдөө колдобогон жыйынтыктар

• ДНК маркерлери амилозанын пайызын түздөн-түз физикалык түрдө өлчөбөйт.
• Жаңы маркерлер AAC вариациясынын баарын түшүндүрбөйт.
• Аныкталган гаплотиптер дүйнөдөгү бардык күрүч гермплазмаларында бирдей божомол күчүн көрсөтөрү далилденген эмес.
• Waxy SNPлери дан формасынын түз биологиялык себеби экени көрсөтүлгөн эмес.
• AAC бир гана GBSSI менен аныкталбайт; крахмал метаболизминин башка гендери да таасир этиши мүмкүн.
• Marker-assisted selection бардык жагдайларда фенотипти түз өлчөөнү толугу менен жойбойт.

Генетикалык фон эмне үчүн маанилүү?

Бирдей маркерлер ар башка күрүч коллекцияларында AAC вариациясынын ар башка көлөмүн түшүндүрүшү мүмкүн. Мурунку айрым изилдөөлөр ошол эле же окшош маркерлер менен %85–94 чегине жакын түшүндүрүү көрсөткүчтөрүн билдирген; бул изилдөөдө болсо эң күчтүү маанилүү комбинация болжол менен %79,5 деңгээлинде калган.

Изилдөөчүлөр бул айырма изилденген материалдын көптөгөн өлкөлөрдөн келиши жана кеңири генетикалык ар түрдүүлүктү камтышы менен байланыштуу болушу мүмкүн деп талкуулашат.

Ошондуктан маркер системасынын бир гермплазма коллекциясында ийгиликтүү болушу башка селекциялык популяцияда ошол эле божомол көрсөткүчүн автоматтык түрдө кепилдебейт.

Булак жана Ыкма Жөнүндө Эскертүү

Түпнуска изилдөө:Improvement of marker-based predictability of Apparent Amylose Content in japonica rice through GBSSI allele mining

Авторлор:Chiara Biselli; Daniela Cavalluzzo; Rosaria Perrini; Alberto Gianinetti; Paolo Bagnaresi; Simona Urso; Gabriele Orasen; Francesca Desiderio; Elisabetta Lupotto; Luigi Cattivelli; Giampiero Valè.

Тең салым кошкон авторлор:Chiara Biselli жана Daniela Cavalluzzo.

Жооптуу автор:Giampiero Valè.

Журнал:Rice.

Жыл / том / макала:2014, 7:1.

DOI:10.1186/1939-8433-7-1

Жарыяланган күнү:2 январь 2014.

Лицензия:Creative Commons Attribution 2.0 — CC BY 2.0.

Каржылоо:AGER Foundation — RISINNOVA project grant 2010–2369 жана MiPAAF — POLORISO project.

Кызыкчылыктардын кагылышы:Авторлор атаандаш кызыкчылыктар жок экенин билдиришкен.

Негизги методологиялык чектөөлөр:Жыйынтыктар 127 аксессиядан турган белгилүү гермплазма коллекциясына негизделет. Жаңы SNPлердин 21 гана өкүл генотипте кайра секвенирлөө аркылуу табылышы коллекциядан тышкары башка варианттар болушу мүмкүн экенин билдирет. Marker-AAC байланыштарына генетикалык фон жана айлана-чөйрө шарттары таасир этиши мүмкүн. Аныкталган маркерлер жогорку AAC үчүн күчтүү тандоо куралдарын бере алат, бирок аларды түз химиялык AAC өлчөөсүн бардык жерде алмаштырган универсалдуу тест катары чечмелөөгө болбойт.

Verianla баяндоо принциби:Бул мазмун түпнуска макаланын абзац-абзац котормосу эмес. Изилдөөнүн эксперименттик дизайны, молекулалык маркер жыйынтыктары, AAC вариациясынын пайыздары, жаңы SNP позициялары жана илимий чектөөлөрү сакталган; мазмун өз алдынча түшүндүрүүчү түзүмдө кайра уюштурулган. Түпнуска тизмек схемалары, гель сүрөттөрү жана корреляция графиктери үчүн DOI аркылуу булак изилдөөгө кайрылуу керек.