Görünen amiloz içeriği — Apparent Amylose Content (AAC) — pirincin pişme sırasında yumuşak, yapışkan veya daha kuru ve tane tane kalmasını belirleyen en önemli nişasta özelliklerinden biridir. Pirinç endospermindeki amiloz sentezinin temel düzenleyicilerinden biri, Waxy (Wx) geni tarafından kodlanan Granule-Bound Starch Synthase I (GBSSI) enzimidir.

Bu çalışma, pirinç ıslahında kullanılan mevcut DNA belirteçlerinin AAC düzeyini ne kadar iyi öngörebildiğini değerlendirmiş ve özellikle %24,5'in üzerindeki yüksek amilozlu genotipleri daha güvenilir biçimde seçebilmek amacıyla GBSSI/Waxy geninde yeni genetik varyantlar aramıştır.

Toplam 127 pirinç aksesyonu — 125 japonica ve 2 indica — incelenmiştir. İlk introndaki G/T SNP tek başına AAC varyasyonunun %77,5'ini açıklarken, exon 6'daki A/C SNP ile birlikte kullanıldığında açıklanan varyasyon %79,5'e yükselmiştir. RM190 mikrosatellitinin bu iki SNP'ye eklenmesi ise değeri yalnız %79,6'ya çıkarmıştır.

Mevcut marker haplotipleri AAC değeri %24,5'in üzerindeki erişyonları güvenilir biçimde ayıramadığı için, bütün AAC sınıflarını temsil eden 21 genotipte GBSSI geni ve yaklaşık 1 kb upstream düzenleyici bölge yeniden dizilenmiştir. Toplam 32 SNP saptanmış ve bunlardan dört tanesi yeni dCAPS moleküler belirteçlerinin geliştirilmesinde kullanılmıştır.

Yeni markerlar bütün AAC varyasyonunun açıklanmasını yalnız sınırlı ölçüde artırmasına rağmen, RM190 CT20 ile exon 6 A ve −1514 G allellerinin birlikte bulunduğu haplotip çalışma koleksiyonunda sürekli olarak AAC > %24,5 ile ilişkilendirilmiştir. Bu nedenle yeni belirteçlerin en önemli katkısı toplam varyansı dramatik biçimde artırmaktan çok, yüksek amilozlu belirli genotiplerin seçiminde daha özgül bir moleküler araç sağlamasıdır.

Amiloz pirincin pişmesini neden değiştiriyor?

Pirinç nişastası esas olarak amiloz ve amilopektinden oluşur. Bunların oranı, pişmiş pirincin dokusunu ve tanelerin birbirine yapışma eğilimini güçlü biçimde etkiler.

Yüksek AAC'li çeşitler genellikle daha kuru, sert ve birbirinden ayrılan taneler oluştururken düşük AAC'li çeşitler daha yumuşak, parlak ve yapışkan karakter gösterebilir.

Çalışmanın kullandığı genel sınıflandırmada AAC grupları waxy, düşük, orta ve yüksek amilozlu gruplara ayrılmıştır. Ticari sınıflandırmalarda yaklaşık %26–33 düzeyindeki AAC genellikle yüksek amiloz sınıfı olarak değerlendirilir.

GBSSI ve Waxy geni nedir?

Waxy geni kromozom 6 üzerinde bulunur ve GBSSI enzimini kodlar. GBSSI, pirinç endosperminde amiloz sentezinin temel enzimlerinden biridir.

Waxy lokusunda yaygın iki allel özellikle önemlidir:

• Wxa: genel olarak yüksek AAC ile ilişkilidir.
• Wxb: çoğunlukla düşük ve orta AAC ile ilişkilidir.

Wxb allelinde ilk intronun 5′ splice bölgesindeki G→T SNP, mRNA'nın işlenmesini etkileyerek işlevsel GBSSI miktarının azalmasına yol açabilir. Bu nedenle aynı genin farklı allelleri pirinç tanesindeki amiloz miktarının değişmesinde önemli rol oynar.

Mevcut DNA Belirteçleri Amiloz İçeriğini Ne Kadar İyi Tahmin Etti?

Araştırmacılar önce pirinç ıslahında daha önce kullanılan RM190 mikrosatelliti ile Waxy genindeki önemli SNP'lerin AAC tahminindeki gücünü 127 erişyon üzerinde değerlendirmiştir.

Bu sonuç özellikle ilk introndaki SNP'nin güçlü etkisini ortaya koymaktadır. Intron 1 SNP'si tek başına AAC varyasyonunun %77,5'ini açıklamıştır.

Exon 6 SNP'si tek başına daha düşük açıklama gücüne sahip olsa da intron 1 ile birlikte kullanıldığında AAC tahmini %79,5'e yükselmiştir.

RM190'ın bu kombinasyona eklenmesi yalnız %0,1'lik ek açıklama sağlamıştır. Bu nedenle çalışmanın germplazm koleksiyonunda RM190, intron 1 ve exon 6 SNP'lerinin ötesinde büyük bir ek tahmin kazancı oluşturmamıştır.

Neden Yeni Moleküler Belirteçlere İhtiyaç Duyuldu?

Mevcut marker kombinasyonları düşük, orta ve genel yüksek AAC sınıflarını birbirinden ayırabilse de özellikle AAC değeri %24,5'in üzerinde olan genotipleri güvenilir biçimde seçmekte yetersiz kalmıştır.

Bu sorun özellikle yüksek amilozlu pirincin tercih edildiği pazar ve ıslah programları açısından önemlidir. Islahçı yalnız “yüksek olabilir” sınıfını değil, çok yüksek AAC'ye sahip belirli ebeveynleri veya hatları erken generasyonlarda seçmek isteyebilir.

Bu nedenle araştırmacılar allel mining yaklaşımını kullanmıştır. Allel madenciliği, aynı genin farklı genotiplerdeki DNA dizilerini karşılaştırarak daha önce bilinmeyen veya yeterince karakterize edilmemiş varyantların bulunmasıdır.

GBSSI Allel Madenciliğinde Ne Bulundu?

AAC sınıflarının tamamını temsil eden 21 genotip seçilmiş ve GBSSI geninin tamamı ile yaklaşık 1 kb upstream düzenleyici bölge yeniden dizilenmiştir.

Dizilerin büyük bölümünde yüksek benzerlik bulunmasına rağmen toplam 32 SNP tanımlanmıştır.

Yeni varyantların önemli bölümü protein kodlayan exonlardan çok promoter ve intron gibi kodlamayan bölgelerde bulunmuştur. Bu sonuç GBSSI'nin protein kodlayan bölümünün önemli işlevi nedeniyle görece korunmuş olabileceğini düşündürmektedir.

Belirlenen yeni SNP'ler arasından dört pozisyon moleküler marker geliştirmek için seçilmiştir:

• −1514 — promoter bölgesi,
• +1801 — exon 9,
• +2282 — intron 10,
• +2806 — intron 12.

Bu SNP'ler için dCAPS markerları geliştirilerek 127 erişyon yeniden taranmıştır.

Yeni Markerlar Yüksek Amilozlu Pirinci Daha İyi Ayırabildi mi?

Evet, fakat katkının niteliği önemlidir.

−1514 SNP'sinin mevcut intron 1 ve exon 6 SNP'lerine eklenmesi, açıklanan AAC varyasyonunu %79,5'ten yaklaşık %80,1'e yükseltmiştir. RM190 da modele dahil edildiğinde değer %80,3 olmuştur.

Bu artış küçüktür. Dolayısıyla yeni markerların başarısı “AAC tahmin gücünü büyük ölçüde artırması” değildir.

Asıl önemli sonuç belirli bir haplotipin yüksek AAC ile güçlü biçimde ilişkilendirilmesidir.

RM190 CT20 + exon 6 A + −1514 G kombinasyonu çalışma koleksiyonunda sürekli olarak AAC > %24,5 ile ilişkili bulunmuştur.

Böylece araştırmacılar yüksek amilozlu pirinçlerin marker-assisted selection programlarında daha özgül olarak seçilebilmesi için yeni bir genetik araç önermiştir.

+1801, +2282 ve +2806 SNP'lerinin oluşturduğu belirli allelik desenler de bazı yüksek AAC donorlarını ayırmak için yararlı olabilecek ek diagnostik bilgi sağlamıştır.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Bitki materyali

Çalışma 127 Oryza sativa erişyonundan oluşan koleksiyon üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bunların 40'ı İtalya'daki önemli japonica çeşitlerinden, 87'si ise farklı ülkelerden seçilmiş uluslararası germplazmdan oluşmaktadır.

Toplam koleksiyonda 125 japonica ve 2 indica erişyonu bulunmaktadır.

Her erişyon iki yıl boyunca üç tekrarlı tarla denemelerinde yetiştirilmiştir.

AAC nasıl ölçüldü?

Hasat edilen pirinçlerin görünen amiloz içeriği öğütülmüş tane üzerinden iyot bağlanmasına dayalı spektrometrik yöntemle ölçülmüştür.

FOSS FIAstar 5000 sisteminde örneğe NaOH çözeltisi ve iyot eklenmiş; oluşan renk 720 nm absorbans üzerinden değerlendirilmiştir.

Kalibrasyon için AAC'si %15,40, %23,10 ve %27,7 olan sertifikalı referans pirinç örnekleri kullanılmıştır.

Moleküler analiz

Genomik DNA genç bitki yapraklarından izole edilmiştir. RM190 mikrosatelliti ve farklı Waxy allellerini temsil eden SNP'ler PCR ve dizileme tabanlı yöntemlerle belirlenmiştir.

Yeni SNP'ler için dCAPS yaklaşımında mismatched primerlar kullanılmış ve PCR ürünleri uygun restriksiyon enzimleriyle kesilerek alleller ayrıştırılmıştır.

Yeniden dizileme

21 seçilmiş genotipte yaklaşık 800–2500 bp uzunluklarında altı örtüşen PCR bölgesi amplifiye edilerek GBSSI geni ve 1 kb upstream düzenleyici bölge kapsanmıştır.

Nipponbare genom dizisi referans olarak kullanılmıştır.

En önemli AAC sonuçları

• RM190 tek başına AAC varyasyonunun %74,9'unu açıklamıştır.
• Intron 1 G/T SNP'si %77,5 açıklama sağlamıştır.
• Intron 1 + exon 6 kombinasyonu %79,5 ile temel markerlar arasındaki en güçlü modeli oluşturmuştur.
• Yeni −1514 SNP toplam açıklanan varyasyonu yalnız küçük ölçüde artırmıştır.
• Yeni markerlar özellikle AAC > %24,5 genotiplerinin seçilmesinde daha spesifik haplotiplerin tanımlanmasını sağlamıştır.

Tane şekliyle ilişki

126 non-glutinous erişyonda AAC ile tane şekli arasında anlamlı ilişkiler bulunmuştur.

• AAC arttıkça tane uzunluğu genel olarak artmıştır.
• AAC arttıkça uzunluk/genişlik oranı artmıştır.
• AAC arttıkça tane genişliği azalma eğilimi göstermiştir.

Intron 1 SNP'si tane genişliğindeki varyasyonun %49,7'sini, uzunluk/genişlik oranının %47,7'sini ve tane uzunluğunun %30,8'ini açıklamıştır.

Araştırmacılar bu genetik birlikteliği doğrudan GBSSI'nin tane şeklini kontrol ettiği biçiminde yorumlamamaktadır. Yüksek amiloz ve belirli tane biçimlerinin uzun süreli ıslah ve tüketici tercihleri sırasında birlikte seçilmesi, Waxy allelleri ile tane şekli arasındaki ilişkiyi oluşturmuş olabilir.

Çalışmanın desteklediği sonuçlar

• GBSSI/Waxy lokusu AAC varyasyonunun önemli bölümünü açıklamaktadır.
• İlk introndaki G/T SNP, incelenen germplazmda en güçlü tek markerlardan biridir.
• Intron 1 ve exon 6 SNP'lerinin kombinasyonu AAC varyasyonunun %79,5'ini açıklamıştır.
• 21 genotipte yapılan allel madenciliği 32 SNP ortaya çıkarmıştır.
• Dört yeni dCAPS markerı geliştirilmiştir.
• Belirli bir CT20/exon 6/−1514 haplotipi çalışma koleksiyonunda AAC > %24,5 ile güçlü biçimde ilişkilidir.
• Waxy haplotipleri ile tane şekli özellikleri arasında anlamlı istatistiksel ilişkiler bulunmaktadır.

Çalışmanın desteklemediği sonuçlar

• DNA markerları doğrudan amiloz yüzdesini fiziksel olarak ölçmez.
• Yeni markerlar AAC varyasyonunun tamamını açıklamaz.
• Belirlenen haplotiplerin dünyanın bütün pirinç germplazmında aynı tahmin gücünü göstereceği kanıtlanmamıştır.
• Waxy SNP'lerinin tane şeklinin doğrudan biyolojik nedeni olduğu gösterilmemiştir.
• AAC yalnız GBSSI tarafından belirlenmemektedir; diğer nişasta metabolizması genleri de etkili olabilir.
• Marker-assisted selection doğrudan fenotip ölçümünü bütün durumlarda tamamen ortadan kaldırmaz.

Neden genetik arka plan önemli?

Aynı markerlar farklı pirinç koleksiyonlarında farklı miktarda AAC varyasyonu açıklayabilir. Daha önceki bazı çalışmalar aynı veya benzer markerlarla %85–94'e yaklaşan açıklama değerleri bildirmiştir; bu çalışmada ise en güçlü anlamlı kombinasyon yaklaşık %79,5'te kalmıştır.

Araştırmacılar bu farkın, incelenen materyalin çok sayıda ülkeden gelmesi ve daha geniş genetik çeşitlilik içermesiyle ilişkili olabileceğini tartışmaktadır.

Bu nedenle bir marker sisteminin bir germplazm koleksiyonunda başarılı olması, başka bir ıslah popülasyonunda aynı tahmin performansını otomatik olarak garanti etmez.

Kaynak ve Yöntem Notu

Özgün çalışma:Improvement of marker-based predictability of Apparent Amylose Content in japonica rice through GBSSI allele mining

Yazarlar: Chiara Biselli; Daniela Cavalluzzo; Rosaria Perrini; Alberto Gianinetti; Paolo Bagnaresi; Simona Urso; Gabriele Orasen; Francesca Desiderio; Elisabetta Lupotto; Luigi Cattivelli; Giampiero Valè.

Eş katkılı yazarlar: Chiara Biselli ve Daniela Cavalluzzo.

Sorumlu yazar: Giampiero Valè.

Dergi: Rice.

Yıl / cilt / makale: 2014, 7:1.

DOI: 10.1186/1939-8433-7-1

Yayımlanma tarihi: 2 Ocak 2014.

Lisans: Creative Commons Attribution 2.0 — CC BY 2.0.

Finansman: AGER Foundation — RISINNOVA project grant 2010–2369 ve MiPAAF — POLORISO project.

Çıkar çatışması: Yazarlar rekabet eden çıkar bildirmemiştir.

Temel yöntemsel sınırlar: Sonuçlar 127 erişyonluk belirli germplazm koleksiyonuna dayanmaktadır. Yeni SNP'lerin yalnız 21 temsilî genotipte yeniden dizilemeyle keşfedilmiş olması, koleksiyon dışında başka varyantların bulunabileceği anlamına gelir. Marker-AAC ilişkileri genetik arka plan ve çevresel koşullardan etkilenebilir. Belirlenen markerlar yüksek AAC için güçlü seçim araçları sağlayabilir ancak doğrudan kimyasal AAC ölçümünün evrensel yerine geçen testler olarak yorumlanmamalıdır.

Verianla anlatım ilkesi: Bu içerik özgün makalenin paragraf-paragraf çevirisi değildir. Çalışmanın deney tasarımı, moleküler marker sonuçları, AAC varyasyon yüzdeleri, yeni SNP konumları ve bilimsel sınırlılıkları korunmuş; içerik bağımsız öğretici yapı içinde yeniden düzenlenmiştir. Özgün dizilim şemaları, jel görüntüleri ve korelasyon grafikleri için DOI üzerinden kaynak çalışma incelenmelidir.