Мазмуни зоҳирии амилоза — Apparent Amylose Content (AAC) — яке аз муҳимтарин хусусиятҳои крахмал аст, ки муайян мекунад биринҷ ҳангоми пухтан нарм, часпак ё хушктару дона-дона мемонад. Яке аз танзимгарони асосии синтези амилоза дар эндосперми биринҷ ферменти Granule-Bound Starch Synthase I (GBSSI) мебошад, ки аз ҷониби гени Waxy (Wx) рамзгузорӣ мешавад.

Ин таҳқиқот арзёбӣ кардааст, ки маркерҳои мавҷудаи ДНК, ки дар селексияи биринҷ истифода мешаванд, сатҳи AAC-ро то чӣ андоза хуб пешгӯӣ мекунанд ва махсусан барои боэътимодтар интихоб кардани генотипҳои дорои амилозаи баланд, ки аз %24,5 зиёд аст, дар гени GBSSI/Waxy вариантҳои нави генетикиро ҷустуҷӯ кардааст.

Дар маҷмӯъ 127 аксессияи биринҷ — 125 japonica ва 2 indica — таҳқиқ шуданд. G/T SNP дар интрони аввал ба танҳоӣ %77,5 вариатсияи AAC-ро шарҳ дод, дар ҳоле ки ҳангоми истифода бо A/C SNP дар exon 6, вариатсияи шарҳдодашуда ба %79,5 расид. Илова кардани микросателлити RM190 ба ин ду SNP нишондиҳандаро танҳо то %79,6 боло бурд.

Азбаски гаплотипҳои мавҷудаи маркерӣ аксессияҳои дорои AAC аз %24,5 болотарро боэътимод ҷудо карда натавонистанд, дар 21 генотипе, ки ҳамаи синфҳои AAC-ро намояндагӣ мекарданд, гени GBSSI ва минтақаи танзимкунандаи upstream тақрибан 1 kb аз нав секвениронӣ карда шуданд. Дар маҷмӯъ 32 SNP муайян шуда, чортои онҳо барои таҳияи маркерҳои нави молекулавии dCAPS истифода шуданд.

Гарчанде маркерҳои нав шарҳи умумии вариатсияи AAC-ро танҳо ба андозаи маҳдуд зиёд карданд, гаплотипе, ки RM190 CT20, exon 6 A ва −1514 G-ро якҷо дошт, дар коллексияи таҳқиқотӣ пайваста бо AAC > %24,5 алоқаманд буд. Аз ин рӯ, саҳми муҳимтарини маркерҳои нав на зиёд кардани шадиди вариатсияи умумии шарҳдодашуда, балки пешниҳод кардани абзори молекулавии мушаххастар барои интихоби генотипҳои муайяни дорои амилозаи баланд мебошад.

Чаро амилоза хусусияти пухтани биринҷро тағйир медиҳад?

Крахмали биринҷ асосан аз амилоза ва амилопектин иборат аст. Таносуби онҳо ба сохтори биринҷи пухта ва майли донаҳо ба часпидан ба ҳамдигар таъсири қавӣ мерасонад.

Навъҳои дорои AAC-и баланд одатан донаҳои хушктар, сахттар ва аз ҳам ҷудошаванда ба вуҷуд меоранд, дар ҳоле ки навъҳои дорои AAC-и паст метавонанд нармтар, дурахшонтар ва часпактар бошанд.

Дар таснифи умумие, ки таҳқиқот истифода кардааст, гурӯҳҳои AAC ба waxy, паст, миёна ва баланд-амилоза ҷудо шудаанд. Дар таснифҳои тиҷоратӣ AAC-и тақрибан %26–33 одатан ҳамчун синфи амилозаи баланд арзёбӣ мешавад.

GBSSI ва гени Waxy чист?

Гени Waxy дар хромосомаи 6 ҷойгир аст ва ферменти GBSSI-ро рамзгузорӣ мекунад. GBSSI яке аз ферментҳои асосии синтези амилоза дар эндосперми биринҷ мебошад.

Дар локуси Waxy ду аллели маъмул махсусан муҳиманд:

• Wxa:умуман бо AAC-и баланд алоқаманд аст.
• Wxb:асосан бо AAC-и паст ва миёна алоқаманд аст.

Дар аллели Wxb, G→T SNP дар минтақаи 5′ splice-и интрони аввал метавонад ба коркарди mRNA таъсир расонда, боиси кам шудани миқдори GBSSI-и функсионалӣ гардад. Аз ин рӯ, аллелҳои гуногуни як ген дар тағйирёбии миқдори амилоза дар донаи биринҷ нақши муҳим доранд.

Маркерҳои Мавҷудаи ДНК Мазмуни Амилозаро То Чӣ Андоза Хуб Пешгӯӣ Карданд?

Таҳқиқотчиён аввал қувваи микросателлити RM190, ки қаблан дар селексияи биринҷ истифода мешуд, ва SNP-ҳои муҳими гени Waxy-ро дар пешгӯии AAC дар 127 аксессия арзёбӣ карданд.

Ин натиҷа махсусан таъсири қавии SNP-и интрони аввалро нишон медиҳад. Intron 1 SNP ба танҳоӣ %77,5 вариатсияи AAC-ро шарҳ дод.

Гарчанде Exon 6 SNP ба танҳоӣ қувваи камтари шарҳдиҳӣ дошт, ҳангоми истифода бо intron 1 пешгӯии AAC ба %79,5 расид.

Илова кардани RM190 ба ин комбинатсия танҳо %0,1 шарҳи иловагӣ дод. Аз ин рӯ, дар коллексияи гермплазмаи таҳқиқот RM190 берун аз маълумоте, ки intron 1 ва exon 6 SNP медиҳанд, афзоиши калони иловагии қобилияти пешгӯӣ ба вуҷуд наовард.

Чаро Ба Маркерҳои Нави Молекулавӣ Ниёз Пайдо Шуд?

Комбинатсияҳои мавҷудаи маркерӣ метавонистанд синфҳои паст, миёна ва умуман баланди AAC-ро аз ҳам ҷудо кунанд, вале махсусан барои боэътимод интихоб кардани генотипҳое, ки AAC-и онҳо аз %24,5 зиёд аст, нокифоя буданд.

Ин масъала махсусан барои бозорҳо ва барномаҳои селексионӣ, ки биринҷи дорои амилозаи баландро бартарӣ медиҳанд, муҳим аст. Селексионер метавонад на танҳо синфи «эҳтимолан баланд», балки волидон ё хатҳои мушаххаси дорои AAC-и хеле баландро дар наслҳои барвақт интихоб кардан хоҳад.

Аз ин рӯ, таҳқиқотчиёнallel miningусулро истифода карданд. Ҷустуҷӯи аллелҳо — муқоисаи пайдарпаии ДНК-и як ген дар генотипҳои гуногун барои ёфтани вариантҳое мебошад, ки қаблан номаълум ё нокифоя тавсиф шудаанд.

Дар Ҷустуҷӯи Аллелҳои GBSSI Чӣ Ёфт Шуд?

21 генотип, ки ҳамаи синфҳои AAC-ро намояндагӣ мекарданд, интихоб шуда, тамоми гени GBSSI ва минтақаи танзимкунандаи upstream тақрибан 1 kb аз нав секвениронӣ карда шуд.

Бо вуҷуди шабоҳати баланди қисми зиёди пайдарпаӣ, дар маҷмӯъ32 SNPмуайян карда шуд.

Қисми муҳими вариантҳои нав бештар дар минтақаҳои ғайрикодкунанда, аз қабили promoter ва intron, ёфт шуданд, на дар exon-ҳои рамзгузори сафеда. Ин натиҷа нишон медиҳад, ки қисми рамзгузори сафедаи GBSSI мумкин аст аз сабаби вазифаи муҳими худ нисбатан ҳифзшуда бошад.

Аз байни SNP-ҳои нави муайяншуда барои таҳияи маркери молекулавӣ чор мавқеъ интихоб шуд:

• −1514 — минтақаи promoter,
• +1801 — exon 9,
• +2282 — intron 10,
• +2806 — intron 12.

Барои ин SNP-ҳо маркерҳои dCAPS таҳия шуда, 127 аксессия аз нав скрининг карда шуданд.

Оё Маркерҳои Нав Биринҷи Дорои Амилозаи Баландро Беҳтар Ҷудо Карданд?

Бале, аммо хусусияти саҳм муҳим аст.

Илова кардани −1514 SNP ба intron 1 ва exon 6 SNP-ҳои мавҷуда вариатсияи шарҳдодашудаи AAC-ро аз %79,5 то тақрибан %80,1 баланд кард. Вақте RM190 низ ба модел дохил карда шуд, нишондиҳанда %80,3 гардид.

Ин афзоиш хурд аст. Аз ин рӯ, муваффақияти маркерҳои нав «ба таври назаррас зиёд кардани қувваи пешгӯии AAC» нест.

Натиҷаи асосии муҳим ин аст, ки як гаплотипи муайян бо AAC-и баланд робитаи қавӣ дошт.

RM190 CT20 + exon 6 A + −1514 Gкомбинатсия дар коллексияи таҳқиқотӣ пайваста боAAC > %24,5алоқаманд муайян шуд.

Ҳамин тавр, таҳқиқотчиён барои интихоб кардани биринҷҳои дорои амилозаи баланд дар барномаҳои marker-assisted selection бо мушаххасияти бештар абзори нави генетикиро пешниҳод карданд.

Намунаҳои муайяни аллелӣ, ки аз +1801, +2282 ва +2806 SNP ба вуҷуд омадаанд, инчунин маълумоти иловагии диагностикӣ додаанд, ки метавонад барои ҷудо кардани баъзе донорҳои дорои AAC-и баланд муфид бошад.

Усул ва Натиҷаҳои Таҳқиқот

Маводи растанӣ

Таҳқиқот дар коллексияе аз 127 аксессияи Oryza sativa гузаронида шудааст. Аз онҳо 40-то навъҳои муҳими japonica аз Италия ва 87-то гермплазмаи байналмилалӣ аз кишварҳои гуногун интихобшуда буданд.

Дар коллексияи умумӣ 125 аксессияи japonica ва 2 аксессияи indica мавҷуд буд.

Ҳар аксессия дар тӯли ду сол дар таҷрибаҳои саҳроии се такрорӣ парвариш карда шуд.

AAC чӣ гуна чен карда шуд?

Мазмуни зоҳирии амилозаи биринҷи ҷамъоваришуда бо усули спектрометрӣ, ки ба пайвастшавии йод дар донаи осиёбшуда асос ёфтааст, чен карда шуд.

Дар системаи FOSS FIAstar 5000 ба намуна маҳлули NaOH ва йод илова карда шуда, ранги ҳосилшуда аз рӯи absorbance дар 720 nm арзёбӣ гардид.

Барои калибровка намунаҳои сертификатшудаи референсии биринҷ бо AAC-и %15,40, %23,10 ва %27,7 истифода шуданд.

Таҳлили молекулавӣ

ДНК-и геномӣ аз баргҳои ҷавони растанӣ ҷудо карда шуд. Микросателлити RM190 ва SNP-ҳое, ки аллелҳои гуногуни Waxy-ро намояндагӣ мекарданд, бо усулҳои PCR ва секвениронӣ муайян шуданд.

Барои SNP-ҳои нав дар усули dCAPS primer-ҳои mismatched истифода шуда, маҳсулоти PCR бо ферментҳои мувофиқи рестриксионӣ бурида ва аллелҳо ҷудо карда шуданд.

Секвениронии дубора

Дар 21 генотипи интихобшуда шаш минтақаи ҳампӯши PCR бо дарозии тақрибан 800–2500 bp амплификатсия шуда, гени GBSSI ва минтақаи танзимкунандаи upstream 1 kb фаро гирифта шуд.

Пайдарпаии геномии Nipponbare ҳамчун референс истифода шуд.

Муҳимтарин натиҷаҳои AAC

• RM190 ба танҳоӣ %74,9 вариатсияи AAC-ро шарҳ дод.
• Intron 1 G/T SNP %77,5 шарҳдиҳӣ таъмин кард.
• Комбинатсияи Intron 1 + exon 6 бо %79,5 дар байни маркерҳои асосӣ қавитарин моделро ташкил дод.
• −1514 SNP-и нав вариатсияи умумии шарҳдодашударо танҳо каме зиёд кард.
• Маркерҳои нав махсусан имкон доданд, ки барои интихоби генотипҳои AAC > %24,5 гаплотипҳои мушаххастар муайян карда шаванд.

Робита бо шакли дона

Дар 126 аксессияи non-glutinous байни AAC ва шакли дона робитаҳои назаррас ёфт шуданд.

• Бо зиёд шудани AAC дарозии дона умуман зиёд шуд.
• Бо зиёд шудани AAC таносуби дарозӣ/паҳно зиёд шуд.
• Бо зиёд шудани AAC паҳнои дона тамоюли коҳиш нишон дод.

Intron 1 SNP %49,7 вариатсияи паҳнои дона, %47,7 вариатсияи таносуби дарозӣ/паҳно ва %30,8 вариатсияи дарозии донаро шарҳ дод.

Таҳқиқотчиён ин робитаи генетикиро чунин маънидод намекунанд, ки GBSSI мустақиман шакли донаро назорат мекунад. Интихоби муштараки амилозаи баланд ва шаклҳои муайяни дона дар ҷараёни селексияи дарозмуддат ва афзалиятҳои истеъмолкунандагон метавонад робитаи байни аллелҳои Waxy ва шакли донаро ба вуҷуд оварда бошад.

Натиҷаҳое, ки таҳқиқот дастгирӣ мекунад

• Локуси GBSSI/Waxy қисми муҳими вариатсияи AAC-ро шарҳ медиҳад.
• G/T SNP дар интрони аввал яке аз қавитарин маркерҳои ягона дар гермплазмаи таҳқиқшуда мебошад.
• Комбинатсияи Intron 1 ва exon 6 SNP %79,5 вариатсияи AAC-ро шарҳ додааст.
• Ҷустуҷӯи аллелҳо дар 21 генотип 32 SNP-ро ошкор кард.
• Чор маркери нави dCAPS таҳия шуд.
• Гаплотипи муайяни CT20/exon 6/−1514 дар коллексияи таҳқиқотӣ бо AAC > %24,5 робитаи қавӣ дорад.
• Байни гаплотипҳои Waxy ва хусусиятҳои шакли дона робитаҳои омории назаррас мавҷуданд.

Натиҷаҳое, ки таҳқиқот дастгирӣ намекунад

• Маркерҳои ДНК фоизи амилозаро мустақиман ба таври физикӣ чен намекунанд.
• Маркерҳои нав тамоми вариатсияи AAC-ро шарҳ намедиҳанд.
• Исбот нашудааст, ки гаплотипҳои муайяншуда дар тамоми гермплазмаи биринҷи ҷаҳон ҳамон қувваи пешгӯиро нишон медиҳанд.
• Нишон дода нашудааст, ки SNP-ҳои Waxy сабаби бевоситаи биологии шакли дона мебошанд.
• AAC танҳо аз ҷониби GBSSI муайян намешавад; генҳои дигари метаболизми крахмал низ метавонанд таъсир расонанд.
• Marker-assisted selection дар ҳама ҳолатҳо ченкунии мустақими фенотипро пурра аз байн намебарад.

Чаро заминаи генетикӣ муҳим аст?

Ҳамон маркерҳо метавонанд дар коллексияҳои гуногуни биринҷ миқдори гуногуни вариатсияи AAC-ро шарҳ диҳанд. Баъзе таҳқиқоти пешин бо ҳамон ё маркерҳои монанд нишондиҳандаҳои шарҳдиҳии наздик ба %85–94-ро гузориш додаанд; дар ин таҳқиқот бошад қавитарин комбинатсияи назаррас тақрибан дар %79,5 боқӣ монд.

Таҳқиқотчиён баррасӣ мекунанд, ки ин фарқ метавонад ба он вобаста бошад, ки маводи таҳқиқшуда аз кишварҳои зиёде омадааст ва гуногунии васеътари генетикиро дар бар мегирад.

Аз ин рӯ, муваффақ будани як низоми маркерӣ дар як коллексияи гермплазма худкор кафолат намедиҳад, ки он дар популятсияи дигари селексионӣ ҳамон нишондиҳандаи пешгӯиро медиҳад.

Ёддошт оид ба Манбаъ ва Усул

Таҳқиқоти аслӣ:Improvement of marker-based predictability of Apparent Amylose Content in japonica rice through GBSSI allele mining

Муаллифон:Chiara Biselli; Daniela Cavalluzzo; Rosaria Perrini; Alberto Gianinetti; Paolo Bagnaresi; Simona Urso; Gabriele Orasen; Francesca Desiderio; Elisabetta Lupotto; Luigi Cattivelli; Giampiero Valè.

Муаллифони саҳми баробар:Chiara Biselli ва Daniela Cavalluzzo.

Муаллифи масъул:Giampiero Valè.

Маҷалла:Rice.

Сол / ҷилд / мақола:2014, 7:1.

DOI:10.1186/1939-8433-7-1

Санаи нашр:2 январи 2014.

Иҷозатнома:Creative Commons Attribution 2.0 — CC BY 2.0.

Маблағгузорӣ:AGER Foundation — RISINNOVA project grant 2010–2369 ва MiPAAF — POLORISO project.

Бархӯрди манфиатҳо:Муаллифон мавҷудияти манфиатҳои рақобаткунандаро гузориш надодаанд.

Маҳдудиятҳои асосии методологӣ:Натиҷаҳо ба коллексияи мушаххаси гермплазма аз 127 аксессия асос ёфтаанд. Он ки SNP-ҳои нав танҳо бо секвениронии дубора дар 21 генотипи намояндагӣ кашф шудаанд, маъно дорад, ки берун аз коллексия вариантҳои дигар вуҷуд дошта метавонанд. Робитаҳои Marker-AAC метавонанд аз заминаи генетикӣ ва шароити муҳити зист таъсир гиранд. Маркерҳои муайяншуда метавонанд барои AAC-и баланд абзорҳои пурқуввати интихобӣ диҳанд, аммо онҳоро набояд ҳамчун озмоишҳое маънидод кард, ки ченкунии мустақими кимиёвии AAC-ро дар ҳама ҳолатҳо ба таври универсалӣ иваз мекунанд.

Принсипи баёни Verianla:Ин муҳтаво тарҷумаи параграф-ба-параграфи мақолаи аслӣ нест. Тарҳи таҷрибавӣ, натиҷаҳои маркерҳои молекулавӣ, фоизҳои вариатсияи AAC, мавқеъҳои нави SNP ва маҳдудиятҳои илмии таҳқиқот ҳифз шуда, муҳтаво дар сохтори мустақили омӯзишӣ аз нав тартиб дода шудааст. Барои схемаҳои аслии пайдарпаӣ, тасвирҳои гел ва графикҳои коррелятсия бояд тавассути DOI ба таҳқиқоти манбаъ муроҷиат кард.