Folik asit (FA), tek karbon metabolizması, nükleotid sentezi, DNA onarımı ve metilasyon gibi temel hücresel süreçlerde görev alan bir B vitamini türevidir. Bu preprint çalışmada araştırmacılar, folik asidin kronik alkol maruziyetinin beyin korteksinde oluşturduğu nörotoksik etkileri yalnız antioksidan düzeyde değil, protein kalite kontrol sistemi olan proteostaz ve endoplazmik retikulum (ER) stres yanıtı üzerinden de etkileyip etkilemediğini araştırmıştır. Kronik alkole maruz bırakılan farelerde folik asit davranış performansını iyileştirmiş, kortikal histopatolojik hasarı, oksidatif stresi ve mitokondri/ER ultrastrüktür bozukluklarını azaltmıştır. Aynı zamanda HSP90 ve GRP78 artışını baskılamış, PERK/ATF4/CHOP stres sinyalini azaltmış ve HSP70, HSF1 ile LAMP2A gibi proteostazla ilişkili yanıtların bir bölümünü yeniden yükseltmiştir.

PC12 hücrelerinde yapılan mekanistik deneyler, etanolün HSP90 protein miktarını ve HSP90 asetilasyonunu artırdığını göstermiştir. Folik asit bu artışları azaltmış; mitokondri membran potansiyelini, ATP üretimini, DNA bütünlüğünü ve hücresel yaşamı destekleyen yönde sonuçlar vermiştir. HSP90 aşırı ekspresyonu folik asidin ER stresini baskılayıcı etkisini zayıflatırken, asetilasyonu artıran trichostatin A uygulaması folik asidin bazı koruyucu etkilerini kısmen ortadan kaldırmıştır. Molecular docking, CETSA ve DARTS sonuçları HSP90'ın folik asidin olası moleküler hedeflerinden biri olabileceğini desteklemektedir; ancak doğrudan fiziksel bağlanma henüz kesin biyofiziksel yöntemlerle doğrulanmamıştır.

Araştırmanın temel problemi

Kronik veya aşırı alkol kullanımı, öğrenme, hafıza ve duygusal düzenleme ile ilişkili nöral devreleri olumsuz etkileyebilir. Alkol maruziyeti mitokondri fonksiyonunu bozabilir, ATP üretimini azaltabilir, reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumunu artırabilir ve hücresel stres yanıtlarını aktive edebilir.

Bu hasarın yalnız oksidatif stresle açıklanamayacağı giderek daha fazla kabul edilmektedir. Mitokondri bozukluğu, endoplazmik retikulum stresi, protein kalite kontrolündeki aksama ve metabolik yeniden programlama birbirini besleyebilen bir stres ağı oluşturabilir.

Bu çalışmanın odaklandığı ana soru şudur: Folik asit, alkol kaynaklı beyin hasarını HSP90 merkezli proteostaz ve ER stres mekanizmalarını düzenleyerek azaltabilir mi?

Proteostaz Nedir ve Alkol Neden Bu Sistemi Bozabilir?

Proteostaz, hücrenin proteinlerin doğru katlanmasını, hasarlı proteinlerin onarılmasını veya uzaklaştırılmasını ve protein kalitesinin korunmasını sağlayan bütünleşik sistemidir. HSP70, HSP90, HSC70 ve LAMP2A gibi proteinler bu ağın önemli bileşenleri arasındadır.

Uzun süreli alkol maruziyeti yanlış katlanmış veya hasarlı protein yükünü artırabilir. Bu durumda hücrenin şaperon sistemleri üzerindeki baskı yükselir. Eğer bu sistemler dengeyi geri kuramazsa proteotoksik stres ile ER stresi birbirini güçlendirebilir.

HSP90 neden önemli?

Heat Shock Protein 90 (HSP90), çok sayıda istemci proteinin katlanması ve stabilitesinde görev alan ATP-bağımlı bir moleküler şaperondur.

HSP90'ın aktivitesi yalnız protein miktarıyla değil, asetilasyon gibi post-translasyonel modifikasyonlarla da düzenlenebilir. Aşırı veya uygunsuz HSP90 aktivitesi, hücrenin normal stres adaptasyonundan maladaptif proteostaz durumuna geçişinin bir parçası olabilir.

Çalışmada kronik alkol maruziyeti HSP90 protein düzeyini artırmış, buna karşılık Hsp90 mRNA düzeyi belirgin biçimde değişmemiştir. Bu sonuç HSP90 artışının en azından kısmen transkripsiyon sonrası veya protein stabilitesi düzeyindeki mekanizmalarla ilişkili olabileceğini düşündürmektedir.

Folik Asit HSP90'a Doğrudan Bağlanıyor mu?

Çalışma HSP90'ı ilk olarak ağ farmakolojisi yaklaşımıyla olası hedef olarak belirlemiştir. Folik asidin tahmini hedefleri ile alkol ilişkili beyin hasarı genleri arasında 30 ortak gen bulunmuş ve HSP90 ağdaki merkezi düğümlerden biri olarak öne çıkmıştır.

Moleküler docking analizinde folik asit ile HSP90 arasında yaklaşık −8,6 kcal/mol bağlanma enerjisi hesaplanmış; LEU93, ASN37, SER38 ve ASP39 bölgeleriyle etkileşim öngörülmüştür.

Docking tek başına fiziksel bağlanmanın deneysel kanıtı değildir. Bu nedenle araştırmacılar ayrıca iki hücresel hedef-etkileşim testi kullanmıştır.

CETSA deneyinde folik asit varlığında HSP90'ın termal stabilitesinin arttığı görülmüştür. DARTS deneyinde ise HSP90'ın proteaz sindirimine karşı daha dirençli hale geldiği raporlanmıştır.

Bu veriler folik asit ile HSP90 arasında bir etkileşim olabileceğini desteklemektedir. Ancak yazarlar, doğrudan bağlanmanın daha ileri biyofiziksel yöntemlerle doğrulanması gerektiğini açıkça belirtmektedir.

Hayvan modeli nasıl kuruldu?

Sekiz haftalık erkek C57BL/6J fareleri beş gruba ayrılmıştır:

• Kontrol
• Alkol modeli
• Folik asit
• 4-PBA
• 17-AAG

Her grupta 20 fare bulunmuştur.

Kontrol grubu alkolsüz izokalorik Lieber-DeCarli diyet alırken diğer gruplar %4 v/v alkol içeren Lieber-DeCarli sıvı diyet kullanmıştır.

Folik asit:

5 mg/kg/gün, haftada altı gün, toplam 12 hafta oral gavajla verilmiştir.

ER stresini hedefleyen 4-PBA ve HSP90 inhibitörü 17-AAG ise kronik alkol maruziyeti oluşturulduktan sonra son üç haftada uygulanmıştır.

Davranış testlerinde ne görüldü?

Alkol maruziyeti elevated plus maze ve Y-maze testlerinde keşif davranışlarını azaltmış, forced swimming testinde ise hareketsizlik davranışını artırmıştır.

Folik asit alan farelerde bu davranış değişikliklerinin önemli bölümü hafiflemiştir. Benzer yönde iyileşmeler 4-PBA ve 17-AAG gruplarında da görülmüştür.

Bu benzerlik, ER stresi ve HSP90 ile ilişkili süreçlerin alkol kaynaklı davranış bozukluklarının altında yer alan mekanizmanın parçalarından biri olabileceği yorumunu desteklemektedir.

Kortikal doku hasarı

H&E boyaması alkol grubunda nöronal organizasyon bozukluğu ve vakuoler dejenerasyon göstermiştir. Nissl boyamasında Nissl cisimciklerinin yoğunluğu azalmıştır.

Folik asit uygulaması sonrasında nöronal dizilim daha düzenli hale gelmiş, vakuolizasyon azalmış ve Nissl yoğunluğu alkol modeline göre artmıştır.

Alkol Mitokondri ve Endoplazmik Retikulumu Nasıl Etkiledi?

Alkol maruziyetli farelerin korteksinde antioksidan enzim aktiviteleri azalmış, ROS düzeyi artmıştır.

Transmisyon elektron mikroskopisi:

• mitokondri şişmesi,
• mitokondri kristalarının bozulması,
• endoplazmik retikulum genişlemesi

gibi ultrastrüktürel hasarlar göstermiştir.

Folik asit bu yapısal değişikliklerin şiddetini azaltmıştır.

HSP90 ve GRP78 birlikte neden arttı?

İmmünofloresan incelemelerde alkol maruziyeti sonrası kortikal hücrelerde hem HSP90 hem de ER stres şaperonu GRP78 artmış ve iki proteinin eş-lokalizasyonu güçlenmiştir.

Bu bulgu hücrenin protein kalite kontrol sistemi ile ER stres yanıtının aynı anda aktive olduğunu göstermektedir.

Folik asit hem HSP90 hem GRP78 düzeylerini azaltmıştır.

PERK–ATF4–CHOP Yolu Nedir?

PERK, endoplazmik retikulumda protein katlanma stresi oluştuğunda aktive olabilen üç temel unfolded protein response sensöründen biridir.

Uzun süreli veya çözülemeyen ER stresinde PERK sinyali ATF4 ve CHOP üzerinden hücre ölümüne katkıda bulunabilir.

Alkol grubunda:

• GRP78 ↑
• p-PERK ↑
• ATF4 ↑
• CHOP ↑

bulunmuştur.

Folik asit bu artışları belirgin biçimde azaltmıştır.

Bu sonuç, folik asidin alkol kaynaklı maladaptif ER stresini baskıladığı yorumunu desteklemektedir.

Proteostazla ilişkili diğer proteinler

Alkol maruziyeti sonrasında HSP70 ve HSF1 düzeyleri düşmüş, LAMP2A sinyali azalmıştır.

Folik asit uygulaması:

• HSP70'u artırmış,
• HSF1 yanıtını kısmen geri kazandırmış,
• LAMP2A düzeyini yükseltmiştir.

Bu değişiklikler protein kalite kontrol kapasitesinde kısmi toparlanma ile uyumludur.

LAMP2A ve HSC70 Neden Önemlidir?

LAMP2A ve HSC70, şaperon aracılı otofaji (Chaperone-Mediated Autophagy, CMA) sisteminin temel bileşenlerindendir.

CMA, belirli sitozolik proteinlerin lizozom içine seçici olarak taşınarak parçalanmasını sağlar.

Çalışmada etanol maruziyeti LAMP2A ve HSC70 proteinlerini azaltırken folik asit bu proteinlerin düzeyini yükseltmiştir.

Ancak araştırmacılar CMA aktivitesini doğrudan akış ölçümüyle değerlendirmemiştir. Bu nedenle sonuçlar “CMA kesin olarak aktive edildi” şeklinde yorumlanamaz.

Metabolomik analiz

Kortikal dokuda UPLC-Q-TOF tabanlı hedeflenmemiş metabolomik analiz yapılmıştır.

Kontrol ve alkol modeli arasında 26, folik asit ile alkol modeli arasında ise 31 diferansiyel metabolit tanımlanmıştır.

Volcano plot analizinde alkol grubunda 90 metabolitin arttığı, 41 metabolitin azaldığı; folik asit sonrası ise 10 metabolitin arttığı ve 31 metabolitin azaldığı raporlanmıştır.

En belirgin değişikliklerin:

• triptofan–kinürenin metabolizması,
• dallı zincirli amino asit metabolizması

ile ilişkili olduğu görülmüştür.

Kinürenin Yolu ile ER Stresi Arasında Bağ Var mı?

Triptofan–kinürenin yolu inflamasyon, oksidatif stres ve nöroaktif metabolit üretimiyle ilişkilidir.

PC12 hücrelerinde etanol:

• IDO1 proteinini artırmış,
• kinürenin birikimini artırmıştır.

Folik asit bu değişiklikleri kısmen azaltmıştır.

4-PBA'nın benzer yönde etki göstermesi, ER stresinin bu metabolik değişikliklerle ilişkili olabileceğini düşündürmektedir.

Ancak ATF4 veya IDO1 doğrudan susturulmadığı veya aşırı eksprese edilmediği için PERK/ATF4 → IDO1 → kinürenin zincirinin nedenselliği henüz kesinleşmiş değildir.

PC12 hücrelerinde etanol hasarı

PC12 hücrelerinde 500 mM etanol kullanılmıştır.

Bu maruziyet:

• hücre canlılığını azaltmış,
• ROS'u artırmış,
• mitokondri membran potansiyelini düşürmüş,
• ATP üretimini azaltmış,
• comet assay ile DNA hasarını artırmış,
• γ-H2AX sinyalini yükseltmiştir.

Folik asit için 20 ve 40 µM dozları sonraki deneylerde kullanılmıştır ve bu dozlar etanolün oluşturduğu hücresel hasarın önemli bir bölümünü azaltmıştır.

HSP90 Aşırı Ekspresyonu Folik Asidin Etkisini Değiştirdi mi?

Evet. HSP90 aşırı ekspresyonu yapılan PC12 hücrelerinde folik asidin HSP90, GRP78, p-PERK, ATF4 ve CHOP üzerindeki baskılayıcı etkileri zayıflamıştır.

Bu sonuç HSP90'ın yalnızca alkol stresi sırasında artan bir belirteç olmadığını, folik asidin koruyucu etkilerinin ortaya çıkmasında işlevsel bir rol oynayabileceğini desteklemektedir.

HSP90 inhibitörü 17-AAG ise birçok ölçütte folik aside benzer yönde sonuç vermiştir.

HSP90 Asetilasyonu Neden Kritik?

HSP90 fonksiyonu asetilasyonla düzenlenebilir. Asetillenmiş HSP90'ın konformasyonu ve şaperon etkinliği değişebilir.

Çalışmada etanol:

Ac-HSP90 ↑

oluşturmuştur.

Folik asit ise HSP90 asetilasyonunu azaltmıştır.

Asetilasyonu etkileyen histon deasetilaz inhibitörü trichostatin A (TSA) eklendiğinde folik asidin Ac-HSP90'u azaltıcı etkisi zayıflamıştır.

TSA aynı zamanda folik asidin:

• PERK/ATF4/CHOP sinyalini baskılama,
• LAMP2A ve HSC70'u yükseltme,
• apoptozu azaltma

etkilerinin bir bölümünü geri çevirmiştir.

Apoptoz sonuçları

Etanol maruziyeti:

• apoptotik hücre oranını artırmış,
• Bax düzeyini artırmış,
• cleaved caspase-3 düzeyini artırmış,
• Bcl-2 düzeyini azaltmıştır.

Folik asit bu değişikliklerin çoğunu ters yönde etkilemiştir.

TSA uygulaması koruyucu etkinin bir bölümünü azaltmıştır.

İnsan AUD Beyin Verisi Ne Gösterdi?

Araştırmacılar GSE182173 veri setindeki insan prefrontal korteks transkriptomunu yeniden analiz etmiştir.

Gene Set Enrichment Analysis sonuçlarına göre:

• neuronal ensheathment: Kontrol yönünde, NES = 2,380
• oligodendrocyte differentiation: Kontrol yönünde, NES = 2,254
• lysosome organization: Kontrol yönünde, NES = 1,693
• KEAP1–NRF2 signaling: AUD yönünde, NES = −1,897

bulunmuştur.

AUD grubunda miyelin ilişkili PLP1 ve MAG ekspresyonu daha düşük, oksidatif stres ile ilişkili GSTM1 ve NQO1 ise daha yüksek bulunmuştur.

Bu sonuçlar AUD prefrontal korteksinde miyelin/oligodendrosit programları, lizozomal homeostaz ve oksidatif stres yanıtlarının değiştiğini göstermektedir.

Bu İnsan Verisi HSP90 Mekanizmasını Kanıtlıyor mu?

Hayır. GSE182173 analizi yalnız AUD bulunan insanların beyin dokusundaki transkripsiyonel yol değişikliklerini göstermektedir.

Veri setinde folik asit tedavisi uygulanmamış, HSP90–folik asit etkileşimi deneysel olarak test edilmemiştir.

Dolayısıyla insan transkriptom verisi HSP90 merkezli mekanizmayı doğrudan doğrulamamakta; yalnızca deneysel modelde gözlenen stres, lizozom ve hücresel homeostaz değişiklikleri için klinik bağlam sağlamaktadır.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Deneysel tasarım özeti

Önerilen mekanizma

Çalışmanın doğrudan desteklediği sonuçlar

• Folik asit kronik alkol maruziyetli farelerde davranış ve kortikal histopatoloji sonuçlarını iyileştirmiştir.
• Folik asit oksidatif stres ile mitokondri ve ER hasarını azaltmıştır.
• Alkol HSP90 proteinini artırırken HSP90 mRNA'sında belirgin artış oluşturmamıştır.
• Folik asit HSP90 ve GRP78 artışını azaltmıştır.
• Folik asit PERK/ATF4/CHOP sinyalini baskılamıştır.
• HSP90 aşırı ekspresyonu folik asidin ER stresini baskılayıcı etkisini zayıflatmıştır.
• Folik asit HSP90 asetilasyonunu azaltmıştır.
• TSA, folik asidin HSP90 asetilasyonu ve bazı proteostaz/apoptoz sonuçları üzerindeki etkisini zayıflatmıştır.
• Folik asit etanol kaynaklı mitokondri bozukluğu ve DNA hasarını PC12 hücrelerinde azaltmıştır.
• Folik asit triptofan–kinürenin metabolizmasındaki bazı alkol kaynaklı değişiklikleri kısmen düzeltmiştir.

Çalışmanın doğrudan kanıtlamadığı noktalar

• Folik asidin insanlarda alkol kullanım bozukluğunu tedavi ettiği gösterilmemiştir.
• Folik asit ile HSP90 arasında doğrudan fiziksel bağlanma kesin olarak kanıtlanmamıştır.
• HSP90'ın hangi asetilasyon bölgesinin kritik olduğu belirlenmemiştir.
• İlgili deasetilaz enzimi tanımlanmamıştır.
• Şaperon aracılı otofaji akışı doğrudan ölçülmemiştir.
• PERK/ATF4–IDO1–kinürenin zincirinin nedenselliği doğrudan genetik müdahaleyle gösterilmemiştir.
• İnsan GSE182173 verisi folik asit tedavisini veya HSP90 mekanizmasını doğrudan test etmemektedir.

Klinik açıdan nasıl yorumlanmalı?

Çalışmanın sonuçları folik asidin alkol kaynaklı sinir hücresi stresinde biyolojik olarak anlamlı koruyucu mekanizmalara sahip olabileceğini düşündürmektedir.

Bununla birlikte kullanılan folik asit dozu fare modeline özgüdür ve doğrudan insana çevrilemez. Klinik etkinlik, güvenlik, doz ve tedavi süresi kontrollü insan çalışmalarında belirlenmeden bu bulgular tedavi önerisi olarak yorumlanmamalıdır.

Kaynak ve Yöntem Notu

Özgün çalışma: Folic acid attenuates alcohol-induced neurotoxicity by modulating HSP90-associated proteostasis and endoplasmic reticulum stress.

Yazarlar: Nan Zhang, Kening Zhang, Huaqi Zhang, Bingxue Song, Xi Liang, Zhitong Zhou, Meilan Xue ve Hui Liang.

Kurumlar: Qingdao Medical College, Qingdao University; Department of Cardiovascular Medicine, Qingdao University Affiliated Hospital; Science Center for Future Foods, Jiangnan University.

Yayın durumu: SSRN preprint. Hakem değerlendirmesinden geçmemiştir.

SSRN: 7346567.

Hayvan modeli: Erkek C57BL/6J fareleri; %4 v/v etanol içeren Lieber-DeCarli diyeti; 12 haftalık kronik maruziyet.

Folik asit uygulaması: 5 mg/kg, oral gavaj, günde bir kez, haftada altı gün.

Hücresel model: PC12 hücreleri, 500 mM etanol; folik asit 20 ve 40 µM.

Başlıca yöntemler: davranış testleri, H&E, Nissl, TEM, ROS analizi, Western blot, qRT-PCR, immunofloresan, comet assay, JC-1, immunoprecipitation, network pharmacology, molecular docking, CETSA, DARTS, hedeflenmemiş metabolomik ve insan transkriptom yeniden analizi.

İstatistik: One-way ANOVA + Tukey veya Kruskal-Wallis + Dunn; Spearman korelasyonu; çoklu karşılaştırmalarda Benjamini-Krieger-Yekutieli düzeltmesi; q < 0,05 anlamlı kabul edilmiştir.

Finansman: National Natural Science Foundation of China No. 82273626; Shandong Province Natural Science Foundation No. ZR2024MH073; Qingdao Key Technology Research and Industrialization Demonstration Projects No. 25-1-1-gjgg-71-nsh.

Veri erişilebilirliği: Verilerin talep üzerine sağlanacağı bildirilmiştir.

Çıkar çatışması: Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmiştir.

Temel sınırlılıklar: Çalışma preprinttir. Folik asit-HSP90 fiziksel bağlanması kesin biyofiziksel yöntemlerle doğrulanmamıştır. HSP90 asetilasyon bölgeleri ve ilgili deasetilazlar belirlenmemiştir. CMA akışı doğrudan ölçülmemiştir. İnsan transkriptom analizi ikincil ve yol düzeyindedir; folik asit tedavisini test etmez.