Asidi ya foliki (FA), ni kiambata cha vitamini B kinachoshiriki katika michakato ya msingi ya seli kama umetaboli wa kaboni moja, usanisi wa nyukleotidi, urekebishaji wa DNA na umethilishaji. Katika utafiti huu wa preprint, watafiti walichunguza ikiwa asidi ya foliki inaweza kuathiri madhara ya neurotoxicity yanayosababishwa na mfiduo wa muda mrefu wa pombe katika gamba la ubongo si katika kiwango cha antioxidant pekee, bali pia kupitia proteostasis — mfumo wa udhibiti wa ubora wa protini — na mwitikio wa msongo wa retikulamu endoplasmatiki (ER). Katika panya waliowekwa kwenye mfiduo wa muda mrefu wa pombe, asidi ya foliki iliboresha utendaji wa kitabia, ikapunguza uharibifu wa histopatholojia ya gamba, msongo wa oksidishaji na hitilafu za ultrastructure za mitochondria/ER. Wakati huohuo ilipunguza ongezeko la HSP90 na GRP78, ikapunguza ishara ya msongo ya PERK/ATF4/CHOP na kuongeza tena sehemu ya majibu yanayohusiana na proteostasis kama HSP70, HSF1 na LAMP2A.

Majaribio ya kimekanisti katika seli za PC12 yalionyesha kuwa ethanoli huongeza kiwango cha protini HSP90 na asetilesheni ya HSP90. Asidi ya foliki ilipunguza ongezeko hili; ikatoa matokeo yanayounga mkono uwezo wa utando wa mitochondria, uzalishaji wa ATP, uadilifu wa DNA na uhai wa seli. Uonyeshaji kupita kiasi wa HSP90 ulidhoofisha athari ya asidi ya foliki ya kukandamiza msongo wa ER, huku matumizi ya trichostatin A, ambayo huongeza asetilesheni, yakipunguza kwa kiasi baadhi ya athari zake za kinga. Matokeo ya Molecular docking, CETSA na DARTS yanaunga mkono uwezekano kwamba HSP90 ni mojawapo ya malengo ya kimolekuli ya asidi ya foliki; hata hivyo, ufungamanaji wa moja kwa moja wa kimwili bado haujathibitishwa kwa mbinu mahususi za kifizikia-baiolojia.

Tatizo kuu la utafiti

Matumizi ya pombe ya muda mrefu au kupita kiasi yanaweza kuathiri vibaya mizunguko ya neva inayohusiana na kujifunza, kumbukumbu na udhibiti wa hisia. Mfiduo wa pombe unaweza kuharibu utendaji wa mitochondria, kupunguza uzalishaji wa ATP, kuongeza uzalishaji wa aina tendaji za oksijeni (ROS) na kuamsha majibu ya msongo wa seli.

Inazidi kukubalika kwamba uharibifu huu hauwezi kuelezwa kwa msongo wa oksidishaji pekee. Hitilafu za mitochondria, msongo wa retikulamu endoplasmatiki, kuvurugika kwa udhibiti wa ubora wa protini na upangaji upya wa kimetaboliki vinaweza kuunda mtandao wa msongo unaoweza kujichochea wenyewe.

Swali kuu linalolengwa na utafiti huu ni: Je, asidi ya foliki inaweza kupunguza uharibifu wa ubongo unaosababishwa na pombe kwa kudhibiti proteostasis inayolenga HSP90 na mifumo ya msongo wa ER?

Proteostasis ni Nini na Kwa Nini Pombe Inaweza Kuvuruga Mfumo Huu?

Proteostasis ni mfumo jumuishi unaohakikisha protini zinakunja kwa usahihi, protini zilizoharibika zinatengenezwa au kuondolewa, na ubora wa protini unadumishwa. Protini kama HSP70, HSP90, HSC70 na LAMP2A ni miongoni mwa vipengele muhimu vya mtandao huu.

Mfiduo wa muda mrefu wa pombe unaweza kuongeza mzigo wa protini zilizokunjwa vibaya au zilizoharibika. Katika hali hii, shinikizo juu ya mifumo ya chaperone ya seli huongezeka. Ikiwa mifumo hii haiwezi kurejesha usawa, msongo wa proteotoxic na msongo wa ER vinaweza kuimarishana.

Kwa nini HSP90 ni muhimu?

Heat Shock Protein 90 (HSP90), ni chaperone ya kimolekuli inayotegemea ATP ambayo hushiriki katika kukunja na uthabiti wa protini nyingi za mteja.

Shughuli ya HSP90 inaweza kudhibitiwa si kwa kiwango cha protini pekee, bali pia na marekebisho ya post-translational kama asetilesheni. Shughuli nyingi au isiyofaa ya HSP90 inaweza kuwa sehemu ya mpito wa seli kutoka kwa urekebishaji wa kawaida wa msongo hadi hali ya proteostasis isiyobadilika vizuri.

Katika utafiti, mfiduo wa muda mrefu wa pombe uliongeza kiwango cha protini HSP90, huku kiwango cha Hsp90 mRNA hakikubadilika kwa kiasi kikubwa. Matokeo haya yanaashiria kuwa ongezeko la HSP90 linaweza kuhusishwa angalau kwa sehemu na mifumo ya baada ya unukuzi au uthabiti wa protini.

Je, Asidi ya Foliki Hufungamana Moja kwa Moja na HSP90?

Utafiti ulitambua HSP90 kwanza kama lengo linalowezekana kupitia mbinu ya network pharmacology. Kati ya malengo yaliyotabiriwa ya asidi ya foliki na jeni zinazohusishwa na uharibifu wa ubongo unaohusiana na pombe kulikuwa na jeni 30 zinazofanana, na HSP90 ikaibuka kama mojawapo ya nodi kuu kwenye mtandao.

Katika uchambuzi wa molecular docking, kati ya asidi ya foliki na HSP90 ilikokotolewa takriban −8,6 kcal/mol ya nishati ya ufungamanaji; mwingiliano na maeneo ya LEU93, ASN37, SER38 na ASP39 ulitabiriwa.

Docking peke yake si ushahidi wa majaribio wa ufungamanaji wa kimwili. Kwa hiyo, watafiti pia walitumia vipimo viwili vya mwingiliano wa lengo katika seli.

CETSA ilionyesha kuwa uwepo wa asidi ya foliki huongeza uthabiti wa joto wa HSP90. DARTS nayo iliripoti kuwa HSP90 ikawa sugu zaidi kwa mmeng’enyo wa protease.

Data hizi zinaunga mkono uwezekano wa mwingiliano kati ya asidi ya foliki na HSP90. Hata hivyo, waandishi wanasema wazi kwamba ufungamanaji wa moja kwa moja unahitaji kuthibitishwa kwa mbinu za juu zaidi za kifizikia-baiolojia.

Muundo wa wanyama uliundwaje?

Panya dume wa C57BL/6J wenye umri wa wiki nane waligawanywa katika makundi matano:

• Udhibiti
• Muundo wa pombe
• Asidi ya foliki
• 4-PBA
• 17-AAG

Kila kundi lilikuwa na panya 20.

Kundi la udhibiti lilipokea lishe ya Lieber-DeCarli yenye kalori sawa bila pombe, huku makundi mengine yakitumia lishe ya kioevu ya Lieber-DeCarli yenye %4 v/v pombe.

Asidi ya foliki:

5 mg/kg/siku, siku sita kwa wiki, kwa jumla ya wiki 12, ilitolewa kwa oral gavage.

4-PBA inayolenga msongo wa ER na kizuizi cha HSP90, 17-AAG, zilitolewa katika wiki tatu za mwisho baada ya kuanzishwa kwa mfiduo wa muda mrefu wa pombe.

Ni nini kilionekana katika vipimo vya tabia?

Mfiduo wa pombe ulipunguza tabia za uchunguzi katika elevated plus maze na Y-maze, na kuongeza kutosonga katika forced swimming test.

Katika panya waliopokea asidi ya foliki, sehemu kubwa ya mabadiliko haya ya kitabia ilipungua. Maboresho ya mwelekeo sawa pia yalionekana katika makundi ya 4-PBA na 17-AAG.

Ufanano huu unaunga mkono tafsiri kwamba msongo wa ER na michakato inayohusiana na HSP90 inaweza kuwa mojawapo ya sehemu za mfumo unaosababisha matatizo ya kitabia yanayotokana na pombe.

Uharibifu wa tishu za gamba

Rangi ya H&E ilionyesha kuvurugika kwa mpangilio wa neuroni na degeneration ya vakuoli katika kundi la pombe. Katika rangi ya Nissl, msongamano wa chembe za Nissl ulipungua.

Baada ya matumizi ya asidi ya foliki, mpangilio wa neuroni ulikuwa wa kawaida zaidi, vakuolization ilipungua, na msongamano wa Nissl uliongezeka ikilinganishwa na muundo wa pombe.

Pombe Iliathirije Mitochondria na Retikulamu Endoplasmatiki?

Katika gamba la panya waliowekwa kwenye pombe, shughuli za vimeng’enya antioxidant zilipungua na kiwango cha ROS kiliongezeka.

Microscopy ya elektroni ya transmission:

• uvimbe wa mitochondria,
• kuharibika kwa cristae za mitochondria,
• kupanuka kwa retikulamu endoplasmatiki

vilionyesha uharibifu wa ultrastructure kama huo.

Asidi ya foliki ilipunguza ukali wa mabadiliko haya ya kimuundo.

Kwa nini HSP90 na GRP78 ziliongezeka pamoja?

Katika uchunguzi wa immunofluorescence baada ya mfiduo wa pombe, HSP90 na GRP78, chaperone ya msongo wa ER, ziliongezeka katika seli za gamba na co-localization ya protini hizo mbili ikaongezeka.

Ugunduzi huu unaonyesha kwamba mfumo wa udhibiti wa ubora wa protini na mwitikio wa msongo wa ER uliamilishwa kwa wakati mmoja.

Asidi ya foliki ilipunguza viwango vya HSP90 na GRP78.

Njia ya PERK–ATF4–CHOP ni Nini?

PERK ni mojawapo ya sensa tatu kuu za unfolded protein response zinazoweza kuamilishwa wakati kuna msongo wa kukunja protini katika retikulamu endoplasmatiki.

Katika msongo wa ER wa muda mrefu au usiotatuliwa, ishara ya PERK inaweza kuchangia kifo cha seli kupitia ATF4 na CHOP.

Katika kundi la pombe:

• GRP78 ↑
• p-PERK ↑
• ATF4 ↑
• CHOP ↑

vilipatikana.

Asidi ya foliki ilipunguza ongezeko hili kwa kiasi kikubwa.

Matokeo haya yanaunga mkono tafsiri kwamba asidi ya foliki hukandamiza msongo wa ER usiobadilika vizuri unaosababishwa na pombe.

Protini nyingine zinazohusiana na proteostasis

Baada ya mfiduo wa pombe, viwango vya HSP70 na HSF1 vilipungua na ishara ya LAMP2A ikapungua.

Matumizi ya asidi ya foliki:

• yaliongeza HSP70,
• yalirejesha kwa kiasi mwitikio wa HSF1,
• yaliongeza kiwango cha LAMP2A.

Mabadiliko haya yanaendana na urejeshaji wa sehemu wa uwezo wa udhibiti wa ubora wa protini.

Kwa nini LAMP2A na HSC70 ni Muhimu?

LAMP2A na HSC70 ni vipengele vya msingi vya autophagy inayosaidiwa na chaperone (Chaperone-Mediated Autophagy, CMA).

CMA huwezesha protini fulani za cytosolic kusafirishwa kwa uteuzi hadi lysosome na kuvunjwa.

Katika utafiti, mfiduo wa ethanoli ulipunguza protini za LAMP2A na HSC70, huku asidi ya foliki ikiongeza viwango vya protini hizi.

Hata hivyo, watafiti hawakupima shughuli ya CMA moja kwa moja kwa kipimo cha flux. Kwa hiyo, matokeo hayawezi kutafsiriwa kuwa “CMA iliamilishwa kwa hakika”.

Uchambuzi wa metabolomics

Katika tishu za gamba, uchambuzi wa metabolomics usiolengwa unaotegemea UPLC-Q-TOF ulifanywa.

Kati ya kundi la udhibiti na muundo wa pombe, 26 na kati ya asidi ya foliki na muundo wa pombe, 31 metabolites tofauti zilitambuliwa.

Katika uchambuzi wa Volcano plot, iliripotiwa kuwa katika kundi la pombe metabolites 90 ziliongezeka na 41 zikapungua; baada ya asidi ya foliki, metabolites 10 ziliongezeka na 31 zikapungua.

Mabadiliko yaliyoonekana zaidi yalihusiana na:

• umetaboli wa tryptophan–kynurenine,
• umetaboli wa amino acid zenye matawi

.

Je, Kuna Uhusiano Kati ya Njia ya Kynurenine na Msongo wa ER?

Njia ya tryptophan–kynurenine inahusishwa na uvimbe, msongo wa oksidishaji na uzalishaji wa metabolite za neuroactive.

Katika seli za PC12, ethanoli:

• iliongeza protini IDO1,
• iliongeza mkusanyiko wa kynurenine.

Asidi ya foliki ilipunguza mabadiliko haya kwa kiasi.

Athari ya 4-PBA katika mwelekeo sawa inaashiria kuwa msongo wa ER unaweza kuhusishwa na mabadiliko haya ya kimetaboliki.

Hata hivyo, kwa kuwa ATF4 au IDO1 hazikunyamazishwa moja kwa moja wala kuonyeshwa kupita kiasi, sababu ya mnyororo PERK/ATF4 → IDO1 → kynurenine bado haijathibitishwa.

Uharibifu wa ethanoli katika seli za PC12

Katika seli za PC12, 500 mM ethanoli ilitumika.

Mfiduo huu:

• ulipunguza uhai wa seli,
• uliongeza ROS,
• ulipunguza uwezo wa utando wa mitochondria,
• ulipunguza uzalishaji wa ATP,
• uliongeza uharibifu wa DNA kwa comet assay,
• uliongeza ishara ya γ-H2AX.

Dozi za 20 na 40 µM za asidi ya foliki zilitumika katika majaribio yaliyofuata, na dozi hizi zilipunguza sehemu kubwa ya uharibifu wa seli uliosababishwa na ethanoli.

Je, Uonyeshaji Kupita Kiasi wa HSP90 Ulibadilisha Athari ya Asidi ya Foliki?

Ndiyo. Katika seli za PC12 zenye uonyeshaji kupita kiasi wa HSP90, athari za asidi ya foliki za kukandamiza HSP90, GRP78, p-PERK, ATF4 na CHOP zilidhoofika.

Matokeo haya yanaunga mkono kwamba HSP90 si alama tu inayoongezeka wakati wa msongo wa pombe, bali inaweza kuwa na jukumu la kiutendaji katika kujitokeza kwa athari za kinga za asidi ya foliki.

Kizuizi cha HSP90, 17-AAG, kilitoa matokeo ya mwelekeo unaofanana na asidi ya foliki katika vipimo vingi.

Kwa nini Asetilesheni ya HSP90 ni Muhimu?

Utendaji wa HSP90 unaweza kudhibitiwa na asetilesheni. Muundo na shughuli ya chaperone ya HSP90 iliyosetileshwa vinaweza kubadilika.

Katika utafiti, ethanoli:

Ac-HSP90 ↑

ilisababisha.

Asidi ya foliki ilipunguza asetilesheni ya HSP90.

Wakati kizuizi cha histone deacetylase kinachoathiri asetilesheni, trichostatin A (TSA), kilipoongezwa, athari ya asidi ya foliki ya kupunguza Ac-HSP90 ilidhoofika.

TSA pia iligeuza sehemu ya athari za asidi ya foliki za:

• kukandamiza ishara ya PERK/ATF4/CHOP,
• kuongeza LAMP2A na HSC70,
• kupunguza apoptosis

.

Matokeo ya apoptosis

Mfiduo wa ethanoli:

• uliongeza uwiano wa seli za apoptotic,
• uliongeza kiwango cha Bax,
• uliongeza kiwango cha cleaved caspase-3,
• ulipunguza kiwango cha Bcl-2.

Asidi ya foliki iliathiri mabadiliko mengi haya katika mwelekeo wa kinyume.

Matumizi ya TSA yalipunguza sehemu ya athari ya kinga.

Data ya Ubongo wa Binadamu wenye AUD Ilionyesha Nini?

Watafiti walichambua upya transcriptome ya prefrontal cortex ya binadamu katika seti ya data ya GSE182173.

Kulingana na matokeo ya Gene Set Enrichment Analysis:

• neuronal ensheathment: Katika mwelekeo wa udhibiti, NES = 2,380
• oligodendrocyte differentiation: Katika mwelekeo wa udhibiti, NES = 2,254
• lysosome organization: Katika mwelekeo wa udhibiti, NES = 1,693
• KEAP1–NRF2 signaling: Katika mwelekeo wa AUD, NES = −1,897

vilipatikana.

Katika kundi la AUD, uonyeshaji wa PLP1 na MAG unaohusiana na myelin ulikuwa chini, huku GSTM1 na NQO1 zinazohusiana na msongo wa oksidishaji zikiwa juu.

Matokeo haya yanaonyesha kuwa programu za myelin/oligodendrocyte, homeostasis ya lysosome na majibu ya msongo wa oksidishaji hubadilika katika prefrontal cortex ya AUD.

Je, Data Hii ya Binadamu Inathibitisha Mfumo wa HSP90?

Hapana. Uchambuzi wa GSE182173 unaonyesha tu mabadiliko ya njia za transcriptome katika tishu za ubongo za watu wenye AUD.

Katika seti hii ya data, matibabu ya asidi ya foliki hayakufanyika na mwingiliano wa HSP90–asidi ya foliki haukujaribiwa kimajaribio.

Kwa hiyo, data ya transcriptome ya binadamu haithibitishi moja kwa moja mfumo unaolenga HSP90; inatoa tu muktadha wa kliniki kwa mabadiliko ya msongo, lysosome na homeostasis ya seli yaliyoonekana katika muundo wa majaribio.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Muhtasari wa muundo wa majaribio

Mfumo unaopendekezwa

Matokeo yanayoungwa mkono moja kwa moja na utafiti

• Asidi ya foliki iliboresha matokeo ya tabia na histopatholojia ya gamba katika panya waliowekwa kwenye pombe ya muda mrefu.
• Asidi ya foliki ilipunguza msongo wa oksidishaji na uharibifu wa mitochondria na ER.
• Pombe iliongeza protini HSP90 lakini haikusababisha ongezeko kubwa la HSP90 mRNA.
• Asidi ya foliki ilipunguza ongezeko la HSP90 na GRP78.
• Asidi ya foliki ilikandamiza ishara ya PERK/ATF4/CHOP.
• Uonyeshaji kupita kiasi wa HSP90 ulidhoofisha athari ya asidi ya foliki ya kukandamiza msongo wa ER.
• Asidi ya foliki ilipunguza asetilesheni ya HSP90.
• TSA ilidhoofisha athari ya asidi ya foliki kwenye asetilesheni ya HSP90 na baadhi ya matokeo ya proteostasis/apoptosis.
• Asidi ya foliki ilipunguza hitilafu za mitochondria na uharibifu wa DNA uliosababishwa na ethanoli katika seli za PC12.
• Asidi ya foliki ilirekebisha kwa kiasi baadhi ya mabadiliko yanayosababishwa na pombe katika umetaboli wa tryptophan–kynurenine.

Mambo ambayo utafiti haukuthibitisha moja kwa moja

• Haijaonyeshwa kuwa asidi ya foliki hutibu alcohol use disorder kwa binadamu.
• Ufungamanaji wa moja kwa moja wa kimwili kati ya asidi ya foliki na HSP90 haujathibitishwa kwa uhakika.
• Haijabainishwa ni eneo gani la asetilesheni la HSP90 ni muhimu.
• Enzimu ya deacetylase inayohusika haijatambuliwa.
• Flux ya autophagy inayosaidiwa na chaperone haikupimwa moja kwa moja.
• Uhusiano wa kisababishi wa mnyororo PERK/ATF4–IDO1–kynurenine haujaonyeshwa kwa uingiliaji wa moja kwa moja wa kijeni.
• Data ya binadamu ya GSE182173 haijaribu moja kwa moja matibabu ya asidi ya foliki au mfumo wa HSP90.

Yatafsiriwaje kwa mtazamo wa kliniki?

Matokeo ya utafiti yanaashiria kuwa asidi ya foliki inaweza kuwa na mifumo ya kinga yenye maana ya kibaiolojia katika msongo wa seli za neva unaosababishwa na pombe.

Hata hivyo, dozi ya asidi ya foliki iliyotumika ni mahususi kwa muundo wa panya na haiwezi kuhamishwa moja kwa moja kwa binadamu. Kabla ya ufanisi wa kliniki, usalama, dozi na muda wa matibabu kuamuliwa katika tafiti za binadamu zinazodhibitiwa, matokeo haya hayapaswi kutafsiriwa kama mapendekezo ya matibabu.

Maelezo ya Chanzo na Mbinu

Utafiti asilia: Folic acid attenuates alcohol-induced neurotoxicity by modulating HSP90-associated proteostasis and endoplasmic reticulum stress.

Waandishi: Nan Zhang, Kening Zhang, Huaqi Zhang, Bingxue Song, Xi Liang, Zhitong Zhou, Meilan Xue na Hui Liang.

Taasisi: Qingdao Medical College, Qingdao University; Department of Cardiovascular Medicine, Qingdao University Affiliated Hospital; Science Center for Future Foods, Jiangnan University.

Hali ya uchapishaji: SSRN preprint. Haijapitia peer review.

SSRN: 7346567.

Muundo wa wanyama: Panya dume wa C57BL/6J; lishe ya Lieber-DeCarli yenye %4 v/v ethanoli; wiki 12 za mfiduo wa muda mrefu.

Matumizi ya asidi ya foliki: 5 mg/kg, oral gavage, mara moja kwa siku, siku sita kwa wiki.

Muundo wa seli: Seli za PC12, 500 mM ethanoli; asidi ya foliki 20 na 40 µM.

Mbinu kuu: vipimo vya tabia, H&E, Nissl, TEM, uchambuzi wa ROS, Western blot, qRT-PCR, immunofluorescence, comet assay, JC-1, immunoprecipitation, network pharmacology, molecular docking, CETSA, DARTS, metabolomics isiyolengwa na uchambuzi upya wa transcriptome ya binadamu.

Takwimu: One-way ANOVA + Tukey au Kruskal-Wallis + Dunn; Spearman correlation; marekebisho ya Benjamini-Krieger-Yekutieli katika ulinganisho mwingi; q < 0,05 ilichukuliwa kuwa muhimu.

Ufadhili: National Natural Science Foundation of China No. 82273626; Shandong Province Natural Science Foundation No. ZR2024MH073; Qingdao Key Technology Research and Industrialization Demonstration Projects No. 25-1-1-gjgg-71-nsh.

Upatikanaji wa data: Ilielezwa kuwa data itatolewa kwa ombi.

Mgongano wa maslahi: Waandishi wametangaza kuwa hakuna mgongano wa maslahi.

Vikwazo vikuu: Utafiti ni preprint. Ufungamanaji wa kimwili wa asidi ya foliki-HSP90 haujathibitishwa kwa mbinu mahususi za kifizikia-baiolojia. Maeneo ya asetilesheni ya HSP90 na deacetylases zinazohusika hayajatambuliwa. Flux ya CMA haikupimwa moja kwa moja. Uchambuzi wa transcriptome ya binadamu ni wa sekondari na wa kiwango cha njia; haujaribu matibabu ya asidi ya foliki.