Hibiscus syriacus L. çiçek ekstraktı, bu çalışmada farklı bitki çeşitlerinin fenolik bileşik profili ile laboratuvar koşullarındaki antioksidan davranışını karşılaştırmak için kullanılan bitkisel bir ekstrakt sistemidir. Araştırmacılar Samcheonri (HSSC), Parangsae (HSPR), Pyeonghwa (HSPH), Gojumong (HSGM), Honghwarang (HSHH), Goun (HSGU), Seondeok (HSSD), Hwarang (HSHR), Baedal (HSBD) ve Saimdang (HSSI) olmak üzere 10 çeşidin çiçeklerini sıcak hava ile kurutmuş, %70 etanol kullanarak üç kez geri soğutuculu/Soxhlet tipi ekstraksiyon uygulamış ve elde edilen ekstraktları aynı analitik çerçevede karşılaştırmıştır. Sekiz hedef fenolik bileşik yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile nicel olarak ölçülmüş; ayrıca yedi farklı antioksidan test uygulanmıştır.

Çalışmanın en dikkat çekici sonucu, en yüksek toplam sekiz fenolik bileşik miktarı ile en yüksek antioksidan aktivitenin aynı çeşitte görülmemesidir. HSHH ekstraktında sekiz hedef fenolik bileşiğin toplamı 201.46±1.49 mg/g ile en yüksek düzeydeyken, HSPR yedi antioksidan ölçümün tamamında en güçlü sonucu vermiştir. HSPR; 98.75±0.38 mg AAE/g indirgeme gücü, 592.35±2.41 µg/mL ile en düşük hidrojen peroksit IC₅₀ değeri, %79.53±0.49 superoxide anyon radikali süpürme, 730.58±10.95 µmol TE/g TRAP, %80.56±0.18 metal iyonu şelatlama, 1,629.82±0.55 µmol TE/g ORAC ve 1,758.35±10.03 µmol TE/g CUPRAC değeriyle incelenen çeşitler içinde en yüksek antioksidan performansı göstermiştir. HSPH ise tüm antioksidan testlerde en düşük performansı göstermiştir.

HPLC sonuçları çeşitlerin kimyasal profillerinin birbirinden belirgin biçimde ayrıldığını göstermektedir. HSSI gallic acid açısından, HSPR chlorogenic acid, rutin ve ölçülebilen quercetin açısından, HSGU p-coumaric acid açısından, HSHH ise ferulic acid ve isoquercitrin açısından en yüksek ölçülen değerlere sahiptir. Bununla birlikte bazı bileşikler bazı çeşitlerde tespit edilmemiştir; dolayısıyla “en düşük” nicel değer ile “tespit edilmedi” ifadesi aynı şey değildir. Özellikle chlorogenic acid HSHH, HSSD ve HSHR'de; p-coumaric acid HSBD'de; ferulic acid HSPH ve HSGU'da tespit edilmemiştir.

Bu çalışma in vitro kimyasal ve analitik testlerden oluşmaktadır. Sonuçlar, belirli ekstraksiyon koşullarında hazırlanmış çiçek ekstraktlarının laboratuvar ortamındaki antioksidan kapasitesini karşılaştırır; insanların bu çiçekleri tüketmesi halinde hastalık önleme, tedavi, klinik yarar veya güvenlik sonucu vermez. HSPR'nin “fonksiyonel materyal adayı” olarak öne çıkması, düzenleyici açıdan onaylanmış bir sağlık beyanı veya insanlarda kanıtlanmış fayda anlamına gelmez.

Araştırma problemi: aynı türün farklı çeşitleri gerçekten aynı kimyasal ve antioksidan profile mi sahiptir?

Hibiscus syriacus aynı botanik tür içinde çok sayıda kültivar veya çeşit barındırır. “Kültivar”, insanlar tarafından seçilmiş ve belirli özellikleri korunarak çoğaltılan bitki çeşididir. Aynı tür içinde yer alsalar bile genetik yapı, çiçek rengi, metabolit sentezi ve çevreyle etkileşim gibi etkenler nedeniyle farklı kültivarların aynı fenolik bileşiklerden aynı miktarda üretmesi beklenmek zorunda değildir. Çalışmanın temel sorusu bu nedenle yalnız “Hibiscus syriacus çiçeğinde antioksidan aktivite ölçülebilir mi?” değildir; daha kesin olarak “10 farklı Hibiscus syriacus çeşidinin hedef fenolik bileşik kompozisyonu ve laboratuvar antioksidan testleri aynı koşullarda karşılaştırıldığında hangi çeşitler ayrışır?” sorusudur.

Bu ayrım önemlidir, çünkü bir bitki türünün tek bir örneğinden alınan sonuç bütün çeşitlere otomatik olarak genellenemez. Araştırmacılar bu boşluğu azaltmak için 10 çeşidi aynı analitik yöntem dizisi içinde karşılaştırmış, yalnız toplam bir “antioksidan” puan vermek yerine sekiz fenolik bileşiği ayrı ayrı nicel ölçmüş ve antioksidan davranışı yedi farklı kimyasal testle incelemiştir.

İncelenen 10 çeşit ve çalışma kodları

Çiçekler Güney Kore'nin Chungcheongnam-do eyaletindeki Seosan bölgesinden toplanmış ve 27 Ekim 2025'te Woori Mugunghwa Research Institute tarafından araştırmacılara sağlanmıştır. Bu nedenle analitik hazırlama ve ölçüm koşulları standartlaştırılmış olsa da bitki materyalinin tek bir hasat gününde toplanmadığı özellikle akılda tutulmalıdır.

Fenolik bileşik nedir ve bu çalışmada neden ölçülmüştür?

Fenolik bileşikler, yapılarında bir veya daha fazla fenolik hidroksil grubu taşıyan geniş bir bitkisel ikincil metabolit ailesidir. Bu moleküllerin bazıları elektron veya hidrojen aktarımı yapabilir, bazıları serbest radikallerle etkileşebilir ve bazıları geçiş metal iyonlarını bağlayabilir. Bu kimyasal özellikler, laboratuvarda antioksidan davranışı ölçen birçok testin temelini oluşturur. Ancak bir bileşiğin laboratuvar tüpünde elektron vermesi veya radikal süpürmesi, aynı etkinin insan vücudunda aynı büyüklükte gerçekleşeceğini tek başına göstermez; emilim, metabolizma, biyoyararlanım ve doku dağılımı gibi biyolojik aşamalar bu çalışmanın kapsamında değildir.

Araştırmada sekiz hedef bileşik birlikte ölçülmüştür: gallic acid (GA), chlorogenic acid (CGA), caffeic acid (CA), p-coumaric acid (p-CMA), ferulic acid (FA), isoquercitrin (IQC), rutin (RT) ve quercetin (QC). Kaynak kromatogramda bu sekiz bileşik sırasıyla 1'den 8'e numaralandırılmıştır; ancak ham kromatografik zaman-serisi verileri verilmediği için Verianla burada yeni bir “ölçülmüş kromatogram” uydurmamaktadır.

Çiçekten analiz numunesine: ekstraksiyon zinciri

Ekstraksiyon neden sonuçların yorumunu sınırlar?

Çalışmada ölçülen şey doğrudan taze çiçeğin bütün biyolojik etkisi değildir. Önce çiçekler 40°C'de sıcak hava ile kurutulmuş, öğütülmüş ve %70 etanol ile ekstrakte edilmiştir. Bu süreç hangi moleküllerin çözücüye geçtiğini belirler. Bu nedenle elde edilen mg/g değerleri ve antioksidan test sonuçları bu hazırlama ve ekstraksiyon protokolüne ait ekstraktların özellikleridir. Farklı kurutma sıcaklığı, farklı çözücü, farklı ekstraksiyon süresi veya taze materyal kullanımı aynı nicel sonucu vermek zorunda değildir.

HPLC Analizinin Güvenilir Olduğu Nasıl Gösterildi?

Çalışma, HPLC ile elde edilen fenolik bileşik miktarlarını yalnız cihaz çıktısı olarak kabul etmemiş; yöntemi doğruluk, doğrusal yanıt, algılama/ölçme duyarlılığı ve tekrar edilebilirlik açısından valide etmiştir. Standart ekleme geri kazanımları yaklaşık %98-105 aralığında kalmış, sekiz bileşiğin kalibrasyonlarında r² değeri 0.9999-1.0000 aralığında bulunmuş ve gün-içi/günler-arası bağıl standart sapmalar tüm raporlanan ölçümlerde %1.6'nın altında tutulmuştur. Bu göstergeler yöntemin incelenen matriste tutarlı nicel ölçüm yapabildiğini destekler; ancak bunlar biyolojik etkinliğin doğrulandığı anlamına gelmez.

HPLC tam olarak ne yapıyor?

Yüksek performanslı sıvı kromatografisi, bir sıvı mobil faz içinde taşınan bileşikleri kolon adı verilen sabit faz üzerinden geçirerek ayırır. Bu çalışmada C18 ters-faz kolon kullanılmıştır. Farklı moleküller kolonla ve hareketli fazla farklı derecede etkileştiği için kolondan farklı zamanlarda çıkar; dedektör 254 nm'de oluşan sinyali kaydeder. Araştırmacılar hedef bileşiklerin standart çözeltileriyle kalibrasyon oluşturup örnek pik alanlarını bu kalibrasyonlarla ilişkilendirerek konsantrasyon hesaplamıştır.

HPLC cihaz ve çalışma koşulları

Gradient programı ne anlama geliyor?

“Gradient”, mobil faz bileşiminin analiz süresince sabit tutulmaması, zamanla değiştirilmesidir. Burada su ağırlıklı başlangıçtan giderek daha yüksek asetonitril oranına geçilmesi, farklı polarite ve kolon etkileşimine sahip sekiz hedef bileşiğin ayrılmasına yardımcı olur; 70. dakikada başlangıç bileşimine dönülerek kolon tekrar başlangıç koşullarına getirilir.

Kalibrasyon eğrisi ve Y=ax+b denklemi

Her hedef standart önce 2,000 µg/mL stok çözelti olarak hazırlanmış; standartlar karıştırıldıktan sonra 3.125, 6.25, 12.5, 25 ve 50 µg/mL düzeylerinde kalibrasyon çözeltileri oluşturulmuştur. Kaynakta kalibrasyon ilişkisi \(Y=ax+b\) doğrusal modeliyle ifade edilir.

1. Formül neyi hesaplar? \(Y=ax+b\) modeli, bilinen standart konsantrasyonlarıyla ölçülen HPLC pik alanı arasındaki doğrusal kalibrasyon ilişkisini temsil eder. Amaç, cihaz sinyalini konsantrasyonla ilişkilendiren analit-özgü bir doğru oluşturmaktır.

2. Değişkenler nelerdir? \(Y\) pik alanıdır; \(x\) konsantrasyondur; \(a\) doğrunun eğimidir; \(b\) y-eksenini kesme değeridir. Eğimin büyük olması, aynı konsantrasyon değişiminin daha büyük pik alanı değişimi üretmesi anlamına gelir; ancak farklı analitlerin eğimleri doğrudan “daha fazla bileşik” anlamında karşılaştırılamaz, çünkü her analitin dedektör yanıtı ayrıdır.

3. Birimler nelerdir? Çalışmanın kalibrasyonunda \(x\) için konsantrasyon birimi µg/mL'dir. \(Y\), kromatografik pik alanıdır; kaynak tablo pik alanı için bağımsız fiziksel birim belirtmez. Bu nedenle \(a\)'nın birimi pik alanı/(µg/mL), \(b\)'nin birimi ise pik alanıyla aynıdır.

4. Matematiksel rol nedir? Denklem doğrusal regresyon modelidir. Bilinmeyen numunede hedef bileşiğin pik alanı ölçüldüğünde ilişki cebirsel olarak \(x=(Y-b)/a\) biçiminde çözülerek konsantrasyon tahmin edilebilir. Bu ikinci ifade yeni bir deney sonucu değil, kaynakta verilen doğrusal denklemin cebirsel yeniden düzenlenmesidir.

5. Analitik anlam nedir? HPLC önce bileşikleri kolonda ayırır; 254 nm dedektör her hedef analit için bir sinyal/pik üretir. Kalibrasyon doğrusu, bu sinyal büyüklüğünün bilinen standart konsantrasyonlarıyla nasıl değiştiğini tanımlar ve numunedeki hedef bileşiğin nicel hesabına temel olur.

6. Hangi koşullar altında geçerlidir? Bu kalibrasyon ilişkileri çalışmada kullanılan her analit için 3.125, 6.25, 12.5, 25 ve 50 µg/mL standart düzeyleri, belirtilen C18 kolon, mobil faz gradyanı, 1.0 mL/dak akış, 30°C kolon sıcaklığı, 254 nm algılama ve 10 µL enjeksiyon koşulları altında oluşturulmuştur. Kalibrasyon aralığının dışına taşan bir değerin aynı doğrusal ilişkiyi koruduğu kaynak tarafından ayrıca gösterilmemiştir.

7. Sonuç nasıl yorumlanmalıdır? Sekiz analitin r² değeri 0.9999 veya 1.0000'dır; bu, kullanılan kalibrasyon aralığında pik alanı-konsantrasyon ilişkisinin çok güçlü biçimde doğrusal olduğunu destekler. Yüksek r² tek başına bütün analitik hataların yok olduğu anlamına gelmediğinden araştırmacılar geri kazanım, LOD/LOQ ve gün-içi/günler-arası kesinliği de ayrıca değerlendirmiştir.

Geri kazanım, LOD, LOQ ve %RSD neyi anlatır?

Geri kazanım (recovery), bilinen miktarda standardın gerçek numune matrisine eklenmesinden sonra analitik yöntemin bu miktarın ne kadarını tekrar ölçebildiğini gösterir. Çalışmada 6.0, 8.0, 10.0 ve 12.0 µg/mL spike seviyeleri kullanılmıştır. Sonuçların yaklaşık %100 çevresinde kalması, hazırlama ve ölçüm zincirinde büyük sistematik kayıp veya fazladan sinyal bulunmadığını destekler.

LOD (limit of detection), analitin varlığının güvenilir biçimde fark edilebildiği düşük konsantrasyon bölgesini; LOQ (limit of quantitation) ise nicel değerin güvenilir biçimde raporlanabildiği daha yüksek eşiği temsil eder. Kaynak, LOD ve LOQ değerlerini verir ancak hesaplama formülünü açık biçimde yazmaz; bu nedenle burada kaynak dışı bir LOD/LOQ denklemi eklenmemiştir.

%RSD (relative standard deviation; bağıl standart sapma), tekrarlı ölçümlerin ortalamaya göre ne kadar yayıldığını yüzdesel olarak ifade eden kesinlik göstergesidir. Küçük %RSD, tekrarlı ölçümlerin birbirine yakın olduğunu gösterir. Bu çalışmada gün-içi değerler yaklaşık %0.395-1.302, günler-arası değerler yaklaşık %0.367-1.508 aralığındadır.

Fenolik bileşik sonuçları: hangi çeşit hangi bileşikte öne çıktı?

Fenolik profil tek bir “toplam fenolik” sayısından oluşmamaktadır. HSSI gallic acid bakımından 2.05±0.01 mg/g ile en yüksek değeri verirken, HSPR chlorogenic acid bakımından 66.18±0.47 mg/g ile en yüksek değeri göstermiştir. HSGU, 48.12±0.61 mg/g p-coumaric acid ile belirgin biçimde ayrılmıştır. HSHH ise 11.87±0.11 mg/g ferulic acid ve 179.47±1.29 mg/g isoquercitrin ile bu iki bileşikte en yüksek ölçülen değerlere ulaşmıştır. HSPR ayrıca 13.54±0.15 mg/g rutin ve 7.04±0.06 mg/g quercetin ile bu iki analitte en yüksek ölçülen değerlere sahiptir.

Kısaltmalar: GA, gallic acid; CGA, chlorogenic acid; CA, caffeic acid; p-CMA, p-coumaric acid; FA, ferulic acid; IQC, isoquercitrin; RT, rutin; QC, quercetin.

En Yüksek Toplam Fenolik İçerik Neden En Yüksek Antioksidan Aktiviteyle Aynı Çeşitte Değildi?

Çalışmada HSHH sekiz hedef bileşiğin toplamında 201.46±1.49 mg/g ile en yüksek değeri taşırken, bütün antioksidan testlerde HSPR birinci olmuştur; bu nedenle sonuçlar yalnız toplam miktarın değil, ekstrakt içindeki bileşik kompozisyonu ve bileşiklerin birbirine göre oranlarının da önemli olabileceğini düşündürmektedir. HSPR özellikle chlorogenic acid, rutin ve ölçülebilen quercetin açısından güçlü bir profile sahiptir. Ancak çalışma tek tek bileşiklerin katkısını izole eden bir ablasyon deneyi, saf bileşik karışım deneyi veya nicel korelasyon/nedensellik modeli raporlamadığı için “HSPR'nin üstünlüğüne şu tek bileşik neden oldu” sonucu çıkarılamaz.

Yedi antioksidan testi neden bir arada kullanıldı?

“Antioksidan kapasite” tek bir kimyasal olay değildir. Elektron verme, belirli radikalleri söndürme, hidrojen peroksitle ilişkili reaksiyonu azaltma, peroxyl radikallerine karşı zincir reaksiyonunu yavaşlatma veya Fe²⁺ gibi metal iyonlarını bağlama gibi farklı kimyasal davranışlar farklı testlerle görülür. Bu nedenle araştırmacılar bir tek DPPH veya ABTS testiyle yetinmek yerine yedi ayrı ölçüm kullanmıştır. Bir çeşidin çok farklı testlerde aynı yönde öne çıkması, laboratuvar antioksidan profilinin tek bir assay'e özgü tesadüfi bir sıralama olmadığını destekler; yine de bu sonuçlar biyolojik organizmadaki klinik etki değildir.

1. İndirgeme gücü: elektron verme kapasitesi

İndirgeme gücü testinde ekstrakt içindeki indirgen maddeler ferric iyonu ferrous forma dönüştürür. Araştırmada 40 µL ekstrakt; potassium ferricyanide ve pH 6.6 fosfat tamponuyla 50°C'de 30 dakika reaksiyona sokulmuş, TCA eklenip 10,000×g'de 5 dakika santrifüj edilmiş ve üst faz FeCl₃ ile reaksiyona girdikten sonra 700 nm'de ölçülmüştür. Ascorbic acid ile 25-200 µg/mL kalibrasyon kullanılmıştır. Sonuçlar mg ascorbic acid equivalent/g (mg AAE/g) olarak ifade edilmiştir. Bu metrikte yüksek değer daha yüksek indirgeme gücü anlamına gelir.

IC50 Değeri Düşük Olduğunda Ne Anlama Gelir?

IC₅₀, incelenen etkinin %50 düzeyine ulaşması için gereken örnek konsantrasyonunu ifade eder; bu nedenle aynı deney sistemi içinde daha düşük IC₅₀, aynı %50 etki için daha az ekstrakt gerektiğini ve daha yüksek potensi gösterir. Bu çalışmada hidrojen peroksit süpürme testinde HSPR 592.35±2.41 µg/mL ile en düşük, HSPH 690.92±1.89 µg/mL ile en yüksek IC₅₀ değerini vermiştir. IC₅₀ burada laboratuvar reaksiyonuna aittir; insan dozu, tedavi dozu veya güvenli tüketim miktarı değildir.

2. Hidrojen peroksit süpürme

Hidrojen peroksit testi, Miller yönteminin değiştirilmiş ABTS-peroxidase sistemiyle yapılmıştır. 80 µL ekstrakta 20 µL 10 mM H₂O₂ ve 100 µL 0.1 M fosfat tamponu (pH 5.0) eklenmiş; ekstraktın reaksiyondaki son konsantrasyonu 1.0 mg/mL olacak şekilde ayarlanmıştır. İlk 37°C/5 dakika inkübasyonundan sonra 30 µL 1.25 mM ABTS ve 30 µL 1 U/mL peroxidase eklenmiş, 37°C'de 10 dakika daha reaksiyon yapılmış ve 405 nm'de ölçülmüştür. Farklı ekstrakt konsantrasyonlarından IC₅₀ türetilmiştir.

3. Superoxide anyon radikali süpürme

Bu ölçüm, hypoxanthine-xanthine oxidase sistemi ve nitro blue tetrazolium (NBT) indirgenmesine dayalı değiştirilmiş Nishikimi yöntemidir. 30 µL ekstrakt; 30 mM EDTA, 30 mM hypoxanthine ve 1.42 mM NBT ile reaksiyona sokulmuş, ardından xanthine oxidase eklenmiş ve toplam hacim 50 mM fosfat tamponuyla 300 µL'ye tamamlanmıştır. 20 dakikalık oda sıcaklığı reaksiyonundan sonra 560 nm'de ölçüm yapılmıştır. Pozitif kontrol ascorbic acid'dir. Yüksek yüzde daha güçlü süpürme aktivitesi olarak yorumlanır.

4. TRAP: toplam radikal yakalama potansiyeli

Total Radical Trapping Antioxidant Potential (TRAP), tek bir radikal türünden ziyade sistemin toplam radikal yakalama davranışını temsil etmeyi amaçlar. 150 µM ABTS ve 2.5 µM metmyoglobin, 75 µM H₂O₂ ile aktive edilerek reaksiyon karışımı hazırlanmıştır. 100 µL ekstrakt 900 µL reaksiyon çözeltisiyle 30°C'de 8 dakika inkübe edilmiş ve 740 nm'de ölçülmüştür. Trolox 18.75-300 µM kalibrasyon aralığında kullanılmıştır. Sonuç µmol Trolox equivalent/g (µmol TE/g) olarak ifade edilir; yüksek değer daha yüksek toplam radikal yakalama kapasitesini gösterir.

5. Fe2+ metal iyonu şelatlama

Fe²⁺ gibi geçiş metalleri belirli oksidatif reaksiyonlarda reaktif radikal oluşumuna katkı verebilir. Şelatlama testinde amaç, ekstraktın Fe²⁺ iyonunu ferrozine reaksiyonundan önce bağlayabilme derecesini ölçmektir. 200 µL ekstrakta 20 µL 2 mM FeCl₂ ve 20 µL 5 mM ferrozine eklenmiş, 10 dakika oda sıcaklığında tutulmuş ve 562 nm'de ölçülmüştür. Pozitif kontrol EDTA'dır. Yüksek yüzde daha yüksek metal bağlama aktivitesi anlamına gelir.

6. ORAC: peroxyl radikallerine karşı zaman-bağımlı koruma

Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC), fluorescein sinyalinin AAPH tarafından oluşturulan peroxyl radikalleri nedeniyle zamanla azalmasını ve örneğin bu düşüşü ne kadar geciktirdiğini izler. Çalışmada 25 µL ekstrakta 150 µL 70 nM fluorescein eklenmiş, 37°C'de 10 dakika bekletildikten sonra 25 µL 19 mM AAPH eklenmiştir. RF-6000 floresans spektrofotometrede 485 nm uyarma ve 530 nm emisyon dalga boylarında, 37°C'de 90 dakika boyunca üç dakikada bir ölçüm alınmıştır. Trolox 6.25-100 µM standart aralığı kullanılmıştır. Yüksek µmol TE/g değeri daha yüksek ORAC demektir.

7. CUPRAC: Cu2+ iyonunu Cu+ formuna indirgeme kapasitesi

Cupric Reducing Antioxidant Capacity (CUPRAC), elektron veren bileşiklerin Cu²⁺ iyonunu Cu⁺ formuna indirgeme kapasitesini neocuproine kompleksi üzerinden ölçer. 10 mM CuCl₂·2H₂O, pH 7.0 ammonium acetate tamponu ve 7.5 mM neocuproine çözeltisi 1:1:1 oranında karıştırılmıştır. 200 µL ekstrakta 600 µL reaksiyon çözeltisi eklenmiş, bir saat sonra 450 nm'de ölçülmüştür. Trolox 31.13-500 µM kalibrasyon için, α-tocopherol ise pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Sonuçlar µmol TE/g olarak verilmiştir; yüksek değer daha güçlü kuprik iyon indirgeme kapasitesini gösterir.

Antioksidan testlerin tüm nicel sonuçları

Tablodaki genel sıralama dikkat çekicidir: HSPR bütün antioksidan testlerde en iyi, HSPH ise bütün testlerde en düşük sonucu vermektedir. HSBD çoğu testte HSPR'yi izleyen ikinci güçlü çeşit olarak görünür. CUPRAC'ta HSSI, HSBD ve HSHH birbirine yakın bir grup oluşturmuş ve bu üç çeşit arasında kaynakta anlamlı fark bulunmadığı belirtilmiştir; HSPR ise yine daha yüksek bulunmuştur.

Pozitif kontroller neden çeşitlerle “yarışan” bir on birinci örnek değildir?

Ascorbic acid, Trolox, EDTA ve α-tocopherol gibi pozitif kontroller testin beklenen kimyasal tepkiyi verdiğini göstermek için kullanılmış referans maddelerdir. Bunların konsantrasyonları ve kimyasal saflıkları bitki ekstraktlarından farklıdır. Bu yüzden “pozitif kontrol şu değerde, demek ki şu çeşit insanlarda bunun yüzde şu kadarı kadar etkilidir” biçiminde doğrudan biyolojik karşılaştırma yapılamaz.

İstatistiksel anlamlılık nasıl değerlendirildi?

Bütün deneyler üç kez tekrarlanmış ve sonuçlar ortalama±standart sapma olarak verilmiştir. Araştırmacılar 10 çeşit arasındaki farkları önce tek yönlü varyans analizi (one-way ANOVA) ile test etmiş, ardından grup çiftlerini Tukey HSD testiyle karşılaştırmıştır. Anlamlılık eşiği P<0.05 olarak belirlenmiştir.

ANOVA neyi sorar? ANOVA, aynı metriği taşıyan 10 çeşit ortalamasının hepsinin tek bir ortak ortalama etrafında açıklanıp açıklanamayacağını sınar. Anlamlı sonuç, en az bir grubun diğerlerinden farklı olduğuna işaret eder; fakat hangi grupların farklı olduğunu tek başına söylemez.

Tukey HSD neyi ekler? Tukey testi, çoklu karşılaştırma yaparken hangi çeşit çiftleri arasında istatistiksel fark bulunduğunu belirlemek için kullanılır. Kaynak grafiklerinde farklı harflerle işaretlenen sütunlar, aynı test içinde Tukey HSD'ye göre anlamlı biçimde farklı grupları gösterir.

P<0.05 ne demektir? Bu eşik, sıfır hipotezi altında gözlenen veya daha uç bir farkın olasılığına dayalı karar kuralıdır. P<0.05, farkın büyüklüğünü veya biyolojik önemini tek başına ölçmez. Kaynak etki büyüklüğü veya güven aralığı raporlamamış; temel sunum ortalama±standart sapma ve Tukey grupları üzerinden yapılmıştır.

HSPR'nin Laboratuvarda En Güçlü Çıkması İnsan Sağlığında Üstün Olduğunu Kanıtlar mı?

Hayır. Çalışma, hücre kültürü, hayvan modeli, insan müdahale deneyi veya klinik sonlanım araştırması değildir; %70 etanol ile hazırlanmış çiçek ekstraktlarının kimyasal bileşimini ve in vitro antioksidan davranışını karşılaştırır. HSPR'nin bütün testlerde en yüksek aktiviteyi göstermesi, bu ekstraktın incelenen laboratuvar koşullarında güçlü bir aday olduğunu destekler; ancak tüketildiğinde hastalığı önlediğini, tedavi ettiğini, aynı bileşiklerin biyoyararlanımının yüksek olduğunu veya güvenli etkin dozun belirlendiğini göstermez.

Çalışmanın desteklediği yorumlar

• Hibiscus syriacus çiçeklerinin fenolik bileşik profili çeşitlere göre belirgin biçimde farklılaşmaktadır.
• HSPR, kullanılan yedi laboratuvar antioksidan testinin tamamında incelenen 10 çeşit içinde en güçlü sonucu vermiştir.
• HSPH, kullanılan yedi antioksidan testin tamamında en düşük sonucu vermiştir.
• HSHH, sekiz hedef fenolik bileşiğin toplamında en yüksek; HSPH en düşük değere sahiptir.
• Yüksek toplam hedef fenolik miktarı tek başına en yüksek antioksidan aktiviteyi garanti etmemektedir; bileşik profili ve oranları önem taşıyabilir.
• HPLC yöntemi geri kazanım, doğrusallık, LOD/LOQ ve gün-içi/günler-arası kesinlik ölçümleriyle analitik olarak doğrulanmıştır.

Çalışmanın desteklemediği yorumlar

Çalışma “HSPR insanlarda antioksidan tedavi sağlar”, “Hibiscus syriacus çiçeği belirli bir hastalığı önler”, “en yüksek toplam fenolik içerik mutlaka en yüksek biyolojik yararı verir”, “quercetin tek başına HSPR'nin üstünlüğünün nedenidir” veya “bu sonuçlar bütün yetiştirme bölgeleri, hasat dönemleri ve ekstraksiyon yöntemleri için değişmeden geçerlidir” sonuçlarını desteklemez. Ayrıca araştırma düzenleyici anlamda bir fonksiyonel gıda onayı, toksisite/güvenlik değerlendirmesi, duyusal kabul testi veya raf ömrü çalışması değildir.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Çalışma tasarımı

Bu araştırma, 10 Hibiscus syriacus kültivarının çiçek ekstraktlarını ortak hazırlama ve ölçüm protokolleri altında karşılaştıran deneysel bir laboratuvar çalışmasıdır. Tasarım iki ana veri katmanına sahiptir: birincisi sekiz hedef fenolik bileşiğin HPLC ile nicel ölçümü; ikincisi farklı kimyasal mekanizmalara dayalı yedi in vitro antioksidan testidir.

Materyal hazırlama

Çiçekler 40°C sıcak hava kurutucusunda (OF-22GW, Jeio Tech) kurutulmuş ve toz haline getirilmiştir. Toz materyal otomatik Soxhlet ekstraktörü (E-816, BÜCHI Labortechnik AG) kullanılarak %70 etanol ile her biri 2.5 saat süren üç ardışık geri akış ekstraksiyonuna alınmıştır. Etanol ve su rotary evaporatörde (N-1210B, EYELA) uzaklaştırılmış, ardından ekstrakt FDU-1110 (EYELA) dondurarak kurutucuda tozlaştırılmıştır.

HPLC numune ve standart hazırlama

Gallic acid, chlorogenic acid, caffeic acid, p-coumaric acid, ferulic acid, isoquercitrin, rutin ve quercetin standartları HPLC dereceli metanolde 2,000 µg/mL stok çözelti halinde hazırlanmıştır. Karışık standartlar 3.125, 6.25, 12.5, 25 ve 50 µg/mL konsantrasyonlarına seyreltilerek kalibrasyon eğrileri oluşturulmuştur. Ekstrakt numuneleri 10 mg/mL olarak HPLC dereceli metanolde hazırlanmış ve 0.2 µm PTFE-H şırınga filtresinden geçirilmiştir.

HPLC analitik doğrulama

Doğruluk için sekiz standardın 6.0, 8.0, 10.0 ve 12.0 µg/mL düzeylerinde spike-in geri kazanımı ölçülmüştür. Duyarlılık LOD ve LOQ değerleriyle, kesinlik ise gün-içi ve günler-arası %RSD ile değerlendirilmiştir. Sekiz bileşiğin ortalama geri kazanımları %100.64 ile %103.58 arasında, toplam geri kazanım aralıkları yaklaşık %98.45 ile %105.43 arasında kalmıştır. Kalibrasyon r² değerleri 0.9999-1.0000 aralığındadır. En düşük LOD p-coumaric acid için 0.028 µg/mL, en yüksek LOD isoquercitrin için 0.264 µg/mL; en düşük LOQ p-coumaric acid için 0.081 µg/mL, en yüksek LOQ isoquercitrin için 0.793 µg/mL olarak raporlanmıştır.

Fenolik bileşiklerde ana nicel bulgular

Gallic acid bütün çeşitlerde ölçülmüş ve en yüksek HSSI'da 2.05±0.01 mg/g, en düşük HSGU'da 0.19±0.00 mg/g bulunmuştur. Chlorogenic acid ölçülebilen çeşitler içinde HSPR'de 66.18±0.47 mg/g ile en yüksek, HSSI'da 2.81±0.03 mg/g ile en düşük nicel değeri vermiş; HSHH, HSSD ve HSHR'de tespit edilmemiştir. Caffeic acid yalnız HSPH'de 4.03±0.05 mg/g ve HSGU'da 1.43±0.02 mg/g olarak tespit edilmiştir.

p-Coumaric acid HSGU'da 48.12±0.61 mg/g ile en yüksek ölçülen değere ulaşmış, HSBD'de tespit edilmemiştir; tespit edilen örnekler içinde en düşük değer HSSD'de 1.97±0.03 mg/g'dır. Ferulic acid HSHH'de 11.87±0.11 mg/g ile en yüksek düzeyde bulunmuş; HSPH ve HSGU'da tespit edilmemiştir. Isoquercitrin bütün çeşitlerde ölçülmüş ve HSHH'de 179.47±1.29 mg/g ile en yüksek, HSPH'de 5.73±0.07 mg/g ile en düşük değeri vermiştir.

Rutin HSPR'de 13.54±0.15 mg/g ile en yüksek, HSSI'da 3.26±0.03 mg/g ile en düşük değeri vermiştir. Quercetin yalnız HSPR, HSPH, HSSD ve HSBD'de tespit edilmiş; ölçülen değerler içinde HSPR 7.04±0.06 mg/g ile en yüksek, HSPH 0.18±0.00 mg/g ile en düşük düzeydedir. Sekiz bileşiğin toplamında HSHH 201.46±1.49 mg/g ile en yüksek, HSPH 30.13±0.25 mg/g ile en düşük değere sahiptir.

Antioksidan testlerde ana nicel bulgular

HSPR indirgeme gücünde 98.75±0.38 mg AAE/g ile birinci, HSPH 57.87±0.71 mg AAE/g ile sonuncudur. Hidrojen peroksit IC₅₀ değerinde yön tersine çevrilir: düşük değer daha güçlüdür; HSPR 592.35±2.41 µg/mL ile en düşük, HSPH 690.92±1.89 µg/mL ile en yüksek IC₅₀ değerini göstermiştir.

Superoxide süpürme aktivitesinde HSPR %79.53±0.49, HSPH %59.93±0.24; TRAP'ta HSPR 730.58±10.95 µmol TE/g, HSPH 377.11±16.95 µmol TE/g; Fe²⁺ şelatlamada HSPR %80.56±0.18, HSPH %50.62±0.64; ORAC'ta HSPR 1,629.82±0.55 µmol TE/g, HSPH 1,022.12±5.45 µmol TE/g; CUPRAC'ta HSPR 1,758.35±10.03 µmol TE/g, HSPH 373.44±20.12 µmol TE/g olarak ölçülmüştür. Bu yedi testin tamamında çeşitler arasındaki ana sıralamanın aynı uçlarda tekrarlanması, HSPR ve HSPH arasındaki laboratuvar antioksidan profil farkının birden fazla kimyasal test tarafından desteklendiğini göstermektedir.

HSHH ile HSPR arasındaki kritik fark

HSHH toplam sekiz hedef fenolik bileşik miktarında 201.46±1.49 mg/g ile birinci olmasına rağmen antioksidan testlerde birinci değildir. HSPR'nin toplamı 151.96±1.11 mg/g ile daha düşüktür fakat chlorogenic acid, rutin ve ölçülebilen quercetin düzeyleri yüksektir ve bütün antioksidan testlerde en yüksek aktiviteyi gösterir. Çalışmanın tartışması bu deseni, toplam miktarın yanında ana bileşiklerin kompozisyon ve oran farklılıklarının da önemli olabileceği yönünde yorumlar. Fakat çalışma doğrudan bir bileşik-aktivite regresyonu, kısmi korelasyon veya saf bileşik katkı analizi sunmadığı için mekanizma nicel olarak ayrıştırılmamıştır.

Tekrar sayısı ve belirsizlik

Bütün deneyler üç tekrar halinde yürütülmüş ve ortalama±standart sapma verilmiştir. Kaynak “n=3” bilgisini açıkça verir; ancak bu üç tekrarın her çeşit için üç bağımsız biyolojik hasat/ekstraksiyon partisi mi, yoksa aynı hazırlanan materyal üzerinde analitik/teknik tekrarlar mı olduğu ayrıntılı biçimde açıklanmaz. Bu nedenle n=3 değeri “üç bağımsız tarla popülasyonu” gibi geniş yorumlanmamalıdır.

Güçlü yönler

Çalışmanın güçlü tarafları, 10 kültivarın aynı analitik çerçevede değerlendirilmesi, sekiz hedef fenolik bileşiğin tek HPLC yönteminde nicel ölçülmesi, HPLC yönteminin geri kazanım-duyarlılık-kesinlik açısından valide edilmesi ve antioksidan performansın yedi farklı testle çapraz kontrol edilmesidir. Ayrıca yalnız toplam fenolik benzeri tek bir toplu ölçüm yerine bileşik bazlı kompozisyon verilmesi, HSHH ile HSPR arasındaki “toplam miktar ≠ tüm testlerde en yüksek aktivite” farkını görünür kılar.

Temel sınırlılıklar

Birinci sınır, sonuçların in vitro kimyasal testlere ait olmasıdır. İkinci sınır, bütün bulguların 40°C kurutma ve %70 etanol ekstraksiyonu ile elde edilen spesifik ekstraktlara ait olmasıdır. Üçüncü sınır, materyalin Seosan'dan üç farklı günde toplanmış olması ve biyolojik tekrar yapısının kaynakta ayrıntılı tanımlanmamasıdır. Dördüncü sınır, araştırmanın yalnız seçilmiş sekiz fenolik bileşiği hedeflemesidir; ekstraktın bütün metabolomunu veya tüm fenolik/antosiyanin repertuvarını ölçmez. Beşinci sınır, bileşik kompozisyonu ile yedi antioksidan sonuç arasındaki nedensel katkıların ayrı bir modelle nicel olarak ayrıştırılmamış olmasıdır.

Fonksiyonel materyal geliştirme açısından doğru yorum

Kaynak yazarları HSPR'yi antioksidan temelli fonksiyonel materyal araştırmaları için güçlü bir aday olarak değerlendirir. Bu, aday seçimi açısından anlamlı bir laboratuvar ön-eleme sonucudur. Aşağıdaki geliştirme zinciri çalışmanın bulgusu değil, bu tür bir laboratuvar adayının gerçek ürüne dönüşmesinde genel olarak ayrıca incelenmesi gereken aşamaları açıklayan Verianla öğretici katmanıdır: ekstrakt standardizasyonu, bileşik stabilitesi, güvenlik/toksikoloji, sindirim ve biyoyararlanım, hücresel ve gerektiğinde hayvansal doğrulama, insan çalışmaları, üretim ölçeklendirme, raf ömrü ve ilgili düzenleyici gereklilikler. Bu sonraki aşamalar bu makalede yapılmamıştır.

Kaynak ve Yöntem Notu

Özgün başlık: Comparative Analysis of Phenolic Compounds and Antioxidant Activity among Ten Cultivars of Hibiscus syriacus Flowers.

Kaynak Korece başlık: 무궁화 10개 품종 꽃의 페놀성 화합물 조성 및 항산화 활성 비교 분석.

Yazarlar ve sıra: Dohyeong Kim, Yeop Jung, Hamin Jang, Yongju Lee, Yunseo Heo, Gyeongeun Park, Sunyoung Park.

Eş katkı: Dohyeong Kim ve Yeop Jung kaynak PDF'de yıldız işaretiyle eş katkılı yazarlar olarak belirtilmiştir.

Sorumlu yazar: Sunyoung Park. Kaynak PDF'nin yazar satırında Sunyoung Park için üstsimge “2” kullanılmış ve bu numara Department of Physiology, College of Korean Medicine ile eşleşmektedir; buna karşılık aynı PDF'nin sorumlu yazar dipnotunda “Department of Biocosmetics, Semyung University” yazmaktadır. Bu kaynak içi afiliyasyon tutarsızlığı sessizce düzeltilmemiştir. KCI kaydı Sunyoung Park için yalnız “Semyung University” bilgisini verir ve departman düzeyindeki çelişkiyi çözmez.

Kurumlar: Semyung University bünyesinde Department of Oriental Medical Food & Nutrition; Department of Physiology, College of Korean Medicine; Department of Bio-Pharmaceutical Science; Department of Biofood and Nutrition Science; Department of Biocosmetics.

Dergi: Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition (한국식품영양과학회지).

Yayın kurumu: The Korean Society of Food Science and Nutrition.

Cilt / sayı / sayfalar: 55(4), 322-339.

Yıl / sayı tarihi: 2026; cilt 55, sayı 4, Nisan 2026.

DOI: 10.3746/jkfn.2026.55.4.322.

Resmî bağlantı: https://doi.org/10.3746/jkfn.2026.55.4.322

ISSN: Basılı ISSN 1226-3311; çevrimiçi ISSN 2288-5978.

Kaynak türü: Deneysel laboratuvar araştırma makalesi; derleme, preprint, klinik çalışma veya saha müdahale deneyi değildir.

Hakemlik durumu: Makale Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition'da yayımlanmıştır; derginin resmî sitesinde ayrı “Review Policy” ve “Peer Review Policy” bölümleri bulunmaktadır. Kaynak bir preprint olarak sunulmamaktadır.

Gönderim / revizyon / kabul: 15 Aralık 2025'te alındı; 31 Aralık 2025'te revize edildi; 7 Ocak 2026'da kabul edildi.

Lisans: Kaynak PDF makaleyi Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 (CC BY-NC 4.0) kapsamında açık erişim olarak belirtmektedir.

Finansman: Çalışmanın finansman notunda 2025 yılı için Kore Eğitim Bakanlığı ve Chungcheongbuk-do desteği ile Chungbuk RISE Center üzerinden yürütülen RISE programı belirtilmiş; proje numarası 2025-RISE-11-008-02 olarak verilmiştir.

Veri erişilebilirliği: Kaynak PDF'de ayrı bir “Data Availability” bildirimi görülmemektedir. Bu nedenle ham kromatogram verisi, ham tekrarlı ölçümler veya bireysel veri noktalarının kamuya açık olduğu varsayılmamıştır.

Çıkar çatışması: Kaynak PDF'de ayrı bir çıkar çatışması bildirimi görülmemektedir; bu ifade “çıkar çatışması kesinlikle yoktur” anlamında genişletilmemiştir.

CRediT / ayrıntılı yazar katkıları: Kaynak PDF'de ayrı bir CRediT katkı tablosu görülmemektedir.

Temel yöntemsel sınır: Bulgular %70 etanol ile hazırlanmış çiçek ekstraktlarının HPLC profili ve in vitro kimyasal antioksidan testlerine aittir. İnsanlarda sağlık etkisi, klinik etkinlik, doz, güvenlik veya biyoyararlanım araştırılmamıştır.