To‘rt yarim LIM domenli oqsil 2, qisqacha nomi bilan FHL2 — hujayra ichida juda ko‘p sonli oqsillarni bir-biriga bog‘lay oladigan modulli regulyator oqsildir. Hujayra karkasi (sitoskelet), gen ekspressiyasi va hujayraviy signal yo‘llari o‘rtasida aloqa o‘rnatuvchi FHL2 ning 90 dan ortiq o‘zaro ta’sir sheriklari aniqlangan. Shunga qaramay, to‘liq uzunlikdagi FHL2 oqsilini yetarli miqdorda, eruvchan va strukturaviy tahlillarga yaroqli holatda ishlab chiqarish uzoq vaqtdan beri murakkab bo‘lib kelgan. Bu qiyinchilik oqsilning eritmada o‘zini qanday tutishini va β-katenin kabi muhim sheriklariga qanday molekulyar tartibda birikishini tushunishni cheklab qo‘ygan edi.

Tina Logonder, Uroš Prešern va Aljaž Gaber tomonidan olib borilgan tadqiqotda to‘liq uzunlikdagi va yakuniy bosqichda fyuijn yorlig‘iga (fusion tag) ega bo‘lmagan FHL2 oqsilini Escherichia coli bakteriyalarida milligramm miqyosida ishlab chiqarish imkonini beruvchi usul ishlab chiqildi. Tadqiqotchilar turli xil eruvchanlik yorliqlarini taqqoslab, sfGFP fyuijni eng yuqori eruvchan oqsil miqdorini ta’minlashini ko‘rsatdilar hamda FHL2 ning rux saqlovchi LIM domenlarining to‘g‘ri buklanishini (folding) qo‘llab-quvvatlash uchun ishlab chiqarish muhitidagi ZnCl₂ miqdorini optimallashtirdilar.

sfGFP yorlig‘i FHL2 ning bakteriyalardagi umumiy ekspressiya darajasini taxminan 7 barobar, eruvchan fraksiyadagi ulushini esa taxminan 6,2 barobar oshirdi. Eruvchan FHL2 miqdoridagi umumiy o‘sish His yorlig‘iga ega FHL2 ning eruvchan fraksiyasiga nisbatan 45,3 ± 8,5 barobar deb hisoblandi. Rux qo‘shilishi eruvchan oqsil hosil bo‘lishini oshirgan bo‘lsa-da, ruxning yuqori darajalari bakteriyalar o‘sishini susaytirdi. Eruvchan oqsil unumi va hujayralar o‘sishi birgalikda baholanganda 250 va 500 µM ZnCl₂ eng maqbul oraliq deb topildi, yirik miqyosli ishlab chiqarishda esa 250 µM ishlatildi.

Tozalash yakunida taxminan 90 foiz soflikda, 19 mg/ml gacha konsentratsiyalana oladigan va kulturaning har bir litridan taxminan 5,9 mg yorliqsiz FHL2 olindi. Doiraviy dixroizm (CD) o‘lchovlari tozalangan oqsilning ikkilamchi struktura tarkibi AlphaFold modelidan hisoblangan qiymatlarga mos kelishini ko‘rsatdi. Statik yorug‘lik sochilishi bilan birlashtirilgan o‘lcham bo‘yicha istisno xromatografiyasi (SEC-SLS) esa FHL2 eritmada asosan bir molekulali, ya’ni monomer holatda bo‘lishini namoyon qildi.

Kichik burchakli rentgen nurlari sochilishi (SAXS) natijalari FHL2 ning qattiq va to‘g‘ri chiziqli tayoqcha kabi harakat qilmasligini ko‘rsatdi. Eksperimental aylanish radiusi (R_g) 37,8 Å, maksimal molekulyar o‘lcham (D_max) 137 Å deb o‘lchandi. To‘liq cho‘zilgan AlphaFold modelida bu qiymatlar mos ravishda 50,7 va 177 Å ga teng. Ushbu tafovut eritmadagi FHL2 molekulalarining katta qismi cho‘zilgan shakldan ko‘ra ancha ixcham va bukilgan konformatsiyalarni qabul qilishini ko‘rsatadi.

SAXS va ko‘ndalang tikishli mass-spektrometriya (XL-MS) ma’lumotlari birgalikda qo‘llanilgan integrativ modellashtirish yagona qat’iy struktura o‘rniga bir-biriga o‘tib turuvchi strukturaviy ansambllar mavjudligini tasdiqladi. Turli model oilalarida FHL2 molekulalarining 35–57 foizi cho‘zilgan, 11–34 foizi ixcham bukilgan, qolgan 12–54 foizi esa oraliq konformatsiyalarga ajratildi. Ushbu moslashuvchanlik FHL2 ning turli oqsil sheriklariga yoki bir vaqtning o‘zida bir nechta o‘zaro ta’sir yuzalariga moslasha oladigan molekulyar karkas kabi ishlashini tushuntirishi mumkin.

Tadqiqotning eng diqqatga sazovor natijasi FHL2 bilan β-katenin o‘rtasidagi kompleksning birikish nisbatidir. O‘lcham bo‘yicha istisno xromatografiyasi, statik yorug‘lik sochilishi va izotermik titrlash kalorimetriyasi (ITC) natijalari bitta β-katenin molekulasiga ikkita FHL2 molekulasi birika olishini ko‘rsatdi. Kompleksning eksperimental molekulyar massasi 140,2 kDa deb o‘lchandi; bu qiymat 1:1 kompleks uchun kutilgan 117,7 kDa dan yuqori bo‘lib, ikkita FHL2 va bitta β-katenindan iborat kompleks uchun hisoblangan 149,8 kDa ga yaqin keldi.

Kalorimetriya o‘lchovlarida birikish stexiometriyasi 2,040 ± 0,001, dissotsiatsiya konstantasi (K_d) esa 530 ± 30 nM deb belgilandi. Bu qiymat o‘zaro ta’sir mikromolyardan past bo‘lgan kuchli birikish kuchiga ega ekanligini ko‘rsatadi. O‘zaro ta’sir kuchli va qulay molekulalararo kontaktlar bilan ta’minlangan bo‘lsa-da, kompleks hosil bo‘lishi davomida oqsillarning erkin harakatining cheklanishi entropik to‘siqni (yo‘qotishni) yuzaga keltirdi.

Tadqiqot FHL2 saraton kasalligida aniq davolash nishoni ekanligini yoki 2:1 kompleks barcha hujayralarda bir xil shakllanishini da’vo qilmaydi. Tadqiqot tozalangan rekombinant oqsillar bilan o‘tkazilgan laboratoriya tajribalariga va strukturaviy modellashtirishga asoslanadi. Hujayra ichida kompleksning real vaqt rejimidagi strukturasi, birikish yuzalari, ikkita FHL2 molekulasining aynan bir xil yoki turli sohalardan birikishi va ushbu tartib gen ekspressiyasini qanday o‘zgartirishi hali bevosita ko‘rsatilmagan.

FHL2 qanday oqsil?

FHL2 ning to‘liq nomi “Four-and-a-half LIM domains protein 2” bo‘lib, o‘zbek tilida to‘rt yarim LIM domenli oqsil 2 degan ma’noni anglatadi. Oqsil bitta yarim LIM domeni va to‘rtta to‘liq LIM domenidan tashkil topgan beshta modulli bo‘limga ega. Tadqiqotdagi strukturaviy tasvirlarda ushbu bo‘limlar LIM0, LIM1, LIM2, LIM3 va LIM4 deb nomlangan.

Har bir to‘liq LIM domeni ikkita ketma-ket rux barmog‘idan tashkil topadi. Yarim LIM domeni esa bitta rux barmog‘ini saqlaydi. Shu tariqa to‘liq uzunlikdagi FHL2 da jami to‘qqizta rux barmog‘i mavjud. LIM domenlari orasida taxminan to‘qqizta aminokislotadan iborat qisqa va moslashuvchan bog‘lovchi (linker) ketma-ketliklar joylashgan.

Bu yerdagi “rux barmog‘i” (zinc finger) iborasini klassik DNK ga birikuvchi rux barmog‘i oqsillari bilan adashtirmaslik kerak. FHL2 ning LIM domenlari asosan nuklein kislotalarga birikish uchun emas, balki oqsil-oqsil o‘zaro ta’sirini o‘rnatish uchun xizmat qiladi. Rux ionlari domenlarning fazoviy strukturasini saqlab, oqsilning to‘g‘ri buklanishiga yordam beradi.

FHL2 ning 90 dan ortiq o‘zaro ta’sir sheriklari qayd etilgan. Ular qatoriga quyidagilar kiradi:

• Transkripsiya omillari va transkripsiya ko-faktorlari,
• Hujayra membranasi retseptorlari,
• Sitoskelet oqsillari,
• Fermentlar,
• Signal yo‘llari komponentlari.

Ushbu keng qamrovli o‘zaro ta’sir tarmog‘i FHL2 ni o‘zicha yagona fermentativ reaksiyani bajaruvchi oqsil emas, balki turli oqsillarni ayni bir regulyator muhitda birlashtiruvchi adapter yoki karkas (skfold) oqsilga aylantiradi.

FHL2 bilan saraton o‘rtasidagi bog‘liqlik nima uchun murakkab?

FHL2 ning hujayraviy funksiyasi u joylashgan to‘qima, hujayra turi, o‘zaro ta’sir sheriklari va faollashgan signal yo‘liga qarab o‘zgarishi mumkin. Tadqiqotda umumlashtirilgan ilmiy adabiyotlarga ko‘ra, FHL2 ayrim saraton turlarida o‘smani qo‘llab-quvvatlovchi onkogen kabi, ba’zi holatlarda esa o‘smani bostiruvchi oqsil kabi harakat qilishi mumkin.

Ko‘krak bezi saratonining ma’lum BRCA1 bilan bog‘liq shakllarida va jigar hujayrali karsinomasida FHL2 ekspressiyasi kamayishi xabar qilingan. Bunga zid ravishda oshqozon, kolorektal, mayda hujayrali bo‘lmagan o‘pka, bachadon bo‘yni, tuxumdon, prostata, oshqozon osti bezi duktal adenokarsinomasi, melanoma va ayrim leykemiya turlarida FHL2 ekspressiyasining oshishi qayd etilgan. Ba’zi ko‘krak, yo‘g‘on ichak va o‘pka saratoni tadqiqotlarida FHL2 ning yuqori darajasi yomon prognoz bilan bog‘langan.

Biroq ushbu ma’lumotlar joriy tajribaning yangi klinik natijalari hisoblanmaydi. Tadqiqotchilar bemor namunalarini, o‘sma o‘sishini yoki davolashga javobni o‘lchamaganlar. Tadqiqotning saraton nuqtayi nazaridan ahamiyati shundaki, FHL2 ning β-katenin bilan o‘rnatgan strukturaviy aloqasi Wnt/β-katenin signal yo‘lini chuqurroq tushunishga yordam berishi mumkin.

Wnt/β-katenin signal yo‘lida FHL2 ning o‘rni

β-katenin hujayralar yopishishi (adgeziyasi) va gen ekspressiyasini boshqarish kabi ikkita muhim vazifaga ega oqsildir. Wnt signal yo‘li faollashganda, β-kateninning hujayra ichidagi miqdori, fosforillanishi, parchalanishi va hujayra yadrosiga ko‘chishi o‘zgarishi mumkin. Yadroda to‘plangan β-katenin ma’lum maqsadli genlarning ekspressiyasini faollashtiradi.

FHL2 ning β-kateninga to‘g‘ridan-to‘g‘ri birikishi, β-kateninning fosforillanishi va hujayra ichidagi joylashuviga ta’sir ko‘rsatishi avvalroq xabar qilingan. Shunga qaramay, ikki oqsilning qaysi yuzalar orqali birikishi borasida oldingi tadqiqotlar xulosalari to‘liq mos kelmagan.

Bitta tadqiqot β-kateninning N-uchki qismi va birinchi armadillo takrori zarurligini ta’kidlagan bo‘lsa, boshqa bir ish ARM1–9 sohasini va ayniqsa ARM3–8 takrorlarini asosiy o‘ringa qo‘ygan. Shuningdek, FHL2 ning LIM domenlaridan birortasining olib tashlanishi o‘zaro ta’sirni keskin kamaytirishi mumkinligi bildirilgan.

Ushbu qarama-qarshiliklarning muhim sabablaridan biri oldingi tadqiqotlarda to‘liq uzunlikda bo‘lmagan β-katenin bo‘laklaridan yoki GST va MBP kabi yirik fyuijn yorliqlarini tashuvchi FHL2 namunalaridan foydalanilgani bo‘lishi mumkin. Katta yorliq oqsilning moslashuvchanligini cheklab qo‘yishi, birikish yuzasini to‘sib qo‘yishi yoki kompleksning haqiqiy molekulyar massasini aniqlashni qiyinlashtirishi mumkin.

Asosiy texnik muammo: To‘liq uzunlikdagi FHL2 nima uchun qiyin ishlab chiqariladi?

Oqsilning strukturasi va o‘zaro ta’sirini o‘rganish uchun avvalo yetarli miqdorda, eruvchan va to‘g‘ri buklangan oqsil olish talab etiladi. FHL2 uchun bu bosqich nihoyatda murakkabdir. Buning asosiy sabablari quyidagilardan iborat:

• Oqsil juda ko‘p sonli rux koordinatsiya markazlarini saqlaydi.
• Rux yetishmovchiligi LIM domenlarining chala buklanishiga olib kelishi mumkin.
• Noto‘g‘ri buklangan oqsillar bakteriyada erimaydigan agregatlar hosil qiladi.
• FHL2 ning domenlararo moslashuvchanligi oqsilni agregatsiyaga moyil qilib qo‘yadi.
• Eruvchanlikni oshiruvchi katta yorliqlar olib tashlanganda oqsil yana cho‘kmaga tushishi mumkin.

Tadqiqotchilarning dastlabki yorliqsiz FHL2 ishlab chiqarish urinishlari muvaffaqiyatsiz bo‘lgan edi. Past harorat va turli ZnCl₂ darajalari sinab ko‘rilganiga qaramay, oqsil asosan erimaydigan fraksiyada qolib ketgan. Erimaydigan oqsilni qayta buklash (refolding) urinishlari ham sezilarli miqdorda eruvchan FHL2 bermagan.

Turli fyuijn yorliqlari qanday taqqoslandi?

FHL2 ning eruvchanligini oshirish maqsadida to‘rtta turli konstruksiya taqqoslandi:

• HT-FHL2: His yorlig‘iga ega FHL2,
• GST-FHL2: Glutation S-transferaza bilan birlashtirilgan FHL2,
• MBP-FHL2: Maltoza bog‘lovchi oqsil bilan birlashtirilgan FHL2,
• sfGFP-FHL2: Superfolder yashil lyuminessent oqsili bilan birlashtirilgan FHL2.

1A-rasmdagi vestern-blot tasvirlari har bir konstruksiyaning eruvchan va erimaydigan fraksiyalardagi taqsimotini ko‘rsatadi. GST umumiy ekspressiya darajasini oshirgan, ammo eruvchanlik ulushini yaxshilamagan. Hatto GST-FHL2 ning eruvchan fraksiyadagi ulushi His yorliqli konstruksiyadan ham past bo‘lib qolgan.

MBP umumiy ekspressiya miqdorini sezilarli o‘zgartirmagan, biroq eruvchan oqsil ulushini 2,5 ± 0,7 barobar oshirgan. Eng katta yutuq sfGFP fyuijnida kuzatilgan:

• Umumiy ekspressiya darajasi 7,0 ± 0,7 barobar oshdi.
• Eruvchan fraksiya ulushi 6,2 ± 1,6 barobar oshdi.
• Eruvchan oqsil miqdoridagi umumiy o‘sish 45,3 ± 8,5 barobarga yetdi.

Ushbu natijalar tufayli yirik miqyosli ishlab chiqarish uchun sfGFP-FHL2 konstruksiyasi tanlandi. sfGFP bu yerda yakuniy tajriba oqsilining bir qismi sifatida qoldirilmadi; ishlab chiqarish va buklanish bosqichida yordam bergach, TEV proteazasi yordamida kesib tashlandi.

Rux nima uchun zarur edi va nima uchun uni cheksiz oshirib bo‘lmas edi?

FHL2 to‘qqizta rux barmog‘ini o‘z ichiga olishi hisobga olinsa, hujayra ichida yetarli Zn²⁺ mavjudligi to‘g‘ri buklanish uchun juda muhimdir. Tadqiqotchilar ishlab chiqarish muhitiga 0, 100, 250, 500 va 1 000 µM ZnCl₂ qo‘shib, eruvchan sfGFP-FHL2 miqdorini taqqosladilar.

ZnCl₂ qo‘shilishi umumiy oqsil ekspressiyasini jiddiy o‘zgartirmadi, biroq eruvchan fraksiyadagi oqsil miqdorini oshirdi. Yaxshilanish 100 µM darajasida boshlanib, 250 va 500 µM darajalarida yanada kuchaydi.

Biroq rux yuqori konsentratsiyalarda bakteriyalar uchun toksikdir. 1E-rasmda ishlab chiqarish oxirida o‘lchangan OD₆₀₀ qiymatlari ZnCl₂ miqdori oshgan sari bakteriyalar o‘sishi kamayganini ko‘rsatadi. O‘sishning eng kuchli pasayishi 1 000 µM da kuzatildi.

Shu sababli nafaqat har bir hujayra ishlab chiqargan eruvchan oqsilga, balki kulturaning bir litridan olinishi mumkin bo‘lgan jami eruvchan oqsilga e’tibor qaratildi. 1F-rasmdagi taqqoslash 250 va 500 µM ZnCl₂ darajalari eng maqbul muvozanatni ta’minlashini ko‘rsatdi. Katta miqyosli ishlab chiqarishda hujayra o‘sishini kamroq susaytiruvchi 250 µM darajasi tanlandi.

Tozalash jarayoni qanday kechdi?

FHL2 18°C da tun davomida ekspressiya qilindi. Past harorat bakteriyada sintezlanayotgan oqsilning sekinroq va to‘g‘ri buklanishiga yordam berish maqsadida qo‘llanildi.

Tozalash bosqichlari quyidagi tartibda amalga oshirildi:

1. His yorlig‘iga ega sfGFP-FHL2 birinchi immobilizatsiyalangan metall affin xromatografiyasi (IMAC) bilan tutib olindi.
2. TEV proteazasi qo‘shilib, sfGFP bilan FHL2 orasidagi bog‘lanish kesildi.
3. Kesish jarayonida namuna tun davomida dializ qilindi.
4. His yorlig‘iga ega sfGFP va TEV proteazasi ikkinchi metall affin ustunida tutib qolindi.
5. Yorliqsiz FHL2 oqib o‘tgan fraksiyada yig‘ib olindi.
6. Yakuniy tozalash va bufer almashtirish o‘lcham bo‘yicha istisno xromatografiyasi bilan amalga oshirildi.

TEV kesishi va dializ paytida sezilarli miqdorda cho‘kish yuz berdi, santrifugalashdan so‘ng 280 nm absorbansida taxminan 50 foiz kamayish kuzatildi. Bu holat sfGFP nafaqat ishlab chiqarishni, balki ayrim FHL2 molekulalarining eruvchan qolishini ham ta’minlaganini, yorliq olib tashlanganda noto‘g‘ri buklangan yoki beqaror molekulalar cho‘kib ketishi mumkinligini ko‘rsatadi.

Shunga qaramay, qolgan eruvchan oqsil taxminan 90 foiz soflikka yetkazildi, 19 mg/ml gacha konsentratsiyalandi va kulturaning litridan taxminan 5,9 mg yorliqsiz FHL2 olindi. Bu miqdor SAXS, kalorimetriya va mass-spektrometriya kabi usullarni qo‘llash uchun to‘liq yetarli bo‘ldi.

Tozalangan FHL2 haqiqatan ham to‘g‘ri buklangan edimi?

Doiraviy dixroizm (CD) oqsillardagi alfa-spiral va beta-qatlam kabi ikkilamchi strukturalarning taxminiy ulushini o‘lchashda qo‘llaniladi. Eksperimental CD ma’lumotlarini tahlil qilish natijasida:

Eksperimental va hisoblangan ulushlarning bir-biriga yaqinligi tozalangan FHL2 ning ikkilamchi strukturasi umumiy hisobda kutilgan buklanishga mos kelishini ko‘rsatdi.

FHL2 eritmada monomer holatidami yoki dimer?

O‘lcham bo‘yicha istisno xromatografiyasida asosiy monomer cho‘qqisidan oldin kichik qo‘shimcha cho‘qqi kuzatildi. Bu erta cho‘qqi taxminan 64,4 kDa li strukturaga to‘g‘ri kelgani bois, dastlab FHL2 dimeri bo‘lishi mumkin deb o‘yildi.

Agar haqiqiy monomer-dimer muvozanati mavjud bo‘lsa, oqsil konsentratsiyasi oshganda dimer miqdori ortishi va bunga mos ravishda monomer ulushi kamayishi kutiladi. Tadqiqotchilar bu ehtimolni tekshirish uchun FHL2 ni 1–7 mg/ml (taxminan 31–218 µM) oralig‘ida SEC-SLS bilan tekshirdilar.

Erta chiqqan cho‘qqi oqsil konsentratsiyasi bilan birga oshdi, biroq monomer cho‘qqisida mos ravishda kamayish kuzatilmadi. Monomer va erta cho‘qqi o‘rtasidagi nisbiy taqsimot sinovdan o‘tkazilgan konsentratsiyalarda o‘zgarmadi. Shu sababli erta cho‘qqi eritmada muvozanatli tarzda hosil bo‘lib ajraluvchi haqiqiy FHL2 gomodimeri sifatida talqin qilinmadi.

Asosiy cho‘qqining o‘lchangan molekulyar massasi nazariy 32,2 kDa qiymatiga yaqin bo‘ldi va FHL2 eritmada asosan monomer holatda bo‘ladi degan xulosaga kelindi.

SAXS FHL2 ning moslashuvchanligini qanday ko‘rsatdi?

Kichik burchakli rentgen nurlari sochilishi (SAXS) oqsillarni kristallamasdan, eritmada ularning umumiy o‘lchamlari, shakllari va moslashuvchanligi haqida ma’lumot beradi. Bu usul har bir atomning aniq o‘rnini ko‘rsatmaydi, ammo molekulaning ixcham, cho‘zilgan yoki elastik ekanligini ochib bera oladi.

3A-rasmdagi Kratky grafigida FHL2 ning egri chizig‘i qattiq va sharsimon oqsil bo‘lgan BSA ning qo‘ng‘iroqsimon profilidan yaqqol ajralib turdi. FHL2 egri chizig‘ining yuqori qiymatlarda keng davom etishi oqsilning yuqori darajada moslashuvchan ekanligini ko‘rsatadi.

AlphaFold modelining to‘liq cho‘zilgan strukturasidan hisoblangan nazariy SAXS egri chizig‘i eksperimental ma’lumotlarga to‘g‘ri kelmadi. Yagona model mosligidagi χ² qiymati 15,231 ga teng bo‘ldi. Ushbu yuqori nomuvofiqlik eritmadagi barcha FHL2 molekulalarini yagona va to‘liq cho‘zilgan struktura sifatida ifodalab bo‘lmasligini ko‘rsatadi.

R_g va D_max qiymatlari nimani anglatadi?

Aylanish radiusi (R_g) molekulyar massaning markaz atrofida qanchalik tarqalganini bildiradi. Katta R_g qiymati ko‘proq cho‘zilgan, kichik qiymat esa ixchamroq strukturani bildiradi.

Maksimal o‘lcham (D_max) molekuladagi bir-biridan eng uzoq ikki nuqta orasidagi taxminiy eng katta masofadir.

Har ikki eksperimental qiymatning cho‘zilgan modeldan kichik bo‘lishi eritmadagi oqsil o‘rtacha hisobda qisqaroq va ixchamroq struktura ansamblini hosil qilishini ko‘rsatadi.

Juftliklararo masofa taqsimotida 22,5 Å atrofida yaqqol cho‘qqi kuzatildi. Bu masofa bitta LIM domenining xarakterli o‘lchamiga mos keladi. Taqsimotning 137 Å gacha cho‘zilgan dumi esa FHL2 ning mutlaqo sharsimon emas, balki umumiy cho‘zilgan, ammo turli darajada bukiluvchi ko‘p domenli arxitekturaga ega ekanligini ko‘rsatadi.

Nima uchun yagona struktura o‘rniga “konformatsion ansambl” qo‘llanildi?

Moslashuvchan oqsillar eritmada yagona qat’iy holatda turmaydi. Ayni bir oqsil molekulasi vaqt o‘tishi bilan ochiqroq, bukilganroq yoki oraliq holatlarga o‘tishi mumkin. Shu bois moslashuvchan oqsilni faqat bitta fazoviy model bilan tushuntirish xatoga olib kelishi mumkin.

Tadqiqotchilar SAXS ma’lumotlarini ko‘ndalang tikishli mass-spektrometriya (XL-MS) orqali olingan masofa cheklovlari bilan birlashtirdilar. XL-MS usulida oqsilning bir-biriga yaqin sohalari kimyoviy birikma bilan ko‘ndalang tikiladi. So‘ngra qaysi aminokislota juftliklari bog‘langani mass-spektrometriya bilan aniqlanadi. Agar modelda ikki qoldiq bog‘lovchi yetib borolmaydigan darajada uzoq bo‘lsa, model eksperimental cheklovga mos kelmaydi.

Modellashtirish uchun ikkita RRT tanlanmasi va bitta BioEmu tanlanmasi qo‘llanildi. Ushbu uch yondashuv mos ravishda taxminan 10 315, 10 404 va 9 461 xil FHL2 konformatsiyasini yaratdi. Shu tariqa qariyb 30 mingta turli strukturaviy ehtimol baholandi.

Modellar SAXS egri chizig‘iga mosligi va XL-MS cheklovlarini qondirish darajasiga qarab baholandi. Birlashgan bali 0,887 va undan yuqori bo‘lgan 104 ta ansambl tanlab olindi, so‘ngra strukturaviy o‘xshashligiga qarab 28 ta turli ansamblga va yakuniy bosqichda beshta asosiy oilaga ajratildi.

Besh strukturaviy oila nimani ko‘rsatdi?

4-rasmda 1, 2, 4, 14 va 25 raqamli yetakchilar vakillik qilgan beshta ansambl oilasi ko‘rsatilgan. Ushbu oilalarning SAXS mosligidagi χ² qiymatlari 2,302 dan 2,512 gacha o‘zgardi. Bu ko‘rsatkichlar yagona cho‘zilgan AlphaFold modelining 15,231 qiymatiga nisbatan ancha yaxshi moslikni bildiradi.

Har bir ansambl 46 ta XL-MS ko‘ndalang bog‘lanishining 57,4–69,6 foizini bir vaqtda qondirdi. Yagona ansambl barcha bog‘lanishlarni qondira olmasligi oqsilning doimiy harakatlanuvchi tabiati bilan mos keladi. Turli ansambllar birgalikda qaralganda, 46 ta bog‘lanishning 43 tasi kamida bitta ansambl tomonidan tushuntirildi. Atigi 6 foizga yaqin qismi izohsiz qoldi.

Modellar R_g qiymatlariga ko‘ra uch guruhga bo‘lindi:

• Bukilgan konformatsiya:R_g AlphaFold modelining 75 foizidan kichik; taxminan 38,0 Å dan past.
• Cho‘zilgan konformatsiya:R_g AlphaFold modelining 90 foizidan katta; taxminan 45,6 Å dan yuqori.
• Oraliq konformatsiya: Ushbu ikki chegara orasidagi tuzilmalar.

Besh ansambl oilasi bo‘yicha taqsimot quyidagi oraliqlarda bo‘ldi:

• Cho‘zilgan konformatsiyalar: 35–57%,
• Ixcham va bukilgan konformatsiyalar: 11–34%,
• Oraliq konformatsiyalar: 12–54%.

Bu natija FHL2 vaqtning qariyb yarmida cho‘zilgan shakllarni olishi mumkin bo‘lsa-da, faqatgina to‘g‘ri va qattiq tayoqcha emasligini ko‘rsatadi. Molekulalarning salmoqli qismi o‘z ustiga bukilish xususiyatiga ega.

Moslashuvchanlik FHL2 funksiyasi uchun nima sababdan muhim?

FHL2 ni turli birikish nuqtalariga ega elastik molekulyar qo‘l deb tasavvur qilish mumkin. Qattiq tayoqcha faqat ma’lum geometriyaga ega oqsillarga birika oladi. Moslashuvchan oqsil esa domenlar orasidagi burchaklarni o‘zgartirib, turli o‘lchamdagi va turli joylashuvdagi sheriklarga moslasha oladi.

FHL2 ning to‘rtta to‘liq va bitta yarim LIM domeni turli oqsillarni bir vaqtda ushlab tura oladigan ko‘p sonli o‘zaro ta’sir yuzalarini shakllantiradi. Domenlar orasidagi qisqa bog‘lovchilar oqsilga cheksiz emas, balki nazorat qilinadigan moslashuvchanlik beradi. Bu xususiyat:

• Bir nechta oqsilni ayni bir kompleksda jamlash,
• Turli signal yo‘llarida turli birikish tartiblarini o‘rnatish,
• Birikish jarayonida oqsilning tartibliroq holatga o‘tishi,
• Uzoq sohalar orasida vaqtinchalik kontaktlar hosil bo‘lishini ta’minlashi mumkin.

Biroq tadqiqot muayyan konformatsiya aniq bir hujayraviy funksiyani bevosita bajarishini ko‘rsatmagan. Moslashuvchanlik karkas funksiyasini osonlashtiradi degan xulosa eksperimental ma’lumotlarga asoslangan mexanistik talqindir.

FHL2 bilan β-katenin o‘rtasidagi to‘g‘ridan-to‘g‘ri o‘zaro ta’sir qanday ko‘rsatildi?

Dastlab FHL2 va β-katenin alohida hamda aralashma holida o‘lcham bo‘yicha istisno xromatografiyasiga kiritildi. Ikki oqsil birga berilganda, pastroq elutsiya hajmida yangi cho‘qqi paydo bo‘ldi, alohida oqsillarga tegishli cho‘qqilar esa kichraydi.

O‘lcham bo‘yicha istisno xromatografiyasida yirik molekulyar komplekslar ustundan ertaroq chiqadi. Shu sababli yangi cho‘qqining past elutsiya hajmida chiqishi FHL2 bilan β-katenin yirikroq kompleks hosil qilganini ko‘rsatadi.

Yangi cho‘qqidan olingan fraksiyalarning SDS-PAGE tahlilida ham β-katenin, ham FHL2 chiziqlari ko‘rindi. Bu natija ikki oqsil ayni bir xromatografiya fraksiyasida birga ekanligini va barqaror kompleks tuzganini tasdiqladi.

Kutilmagan 2:1 stexiometriya qanday aniqlandi?

SEC-SLS usuli xromatografiya cho‘qqisidan o‘tayotgan molekulalarning yorug‘likni sochish xususiyatidan foydalanib, molekulyar massani bevosita baholaydi. Tadqiqotda o‘lchangan va nazariy qiymatlar quyidagicha:

Bitta FHL2 va bitta β-katenindan tashkil topgan 1:1 kompleksning nazariy massasi 117,7 kDa ga teng. O‘lchangan 140,2 kDa qiymati bu sondan sezilarli darajada yuqoridir. Aksincha, ikkita FHL2 va bitta β-katenin uchun kutilgan 149,8 kDa qiymatiga ancha yaqindir.

Shu sababli kompleksning asosiy tuzilishi:

\[ 2\,\mathrm{FHL2}+1\,\beta\text{-katenin} \]

ekanligi haqida xulosaga kelindi. Ushbu ifoda kimyoviy reaksiya tenglamasi emas, balki kompleksning molekulyar tarkibini bildiruvchi stexiometrik ifodadir.

Oqsillar nisbati o‘zgarganda kompleks nima sababdan o‘zgardi?

FHL2 va β-katenin konsentratsiyalari o‘zgartirilganda o‘lchangan kompleks massasi ham o‘zgardi:

• 4 mg/ml FHL2 + 4 mg/ml β-katenin: 140,2 kDa; 2:1 kompleksga mos.
• 4 mg/ml FHL2 + 1 mg/ml β-katenin: 113,9 kDa; taxminan 1:1 kompleksga mos.
• 2 mg/ml FHL2 + 2 mg/ml β-katenin: Cho‘qqi bo‘ylab taxminan 125–135 kDa oralig‘ida o‘zgaruvchi massa; 1:1 va 2:1 tuzilishlar orasidagi geterogen holat.

Bu topilma 2:1 kompleksning shakllanishi oqsillarning mutlaq konsentratsiyasiga va ularning o‘zaro nisbatiga bog‘liq bo‘lishi mumkinligini ko‘rsatadi. Kompleks barcha sharoitlarda o‘zgarmas yagona tuzilma sifatida mavjud bo‘lmagan.

ITC birikish kuchi va nisbatini qanday tasdiqladi?

Izotermik titrlash kalorimetriyasi (ITC) ikki molekula birikkanida ajralib chiqadigan yoki yutiladigan issiqlikni o‘lchaydi. Tadqiqotchilar 276 µM FHL2 ni 13,8 µM β-katenin saqlagan kyuvetaga titrladilar va birikish egri chizig‘ini bir turdagi birikish joylari modeli bilan baholadilar.

ITC natijalari:

Birikish termodinamikasi nimani anglatadi?

Tadqiqotdagi termodinamik qiymatlar bog‘liqligini tushuntirish uchun erkin energiya tenglamasidan foydalanish mumkin:

\[ \Delta G=\Delta H-T\Delta S \]

Bunda:

• ΔG — Gibbs erkin energiyasining umumiy o‘zgarishini,
• ΔH — molekulalararo bog‘lar va kontaktlar bilan bog‘liq entalpiya o‘zgarishini,
• T — mutlaq haroratni,
• ΔS — tizimning tartibsizligi va harakat erkinligidagi o‘zgarishni ifodalaydi.

Tadqiqot natijalari −TΔS qiymatini 22,8 kkal/mol deb ko‘rsatadi. Ushbu ko‘rinish qo‘llanilganda munosabat quyidagicha yoziladi:

\[ \Delta G=\Delta H+(-T\Delta S) \]

\[ \Delta G\approx-31{,}4+22{,}8=-8{,}6\ \mathrm{kkal/mol} \]

Bu qiymat keltirilgan −8,57 kkal/mol natijasi bilan mos keladi. Kuchli manfiy ΔH ko‘rsatkichi FHL2 bilan β-katenin o‘rtasida juda ko‘p sonli qulay molekulalararo kontaktlar hosil bo‘lganini bildiradi. Musbat −TΔS esa birikish jarayonida oqsillarning harakat va konformatsion erkinligi kamayganini ko‘rsatadi.

Moslashuvchan FHL2 ning β-kateninga birikkanda ma’lum konformatsiyalar bilan cheклаnishi entropik yo‘qotishning ehtimoliy sabablaridan biridir. β-kateninning tartibsiz N- va C-uchki qismlari ham kompleks shakllanishida tartibliroq holatga o‘tishi mumkin. Biroq tadqiqot birikishdan keyingi atom darajasidagi strukturani aniqlamaganligi sababli aynan qaysi sohalar tartiblanganini bevosita ko‘rsatmagan.

Nima uchun yagona birikish bosqichi ko‘ringani holda nisbat 2:1 chiqdi?

ITC egri chizig‘i taxminan ikkita FHL2 birikkanini ko‘rsatgan bo‘lsa-da, ikkita alohida termodinamik bosqich o‘rniga bitta asosiy birikish hodisasini namoyon etdi. Tadqiqotchilar buni β-katenindagi ikkita FHL2 birikish sohasining o‘xshash birikish energiyasiga ega bo‘lishi mumkinligi bilan izohlaydilar.

Boshqa bir ehtimol shundaki, birinchi FHL2 ning birikishi ikkinchi FHL2 ning birikishini osonlashtiradi (kooperativlik) yoki kompleks ichida FHL2-FHL2 kontakti yuzaga keladi. Tadqiqot ushbu variantlarni bir-biridan ajratmagan.

2:1 kompleks uchun ikkita asosiy model ilgari surilgan:

• β-katenin ustida bir vaqtning o‘zida ikkita alohida FHL2 molekulasini tutuvchi bir nechta birikish yuzasi mavjudligi,
• Bitta FHL2 birikkach, ikkinchi FHL2 kompleks ichida birinchi FHL2 bilan aloqa o‘rnatishi.

FHL2 ning yolg‘iz holatda konsentratsiyaga bog‘liq oligomerizatsiyaga uchramasligi ikkinchi ehtimol faqat β-katenin yaratgan kompleks muhitidagina sodir bo‘lishi mumkinligini ko‘rsatadi.

Oldingi 1:1 natijasi bilan ushbu tadqiqotning 2:1 natijasi nima sababdan farq qilishi mumkin?

Oldingi ITC tadqiqotida FHL2 bilan β-katenin uchun 1:1 stexiometriya va 1,08 µM K_d qayd etilgan edi. Biroq o‘sha tajribada:

• β-kateninning to‘liq uzunligi o‘rniga 138–781 aminokislotali qisqartirilgan shakli,
• Yorliqsiz FHL2 o‘rniga MBP-FHL2 fyuijni ishlatilgan edi.

β-kateninning olib tashlangan N-uchki qismi ikkinchi birikish yuzasiga hissa qo‘shayotgan bo‘lishi mumkin. Xuddi shuningdek, katta MBP yorlig‘i FHL2 ning bukilishiga yoki ikkinchi FHL2 molekulasining kompleksga yaqinlashishiga fazoviy (sterik) to‘siq yaratgan bo‘lishi mumkin.

Ushbu tadqiqot to‘liq uzunlikdagi β-katenin va yorliqsiz to‘liq uzunlikdagi FHL2 dan foydalanib, tabiiyroq tajriba modelini yaratdi. Shunga qaramay, bu natija ham tozalangan oqsillar qo‘llanilgan in vitro tizimdan olingan; hujayra ichidagi stexiometriya alohida tasdiqlanishi lozim.

1-rasm nimani ko‘rsatadi?

1-rasmning chap qismi turli fyuijn yorliqlarining FHL2 ishlab chiqarilishiga ta’sirini aks ettiradi. Vestern-blot tasvirlari va ulardan hisoblangan ustunli grafiklar sfGFP ham umumiy ekspressiya, ham eruvchan fraksiya bo‘yicha yaqqol eng yaxshi natija berganini ko‘rsatadi.

Rasmning o‘ng qismi ZnCl₂ optimizatsiyasini ko‘rsatadi. Rux miqdori oshgan sari eruvchan sfGFP-FHL2 ko‘paygan, ammo OD₆₀₀ bilan o‘lchangan bakteriyalar o‘sishi kamaygan. Bir litr kulturaga to‘g‘ri keladigan eruvchan oqsil miqdori bo‘yicha 250 va 500 µM darajalari eng yuqori unumni ta’minlagan.

2-rasm nimani ko‘rsatadi?

2A-rasmdagi CD egri chizig‘i va ikkilamchi struktura jadvali tozalangan FHL2 kutilgan umumiy strukturaviy tarkibga ega ekanligini ko‘rsatadi. 2B-rasmda turli FHL2 konsentratsiyalaridagi SEC-SLS egri chiziqlari ayni bir asosiy elutsiya hajmida to‘planadi va o‘lchangan molekulyar massa monomerga mos keladi.

Bu rasm ishlab chiqarish usuli nafaqat eruvchan oqsil hosil qilganini, balki olingan oqsil to‘g‘ri buklangan va yuqori konsentratsiyalarda yaqqol agregatsiyaga uchramaydigan namuna ekanligini tasdiqlaydi.

3-rasm nimani ko‘rsatadi?

3A-rasmdagi Kratky grafigi FHL2 ning moslashuvchanligini BSA bilan taqqoslaydi. 3B-rasm cho‘zilgan AlphaFold modelini va LIM domenlarining taxminiy o‘lchamlarini ko‘rsatadi. 3C-rasmda ushbu yagona model eksperimental SAXS ma’lumotlariga to‘g‘ri kelmasligi ko‘rinadi.

3D-rasmdagi juftliklararo masofa taqsimoti 22,5 Å atrofida cho‘qqi hosil qilib, 137 Å gacha cho‘ziladi. Bu alohida LIM domenlari ixcham bo‘lsa-da, butun oqsil cho‘zilgan va bukiluvchan tuzilma hosil qilishini ko‘rsatadi.

4-rasm va 5-rasm nimani ko‘rsatadi?

4-rasm SAXS va XL-MS ma’lumotlariga birgalikda mos keluvchi beshta turli konformatsion ansambl oilasini ko‘rsatadi. Har bir satrda SAXS mosligi, qondirilgan ko‘ndalang bog‘lanishlar va o‘sha ansambldagi vakillik modellari keltirilgan.

Modellarning hech birida faqat bitta oqsil shakli mutlaq ustun emas. Ayni bir ansambl ichida to‘g‘ri, qisman bukilgan va sezilarli darajada ixchamlashgan modellar birga mavjud.

5-rasm har bir ansambl oilasidagi cho‘zilgan, oraliq va bukilgan holatlarning foizini umumiy tarzda ko‘rsatadi. Barcha besh oilada bukilgan konformatsiyaning mavjudligi ixcham shakllar modellashtirishdagi tasodifiy istisnolar emasligini anglatadi.

6-rasm nimani ko‘rsatadi?

6A-rasmda FHL2 bilan β-katenin birga berilganda yangi xromatografiya cho‘qqisi hosil bo‘ladi. Uning ostidagi gel yangi cho‘qqi ichida har ikki oqsil ham borligini tasdiqlaydi.

6B-rasmda kompleksning 140,2 kDa deb o‘lchangan molekulyar massasi ikkita FHL2 va bitta β-katenin uchun hisoblangan 149,8 kDa qiymat bilan taqqoslangan.

6C-rasm har bir FHL2 inyeksiyasida paydo bo‘ladigan issiqlik oqimi cho‘qqilarini aks ettiruvchi ITC termogrammasidir. 6D-rasmda integrallangan issiqlik qiymatlari molyar nisbat bilan solishtirilib, n = 2,040, K_d = 530 nM natijasi olingan.

Tadqiqotning o‘tmish, bugun va kelajak nuqtayi nazaridan ahamiyati

O‘tmish nuqtayi nazaridan tadqiqot to‘liq uzunlikdagi FHL2 ning strukturaviy tahlilini cheklab kelgan ishlab chiqarish muammosiga yechim taqdim etadi. Oldingi ishlar asosan katta fyuijn yorliqlari bo‘lgan yoki juda kam miqdorda olingan FHL2 namunalari bilan o‘tkazilgan edi.

Bugungi kun nuqtayi nazaridan tadqiqot FHL2 eritmada monomerik, ammo yuqori darajada moslashuvchan oqsil ekanligini eksperimental tarzda ko‘rsatadi. Shu tariqa FHL2 ni faqat domenlari to‘g‘ri chiziqda tizilgan qattiq struktura sifatida tasavvur qilish yetarli emasligi isbotlandi.

Tadqiqot, shuningdek, to‘liq uzunlikdagi va yorliqsiz oqsillar qo‘llanilganda β-katenin bilan 2:1 kompleks hosil bo‘lishi mumkinligini ko‘rsatadi. Bu natija Wnt/β-katenin signal komplekslarida avval hisobga olinmagan ko‘p valentli birikish tartibi mavjud bo‘lishi mumkinligini bildiradi.

Kelajak nuqtayi nazaridan FHL2 bilan β-katenin o‘rtasidagi aniq kontakt sohalarini aniqlash lozim. Buning uchun krio-elektron mikroskopiya, NMR, yangi XL-MS tajribalari, vodorod-deyteriy almashinuvi, mutatsion tahlil va hujayra ichi vizualizatsiyasi usullarini qo‘llash mumkin.

Shuningdek, ikkita FHL2 molekulasi:

• β-kateninning ayni bir yuzasidagi ikkita sohaga birikadimi,
• Bir-biridan uzoq ikkita sohaga birikadimi,
• O‘zaro kontakt o‘rnatadimi,
• Ketma-ket yoki bir vaqtda birikadimi — bularni aniqlash lozim.

Shunga o‘xshash strukturaviy tadqiqotlar FHL2 ning PI3K/AKT/mTOR, MAPK/ERK va TGF-β kabi boshqa signal yo‘llaridagi komplekslari uchun ham o‘tkazilishi mumkin.

Kundalik hayot va tibbiyot nuqtayi nazaridan ahamiyati

Ushbu tadqiqot to‘g‘ridan-to‘g‘ri dori, diagnostika testi yoki davolash usulini yaratmagan. Kundalik hayot uchun darhol qo‘llaniladigan natijani bermaydi. Uning ahamiyati fundamental darajadadir: Hujayra ichida saraton, yurak kasalliklari va to‘qima javoblari bilan bog‘liq bo‘lgan regulyator oqsilning qanday shakl o‘zgartirishi va muhim signal oqsili bilan qanday nisbatda birikishini tushuntiradi.

Kasalliklarga qarshi nishonli terapiyani yaratish uchun faqatgina oqsil miqdorini emas, u qaysi molekulyar sherik bilan qaysi yuzadan va qanday stexiometriyada birikishini bilish shart. Ushbu tadqiqot kelgusida FHL2-β-katenin o‘zaro ta’siriga qaratilgan ishlar uchun zarur strukturaviy poydevorning bir qismini ta’minlaydi.

Shunga qaramay, 2:1 kompleksning buzilishi saratonni sekinlashtirishi, FHL2 ni bloklash xavfsiz ekanligi yoki ushbu o‘zaro ta’sir bemorlarda davolash nishoni sifatida ishlatilishi mumkinligi ko‘rsatilmagan.

Tadqiqotning kuchli tomonlari

• To‘liq uzunlikdagi va yakuniy bosqichda yorliqsiz FHL2 milligramm miqyosida ishlab chiqarildi.
• Turli fyuijn yorliqlari eksperimental taqqoslandi.
• Rux qo‘shimchasining eruvchanlik va bakteriyalar o‘sishiga qarama-qarshi ta’sirlari birgalikda baholandi.
• Tozalangan oqsilning buklanishi CD bilan tekshirildi.
• Oligomerik holat SEC-SLS bilan turli konsentratsiyalarda o‘rganildi.
• Moslashuvchanlik SEC-SAXS bilan bevosita eksperimental baholandi.
• SAXS ma’lumotlari XL-MS cheklovlari bilan integratsiya qilindi.
• O‘n minglab konformatsiyalar baholanib, bir tomonlama talqindan qochildi.
• FHL2-β-katenin o‘zaro ta’siri SEC, SDS-PAGE, SEC-SLS va ITC kabi bir-birini to‘ldiruvchi usullar bilan tasdiqlandi.
• Stexiometriya ikkita mustaqil miqdoriy usul bilan 2:1 sifatida asoslandi.
• SAXS, proteomika va modellashtirish ma’lumotlarining asosiy qismi ochiq bazalarga joylashtirildi.

Tadqiqotning cheklovlari

• Tadqiqot ilmiy taqrizdan o‘tmagan preprint hisoblanadi.
• Tajribalar tozalangan rekombinant oqsillar bilan in vitro muhitda o‘tkazilgan.
• 2:1 stexiometriya tirik hujayralarda bevosita ko‘rsatilmagan.
• FHL2 bilan β-kateninning aniq birikish yuzalari to‘liq xaritlanmagan.
• Ikkita FHL2 molekulasi bir xil yoki turlicha birikish mexanizmlari bilan kompleksga qo‘shilishi noma’lum.
• SAXS past aniqlikdagi umumiy shakl ma’lumotini beradi, atomar strukturani ko‘rsatmaydi.
• Integrativ modellashtirish yagona mutlaq strukturani emas, eksperimental ma’lumotlarga mos ehtimoliy tuzilmalarni yaratadi.
• Alohida ansambllar XL-MS bog‘lanishlarining faqat 57,4–69,6 foizini bir vaqtda qondira olgan.
• sfGFP olib tashlanayotganda taxminan 50 foiz oqsil yo‘qotilishi ishlab chiqarish jarayonida oqsilning bir qismi beqaror qolganini ko‘rsatadi.
• Oqsillarning bakteriyalarda sintezlanishi inson hujayralaridagi post-translyatsion modifikatsiyalar mavjud emasligini anglatadi.
• Fosforillanish yoki boshqa hujayraviy o‘zgarishlarning stexiometriyaga ta’siri o‘rganilmagan.
• Tadqiqot hujayraviy Wnt maqsadli genlarini, o‘sma o‘sishini yoki davolash javobini o‘lchamagan.

Preprint matnida ayrim texnik hisobot muammolari ham mavjud. Ko‘plab joylarda “Error! Reference source not found.” jumlasi qolib ketgan, qo‘shimcha ma’lumotlar DOI maydoni to‘ldirilmagan va ayrim uslubiy ro‘yxatlarda takroriy yoki noaniq konsentratsiyalar yozilgan. 1-rasm izohida statistik ahamiyatlilik chegaralari “* p ≤ 0,5; ** p ≤ 0,1; *** p ≤ 0,001” ko‘rinishida berilgan. Dastlabki ikki chegara ilmiy nashrlarda qabul qilingan mezonlarga to‘g‘ri kelmasligi sababli ushbu qiymatlar preprintning keyingi tahririda tuzatilishi lozim bo‘lgan tafsilotlardir. Bu yerda tadqiqot o‘zboshimchalik bilan tuzatilmadi, matnda keltirilgan holat aynan hisobga olindi.

Tadqiqot nima demoqda?

• sfGFP fyuijni va maqbul rux ta’minoti bakteriyalarda eruvchan FHL2 ishlab chiqarishni kuchli darajada oshirdi.
• To‘liq uzunlikdagi yorliqsiz FHL2 milligramm miqyosida tozalandi.
• Tozalangan FHL2 ning ikkilamchi strukturasi kutilgan modelga mos keladi.
• FHL2 eritmada asosan monomer holatdadir.
• FHL2 qattiq va to‘liq cho‘zilgan oqsil emas.
• Oqsil cho‘zilgan, oraliq va ixcham bukilgan konformatsiyalar o‘rtasida taqsimlanadi.
• FHL2 bilan β-katenin to‘g‘ridan-to‘g‘ri va mikromolyardan past affinlik bilan birikadi.
• To‘liq uzunlikdagi yorliqsiz oqsillar bilan kompleksning ustun stexiometriyasi 2 FHL2:1 β-katenindir.
• Birikish qulay molekulalararo kontaktlar hisobiga amalga oshadi, biroq konformatsion erkinlik yo‘qotilishini keltirib chiqaradi.

Tadqiqot nima demayapti?

• 2:1 kompleks barcha hujayra turlarida majburiy hosil bo‘lishini ko‘rsatmayapti.
• Ikkita FHL2 ning β-katenin ustidagi aniq birikish o‘rinlarini belgilab bermayapti.
• Kompleksning atomar aniqlikdagi fazoviy strukturasini taqdim etmayapti.
• FHL2 barcha saratonlarda onkogen yoki barcha saratonlarda o‘smani bostiruvchi ekanligini aytmayapti.
• FHL2-β-katenin o‘zaro ta’sirini bloklash kasallikni davolashini isbotlamayapti.
• Biror dori nomzodini, xavfsizlik profilini yoki klinik natijani baholamayapti.
• Bemorlarda diagnostik yoki prognostik tasdiqni taqdim etmayapti.

Tadqiqot usullari va natijalari

Eksperimental ish jarayoni

Oqsil ishlab chiqarish sharoitlari

• Xo‘jayin hujayra: E. coli BL21(DE3).
• Ozuqa muhiti: LB.
• FHL2 induksiyasi: 0,25 mM IPTG.
• β-katenin induksiyasi: 1 mM IPTG.
• Yirik miqyosli FHL2 ishlab chiqarishda ZnCl₂: 250 µM.
• Induksiyadan keyingi harorat: 18°C.
• Induksiya davomiyligi: Tun davomida.
• FHL2 va sfGFP orasidagi TEV kesish ketma-ketligi: ENLYFQ↓G.

SAXS o‘lchov sharoitlari

• FHL2 namuna konsentratsiyasi: 7,5 mg/ml.
• Inyeksiya hajmi: 100 µl.
• Ustun: Superdex 200 Increase 10/300 GL.
• Oqim tezligi: 0,7 ml/daqiqa.
• Nurlanish liniyasi: PETRA III, P12, DESY Gamburg.
• Rentgen energiyasi: 9 keV.
• Tahlil paketi: ATSAS 4.1.0.
• Kichik burchakli, 0,01 Å⁻¹ dan past ma’lumotlar artefakt xavfi tufayli chiqarib tashlangan.

XL-MS va modellashtirish tafsilotlari

• FHL2 konsentratsiyasi: 23,36 µM.
• BS3 ko‘ndalang bog‘lovchi konsentratsiyasi: 697 µM.
• Ko‘ndalang bog‘lash: 25°C da 10 daqiqa.
• Reaksiyani to‘xtatish: 100 mM Tris-HCl, pH 8,0.
• Oqsil gidrolizi: Tripsin.
• Mass-spektrometr: Orbitrap Fusion Lumos.
• Modellashtirishda qo‘llanilgan domenlararo lizin bog‘lanishlari: 46.
• Eng yaxshi ansamblni tanlash mezoni: Birlashgan ball ≥ 0,887.
• Tanlangan ansambllar soni: 104.
• Strukturaviy soddalashtirishdan keyingi turli ansambllar soni: 28.
• Yakuniy ansambl oilalari soni: 5.

Asosiy miqdoriy natijalar

Ma’lumotlarning umumiy texnik xulosasi

• FHL2 ishlab chiqarishdagi asosiy to‘siq oqsilning ruxga bog‘liq buklanishi va agregatsiyaga moyilligidir.
• sfGFP ishlab chiqarish davomida eruvchanlikni oshiruvchi eng samarali fyuijn sherigi bo‘ldi.
• Rux qo‘shimchasi to‘g‘ri buklanishni osonlashtirdi, ammo yuqori konsentratsiyada bakteriyalar o‘sishini susaytirdi.
• Tozalangan FHL2 monomer, buklangan va konsentratsiyalana oladigan namuna ekanligi ko‘rsatildi.
• SAXS natijalari yagona cho‘zilgan struktura eksperimental ma’lumotlarni tushuntira olmasligini ko‘rsatdi.
• XL-MS bilan qo‘llab-quvvatlangan modellashtirish FHL2 bir nechta strukturaviy holatlar orasida harakatlanishini ko‘rsatdi.
• FHL2 ning tabiiy oligomerizatsiya moyilligi kuzatilmase-da, β-katenin kompleksida ikkita FHL2 mavjud bo‘lishi mumkin.
• Birikish nisbatiga oqsillar konsentratsiyasi va aralashma nisbati ta’sir ko‘rsatadi.
• 2:1 stexiometriya ham molekulyar massani o‘lchash, ham kalorimetriya bilan tasdiqlandi.
• Kompleksning aniq molekulyar geometriyasi hali to‘liq hal etilmagan.

Manba va uslubiyot eslatmasi

Ushbu material Tina Logonder, Uroš Prešern va Aljaž Gaber tomonidan tayyorlangan “FHL2 production enabled new insight into its flexibility and unexpected binding stoichiometry with β-catenin” nomli ilmiy ishga asoslanadi.

Tadqiqot Lyublyana Universiteti Kimyo va Kimyoviy Texnologiyalar Fakultetida bajarilgan eksperimental preprint ilmiy maqoladir. Matnda ochiqchasiga “This preprint research paper has not been peer reviewed” ogohlantirishi keltirilgan. Shu sababli tadqiqot ilmiy taqrizdan o‘tmagan. PDF da maqolaning jurnal tomonidan qabul qilingani yoki taqrizli nashri chiqqani haqida ma’lumot berilmagan.

Tadqiqot klinik sinov emas. Unda bemorlar guruhi, davolash bo‘limi, o‘sma javobi yoki klinik xavfsizlik baholanishi mavjud emas. Tadqiqot bakteriyalarda ishlab chiqarilgan rekombinant FHL2 va β-katenin oqsillari ustida o‘tkazilgan in vitro oqsil ekspressiyasi, tozalash, biofizik o‘lchovlar, mass-spektrometriya va hisoblash integrativ modellashtirishiga tayanadi.

SAXS ma’lumotlari Small Angle Scattering Biological Data Bank tizimiga SASDZ36 kodi bilan kiritilgani bildirilgan. Mass-spektrometriya ma’lumotlari PRIDE/ProteomeXchange tizimiga PXD078621 to‘plami sifatida yuklangan. Integrativ modellashtirish ma’lumotlari va ayrim rasm ma’lumotlari Zenodo platformasida 10.5281/zenodo.19680353 DOI raqami ostida ulashilgan. Ushbu DOI tadqiqot ma’lumotlariga tegishli bo‘lib, maqolaning taqrizli nashrini bildirmaydi.

Tadqiqot Sloveniya Tadqiqot va Innovatsiyalar Agentligi tomonidan PS-0140 raqamli ko‘mak bilan moliyalashtirilgan. Mualliflar ma’lum bir moliyaviy yoki shaxsiy manfaatlar to‘qnashuvi mavjud emasligini ma’lum qilganlar.

Matnda tahlil kodini yozishda yordam olish maqsadida ChatGPT dan foydalanilgani, tadqiqotchilar yaratilgan matnni ko‘rib chiqib tahrirlagani va maqola uchun javobgarlikni o‘z zimmalariga olgani tushuntirilgan.

Ushbu sharh faqatgina yuklangan tadqiqotda keltirilgan metodologiya, raqamli ma’lumotlar, rasmlar, natijalar va mualliflar muhokamasiga asoslanib tayyorlangan. PDF da mavjud bo‘lmagan klinik ta’sir, diagnostika muvaffaqiyati, dori samaradorligi, davolash kafolati, tijoriy qo‘llanilishi yoki bemorlar manfaati da’volari qo‘shilmagan.

Tadqiqotning asosiy ilmiy hissasi shundan iboratki, to‘liq uzunlikdagi yorliqsiz FHL2 yetarli miqdorda ishlab chiqarilishi mumkinligi, eritmada moslashuvchan konformatsion ansamblni hosil qilishi va to‘liq uzunlikdagi β-katenin bilan 2:1 nisbatda kompleks tuza olishi isbotlangan. Birikish yuzalarini, hujayra ichidagi stexiometriyani va biologik oqibatlarni aniqlash uchun yangi tajribalar talab etiladi.