Протеини чор ва нимдоменаи LIM 2, бо номи кӯтоҳи FHL2, як протеини танзимкунандаи модулӣ мебошад, ки метавонад дар дохили ҳуҷайра бисёр протеинҳоро ба ҳам пайваст кунад. Барои FHL2, ки метавонад байни ситоскелет, ифодаи генҳо ва роҳҳои сигнализатсияи ҳуҷайравӣ робита барқарор кунад, зиёда аз 90 шарики ҳамтаъсир муайян шудааст. Бо вуҷуди ин, истеҳсоли протеини пуррадарозии FHL2 ба миқдори кофӣ, дар шакли ҳалшаванда ва барои таҳлилҳои сохторӣ муносиб, муддати дароз мушкил буд. Ин душворӣ фаҳмидани он ки тамоми протеин дар маҳлул чӣ гуна рафтор мекунад ва бо шарикони муҳиме мисли β-катенин бо кадом тартиби молекулавӣ пайваст мешавад, маҳдуд кардааст.

Дар таҳқиқоте, ки аз ҷониби Tina Logonder, Uroš Prešern ва Aljaž Gaber анҷом дода шудааст, усуле таҳия гардид, ки имкон медиҳад протеини пуррадароз ва дар марҳилаи ниҳоӣ бидуни теги фюзионӣ FHL2 дар бактерияҳои Escherichia coli дар миқёси миллиграмм истеҳсол карда шавад. Муҳаққиқон тегҳои гуногуни ҳалшавиро муқоиса карданд, нишон доданд, ки фюзиони sfGFP миқдори аз ҳама зиёди протеини ҳалшавандаро таъмин мекунад ва барои дастгирии қатшавии дурусти доменҳои LIM-и дорои руҳ дар FHL2 сатҳи ZnCl₂-ро дар муҳити истеҳсолӣ оптимизатсия карданд.

Теги sfGFP сатҳи умумии ифодаи FHL2-ро дар бактерияҳо тақрибан 7 маротиба ва ҳиссаи онро дар фраксияи ҳалшаванда тақрибан 6,2 маротиба зиёд кард. Афзоиши умумии миқдори FHL2-и ҳалшаванда нисбат ба фраксияи ҳалшавандаи FHL2-и дорои теги His ба андозаи 45,3 ± 8,5 маротиба ҳисоб карда шуд. Таъминоти руҳ истеҳсоли протеини ҳалшавандаро зиёд кард, дар ҳоле ки сатҳҳои баланди руҳ афзоиши бактерияҳоро коҳиш доданд. Вақте ки ҳосили протеини ҳалшаванда ва афзоиши ҳуҷайраҳо якҷоя арзёбӣ шуданд, 250 ва 500 µM ZnCl₂ ҳамчун диапазони муносибтарин муайян гардиданд ва барои истеҳсоли миқёси калон 250 µM истифода шуд.

Дар анҷоми тозакунӣ FHL2-и бидуни тег бо тақрибан 90 фоиз покӣ, қобили консентратсия то 19 mg/mL ва ҳосили тақрибан 5,9 mg ба ҳар литри фарҳанг ба даст оварда шуд. Андозагириҳои дихроизми даврашакл нишон доданд, ки таркиби сохтори дуюмдараҷаи протеини тозашуда бо арзишҳои аз модели AlphaFold ҳисобшуда мувофиқ аст. Хроматографияи хориҷкунии андоза, ки бо парокандашавии статикӣии рӯшноӣ якҷоя карда шуд, нишон дод, ки FHL2 дар маҳлул асосан дар ҳолати якмолекулавӣ, яъне мономерӣ қарор дорад.

Натиҷаҳои парокандашавии рентгении кунҷи хурд нишон доданд, ки FHL2 мисли чӯбчаи сахт ва рост рафтор намекунад. Радиуси таҷрибавии гардиш 37,8 Å ва андозаи максималии молекулавӣ 137 Å чен карда шуд. Дар модели пурра кашидашудаи AlphaFold ин арзишҳо мутаносибан 50,7 ва 177 Å мебошанд. Ин фарқ нишон медиҳад, ки қисми муҳими молекулаҳои FHL2 дар маҳлул нисбат ба шакли кашидашуда конформатсияҳои фишурдатар ва хамшуда мегиранд.

Моделсозии интегратсионӣ, ки дар он маълумоти SAXS ва масс-спектрометрияи кросс-линкинг якҷоя истифода шуданд, мавҷудияти маҷмӯаҳои сохтории ба ҳам табдилшавандаро ба ҷойи як сохтори ягонаи собит дастгирӣ кард. Дар оилаҳои гуногуни модел 35–57 фоизи молекулаҳои FHL2 кашидашуда, 11–34 фоиз дар шакли фишурда хамшуда ва 12–54 фоизи боқимонда дар конформатсияҳои миёна тасниф шуданд. Ин чандирӣ метавонад шарҳ диҳад, ки FHL2 чӣ гуна мисли як чаҳорчӯбаи молекулавӣ амал мекунад, ки метавонад ба шарикони гуногуни протеинӣ ё ҳамзамон ба якчанд сатҳи ҳамтаъсир мутобиқ шавад.

Натиҷаи диққатҷалбкунандаи таҳқиқот таносуби пайвастшавии байни FHL2 ва β-катенин мебошад. Натиҷаҳои хроматографияи хориҷкунии андоза, парокандашавии статикӣии рӯшноӣ ва калориметрияи титркунии изотермалӣ нишон доданд, ки ба як молекулаи β-катенин ду молекулаи FHL2 пайваст шуда метавонанд. Массаи таҷрибавии молекулавии комплекс 140,2 kDa чен карда шуд; ин арзиш аз 117,7 kDa, ки барои комплекси 1:1 интизор меравад, баландтар буда, ба 149,8 kDa, ки барои комплекси иборат аз ду FHL2 ва як β-катенин ҳисоб шудааст, наздик буд.

Дар андозагириҳои калориметрӣ стехиометрияи пайвастшавӣ 2,040 ± 0,001 ва доимии диссотсиатсия 530 ± 30 nM муайян гардид. Ин арзиш нишон медиҳад, ки ҳамтаъсир қувваи пайвастшавии зермикромолярӣ дорад. Дар ҳоле ки ҳамтаъсир бо тамосҳои қавӣ ва мусоиди байнимолекулавӣ дастгирӣ мешавад, кам шудани озодии ҳаракати протеинҳо ҳангоми ташаккули комплекс хароҷоти энтропӣ ба вуҷуд овардааст.

Таҳқиқот нишон намедиҳад, ки FHL2 дар саратон ҳатман ҳадафи табобатшаванда аст ё комплекси 2:1 дар ҳамаи ҳуҷайраҳо бо ҳамин шакл ба вуҷуд меояд. Таҳқиқот ба таҷрибаҳои лабораторӣ бо протеинҳои рекомбинантии тозашуда ва моделсозии сохторӣ асос ёфтааст. Сохтори воқеии комплекс дар дохили ҳуҷайра, сатҳҳои пайвастшавӣ, он ки ду молекулаи FHL2 аз ҳамон минтақа ё минтақаҳои гуногун пайваст мешаванд ва ин тартиб ифодаи генҳоро чӣ гуна тағйир медиҳад, ҳанӯз мустақиман нишон дода нашудааст.

FHL2 чӣ гуна протеин аст?

Номи пурраи FHL2 “Four-and-a-half LIM domains protein 2” буда, маънояш протеини чор ва нимдоменаи LIM 2 мебошад. Протеин аз панҷ қисми модулӣ, яъне як нимдоменаи LIM ва чор доменаи пурраи LIM иборат аст. Дар тасвирҳои сохтории таҳқиқот ин қисмҳо LIM0, LIM1, LIM2, LIM3 ва LIM4 номгузорӣ шудаанд.

Ҳар як доменаи пурраи LIM аз ду ангушти руҳии пайдарпай иборат аст. Нимдоменаи LIM бошад як ангушти руҳӣ дорад. Ҳамин тавр, дар FHL2-и пуррадарозӣ дар маҷмӯъ нӯҳ ангушти руҳӣ мавҷуд аст. Байни доменҳои LIM пайдарпаҳои кӯтоҳ ва чандири пайвасткунанда, тақрибан аз нӯҳ аминокислота, ҷойгиранд.

Истилоҳи “ангушти руҳӣ” дар ин ҷо набояд бо протеинҳои классикии ангушти руҳӣ, ки ба DNA пайваст мешаванд, омехта карда шавад. Доменҳои LIM-и FHL2 асосан на барои пайвастшавӣ ба кислотаҳои нуклеинӣ, балки барои ташкили ҳамтаъсирҳои протеин-протеин истифода мешаванд. Ионҳои руҳ сохтори сеандозаи доменҳоро нигоҳ дошта, ба қатшавии дурусти протеин мусоидат мекунанд.

Барои FHL2 зиёда аз 90 шарики ҳамтаъсир гузориш шудааст. Дар байни онҳо:

• Омилҳои транскрипсионӣ ва ҳамкорони транскрипсионӣ,
• Ретсепторҳои мембранаи ҳуҷайра,
• Протеинҳои ситоскелет,
• Ферментҳо,
• Ҷузъҳои роҳҳои сигнализатсионӣ мавҷуданд.

Ин шабакаи васеи ҳамтаъсир FHL2-ро бештар ба як протеини адаптерӣ ё чаҳорчӯбавӣ табдил медиҳад, ки протеинҳои гуногунро дар як муҳити танзимкунанда ҷамъ меорад, на ба протеине, ки танҳо як реаксияи ферментативиро иҷро мекунад.

Чаро робитаи FHL2 бо саратон мураккаб аст?

Вазифаи ҳуҷайравии FHL2 вобаста ба бофта, навъи ҳуҷайра, шарикони ҳамтаъсир ва роҳи сигнализатсионии фаъолшуда тағйир ёфта метавонад. Тибқи адабиёте, ки дар таҳқиқот ҷамъбаст шудааст, FHL2 дар баъзе саратонҳо метавонад мисли онкогени дастгиркунандаи омос ва дар баъзе заминаҳо мисли протеини фурӯнишонандаи омос амал кунад.

Дар баъзе шаклҳои саратони синаи марбут ба BRCA1 ва дар саратони гепатоселлюлярӣ коҳиши ифодаи FHL2 гузориш шудааст. Баръакс, дар саратони меъда, колоректалӣ, шуши ғайриҳуҷайраи хурд, гардани бачадон, тухмдон, простата, аденокарциномаи дукталии ғадуди зери меъда, меланома ва баъзе навъҳои лейкемия афзоиши ифодаи FHL2 гузориш шудааст. Дар баъзе таҳқиқоти саратони сина, рӯдаи ғафс ва шуш сатҳи баланди FHL2 бо пешомади бад алоқаманд дониста шудааст.

Аммо ин маълумот натиҷаҳои нави клиникии таҷрибаи ҳозира нестанд. Муҳаққиқон намунаҳои беморон, афзоиши омос ё посух ба табобатро чен накардаанд. Аҳамияти таҳқиқот аз нуқтаи назари саратон дар он аст, ки робитаи сохтории FHL2 бо β-катенин метавонад ба фаҳмидани роҳи сигнализатсияи Wnt/β-катенин мусоидат кунад.

Ҷойгоҳи FHL2 дар роҳи сигнализатсияи Wnt/β-катенин

β-катенин протеинест, ки ду вазифаи муҳим — часпиши ҳуҷайраҳо ва танзими ифодаи генҳоро иҷро мекунад. Ҳангоми фаъол шудани роҳи сигнализатсияи Wnt, миқдор, фосфорилатсия, таҷзия ва интиқоли β-катенин ба ядрои ҳуҷайра тағйир ёфта метавонад. β-катенине, ки дар ядро ҷамъ мешавад, метавонад ба ифодаи генҳои муайяни ҳадаф таъсир расонад.

Қаблан гузориш шуда буд, ки FHL2 мустақиман ба β-катенин пайваст мешавад ва метавонад ба фосфорилатсия ва ҷойгиршавии ҳуҷайравии β-катенин таъсир расонад. Бо вуҷуди ин, таҳқиқоти пешина дар бораи он ки ду протеин аз кадом сатҳҳо пайваст мешаванд, пурра мувофиқ набуданд.

Як таҳқиқот зарур будани минтақаи N-терминалии β-катенин ва такрори якуми armadillo-ро гузориш карда буд, дар ҳоле ки таҳқиқоти дигар минтақаи ARM1–9 ва махсусан такрорҳои ARM3–8-ро пешбарӣ кардааст. Ҳамчунин гузориш шудааст, ки ҳазфи ҳар кадоме аз доменҳои LIM-и FHL2 метавонад ҳамтаъсирро ба таври ҷиддӣ коҳиш диҳад.

Яке аз сабабҳои муҳими ин ихтилофҳо метавонад он бошад, ки дар таҳқиқоти қаблӣ порчаҳои нопурраи β-катенин ё намунаҳои FHL2 бо тегҳои бузурги фюзионӣ ба мисли GST ва MBP истифода шудаанд. Теги калон метавонад чандирии протеинро маҳдуд кунад, сатҳи пайвастшавиро пӯшонад ё тафсири массаи воқеии молекулавии комплексро душвор созад.

Мушкилоти асосии техникӣ: Чаро истеҳсоли FHL2-и пуррадароз душвор аст?

Барои омӯзиши сохтор ва ҳамтаъсирҳои протеин, пеш аз ҳама бояд миқдори кофии протеини ҳалшаванда ва дуруст қатшуда ба даст оварда шавад. Барои FHL2 ин марҳила махсусан душвор аст. Сабабҳои асосӣ чунинанд:

• Протеин шумораи зиёди минтақаҳои координатсияи руҳ дорад.
• Норасоии руҳ метавонад ба қатшавии нопурраи доменҳои LIM оварда расонад.
• Протеинҳои нодуруст қатшуда метавонанд дар бактерия агрегатҳои ҳалнашаванда ташкил кунанд.
• Чандирии байнидомении FHL2 метавонад протеинро ба агрегация моил гардонад.
• Ҳангоми хориҷ кардани тегҳои калон, ки ҳалшавиро зиёд мекунанд, протеин метавонад дубора таҳшин шавад.

Кӯшишҳои аввалини муҳаққиқон барои истеҳсоли FHL2-и бидуни тег номуваффақ буданд. Бо вуҷуди санҷидани ҳарорати паст ва сатҳҳои гуногуни ZnCl₂, протеин асосан дар фраксияи ҳалнашаванда боқӣ монд. Кӯшишҳои дубора қат кардани протеини ҳалнашаванда низ миқдори назарраси FHL2-и ҳалшавандаро таъмин накарданд.

Тегҳои гуногуни фюзионӣ чӣ гуна муқоиса карда шуданд?

Барои зиёд кардани ҳалшавии FHL2 чор сохтори гуногун муқоиса карда шуданд:

• HT-FHL2: FHL2 бо теги His,
• GST-FHL2: FHL2-и бо глутатион S-трансфераза пайвастшуда,
• MBP-FHL2: FHL2-и бо протеини пайвасткунандаи мальтоза пайвастшуда,
• sfGFP-FHL2: FHL2-и бо протеини сабзи флуоресцентии суперқатшаванда пайвастшуда.

Тасвирҳои western blot дар Шакли 1A тақсимшавии ҳар як сохторро дар фраксияҳои ҳалшаванда ва ҳалнашаванда нишон медиҳанд. GST сатҳи умумии ифодаро зиёд кард, аммо таносуби ҳалшавиро беҳтар накард. Ҳатто ҳиссаи GST-FHL2 дар фраксияи ҳалшаванда нисбат ба сохтори His-тегдор камтар монд.

MBP миқдори умумии ифодаро ба таври назаррас тағйир надод, аммо таносуби протеини ҳалшавандаро 2,5 ± 0,7 маротиба зиёд кард. Беҳбудии бузургтарин дар фюзиони sfGFP мушоҳида шуд:

• Сатҳи умумии ифода 7,0 ± 0,7 маротиба зиёд шуд.
• Таносуби фраксияи ҳалшаванда 6,2 ± 1,6 маротиба зиёд шуд.
• Афзоиши умумии миқдори протеини ҳалшаванда ба 45,3 ± 8,5 маротиба расид.

Бо назардошти ин натиҷаҳо, барои истеҳсоли миқёси калон сохтори sfGFP-FHL2 интихоб шуд. sfGFP дар ин ҷо ҳамчун қисми протеини ниҳоии таҷрибавӣ боқӣ гузошта нашуд; пас аз кӯмак дар марҳилаи истеҳсол ва қатшавӣ, он бо протеазаи TEV бурида ва хориҷ карда шуд.

Чаро руҳ лозим буд ва чаро онро бе маҳдудият зиёд кардан мумкин набуд?

Бо назардошти он ки FHL2 нӯҳ ангушти руҳӣ дорад, мавҷудияти миқдори кофии Zn²⁺ дар дохили ҳуҷайра барои қатшавии дуруст муҳим аст. Муҳаққиқон ба муҳити истеҳсолӣ 0, 100, 250, 500 ва 1.000 µM ZnCl₂ илова карда, миқдори sfGFP-FHL2-и ҳалшавандаро муқоиса карданд.

Илова кардани ZnCl₂ ифодаи умумии протеинро ба таври назаррас тағйир надод, аммо миқдори протеинро дар фраксияи ҳалшаванда зиёд кард. Беҳбудӣ дар сатҳи 100 µM оғоз шуда, дар 250 ва 500 µM қавитар гардид.

Бо вуҷуди ин, руҳ дар консентратсияҳои баланд барои бактерияҳо заҳрнок аст. Арзишҳои OD₆₀₀, ки дар охири истеҳсол дар Шакли 1E чен шудаанд, нишон медиҳанд, ки бо зиёд шудани сатҳи ZnCl₂ афзоиши бактерияҳо кам шудааст. Коҳиши шадидтарини афзоиш дар 1.000 µM мушоҳида гардид.

Аз ин рӯ, на танҳо ба протеини ҳалшавандаи истеҳсолшуда ба ҳар ҳуҷайра, балки ба миқдори умумии протеини ҳалшавандае, ки аз як литр фарҳанг гирифтан мумкин аст, аҳамият дода шуд. Муқоисаи Шакли 1F нишон дод, ки сатҳҳои 250 ва 500 µM ZnCl₂ тавозуни муносибтаринро таъмин мекунанд. Барои истеҳсоли миқёси калон сатҳи 250 µM интихоб гардид, зеро он афзоиши ҳуҷайраҳоро камтар бозмедошт.

Раванди тозакунӣ чӣ гуна пеш рафт?

FHL2 шабона дар 18°C ифода карда шуд. Ҳарорати паст барои он истифода шуд, ки протеини дар бактерия синтезшаванда сусттар ва дурусттар қат шавад.

Тартиби тозакунӣ чунин буд:

1. sfGFP-FHL2-и дорои теги His аввал бо хроматографияи аффинӣи металлии иммобилизатсияшуда гирифта шуд.
2. Бо илова кардани протеазаи TEV пайванди байни sfGFP ва FHL2 бурида шуд.
3. Ҳангоми буриш намуна шабона диализ карда шуд.
4. sfGFP ва протеазаи TEV-и дорои теги His дар сутуни дуюми аффинӣи металлӣ нигоҳ дошта шуданд.
5. FHL2-и бидуни тег дар фраксияи ҷараён ҷамъоварӣ шуд.
6. Тозакунии ниҳоӣ ва ивазкунии буфер бо хроматографияи хориҷкунии андоза анҷом дода шуд.

Ҳангоми буриши TEV ва диализ миқдори назарраси таҳшиншавӣ ба амал омад ва пас аз сентрифугакунӣ дар абсорбсияи 280 nm тақрибан 50 фоиз коҳиш мушоҳида шуд. Ин ҳолат нишон медиҳад, ки sfGFP на танҳо истеҳсол, балки ҳалшаванда мондани баъзе молекулаҳои FHL2-ро низ дастгирӣ кардааст; ҳангоми хориҷ кардани тег молекулаҳои нодуруст қатшуда ё ноустувор метавонанд таҳшин шаванд.

Бо вуҷуди ин, протеини ҳалшавандаи боқимонда то тақрибан 90 фоиз пок карда шуд, то 19 mg/mL консентратсия карда шуд ва аз ҳар литри фарҳанг тақрибан 5,9 mg FHL2-и бидуни тег ба даст омад. Ин миқдор барои истифодаи усулҳое ба мисли SAXS, калориметрия ва масс-спектрометрия кофӣ буд.

Оё FHL2-и тозашуда воқеан дуруст қат шуда буд?

Дихроизми даврашакл барои чен кардани таносуби тахминии сохторҳои дуюмдараҷа, ба мисли алфа-спирал ва бета-қабат дар протеинҳо, истифода мешавад. Дар натиҷаи ҷудокунии маълумоти таҷрибавии CD:

Наздик будани таносубҳои таҷрибавӣ ва ҳисобшуда нишон дод, ки сохтори дуюмдараҷаи FHL2-и тозашуда дар маҷмӯъ бо қатшавии интизоршаванда мувофиқ аст.

FHL2 дар маҳлул мономер аст ё димер?

Дар хроматографияи хориҷкунии андоза пеш аз пики асосии мономер як пики хурди иловагӣ мушоҳида шуд. Азбаски ин пики барвақт ба сохтори тақрибан 64,4 kDa мувофиқ буд, дар аввал эҳтимол дода шуд, ки он димери FHL2 бошад.

Агар тавозуни воқеии мономер-димер вуҷуд дошта бошад, бо зиёд шудани консентратсияи протеин бояд миқдори димер зиёд ва мутаносибан таносуби мономер кам шавад. Муҳаққиқон барои санҷидани ин эҳтимол FHL2-ро дар диапазони 1–7 mg/mL, яъне тақрибан 31–218 µM, бо SEC-SLS таҳлил карданд.

Пики барвақт бо зиёд шудани консентратсияи протеин афзоиш ёфт, аммо дар пики мономер коҳиши мувофиқ мушоҳида нашуд. Тақсимшавии нисбии байни мономер ва пики барвақт дар консентратсияҳои санҷидашуда тағйир наёфт. Аз ин рӯ, пики барвақт ҳамчун гомодимери воқеии FHL2, ки дар маҳлул дар тавозун ташаккул ёфта ва ҷудо мешавад, тафсир нашуд.

Массаи молекулавии ченшудаи пики асосӣ ба арзиши назариявии 32,2 kDa наздик буд ва хулоса шуд, ки FHL2 дар маҳлул асосан мономер мебошад.

SAXS чандирии FHL2-ро чӣ гуна нишон дод?

Парокандашавии рентгении кунҷи хурд имкон медиҳад, ки бидуни кристаллизатсияи протеин дар бораи андозаҳои умумӣ, шакл ва чандирии он дар маҳлул маълумот гирифта шавад. Ин усул ҷойгиршавии дақиқи ҳар атомро мустақилона муайян намекунад, аммо метавонад нишон диҳад, ки молекула фишурда, кашидашуда ё чандир аст.

Дар графики Kratky-и Шакли 3A каҷи FHL2 аз профили зангӯлашакли BSA, ки протеини сахт ва курашакл аст, ба таври равшан фарқ мекард. Идомаи васеи каҷи FHL2 дар арзишҳои баланд нишон медиҳад, ки протеин чандирии назаррас дорад.

Каҷи назариявии SAXS, ки аз сохтори пурра кашидашудаи модели AlphaFold ҳисоб шуд, ба маълумоти таҷрибавӣ мувофиқати хуб нишон надод. Арзиши χ² барои мувофиқати якмоделӣ 15,231 буд. Ин номувофиқати баланд нишон медиҳад, ки ҳамаи молекулаҳои FHL2 дар маҳлулро бо як сохтори ягона ва пурра кашидашуда ифода кардан мумкин нест.

Арзишҳои R_g ва D_max чиро нишон медиҳанд?

Радиуси гардиш, R_g, нишон медиҳад, ки массаи молекулавӣ дар атрофи марказ то чӣ андоза паҳн шудааст. Арзиши калони R_g одатан ба сохтори бештар кашидашуда ва арзиши хурд ба сохтори фишурдатар ишора мекунад.

Андозаи максималӣ, D_max, масофаи тахминии калонтарин байни ду нуқтаи аз ҳам дуртарини молекуларо ифода мекунад.

Камтар будани ҳар ду арзиши таҷрибавӣ нисбат ба модели кашидашуда нишон медиҳад, ки протеин дар маҳлул ба ҳисоби миёна маҷмӯаи сохтории кӯтоҳтар ва фишурдатарро ташкил медиҳад.

Дар тақсимоти масофаҳои ҷуфтӣ дар атрофи 22,5 Å пики равшан мушоҳида шуд. Ин масофа бо андозаи хоси як доменаи LIM мувофиқ аст. Ба 137 Å расидани думи дарози тақсимот нишон медиҳад, ки FHL2 комилан курашакл нест, балки меъмории бисёрдоменӣ дорад, ки дар маҷмӯъ кашидашуда, вале бо дараҷаҳои гуногун хамшаванда аст.

Чаро ба ҷойи як сохтор “маҷмӯаи конформатсионӣ” истифода шуд?

Протеинҳои чандир дар маҳлул дар як шакли собит намемонанд. Як молекулаи протеин метавонад бо гузашти вақт ба сохторҳои кушодатар, бештар хамшуда ё миёна гузарад. Аз ин рӯ, тавсифи протеини чандир танҳо бо як модели сеандоза метавонад гумроҳкунанда бошад.

Муҳаққиқон маълумоти SAXS-ро бо маҳдудиятҳои масофавии аз масс-спектрометрияи кросс-линкинг гирифташуда якҷоя карданд. Дар усули XL-MS минтақаҳои протеин, ки ба ҳам наздиканд, кимиёвӣ кросс-линк мешаванд. Сипас бо масс-спектрометрия муайян карда мешавад, ки кадом ҷуфтҳои аминокислотаҳо пайваст шудаанд. Агар дар модел ду боқимонда аз масофае, ки кросс-линкер метавонад фаро гирад, хеле дур бошанд, модел бо он маҳдудияти таҷрибавӣ мувофиқ нест.

Барои моделсозӣ ду намунагирии RRT ва як намунагирии BioEmu истифода шуданд. Ин се равиш мутаносибан тақрибан 10.315, 10.404 ва 9.461 конформатсияи гуногуни FHL2 тавлид карданд. Ҳамин тавр, тақрибан 30 ҳазор имконияти сохтории гуногун арзёбӣ шуд.

Моделҳо мувофиқи дараҷаи мувофиқат ба каҷи SAXS ва иҷрои маҳдудиятҳои XL-MS баҳогузорӣ шуданд. 104 маҷмӯае, ки холҳои ҳамгирошудаи онҳо 0,887 ё бештар буд, интихоб шуданд; сипас онҳо аз рӯйи монандии сохторӣ ба 28 маҷмӯаи гуногун ва дар марҳилаи ниҳоӣ ба панҷ оилаи асосӣ ҷудо карда шуданд.

Панҷ оилаи сохторӣ чиро нишон доданд?

Дар Шакли 4 панҷ оилаи маҷмӯавӣ нишон дода шудаанд, ки онҳоро лидерҳои рақами як, ду, чор, чордаҳ ва бисту панҷ намояндагӣ мекунанд. Арзишҳои χ² барои мувофиқати SAXS дар ин оилаҳо аз 2,302 то 2,512 тағйир ёфтанд. Ин арзишҳо нисбат ба арзиши 15,231-и модели ягонаи кашидашудаи AlphaFold мувофиқати хеле беҳтарро нишон медиҳанд.

Ҳар як маҷмӯа ҳамзамон 57,4–69,6 фоизи 46 кросс-линки XL-MS-ро қонеъ кард. Нотавонии як маҷмӯаи ягона барои қонеъ кардани ҳамаи кросс-линкҳо бо сохтори доимо ҳаракаткунандаи протеин мувофиқ аст. Ҳангоми арзёбии маҷмӯаҳои гуногун дар якҷоягӣ, аз 46 кросс-линк 43-тоаш ҳадди ақал аз ҷониби як маҷмӯа қонеъ карда шуд. Танҳо тақрибан 6 фоизи онҳо шарҳ дода нашуданд.

Моделҳо аз рӯйи арзишҳои R_g ба се гурӯҳ ҷудо шуданд:

• Конформатсияи хамшуда: R_g аз 75 фоизи модели AlphaFold хурдтар; тақрибан аз 38,0 Å камтар.
• Конформатсияи кашидашуда: R_g аз 90 фоизи модели AlphaFold калонтар; тақрибан аз 45,6 Å бештар.
• Конформатсияи миёна: Сохторҳое, ки байни ин ду ҳад қарор доранд.

Аз рӯйи панҷ оилаи маҷмӯавӣ тақсимот дар чунин диапазонҳо буд:

• Конформатсияҳои кашидашуда: %35–57,
• Конформатсияҳои фишурда ва хамшуда: %11–34,
• Конформатсияҳои миёна: %12–54.

Ин натиҷа нишон медиҳад, ки FHL2 гарчанде тақрибан нисфи вақт метавонад шаклҳои кашидашуда гирад, танҳо як чӯбчаи рост ва сахт нест. Қисми назарраси молекулаҳо метавонанд ба тарафи худ хам шаванд.

Чаро чандирӣ барои вазифаи FHL2 муҳим буда метавонад?

FHL2-ро метавон ҳамчун бозуи чандири молекулавӣ бо нуқтаҳои гуногуни пайвастшавӣ тасаввур кард. Чӯбчаи сахт танҳо ба протеинҳои дорои геометрияи муайян пайваст шуда метавонад. Протеини чандир бошад метавонад кунҷҳои байни доменҳояшро тағйир дода, ба шарикони андоза ва мавқеи гуногун мутобиқ шавад.

Чор доменаи пурра ва як нимдоменаи LIM-и FHL2 метавонанд сатҳҳои сершумори ҳамтаъсирро ташкил диҳанд, ки протеинҳои гуногунро ҳамзамон нигоҳ медоранд. Пайвасткунандаҳои кӯтоҳи байни доменҳо ба протеин чандирии беохир не, балки назоратшаванда медиҳанд. Ин хусусият метавонад:

• Ҷамъ овардани якчанд протеинро дар дохили як комплекс,
• Ташкили тартибҳои гуногуни пайвастшавӣ дар роҳҳои гуногуни сигнализатсионӣ,
• Гузариши протеин ба сохтори муназзамтар ҳангоми пайвастшавӣ,
• Ташаккули тамосҳои муваққатӣ байни минтақаҳои дурро таъмин кунад.

Аммо таҳқиқот нишон надодааст, ки конформатсияи муайян вазифаи мушаххаси ҳуҷайравиро мустақиман иҷро мекунад. Тафсири он ки чандирӣ вазифаи чаҳорчӯбавиро осон мекунад, шарҳи механистиест, ки бо маълумоти таҷрибавӣ мувофиқ мебошад.

Ҳамтаъсири мустақими байни FHL2 ва β-катенин чӣ гуна нишон дода шуд?

Аввал FHL2 ва β-катенин алоҳида ва дар шакли омехта ба хроматографияи хориҷкунии андоза дода шуданд. Ҳангоми якҷоя додани ду протеин, дар ҳаҷми камтари элюсия пики нав пайдо шуд ва андозаи пикҳои протеинҳои алоҳида кам гардид.

Дар хроматографияи хориҷкунии андоза комплексҳои молекулавии калонтар аз сутун барвақттар мебароянд. Аз ин рӯ, пайдо шудани пики нав дар ҳаҷми камтари элюсия нишон медиҳад, ки FHL2 ва β-катенин комплекси калонтар ташкил мекунанд.

Дар таҳлили SDS-PAGE-и фраксияҳои аз пики нав гирифташуда ҳам банди β-катенин ва ҳам банди FHL2 мушоҳида шуданд. Ин натиҷа тасдиқ кард, ки ду протеин дар як фраксияи хроматографӣ якҷоя ҳастанд ва комплекси устувор ташкил мекунанд.

Стехиометрияи ғайричашмдошти 2:1 чӣ гуна муайян карда шуд?

Усули SEC-SLS массаи молекулавиро мустақиман бо истифода аз хусусиятҳои парокандакунии рӯшноии молекулаҳое, ки аз пики хроматографӣ мегузаранд, тахмин мекунад. Арзишҳои ченшуда ва назариявӣ дар таҳқиқот чунинанд:

Массаи назариявии комплекси 1:1 аз як FHL2 ва як β-катенин 117,7 kDa аст. Арзиши ченшудаи 140,2 kDa аз ин арзиш ба таври равшан баландтар аст. Баръакс, он ба арзиши интизоршавандаи 149,8 kDa барои ду FHL2 ва як β-катенин наздиктар мебошад.

Аз ин рӯ, хулоса шуд, ки сохтори бартаридоштаи комплекс:

\[ 2\,\mathrm{FHL2}+1\,\beta\text{-katenin} \]

мебошад. Ин намоиш муодилаи реаксияи кимиёвӣ нест, балки ифодаи стехиометрии таркиби молекулавии комплекс аст.

Чаро бо тағйир ёфтани таносуби протеинҳо комплекс тағйир ёфт?

Ҳангоми тағйир додани консентратсияҳои FHL2 ва β-катенин массаи ченшудаи комплекс низ тағйир ёфт:

• 4 mg/mL FHL2 + 4 mg/mL β-катенин: 140,2 kDa; бо комплекси 2:1 мувофиқ.
• 4 mg/mL FHL2 + 1 mg/mL β-катенин: 113,9 kDa; тақрибан бо комплекси 1:1 мувофиқ.
• 2 mg/mL FHL2 + 2 mg/mL β-катенин: Массае, ки дар тӯли пик тақрибан байни 125–135 kDa тағйир меёбад; маҷмӯаи гетерогенӣ байни тартибҳои 1:1 ва 2:1.

Ин бозёфт нишон медиҳад, ки ташаккули комплекси 2:1 метавонад ба консентратсияи мутлақи протеинҳо ва таносуби онҳо нисбат ба якдигар вобаста бошад. Комплекс дар ҳамаи шароитҳо ҳамчун як сохтори ягона ва тағйирнопазир мавҷуд набуд.

ITC қувва ва таносуби пайвастшавиро чӣ гуна тасдиқ кард?

Калориметрияи титркунии изотермалӣ гармии хориҷшуда ё ҷаббидашударо ҳангоми пайваст шудани ду молекула чен мекунад. Муҳаққиқон 276 µM FHL2-ро ба ҳуҷайрае, ки 13,8 µM β-катенин дошт, титр карданд ва каҷи пайвастшавиро бо модели минтақаҳои якнавъи пайвастшавӣ арзёбӣ карданд.

Натиҷаҳои ITC:

Термодинамикаи пайвастшавӣ чиро нишон медиҳад?

Барои шарҳ додани робитаи байни арзишҳои термодинамикии таҳқиқот аз муодилаи асосии энергияи озод истифода мешавад:

\[ \Delta G=\Delta H-T\Delta S \]

Дар ин ҷо:

• ΔG, тағйироти умумии энергияи озоди Гиббсро,
• ΔH, тағйироти энталпии марбут ба пайвандҳо ва тамосҳои байнимолекулавиро,
• T, ҳарорати мутлақро,
• ΔS, тағйироти бетартибӣ ва озодии ҳаракати системаро ифода мекунад.

Натиҷаҳои таҳқиқот арзиши −TΔS-ро 22,8 kcal/mol медиҳанд. Ҳангоми истифодаи ин намоиш робита чунин хонда мешавад:

\[ \Delta G=\Delta H+(-T\Delta S) \]

\[ \Delta G\approx-31{,}4+22{,}8=-8{,}6\ \mathrm{kcal/mol} \]

Ин арзиш бо натиҷаи гузоришшудаи −8,57 kcal/mol мувофиқ аст. ΔH-и хеле манфӣ нишон медиҳад, ки байни FHL2 ва β-катенин шумораи зиёди тамосҳои мусоиди байнимолекулавӣ ба вуҷуд меоянд. −TΔS-и мусбат бошад нишон медиҳад, ки ҳангоми пайвастшавӣ озодии ҳаракат ва конформатсияи протеинҳо кам мешавад.

Маҳдуд шудани FHL2-и чандир ба конформатсияҳои муайян ҳангоми пайвастшавӣ ба β-катенин яке аз шарҳҳои эҳтимолии хароҷоти энтропӣ мебошад. Инчунин мумкин аст минтақаҳои бетартиби N- ва C-терминалии β-катенин ҳангоми ташаккули комплекс муназзамтар шаванд. Аммо азбаски таҳқиқот сохтори атомии пас аз пайвастшавиро ҳал накардааст, мустақиман нишон дода нашудааст, ки кадом минтақаҳо муназзам мешаванд.

Чаро дар ҳоле ки як ҳодисаи пайвастшавӣ дида шуд, таносуб 2:1 баромад?

Гарчанде каҷи ITC нишон дод, ки тақрибан ду FHL2 пайваст мешаванд, он ба ҷойи ду гузариши алоҳидаи термодинамикӣ як ҳодисаи бартаридоштаи пайвастшавиро нишон дод. Муҳаққиқон инро бо эҳтимоли он шарҳ медиҳанд, ки ду минтақаи пайвастшавии FHL2 дар β-катенин метавонанд энергияҳои монанди пайвастшавӣ дошта бошанд.

Эҳтимоли дигар ин аст, ки пайваст шудани FHL2-и аввал пайвастшавии FHL2-и дуюмро осон кунад ё дар дохили комплекс тамоси FHL2-FHL2 ба вуҷуд ояд. Таҳқиқот ин имконотро аз ҳам ҷудо накардааст.

Барои комплекси 2:1 ду модели асосӣ матраҳ карда шудаанд:

• Дар β-катенин мавҷуд будани якчанд сатҳи пайвастшавӣ, ки ҳамзамон ду молекулаи алоҳидаи FHL2-ро нигоҳ медоранд,
• Пас аз пайваст шудани як FHL2, молекулаи дуюми FHL2 дар дохили комплекс бо FHL2-и аввал робита барқарор кунад.

Набудани олигомеризатсияи вобаста ба консентратсия дар FHL2-и танҳо нишон медиҳад, ки эҳтимоли дуюм танҳо дар муҳити комплексие, ки β-катенин ба вуҷуд меорад, рух дода метавонад.

Чаро натиҷаи қаблии 1:1 метавонад аз натиҷаи 2:1-и ин таҳқиқот фарқ кунад?

Дар як таҳқиқоти қаблии ITC барои FHL2 ва β-катенин стехиометрияи 1:1 ва K_d-и 1,08 µM гузориш шуда буд. Аммо дар он таҷриба:

• Ба ҷойи β-катенини пуррадароз сохтори буридашудаи 138–781 аминокислотаӣ,
• Ба ҷойи FHL2-и бидуни тег фюзиони MBP-FHL2 истифода шуда буд.

Минтақаи хориҷшудаи N-терминалии β-катенин метавонад ба сатҳи дуюми пайвастшавӣ саҳм гузорад. Ба ҳамин монанд, теги калони MBP метавонад хамшавии FHL2 ё наздик шудани молекулаи дуюми FHL2 ба комплексро аз ҷиҳати стерикӣ маҳдуд карда бошад.

Таҳқиқоти ҳозира бо истифодаи β-катенини пуррадароз ва FHL2-и пуррадарози бидуни тег тарҳи таҷрибавии бештар ба ҳолати табиӣ монандро ба вуҷуд овардааст. Бо вуҷуди ин, ин натиҷа низ аз системаи in vitro бо протеинҳои тозашуда гирифта шудааст; стехиометрия дар дохили ҳуҷайра бояд алоҳида тасдиқ карда шавад.

Шакли 1 чиро нишон медиҳад?

Қисми чапи Шакли 1 таъсири тегҳои гуногуни фюзиониро ба истеҳсоли FHL2 нишон медиҳад. Бандҳои western blot ва графикҳои сутуние, ки аз онҳо ҳисоб шудаанд, нишон медиҳанд, ки sfGFP ҳам аз ҷиҳати ифодаи умумӣ ва ҳам фраксияи ҳалшаванда ба таври равшан натиҷаи беҳтарин додааст.

Қисми рости шакл оптимизатсияи ZnCl₂-ро нишон медиҳад. Бо зиёд шудани руҳ миқдори sfGFP-FHL2-и ҳалшаванда афзоиш ёфт, аммо афзоиши бактерияҳо, ки бо OD₆₀₀ чен шуд, кам гардид. Аз ҷиҳати миқдори протеини ҳалшаванда ба ҳар литр, сатҳҳои 250 ва 500 µM ҳосили баландтаринро таъмин карданд.

Шакли 2 чиро нишон медиҳад?

Каҷи CD ва ҷадвали сохтори дуюмдараҷа дар Шакли 2A нишон медиҳанд, ки FHL2-и тозашуда таркиби умумии сохтории интизоршавандаро дорад. Дар Шакли 2B каҷҳои SEC-SLS дар консентратсияҳои гуногуни FHL2 дар як ҳаҷми асосии элюсия ҷамъ мешаванд ва массаи молекулавии ченшуда бо мономер мувофиқ мемонад.

Ин шакл дастгирӣ мекунад, ки усули истеҳсол на танҳо протеини ҳалшаванда истеҳсол кардааст, балки намунае ба даст омадааст, ки қатшуда буда, дар консентратсияҳои баланд агрегацияи намоён нишон намедиҳад.

Шакли 3 чиро нишон медиҳад?

Графики Kratky дар Шакли 3A чандирии FHL2-ро бо BSA муқоиса мекунад. Шакли 3B модели кашидашудаи AlphaFold ва андозаҳои тахминии доменҳои LIM-ро нишон медиҳад. Дар Шакли 3C дида мешавад, ки ин модели ягона ба маълумоти таҷрибавии SAXS хуб мувофиқ нест.

Тақсимоти масофаҳои ҷуфтӣ дар Шакли 3D дар атрофи 22,5 Å пик дорад ва то 137 Å идома меёбад. Ин нишон медиҳад, ки гарчанде доменҳои алоҳидаи LIM фишурдаанд, тамоми протеин тартиби кашидашуда ва хамшаванда дорад.

Шакли 4 ва Шакли 5 чиро нишон медиҳанд?

Шакли 4 панҷ оилаи гуногуни маҷмӯаҳои конформатсиониро нишон медиҳад, ки ҳамзамон ба маълумоти SAXS ва XL-MS мувофиқанд. Дар ҳар сатр мувофиқати SAXS, кросс-линкҳои қонеъшуда ва сохторҳои намояндагии дар он маҷмӯа мавҷудбуда якҷоя дода шудаанд.

Дар ҳеҷ яке аз моделҳо танҳо як шакли протеин бартарӣ надорад. Дар дохили ҳамон маҷмӯа моделҳои рост, қисман хамшуда ва ба таври намоён фишурда якҷоя мавҷуданд.

Шакли 5 фоизи ҳолатҳои кашидашуда, миёна ва хамшударо дар ҳар оилаи маҷмӯавӣ ба таври ҷамъбастӣ нишон медиҳад. Дар ҳамаи панҷ оила мавҷуд будани конформатсияи хамшуда нишон медиҳад, ки шаклҳои фишурда танҳо сохторҳои истисноие нестанд, ки ҳангоми моделсозӣ пайдо шудаанд.

Шакли 6 чиро нишон медиҳад?

Дар Шакли 6A ҳангоми якҷоя додани FHL2 ва β-катенин пики нави хроматографӣ пайдо мешавад. Гели дар поён буда тасдиқ мекунад, ки дар пики нав ҳар ду протеин мавҷуданд.

Дар Шакли 6B массаи молекулавии ченшудаи комплекс, яъне 140,2 kDa, бо арзиши ҳисобшудаи 149,8 kDa барои ду FHL2 ва як β-катенин муқоиса карда шудааст.

Шакли 6C термограммаи ITC мебошад, ки пикҳои ҷараёни гармиро дар ҳар як инъексияи FHL2 нишон медиҳад. Дар Шакли 6D арзишҳои ҳамгирошудаи гармӣ бо таносуби молярӣ муқоиса шуда, натиҷаи n = 2,040 ва K_d = 530 nM ба даст омадааст.

Аҳамияти таҳқиқот аз нуқтаи назари гузашта, имрӯз ва оянда

Аз нуқтаи назари гузашта таҳқиқот барои мушкилоти истеҳсолие, ки таҳлили сохтории FHL2-и пуррадарозро маҳдуд мекард, роҳҳал пешниҳод мекунад. Таҳқиқоти қаблӣ бештар бо намунаҳои FHL2-и дорои тегҳои бузурги фюзионӣ ё бо миқдори хеле кам бадастомада анҷом дода мешуданд.

Аз нуқтаи назари имрӯз таҳқиқот ба таври таҷрибавӣ нишон медиҳад, ки FHL2 дар маҳлул протеини мономерӣ, вале хеле чандир аст. Ҳамин тавр, маълум мешавад, ки тасвири FHL2 танҳо ҳамчун сохтори сахте, ки доменҳояш хаттӣ ҷойгир шудаанд, нокифоя аст.

Таҳқиқот инчунин нишон медиҳад, ки ҳангоми истифодаи протеинҳои пуррадароз ва бидуни тег комплекси 2:1 бо β-катенин ба вуҷуд омада метавонад. Ин натиҷа ба мавҷудияти тартиби пайвастшавии сервалентие ишора мекунад, ки қаблан дар комплексҳои сигнализатсияи Wnt/β-катенин ба назар гирифта нашуда буд.

Аз нуқтаи назари оянда минтақаҳои дақиқи тамоси байни FHL2 ва β-катенин бояд муайян карда шаванд. Барои ин метавон аз крио-микроскопияи электронӣ, NMR, таҷрибаҳои нави XL-MS, мубодилаи гидроген-дейтерий, таҳлили мутатсионӣ ва усулҳои тасвиргирии дохилиҳуҷайравӣ истифода кард.

Инчунин бояд муайян карда шавад, ки ду молекулаи FHL2:

• Ба ду минтақаи рӯи як сатҳи β-катенин пайваст мешаванд ё не,
• Ба ду минтақаи аз ҳам дур пайваст мешаванд ё не,
• Бо якдигар тамос гирифта пайваст мешаванд ё не,
• Ба таври пайдарпай ё ҳамзамон пайваст мешаванд.

Таҳқиқоти сохтории монандро метавон барои комплексҳои FHL2 дар дигар роҳҳои сигнализатсионӣ, аз ҷумла PI3K/AKT/mTOR, MAPK/ERK ва TGF-β низ татбиқ кард.

Маъно барои ҳаёти рӯзмарра ва саломатӣ

Ин таҳқиқот мустақиман дору, санҷиши ташхисӣ ё табобат таҳия накардааст. Он натиҷаи фавран татбиқшаванда дар ҳаёти рӯзмарра пешниҳод намекунад. Аҳамияти он дар сатҳи бунёдӣ аст: шарҳ медиҳад, ки протеини танзимкунандае, ки бо саратон, бемориҳои дил ва посухҳои бофтаҳо алоқаманд дониста мешавад, чӣ гуна шакл иваз мекунад ва бо протеини муҳими сигнализатсионӣ бо кадом таносуб муттаҳид мешавад.

Барои таҳияи табобатҳои ҳадафманд ба бемориҳо, донистани танҳо миқдори як протеин кофӣ нест; бояд донист, ки он бо кадом шарики молекулавӣ, аз кадом сатҳ ва бо кадом стехиометрия пайваст мешавад. Ин таҳқиқот қисми асоси сохториро барои таҳқиқоти оянда, ки ҳамтаъсири FHL2-β-катенинро ҳадаф мегиранд, таъмин мекунад.

Бо вуҷуди ин, нишон дода нашудааст, ки вайрон кардани комплекси 2:1 саратонро суст мекунад, боздоштани FHL2 бехатар аст ё ин ҳамтаъсир метавонад ҳамчун ҳадафи табобатӣ дар беморон истифода шавад.

Ҷиҳатҳои қавии таҳқиқот

• FHL2-и пуррадароз ва дар марҳилаи ниҳоӣ бидуни тег дар миқёси миллиграмм истеҳсол шудааст.
• Тегҳои гуногуни фюзионӣ ба таври таҷрибавӣ муқоиса шудаанд.
• Таъсирҳои муқобили таъминоти руҳ ба ҳалшавӣ ва афзоиши бактерияҳо якҷоя арзёбӣ шудаанд.
• Қатшавии протеини тозашуда бо CD санҷида шудааст.
• Ҳолати олигомерӣ бо SEC-SLS дар консентратсияҳои гуногун таҳқиқ шудааст.
• Чандирӣ бо SEC-SAXS мустақиман таҷрибавӣ арзёбӣ шудааст.
• Маълумоти SAXS бо маҳдудиятҳои XL-MS ҳамгиро карда шудааст.
• Бо арзёбии даҳҳо ҳазор конформатсия аз тафсири яксохторӣ канорагирӣ шудааст.
• Ҳамтаъсири FHL2-β-катенин бо усулҳои пурракунандаи SEC, SDS-PAGE, SEC-SLS ва ITC тасдиқ шудааст.
• Стехиометрия бо ду усули мустақили миқдорӣ ҳамчун 2:1 дастгирӣ шудааст.
• Қисми муҳими маълумоти SAXS, протеомика ва моделсозӣ ба анборҳои кушодаи маълумот гузошта шудааст.

Маҳдудиятҳои таҳқиқот

• Таҳқиқот preprint мебошад ва аз арзёбии ҳамсолон нагузаштааст.
• Таҷрибаҳо бо протеинҳои рекомбинантии тозашуда дар муҳити in vitro анҷом дода шудаанд.
• Стехиометрияи 2:1 дар ҳуҷайраҳои зинда мустақиман тасвир карда нашудааст.
• Сатҳҳои дақиқи пайвастшавии FHL2 ва β-катенин харитасозӣ нашудаанд.
• Маълум нест, ки ду молекулаи FHL2 бо механизмҳои якхела ё гуногуни пайвастшавӣ ба комплекс ҳамроҳ мешаванд.
• SAXS маълумоти умумии шаклро бо ҳалнокии паст медиҳад; сохтори атомӣ таъмин намекунад.
• Моделсозии интегратсионӣ на як сохтори ягонаи беназир, балки сохторҳои эҳтимолии мувофиқ бо маълумоти таҷрибавиро тавлид мекунад.
• Маҷмӯаҳои алоҳида ҳамзамон танҳо 57,4–69,6 фоизи кросс-линкҳои XL-MS-ро қонеъ карданд.
• Тақрибан 50 фоиз талафи протеин ҳангоми хориҷ кардани sfGFP нишон медиҳад, ки қисми протеин дар раванди истеҳсол ноустувор мондааст.
• Истеҳсоли протеинҳо дар бактерияҳо маънои набудани тағйироти посттранслятсионии ҳуҷайраҳои инсонро дорад.
• Таъсири фосфорилатсия ё дигар тағйироти ҳуҷайравӣ ба стехиометрия таҳқиқ нашудааст.
• Таҳқиқот генҳои ҳадафи ҳуҷайравии Wnt, афзоиши омос ё посух ба табобатро чен накардааст.

Дар матни preprint баъзе мушкилоти шаклии гузоришдиҳӣ низ мавҷуданд. Дар ҷойҳои зиёд ибораи “Error! Reference source not found.” боқӣ мондааст, майдони DOI барои маълумоти иловагӣ пур нашудааст ва дар баъзе рӯйхатҳои усул консентратсияҳо такрорӣ ё номувофиқ навишта шудаанд. Дар шарҳи Шакли 1 ҳадҳои аҳамият бо шакли “* p ≤ 0,5; ** p ≤ 0,1; *** p ≤ 0,001” дода шудаанд. Азбаски ду ҳади аввал бо ҳадҳои маъмул дар нашрияҳои илмӣ мувофиқ ба назар намерасанд, ин арзишҳо ҷузъиёти гузоришдиҳӣ мебошанд, ки бояд дар версияи баъдии preprint тасдиқ шаванд. Дар ин ҷо таҳқиқот ислоҳ нашуда, ҳолати дар матн гузоришшуда айнан ба назар гирифта шудааст.

Таҳқиқот чӣ мегӯяд?

• Фюзиони sfGFP ва таъминоти мувофиқи руҳ истеҳсоли FHL2-и ҳалшавандаро дар бактерияҳо ба таври қавӣ зиёд карданд.
• FHL2-и пуррадарози бидуни тег дар миқёси миллиграмм тоза карда шуд.
• Сохтори дуюмдараҷаи FHL2-и тозашуда бо модели интизоршаванда мувофиқ аст.
• FHL2 дар маҳлул асосан мономер аст.
• FHL2 протеини сахт ва пурра кашидашуда нест.
• Протеин байни конформатсияҳои кашидашуда, миёна ва фишурдаи хамшуда тақсим мешавад.
• FHL2 ва β-катенин мустақиман ва бо аффинитети поёнтар аз микромоляр пайваст мешаванд.
• Бо протеинҳои пуррадарози бидуни тег стехиометрияи бартаридоштаи комплекс 2 FHL2:1 β-катенин мебошад.
• Пайвастшавӣ бо тамосҳои мусоиди байнимолекулавӣ роҳандозӣ мешавад, аммо талафи озодии конформатсионӣ ба вуҷуд меорад.

Таҳқиқот чӣ намегӯяд?

• Нишон намедиҳад, ки комплекси 2:1 ҳатман дар ҳамаи навъҳои ҳуҷайра ба вуҷуд меояд.
• Ҷойҳои дақиқи пайвастшавии ду FHL2 дар β-катенинро муайян намекунад.
• Сохтори комплексро бо ҳалнокии атомӣ пешниҳод намекунад.
• Нишон намедиҳад, ки FHL2 дар ҳамаи саратонҳо онкоген ё дар ҳамаи саратонҳо фурӯнишонандаи омос аст.
• Нишон намедиҳад, ки боздоштани ҳамтаъсири FHL2-β-катенин табобат фароҳам меорад.
• Ягон номзади доруӣ, профили бехатарӣ ё натиҷаи клиникиро арзёбӣ намекунад.
• Тасдиқи ташхисӣ ё пешгӯишавандаро дар беморон пешниҳод намекунад.

Усул ва Натиҷаҳои Таҳқиқот

Ҷараёни кори таҷрибавӣ

Шароити истеҳсоли протеин

• Ҳуҷайраи мизбон: E. coli BL21(DE3).
• Муҳити парвариш: LB.
• Индуксияи FHL2: 0,25 mM IPTG.
• Индуксияи β-катенин: 1 mM IPTG.
• ZnCl₂ дар истеҳсоли миқёси калони FHL2: 250 µM.
• Ҳарорат пас аз индуксия: 18°C.
• Давомнокии индуксия: Шабона.
• Пайдарпаии буриши TEV байни FHL2 ва sfGFP: ENLYFQ↓G.

Шароити андозагирии SAXS

• Консентратсияи намунаи FHL2: 7,5 mg/mL.
• Ҳаҷми инъексия: 100 µL.
• Сутун: Superdex 200 Increase 10/300 GL.
• Суръати ҷараён: 0,7 mL/дақиқа.
• Хатти нур: PETRA III, P12, DESY Hamburg.
• Энергияи рентгенӣ: 9 keV.
• Бастаи таҳлил: ATSAS 4.1.0.
• Маълумоти кунҷи пасттар аз 0,01 Å⁻¹ бинобар хатари артефакти таҷрибавӣ хориҷ карда шуданд.

Ҷузъиёти XL-MS ва моделсозӣ

• Консентратсияи FHL2: 23,36 µM.
• Консентратсияи кросс-линкери BS3: 697 µM.
• Кросс-линкинг: 10 дақиқа дар 25°C.
• Қатъи реаксия: 100 mM Tris-HCl, pH 8,0.
• Ҳазми протеин: Трипсин.
• Масс-спектрометр: Orbitrap Fusion Lumos.
• Кросс-линкҳои лизини байнидоменӣ, ки дар моделсозӣ истифода шуданд: 46.
• Ҳади интихоби беҳтарин маҷмӯа: Холи ҳамгирошуда ≥ 0,887.
• Шумораи маҷмӯаҳои интихобшуда: 104.
• Шумораи маҷмӯаҳои гуногун пас аз содасозии сохторӣ: 28.
• Шумораи ниҳоии оилаҳои маҷмӯавӣ: 5.

Натиҷаҳои асосии миқдорӣ

Тафсири ҷамъбастии техникии маълумот

• Маҳдудияти асосии истеҳсоли FHL2 қатшавии вобаста ба руҳ ва майли протеин ба агрегация мебошад.
• sfGFP дар ҷараёни истеҳсол шарики фюзионии аз ҳама самаранок барои зиёд кардани ҳалшавӣ буд.
• Таъминоти руҳ қатшавии дурустро осон кард, аммо дар консентратсияи баланд афзоиши бактерияҳоро боздошт.
• Нишон дода шуд, ки FHL2-и тозашуда мономерӣ, қатшуда ва қобили консентратсия аст.
• Натиҷаҳои SAXS нишон доданд, ки як сохтори ягонаи кашидашуда маълумоти таҷрибавиро шарҳ дода наметавонад.
• Моделсозии дастгиришуда бо XL-MS нишон дод, ки FHL2 байни якчанд ҳолати сохторӣ ҳаракат мекунад.
• Гарчанде FHL2 майли табиии олигомеризатсия нишон надод, дар комплекси β-катенин ду FHL2 мавҷуд буда метавонанд.
• Таносуби пайвастшавӣ аз консентратсияи протеинҳо ва таносуби омехта таъсир мегирад.
• Стехиометрияи 2:1 ҳам бо ченкунии массаи молекулавӣ ва ҳам бо калориметрия дастгирӣ шудааст.
• Геометрияи дақиқи молекулавии комплекс ҳанӯз муайян нашудааст.

Ёддошт оид ба Манбаъ ва Усул

Ин мундариҷа ба таҳқиқоти Tina Logonder, Uroš Prešern ва Aljaž Gaber бо унвони “FHL2 production enabled new insight into its flexibility and unexpected binding stoichiometry with β-catenin” асос ёфтааст.

Таҳқиқот мақолаи таҷрибавии preprint мебошад, ки дар Факултети химия ва технологияҳои химиявии Донишгоҳи Ljubljana анҷом дода шудааст. Дар матн ба таври равшан огоҳии “This preprint research paper has not been peer reviewed” мавҷуд аст. Аз ин рӯ, таҳқиқот аз арзёбии ҳамсолон нагузаштааст. Дар PDF маълумоте дар бораи қабули мақола аз ҷониби маҷалла ё нашри версияи ҳамсолбаррасишудаи он дода нашудааст.

Таҳқиқот клиникӣ нест. Гурӯҳи беморон, шохаи табобат, посухи омос ё арзёбии бехатарии клиникӣ вуҷуд надорад. Таҳқиқот ба истеҳсол ва тозакунии in vitro-и протеинҳои рекомбинантии FHL2 ва β-катенин дар бактерияҳо, ченкуниҳои биофизикӣ, масс-спектрометрия ва моделсозии ҳисоббарории интегратсионӣ асос ёфтааст.

Гузориш шудааст, ки маълумоти SAXS ба Small Angle Scattering Biological Data Bank бо рамзи дастрасии SASDZ36 интиқол дода шудааст. Маълумоти масс-спектрометрӣ ба низоми PRIDE/ProteomeXchange ҳамчун маҷмӯаи додаҳои PXD078621 боргузорӣ шудааст. Маълумоти моделсозии интегратсионӣ ва баъзе маълумоти шаклҳо дар Zenodo бо DOI-и 10.5281/zenodo.19680353 мубодила шудаанд. Ин DOI ба маълумоти таҳқиқотӣ тааллуқ дорад; он версияи ҳамсолбаррасишуда ва нашршудаи мақоларо ифода намекунад.

Таҳқиқот аз ҷониби Агентии таҳқиқот ва инноватсияи Словения бо дастгирии рақами PS-0140 маблағгузорӣ шудааст. Муаллифон гузориш додаанд, ки ягон бархӯрди манфиатҳои молиявии маълум ё муносибати манфиатии шахсӣ вуҷуд надорад.

Дар матн шарҳ дода шудааст, ки ChatGPT барои кӯмак дар навиштани коди таҳлил истифода шудааст; муҳаққиқон мундариҷаи тавлидшударо баррасӣ ва таҳрир карда, масъулияти мақоларо ба зимма гирифтаанд.

Ин мақолаи тоҷикӣ танҳо бар асоси усулҳо, маълумоти рақамӣ, шаклҳо, натиҷаҳо ва муҳокимаи муаллифон, ки дар таҳқиқоти боршуда пешниҳод шудаанд, омода гардидааст. Даъвоҳои дар PDF мавҷуднабуда дар бораи таъсири клиникӣ, муваффақияти ташхисӣ, самаранокии дору, кафолати табобат, қобилияти тиҷоратӣ ё манфиати беморон илова нашудаанд.

Саҳми асосии илмии таҳқиқот нишон додани он аст, ки FHL2-и пуррадарози бидуни тегро ба миқдори кофӣ истеҳсол кардан мумкин аст, он дар маҳлул маҷмӯаи конформатсионии чандир ташкил медиҳад ва метавонад бо β-катенини пуррадароз дар таносуби 2:1 комплекс созад. Барои муайян кардани сатҳҳои пайвастшавӣ, стехиометрияи дохилиҳуҷайравӣ ва паёмадҳои биологӣ таҷрибаҳои нав лозиманд.