Murakkab o‘simlik preparatlarining qaysi tarkibiy qismlari biologik ta’sirlarga hissa qo‘shishini aniqlash bir komponentli dori vositalarini tahlil qilishdan ancha murakkabdir. Bitta o‘simlik damlamasi yuzlab turli molekulalarni saqlashi mumkin; ushbu molekulalar qutbliligi, barqarorligi, miqdori, ichakdan o‘tishi va metabolizmga uchrash shakllari bo‘yicha bir-biridan keskin farq qiladi.

An’anaviy analitik yondashuvlarda avval formulaning kimyoviy tarkibi aniqlanadi, so‘ngra qonda o‘zgarmagan holda aylanib yuruvchi “prototip” komponentlar qidiriladi. Biroq birikmaning qonda dastlabki molekulyar tuzilishida uchramasligi uning mutlaqo samarasiz ekanligini anglatmasligi mumkin. Ayrim birikmalar ichak bakteriyalari tomonidan parchalanishi, qand qismi ajratilishi, qaytarilishi yoki boshqa metabolitlarga aylantirilishi mumkin. Hosil bo‘lgan yangi mahsulot esa asosiy moddadan ko‘ra osonroq so‘rilishi yoki turlicha biologik xususiyatlarga ega bo‘lishi mumkin.

Xi Chen va uning hamkasblari ushbu analitik “ko‘r nuqta”ni bartaraf etish maqsadida ichak mikrobiotasini to‘g‘ridan-to‘g‘ri komponentlarni saralash strategiyasiga kirituvchi yangi ish tartibini ishlab chiqdilar. Usul giperurikemiya va podagra uchun an’anaviy qo‘llaniladigan to‘qqiz o‘simlikli Qu-Zhuo-Tong-Bi damlamasi (qisqacha QZTBD) misolida konseptual tasdiqlash (proof-of-concept) tadqiqoti sifatida sinovdan o‘tkazildi.

Dastlabki bosqichda QZTBD ning to‘liq kimyoviy profili UPLC-Q-TOF-MS^E usuli bilan tahlil qilindi va jami 221 ta komponent identifikasiya qilindi yoki taxminiy tuzilishi tavsiflandi. Ushbu komponentlar orasida 51 ta terpen, 46 ta flavonoid, 32 ta alkaloid, 30 ta fenol, 11 ta lipid, 9 ta aminokislota va ularning hosilalari, 9 ta kumarin, 5 ta steroid, 4 ta uglevod, 3 ta organik kislota, 3 ta saponin, 2 ta lignan va 16 ta boshqa birikmalar mavjud.

QZTBD ichirilgan kalamushlar qon zardobi tekshirilganda, 221 ta komponentdan faqat 42 tasi o‘zgarmagan prototip shaklida tizimli qon aylanishida aniqlandi. Boshqacha aytganda, damlamada aniqlangan komponentlarning taxminan 19 foizigina prototip sifatida zardobda ko‘rindi, qariyb 81 foizni tashkil etuvchi 179 ta komponent esa dastlabki shaklida topilmadi.

Tadqiqotchilar ushbu 179 ta komponentni to‘g‘ridan-to‘g‘ri “foydasiz” deb hisoblamasdan, ularni ikki bosqichli ichak mikrobiotasi skriningiga yo‘naltirdilar. Birinchi bosqichda normal ichak mikrobiotasiga ega QZTBD ichirilgan kalamushlar bilan keng ta’sir doirasiga ega antibiotiklar kokteyli yordamida mikrobiotasi kamaytirilgan QZTBD ichirilgan kalamushlarning najas profillari o‘zaro solishtirildi.

Antibiotik berilgan kalamushlar najasida 19 ta komponentning signali sezilarli darajada oshdi. Tadqiqotchilar bu to‘planishni normal sharoitda ushbu moddalar ichak mikroorganizmlari tomonidan iste’mol qilinishi, parchalanishi yoki transformatsiyaga uchrashi mumkinligining belgisi sifatida talqin qildilar. Mikrobiota kamaytirilganda ushbu qayta ishlash susaygan va asosiy moddalar najasda ko‘proq qolib ketgan bo‘lishi mumkin.

Ikkinchi bosqichda ushbu 19 ta nomzod modda 25–47 yoshdagi 62 nafar erkak podagra bemoridan olingan najas mikrobiotasi bilan anaerob sharoitda 72 soat davomida inkubatsiya qilindi. Mikrobiota saqlagan muhit bilan mikroorganizmsiz nazorat muhiti taqqoslanganda to‘qqizta komponentning signali statistik jihatdan ishonchli darajada kamaydi.

Ushbu to‘qqiz komponent: quercitrin, sweroside, hesperidin, 3-caffeoylshikimic acid, diosmin, avicularin, engeletin, 5-O-caffeoylshikimic acid va dehydrocorydaline sifatida ko‘rsatildi. Biroq bular strukturasi to‘liq aniqlangan mikrobial metabolitlar emas. Tadqiqot faqat asosiy modda signalining mikrobiota ishtirokida kamayganini ko‘rsatadi.

Zardobda prototip sifatida topilgan sakkizta vakil modda hamda mikrobiota transformatsiyasiga nomzod moddalar orasidan farmakologik ahamiyati va referens standartlarining mavjudligi hisobga olingan holda 15 ta komponent maqsadli miqdoriy tahlil paneliga tanlab olindi. Ushbu panel: engeletin, avicularin, corydaline, D-tetrahydropalmatine, proline betaine, quercitrin, astilbin, luteolin, diosmin, hesperidin, oxypeucedanin hydrate, palmatine, dioscin, sweroside va dehydrocorydaline dan tashkil topdi.

Ushbu 15 ta komponentni yagona tahlilda o‘lchash uchun uch karrali kvadrupolli LC-MS/MS asbobida ko‘p reaksiyali monitoring (MRM) usuli ishlab chiqildi. Usul o‘ziga xoslik, to‘g‘ri chiziqlilik, miqdoriy aniqlash chegarasi (LOQ), asbob aniqligi, kun ichidagi va kunlararo takrorlanuvchanlik, qayta tiklanuvchanlik, qaytarib olish unumi va 24 soatlik eritma barqarorligi bo‘yicha to‘liq validatsiyadan o‘tkazildi.

QZTBD namunalarida eng yuqori miqdorda topilgan komponentlar asosan astilbin, engeletin, quercitrin va proline betaine bo‘ldi. 2-jadvaldagi 15 ta namunada astilbin taxminan 107,203–315,430 µg/g, engeletin 22,925–105,325 µg/g, quercitrin 28,584–97,616 µg/g va proline betaine 8,285–41,809 µg/g oraliqlarida qayd etildi.

Tadqiqotning yakuniy bosqichida ichak mikrobiotasining QZTBD farmakodinamik ta’siridagi o‘rni yuqori yog‘li parhez va mononatriy urat (MSU) kristallari bilan chaqirilgan podagrasimon sichqon modelida o‘rganildi. QZTBD qo‘llanilishi qon zardobidagi siydik kislotasi va kreatinin miqdorini kamaytirdi; yallig‘lanish ko‘rsatkichlari, panja shishi va mexanik og‘riq sezgirligining yaxshilanishi bilan bog‘landi.

Ichak mikrobiotasi antibiotiklar bilan kamaytirilganda ushbu ijobiy o‘zgarishlarning bir qismi kuchsizlandi. Bu natija QZTBD ning sichqon modelidagi ta’siri hech bo‘lmaganda qisman ichak mikrobiotasi faoliyati bilan bog‘liq bo‘lishi mumkinligini tasdiqlaydi.

Shunga qaramay, antibiotik tajribasi aniq bitta bakteriya, ferment yoki metabolitning sababiy rolini ko‘rsatmaydi. Antibiotiklar mikrobiotani yoppasiga o‘zgartirishi va xo‘jayin fiziologiyasiga bevosita ta’sir qilishi ham mumkin. Bundan tashqari, tanlab olingan 15 ta komponentning yoki mikrobial metabolitlarning alohida hayvonlarga berilib, ularning samaradorligi tekshirilgan alohida tajriba o‘tkazilmagan.

Tadqiqotning asosiy ilmiy hissasi yangi podagra davosini klinik isbotlash emas; murakkab o‘simlik preparatlarida faqat qonda o‘zgarmay qolgan molekulalarga e’tibor qaratish yetarli bo‘lmasligini hamda ichak mikrobiotasi orqali o‘zgarish ehtimolini analitik komponentlarni tanlashga kiritish mumkinligini ko‘rsatishdir.

Murakkab o‘simlik formulalarida “faol modda” nima sababdan oson aniqlanmaydi?

Yagona toza kimyoviy moddadan iborat dorida tahlil qilinadigan asosiy molekula aniq bo‘ladi. Aksincha, o‘simlik damlamasi:

• Bir nechta o‘simlik turidan,
• Yuzlab asosiy va ikkilamchi komponentlardan,
• Turli qutblilikdagi molekulalardan,
• Qand saqlovchi glikozidlardan,
• Alkaloidlar, flavonoidlar va terpenlardan,
• Suvda va yog‘da eruvchan fraksiyalardan tashkil topishi mumkin.

Komponentning damlamada ko‘p bo‘lishi uning ichakdan o‘zgarmasdan so‘rilishini kafolatlamaydi. Aksincha, preparatda juda kam miqdorda bo‘lgan molekula yuqori so‘rilish qobiliyatiga yoki kuchli biologik faollikka ega bo‘lishi mumkin.

Ayniqsa glikozidlar, saponinlar va ayrim yuqori qutbli molekulalar ichak shilliq qavatidan prototip holatida juda kam o‘tadi. Ushbu birikmalarning qand guruhlari ichak mikroorganizmlari fermentlari tomonidan uzib tashlanganda kichikroq va lipofilroq aglikonlar hosil bo‘ladi.

Shu sababli uchta alohida savolni farqlash lozim:

1. Damlamada qaysi molekulalar mavjud?
2. Ushbu molekulalarning qaysilari o‘zgarmasdan qonga o‘tadi?
3. Qonga o‘zgarmasdan o‘tmagan moddalarning qaysilari ichakda biologik ahamiyatli mahsulotlarga aylanishi mumkin?

Tadqiqotning yangilik jihati aynan uchinchi savolni analitik ish jarayoniga integratsiya qilganidadir.

Prototip komponent bilan transformatsiyalanuvchi prekursor orasidagi farq

“Prototip so‘rilgan komponent” — bu damlamadagi kimyoviy tuzilishi bilan qon zardobida aniqlangan molekuladir. Masalan, agar molekulaning massasi, ushlanish vaqti va MS/MS parchalanishi damlamadagi standart bilan to‘liq mos kelsa, u prototip sifatida so‘rilgan deb hisoblanadi.

“Prototip sifatida so‘rilmagan komponent” esa damlamada borligi aniqlangan, biroq zardobda aynan shu shaklda topilmagan molekuladir. Buning bir nechta sababi bo‘lishi mumkin:

• Ichakdan umuman so‘rilmasligi,
• Ichak mikroorganizmlari tomonidan o‘zgartirilishi,
• Ichak epiteliy hujayralarida metabolizmga uchrashi,
• Jigardan birinchi o‘tish (first-pass) metabolizmiga uchrashi,
• Najas bilan o‘zgarmay chiqib ketishi,
• Analitik aniqlash chegarasidan past miqdorda bo‘lishi,
• Namuna olish vaqtida zardobda bo‘lmasligi.

Demak, “zardobda prototip yo‘q” degan xulosa “farmakologik ta’siri yo‘q” degani emas.

Ichak mikroorganizmlari molekulalarni qanday o‘zgartirishi mumkin?

Tadqiqotda ichak mikrobiotasining boy fermentlar arsenaliga ega ekanligi ta’kidlanadi. Bular qatoriga:

• β-glyukozidaza,
• β-glyukuronidaza,
• Nitroreduktaza,
• Reduktaza,
• Esteraza va boshqa mikrobial fermentlar kiradi.

Ushbu fermentlar qand bog‘larini uzishi, murakkab efirlarni gidrolizlashi, funksional guruhlarni qaytarish yoki oksidlash reaksiyalariga kiritishi mumkin. Natijada boshlang‘ich moddaning molekulyar hajmi, eruvchanligi va biologik nishonlar bilan o‘zaro ta’siri tubdan o‘zgarishi mumkin.

Biroq ushbu tadqiqot mazkur fermentlarning qaysi biri QZTBD ning aynan qaysi komponentini o‘zgartirganini alohida o‘lchamagan. Mikrobiota vositasidagi o‘zgarishlar faqat moddalar signalining kamayishiga qarab saralangan.

Qu-Zhuo-Tong-Bi damlamasi qaysi o‘simliklardan tashkil topgan?

QZTBD to‘qqizta o‘simlik xomashyosidan tayyorlangan:

O‘simliklar avval o‘z hajmidan o‘n barobar ko‘p deionizatsiyalangan suvda bir soat ivitilib, 40 daqiqa qaynatildi. Qolgan o‘simlik qoldig‘i sakkiz barobar suv bilan 30 daqiqa ikkinchi bor qaynatildi. Ikkala filtrat birlashtirildi, suzildi, quyultirildi va 4°C da saqlandi.

Tadqiqotning yaxlit ish sxemasi

Tadqiqot beshta asosiy analitik va biologik bosqichni birlashtiradi:

1. To‘liq kimyoviy profil: QZTBD dagi imkon qadar ko‘p komponentlarni UPLC-Q-TOF-MS^E bilan aniqlash.
2. Zardobdagi ta’sir tahlili: Kalamush zardobida o‘zgarmay topilgan prototip komponentlarni saralash.
3. Mikrobiota konversiyasi skriningi: Prototip sifatida topilmagan moddalarni antibiotikli tajriba va inson najas mikrobiotasi inkubatsiyasi orqali baholash.
4. Maqsadli miqdoriy tahlil: Tanlangan 15 ta komponentni LC-MS/MS-MRM usulida bir vaqtda o‘lchash.
5. Farmakodinamik tasdiq: Podagrasimon sichqon modelida mikrobiotani yo‘qotish QZTBD samaradorligini o‘zgartirishini tekshirish.

6A-rasm ushbu ish sxemasini vizual umumlashtiradi. Damlamadagi moddalar avval prototip so‘rilgan va so‘rilmaganlarga bo‘linadi; ikkinchi guruh esa kalamush najasi va inson mikrobiotasi orqali qayta filtrlanadi.

UPLC-Q-TOF-MS^E nima uchun qo‘llanildi?

UPLC komponentlarni ustunda yuqori samaradorlik bilan ajratsa, Q-TOF mass-spektrometri ionlarning massa/zaryad nisbatini yuqori aniqlikda o‘lchaydi.

Klassik mass-spektrometriya munosabati:

\[ m/z = \frac{\text{ion massasi}}{\text{ion zaryadi}} \]

• m — ion massasini,
• z — ionning elektr zaryadini bildiradi.

MS^E rejimida past va yuqori to‘qnashuv energiyasi ma’lumotlari ayni bir tahlilda yozib olinadi. Past energiya asosiy molekulyar ionni, yuqori energiya esa parchalanish parchalarini (fragmentlarni) aniqlashga xizmat qiladi.

Bu xususiyat murakkab aralashmalarda juda foydali bo‘lib, nafaqat massaga, balki parchalanish manzaralariga qarab ham kimyoviy tuzilishni taxmin qilish imkonini beradi.

UPLC-Q-TOF-MS^E tahlil sharoitlari

221 ta komponentning kimyoviy taqsimoti

Massa aniqligi xatoligi taklif etilgan prekursor ionlar uchun ±5 ppm oralig‘ida bo‘ldi. Bu yuqori aniqlik strukturaviy taxminlarni quvvatlaydi, biroq bir xil massaga ega izomerlarni mutlaq ajratish uchun yetarli bo‘lmasligi mumkin.

Referens standartlar bilan solishtirilgan moddalar qat’iy tasdiqlandi, boshqa ko‘plab moddalar esa adabiyot va ma’lumotlar bazalari asosida taxminiy tavsiflandi.

1-rasmdagi xromatogrammalar nimani ko‘rsatadi?

1-rasmda QZTBD namunasining musbat va manfiy ion rejimlaridagi asosiy cho‘qqi intensivligi (BPI) xromatogrammalari standartlar eritmasi bilan yonma-yon keltirilgan.

QZTBD xromatogrammasida butun tahlil vaqti bo‘ylab yuzlab cho‘qqilarning uchrashi damlamaning boy kimyoviy tarkibini tasdiqlaydi. Standartlar xromatogrammasi esa kam sonli aniq cho‘qqilardan iborat bo‘lib, maqsadli moddalarning tutilish zonalarini aniqlashga xizmat qiladi.

Flavonoidlarning parchalanish manzarasi

2-rasmda luteolin, diosmin, astilbin va engeletinning MS/MS spektrlari hamda parchalanish yo‘llari ko‘rsatilgan.

Luteolin

Luteolin manfiy rejimda m/z 285,0416 [M−H]⁻ ioni berdi. m/z 151,0040 va 133,0298 ionlari flavon karkasining Retro-Diels–Alder (RDA) parchalanishiga to‘g‘ri keldi.

Diosmin

Diosmin m/z 607,1671 [M−H]⁻ ionini hosil qildi. m/z 299,0561 mahsulot ioni rutinoza qismi uzilgach hosil bo‘lgan diosmetin aglikoniga mos keldi.

Astilbin

Astilbin m/z 449,1098 [M−H]⁻ ioni berdi. Ramnoza qismi uzilgach m/z 303,0518 taksifolin aglikoni; so‘ngra suv yo‘qotilishi bilan m/z 285,0413 va RDA parchalanishi bilan m/z 151,0040 ionlari kuzatildi.

Engeletin

Engeletinda ramnoza uzilishidan so‘ng m/z 287,0561 aglikon ioni, suv chiqishi bilan m/z 269,0459 va keyingi RDA fragmentlari qayd etildi.

Ushbu parchalanishlar flavonoid glikozidlarida qand guruhining ajralishi struktura tahlilida qanday muhim diagnostik belgi ekanini ko‘rsatadi.

Alkaloidlarning parchalanish manzarasi

3-rasm palmatine, dehydrocorydaline, corydaline va D-tetrahydropalmatine uchun musbat rejimdagi parchalanishlarni ko‘rsatadi.

• Palmatine: m/z 352,1542 [M]⁺ ionidan CH₄ va CO chiqib ketishi bilan m/z 336,1228 va 308,1279 ionlari hosil bo‘ldi.
• Dehydrocorydaline: m/z 366,1703 [M]⁺ ionidan m/z 350,1393, 322,1441 va 306,1136 mahsulotlari ajraldi.
• Corydaline: m/z 370,2014 [M+H]⁺ ionidan m/z 354,1703 va diagnostik m/z 192,1019 ioni olindi.
• D-tetrahydropalmatine: m/z 356,1861 [M+H]⁺ ionidan m/z 324,1237, 192,1020 va 176,0708 fragmentlari paydo bo‘ldi.

Tadqiqotchilar ushbu alkaloidlar aynan Yanhusuo o‘simligiga tegishli ekanini va og‘riq hamda yallig‘lanishga qarshi asosiy faol moddalar qatorida ko‘rib chiqilishi mumkinligini muhokama qildilar. Biroq ushbu moddalar alohida sinab ko‘rilmagan.

Boshqa kimyoviy sinflarga misollar

4-rasmda uch xil struktura sinfi ko‘rsatilgan:

• Sweroside: Iridoid glikozid; m/z 359,1341 [M+H]⁺ va glyukoza ajralishi bilan m/z 197,0807.
• Dioscin: Steroid saponin; m/z 869,4903 [M+H]⁺ va ketma-ket qandlar uzilishi bilan m/z 723,4312, 577,3742 va 415,3211.
• Oxypeucedanin hydrate: m/z 305,1021 [M+H]⁺; C₅H₁₀O₂ uzilishi bilan m/z 203,0341 va so‘ngra m/z 147,0340.

Zardobdagi prototip moddalar qanday aniqlandi?

QZTBD ichirilgan kalamushlar qon zardobi nazorat zardobi bilan taqqoslandi. Birikmani prototip sifatida qabul qilish mezonlari:

• Preparat berilgan zardobda bo‘lishi va bo‘sh zardob signalidan kamida 2 barobar yuqori bo‘lishi,
• QZTBD ekstraktidagi tegishli cho‘qqi bilan alohida tutilish vaqti mosligi,
• To‘g‘ri massa va molekulyar formula mosligi,
• O‘xshash MS/MS parchalanish manzarasi.

5-rasmdagi zardob xromatogrammasi xom damlamadagi yuzlab cho‘qqilarga nisbatan ancha kam sonli prototip moddalar qonga yetib borganini yaqqol namoyish etadi.

42 ta prototip komponent qaysi sinflardan iborat bo‘ldi?

• 10 ta terpenoid,
• 9 ta alkaloid,
• 8 ta flavonoid,
• 5 ta fenol,
• 4 ta kumarin,
• Bittalab organik kislota, uglevod, aminokislota, steroid, antraxinon va saponin.

Zardobdagi miqdori, farmakologik qiziqish va standartlarning mavjudligiga qarab sakkizta prototip vakil tanlab olindi:

• Corydaline,
• D-tetrahydropalmatine,
• Palmatine,
• Astilbin,
• Luteolin,
• Oxypeucedanin hydrate,
• Proline betaine,
• Dioscin.

Antibiotiklar bilan mikrobiotani kamaytirish tajribasi

Zardob va najas tahlili uchun 24 ta erkak SD kalamushi to‘rtta guruhga ajratildi (har guruhda 6 ta hayvon):

Antibiotik kokteyli 14 kun davomida ichimlik suvida quyidagi tarkibda berildi:

• Vankomitsin: 0,5 g/l,
• Ampitsillin: 0,1 g/l,
• Neomitsin: 1,0 g/l,
• Metronidazol: 1,0 g/l.

Qo‘shimcha tasvirlarda oddiy va antibiotik berilgan hayvonlar najasi ekilgan petri kosachalaridagi bakteriyalar ko‘rsatilgan. Oddiy guruhda qalin koloniyalar o‘sgan bo‘lsa, antibiotik guruhida koloniyalar deyarli yo‘qolgan. Bu tirik bakteriyalar keskin kamayganini ko‘rsatadi, ammo steril bo‘lib qolganini bildirmaydi.

Antibiotik guruhida najasda ortgan moddalar nima uchun muhim?

Agar normal mikrobiota biror moddani o‘zlashtirsa yoki boshqa shaklga aylantirsa, mikrobiota yo‘qotilganda ushbu modda o‘zgarmasdan najasda ko‘proq to‘planib qoladi.

Ushbu mantiqiy model quyidagicha:

\[ \text{Normal mikrobiota: asosiy komponent} \rightarrow \text{iste’mol yoki transformatsiya} \]

\[ \text{Mikrobiota kamayganda: ko‘proq o‘zgarmagan asosiy komponent} \]

Tadqiqotda 19 ta komponent ABX + QZTBD guruhining najasida oddiy QZTBD guruhiga nisbatan ko‘paygani aniqlandi. Biroq bu ko‘payish faqat mikrobial transformatsiyaga emas, ichak motorikasi, so‘rilish yoki umumiy najas massasi o‘zgarishiga ham bog‘liq bo‘lishi mumkin.

Podagra bemorlari najas mikrobiotasi bilan in vitro tajriba

Inson najasi namunalari 25–47 yoshdagi, podagra artriti bilan kasallangan 62 nafar erkak bemordan olindi. Ishtirokchilardan xabardor qilingan rozilik olingani va tadqiqot etik qo‘mita tomonidan tasdiqlangani bildirildi.

Najas suspenziyasi tayyorlash tartibi:

• 200 mg najas 800 µl steril PBS da suspenziyalandi.
• Yirik zarrachalar 800 × g da (4°C) uch daqiqa santrifugalab cho‘ktirildi.
• Bakteriya suspenziyasi BHI ozuqa muhiti bilan 3 × 10⁹ CFU/ml darajasiga keltirildi.

Uchta inkubatsiya guruhi tuzildi:

Namunalar 80% N₂, 10% H₂ va 10% CO₂ saqlagan anaerob kamerada 37°C da 72 soat inkubatsiya qilindi.

Mikrobiotali guruhda to‘qqizta asosiy moddaning signali mikrobiotasiz nazoratga nisbatan ishonchli darajada kamaydi. Bu kamayish ushbu moddalarning mikroblar tomonidan iste’mol qilingani yoki o‘zgartirilganini ko‘rsatadi.

Ushbu to‘qqiz komponent mikrobial metabolitlarmi?

Yo‘q. Tadqiqotda bu farq aniq ta’kidlanadi. To‘qqizta komponent ichak mikrobiotasi ta’sirida o‘zgarishga moyil bo‘lgan dastlabki asosiy moddalardir.

Tadqiqot:

• Hosil bo‘lgan yangi metabolitlarning kimyoviy tuzilishini aniqlamagan,
• Qaysi bakteriya qaysi moddani o‘zgartirganini ko‘rsatmagan,
• Jarayonga javobgar fermentlarni aniqlamagan,
• Hosil bo‘lgan metabolitning qonga so‘rilishini o‘lchamagan,
• Metabolitning asosiy moddadan kuchliroq ta’sirga egaligini isbotlamagan.

Signalning kamayishi biotransformatsiya, mikrobial oziqlanish, kimyoviy degradatsiya yoki bakteriya yuzasiga adsorbsiya kabi bir nechta jarayonlar natijasi bo‘lishi mumkin.

Nima sababdan to‘qqiz nomzoddan faqat yettitasi yakuniy panelga kirdi?

Zardobdagi sakkizta prototip moddaga mikrobiota skriningidan o‘tgan yettita modda qo‘shilib, 15 ta komponentli miqdoriy tahlil paneli tuzildi.

Skriningda aniqlangan 3-caffeoylshikimic acid va 5-O-caffeoylshikimic acid yakuniy 15 ta modda ro‘yxatiga kiritilmadi. Sababi, ularning toza referens standartlariga ega bo‘lish imkoniyati cheklangan edi.

Bu holat analitik panelning faqat biologik ahamiyatga ko‘ra emas, tijoriy standartlarning mavjudligiga qarab ham shakllanganini ko‘rsatadi.

O‘simliklarni birma-bir chiqarib tashlash (knock-out) tajribasi

Tanlangan moddalar qaysi o‘simlikdan kelib chiqqanini aniqlash uchun to‘liq QZTBD tarkibidan bittadan o‘simlik olib tashlangan salbiy nazorat damlamalari tayyorlandi.

Chiqarilgan o‘simliklar:

• Tufuling,
• Bixie,
• Yiyiren,
• Yanhusuo,
• Foshou.

6E-rasmdagi issiqlik xaritasiga ko‘ra:

• Astilbinning asosiy manbasi Tufuling ekani aniqlandi.
• Corydaline, D-tetrahydropalmatine va dehydrocorydaline kabi alkaloidlar asosan Yanhusuo dan kelib chiqishi ko‘rindi.
• Proline betaine va ayrim sitrus flavonoidlari Foshou chiqarilganda keskin kamaydi.
• Ba’zi flavonoidlar va glikozidlar bitta o‘simlikka bog‘lanmagan umumiy xarakterga ega bo‘ldi.

O‘simlik chiqarilganda moddaning kamayishi ushbu o‘simlik asosiy manba ekanini bildiradi, ammo moddaning faqat shu o‘simlikda uchrashini qat’iy isbotlamaydi.

Maqsadli LC-MS/MS usulining maqsadi

UPLC-Q-TOF-MS^E yuzlab moddalarni keng qamrovda skanerlash uchun ishlatilgan bo‘lsa, uch karrali kvadrupolli LC-MS/MS tizimi tanlangan moddalarni juda aniq va miqdoriy tahlil qilish uchun qo‘llanildi.

MRM usulida birinchi kvadrupol aniq prekursor ionni tanlaydi, to‘qnashuv kamerasida u parchalanadi va uchinchi kvadrupol maqsadli mahsulot ionini qayd etadi. Bu har bir modda uchun o‘ziga xos analitik “barmoq izi” yaratadi.

LC-MS/MS tahlil sharoitlari

15 ta komponent uchun MRM o‘tishlari

Usul validatsiyasi qanday o‘tkazildi?

Maqsadli LC-MS/MS usuli quyidagi mezonlar bo‘yicha tekshirildi:

• O‘ziga xoslik: Standartlar aralashmasi, QZTBD namunasi va bo‘sh erituvchi xromatogrammalarini solishtirish.
• To‘g‘ri chiziqlilik: Cho‘qqi maydonining konsentratsiyaga bog‘liqlik grafigi.
• LOQ: Miqdoriy o‘lchash mumkin bo‘lgan eng past konsentratsiyani baholash.
• Asbob aniqligi: Ayni eritmani ketma-ket 6 marta kiritish.
• Kun ichidagi aniqlik: Ayni kun ichidagi takroriy o‘lchovlar.
• Kunlararo aniqlik: Ketma-ket 3 kundagi o‘lchovlar.
• Takrorlanuvchanlik: Ayni namunaning mustaqil tayyorlangan 6 ta takrori.
• Qaytarib olish unumi: Past, o‘rta va yuqori darajada standart qo‘shish sinovi.
• Barqarorlik: Namunani 0, 2, 4, 8, 12 va 24 soatdan keyin qayta o‘lchash.

Qaytarib olish unumi formulasi:

\[ \text{Qaytarib olish darajasi (\%)} = \frac{\text{o‘lchangan umumiy miqdor} - \text{dastlabki miqdor}} {\text{qo‘shilgan standart miqdori}} \times 100 \]

Mualliflar usul barcha validatsiya talablariga javob berganini bildirdilar. Biroq har bir moddaning alohida sonli natijalari qo‘shimcha jadvallarga joylashtirilgan.

15 ta namunada o‘lchangan miqdorlar

Quyidagi oraliqlar 2-jadvalda keltirilgan 15 ta QZTBD namunasining eng past va eng yuqori ko‘rsatkichlaridan olingan (birlik: µg/g):

Ushbu katta tebranish murakkab o‘simlik vositalarining sifat nazoratida faqat bitta yoki ikkita moddaga tayanish butun preparat tarkibini to‘liq ifodalay olmasligini ko‘rsatadi.

Eng ko‘p modda eng muhim moddami?

Yo‘q. Astilbin miqdori yuzlab µg/g bo‘lgani holda ayrim alkaloidlar 1 µg/g dan past bo‘ldi. Shunga qaramay, kam miqdordagi modda ancha kuchli biologik faollik ko‘rsatishi yoki osonroq so‘rilishi mumkin.

Tadqiqot taklif etgan panel faqat miqdorga qarab tuzilmagan. Unda:

• Kimyoviy sinf,
• Qutblilik,
• Zardobdagi prototip holati,
• Mikrobiota orqali o‘zgarish ehtimoli,
• Farmakologik qiziqish,
• Standartlarning mavjudligi birgalikda hisobga olingan.

Farmakodinamik sichqon tajribasi dizayni

Jami 30 ta erkak C57BL/6J sichqoni 5 guruhga ajratildi (har guruhda 6 ta sichqon):

Model guruhlariga yuqori yog‘li ozuqa berildi va o‘ng orqa panja tagiga har 10 kunda 40 µl PBS ichidagi 1 mg mononatriy urat (MSU) kristallari yuborildi. Davolash olti hafta davom etdi.

Qaysi parametrlar o‘lchandi?

• Zardobdagi siydik kislotasi,
• Zardobdagi kreatinin,
• TNF-α,
• IL-6,
• IL-1β,
• NLRP3,
• Panja shishi indeksi,
• Fon Frey tolalari bilan mexanik og‘riq sezgirligi,
• Jigar a’zo indeksi,
• Buyrak a’zo indeksi.

Panja shishi indeksi formulasi:

\[ \text{Panja shishi indeksi} = \frac{\text{o‘ng panja o‘lchami}} {\text{chap panja o‘lchami}} \]

O‘ng panja MSU kiritilgan tomon hisoblanadi. Nisbatning oshishi shishning kattalashganini bildiradi.

7-rasm nimani ko‘rsatadi?

7-rasm farmakodinamik tajribaning barcha natijalarini ko‘p panelli grafikda ko‘rsatadi:

• Model guruhida zardob siydik kislotasi keskin oshdi.
• QZTBD qo‘llanilishi siydik kislotasini tushirdi.
• Modelda oshgan zardob kreatinini QZTBD bilan kamaydi.
• TNF-α, IL-6, IL-1β va NLRP3 natijalari yallig‘lanish QZTBD bilan bosilganini ko‘rsatdi.
• Panja shishi va mexanik og‘riq QZTBD guruhida sezilarli yaxshilandi.
• Antibiotik + QZTBD guruhida bu yaxshilanishlar faqat QZTBD guruhiga nisbatan kuchsizroq bo‘ldi.
• Jigar va buyrak a’zo indekslarida salbiy o‘zgarishlar kuzatilmadi.

Antibiotik kiritilgach samaradorlikning pasayishi QZTBD ta’sirida ichak mikrobiotasi muhim o‘rin tutishini tasdiqlaydi. Biroq samara butunlay yo‘qolmadi; demak, damlama faqatgina mikrobiota orqali ta’sir qiladi deb bo‘lmaydi.

Antibiotik tajribasi sabab-oqibatni qanchalik isbotlaydi?

ABX + QZTBD guruhining pastroq samara berishi mikrobiotaning ishtirokini quvvatlaydi. Biroq keng ta’sirli antibiotiklar:

• Ko‘plab bakteriya guruhlarini yoppasiga yo‘qotadi,
• Ichak to‘sig‘i o‘tkazuvchanligini o‘zgartirishi mumkin,
• O‘t kislotalari va energiya almashinuviga ta’sir qiladi,
• Dorilar so‘rilishini o‘zgartirishi mumkin,
• Xo‘jayin immunitetiga bevosita ta’sir o‘tkazishi mumkin.

Shu sababli bu natija bitta muayyan bakteriya yoki metabolitning rolini ko‘rsatmaydi. Aniqroq mexanizmlarni ochish uchun mikrobiota transplantatsiyasi, toza metabolitlarni kiritish kabi qo‘shimcha ishlar lozim.

O‘tmish nuqtayi nazaridan ahamiyati

Klassik zardob farmakokimyosi qonda o‘zgarmay topilgan prototip moddalarni asosiy nomzodlar deb hisoblaydi. Bu yondashuv to‘g‘ridan-to‘g‘ri qonga o‘tuvchi moddalarni aniqlashda foydali bo‘lsa-da, glikozidlar va yuqori qutbli moddalarni tahlildan chiqarib tashlaydi.

Ushbu tadqiqot zardobda ko‘rinmagan moddalarni ichak mikrobiotasi orqali qayta baholash tizimini taklif etdi va kengroq saralash uslubini ko‘rsatib berdi.

Bugungi kun nuqtayi nazaridan ahamiyati

O‘simlik vositalarining sifat nazoratida odatda o‘lchash oson yoki ko‘p miqdordagi bir-ikkita modda olinadi. Ular har doim ham biologik faollikni ifodalamasligi mumkin.

Tadqiqot taklif qilgan ikki tomonlama panel:

• To‘g‘ridan-to‘g‘ri so‘riluvchi prototip moddalarni,
• Ichak mikrobiotasi ta’sirida o‘zgaruvchi moddalarni yagona tahlilda birlashtiradi.

Bu yondashuv kelajakda o‘simlik dorilarining sifat belgilarini biologik o‘zlashtirilish yo‘liga qarab tanlashga hissa qo‘shishi mumkin.

Kelgusida qanday ishlar bajarilishi kerak?

• Kamaygan to‘qqizta asosiy moddadan hosil bo‘lgan haqiqiy mikrobial metabolitlar aniqlanishi lozim.
• Metabolitlar yuqori aniqlikdagi nishonsiz metabolomika bilan kuzatilishi kerak.
• Transformatsiyaga javobgar bakteriyalar va fermentlar aniqlanishi lozim.
• Jigar mikrosomalari va ichak hujayralari metabolizmi ham tahlilga qo‘shilishi kerak.
• Tanlangan moddalar va metabolitlar hayvonlarda alohida-alohida sinab ko‘rilishi lozim.
• Mikrobiota o‘zgarishi tizimli qon aylanishiga qanday ta’sir qilishini farmakokinetika bilan o‘lchash zarur.
• Insonlarda QZTBD ichilgandan so‘ng qon, siydik va najas metabolomikasi birga baholanishi lozim.
• Podagra bemorlari bilan sog‘lom odamlarning mikrobial transformatsiya qobiliyati taqqoslanishi kerak.
• 15 moddali panel boshqa laboratoriyalarda va turli partiyalarda tasdiqlanishi lozim.

Kundalik hayot va salomatlik nuqtayi nazaridan talqin

Tadqiqot QZTBD ning odamlar uchun isbotlangan podagra davosi ekanligini ko‘rsatmaydi. Farmakodinamik natijalar sichqon modelidan olingan va undagi dozalarni to‘g‘ridan-to‘g‘ri odamlarga tatbiq etib bo‘lmaydi.

Tadqiqotning umumiy ahamiyati shundaki, ichak mikrobiotasi og‘iz orqali qabul qilingan o‘simlik moddalarini passiv o‘tkazib yuboruvchi oddiy muhit emas. Turli odamlarning ichak bakteriyalari ayni bir o‘simlik moddasini turlicha o‘zgartirishi mumkin. Bu holat kelajakda nima sababdan bir xil o‘simlik damlamasi turli bemorlarga turlicha ta’sir qilishini tushunishda muhim bo‘ladi.

Tadqiqotning kuchli tomonlari

• Kimyoviy profil, zardobdagi moddalar, najas tahlili, inson mikrobiotasi inkubatsiyasi, miqdoriy tahlil va farmakodinamika bitta tizimda birlashtirilgan.
• QZTBD dagi 221 ta komponent keng qamrovda xarakterizatsiya qilingan.
• Musbat va manfiy ionlashuv rejimlari birga ishlatilgan.
• Struktura taxminlari yuqori aniqlikdagi massa va MS/MS parchalanishlari bilan asoslangan.
• Zardobda topilgan va topilmagan moddalar aniq ajratilgan.
• Mikrobiota skriningida ham tirik kalamushlar, ham inson najas mikrobiotasi qo‘llanilgan.
• Antibiotik guruhi mikrobiota mavjudligini qiyoslash vositasi sifatida xizmat qilgan.
• 15 ta komponentli keng qamrovli LC-MS/MS usuli yaratilgan va validatsiya qilingan.
• O‘simliklarni birma-bir chiqarish orqali moddalarning kelib chiqishi o‘rganilgan.
• Sichqon modelida mikrobiotaning preparat samarasidagi hissasi funksional baholangan.
• Nomzodlar “yakuniy faol modda” deb emas, saralangan potensial komponentlar sifatida ehtiyotkorlik bilan taqdim etilgan.

Tadqiqotning cheklovlari

• Tadqiqot ilmiy taqrizdan o‘tmagan preprint hisoblanadi.
• 221 ta moddaning hammasi ham standartlar bilan to‘liq tasdiqlanmagan.
• Zardobda topilmagan 179 moddadan faqat to‘qqiztasi mikrobiota nomzodi sifatida ajratilgan, qolgan 170 tasi o‘rganilmagan.
• Najasda asosiy moddaning kamayishi hosil bo‘lgan metabolit strukturasini ko‘rsatmaydi.
• Mikrobial metabolitlarning so‘rilishi yoki farmakokinetikasi o‘lchanmagan.
• Transformatsiyaga javobgar bakteriyalar yoki fermentlar aniqlanmagan.
• Antibiotiklar mikrobiotani yoppasiga o‘zgartirgani sababli nojo‘ya fiziologik ta’sirlar to‘liq istisno qilinmagan.
• Inson najasi faqat 25–47 yoshli erkak podagra bemorlaridan olingan; sog‘lom odamlar bilan solishtirilmagan.
• Inson najasi faqat in vitro muhitda qo‘llanilgan, odamlarda klinik davolash o‘tkazilmagan.
• Farmakodinamik tasdiq sichqon modeliga tayanadi.
• Tanlangan 15 ta moddaning birortasi alohida ajratilib hayvonlarda sinab ko‘rilmagan.
• Validatsiya natijalarining barcha to‘liq jadvallari asosiy matnda berilmagan.
• QZTBD namunalari orasida ayrim moddalar miqdori ancha katta farq qilgan.
• Uzoq muddatli toksiklik yoki insonlar uchun xavfsizlik o‘rganilmagan.

Tadqiqot nima demoqda?

• QZTBD da 221 ta komponent xarakterizatsiya qilingan.
• Ulardan faqat 42 tasi kalamush zardobida prototip shaklida topilgan.
• Klassik zardob tahlili damlamadagi moddalarning katta qismini e’tibordan chetda qoldiradi.
• Antibiotik qo‘llanilganda 19 ta modda najasda to‘planib qolgan.
• Ushbu 19 moddadan to‘qqiztasi podagra bemorlari mikrobiotasi bilan inkubatsiyada kamaygan.
• To‘qqiz modda ichak mikrobiotasi orqali o‘zgaruvchi asosiy nomzodlardir.
• 15 ta vakil modda bitta LC-MS/MS usulida muvaffaqiyatli o‘lchangan.
• Astilbin, engeletin, quercitrin va proline betaine eng yuqori miqdorlarda topilgan.
• QZTBD podagrasimon sichqonlarda siydik kislotasi, yallig‘lanish, shish va og‘riqni kamaytirgan.
• Mikrobiota yo‘qotilganda bu ta’sirlarning bir qismi susaygan.
• Ichak mikrobiotasi murakkab o‘simlik vositalaridan faol moddalarni saralashga jalb qilinishi mumkin.

Tadqiqot nima demayapti?

• QZTBD insonlar uchun klinik tasdiqlangan podagra davosi ekanini ko‘rsatmayapti.
• Tanlangan 15 moddaning qat’iy yakuniy faol moddalar ekanini isbotlamayapti.
• Mikrobiota hosil qilgan yangi metabolitlarning kimyoviy tuzilishini ko‘rsatmayapti.
• To‘qqiz moddaning kamayishi faqat biotransformatsiya hisobiga bo‘lganini qat’iylashtirmayapti.
• Muayyan bir bakteriya turi QZTBD samarasiga to‘liq javobgar ekanini aytmayapti.
• Sichqonlardagi dozalarning odamlar uchun to‘g‘ri kelishini da’vo qilmayapti.
• A’zo indekslari o‘zgarmaganini to‘liq xavfsizlik kafolati deb ko‘rsatmayapti.
• 15 moddali panel barcha QZTBD mahsulotlari uchun rasmiy standart ekanini bildirmayapti.
• Insonlar mikrobiotasi farqlariga ko‘ra individual davolash tavsiyasini bermayapti.

Tadqiqot usullari va natijalari

Tajriba guruhlarining texnik xulosasi

Analitik saralash bosqichlarining raqamli xulosasi

Rasmlarning asosiy ilmiy mazmuni

Asosiy topilmalarning tizimli xulosasi

• UPLC-Q-TOF-MS^E yordamida 221 ta komponent kimyoviy sinflarga ajratildi.
• Massa aniqligi xatoligi ±5 ppm doirasida ushlab turildi.
• Zardobda prototip sifatida faqat 42 ta komponent aniqlandi.
• 179 ta komponent klassik zardob tahlili doirasidan tashqarida qoldi.
• Antibiotikdan so‘ng najasda 19 ta komponent to‘plandi.
• Inson podagra mikrobiotasi bilan inkubatsiyada ulardan 9 tasi kamaydi.
• 15 ta vakil modda uchun 28 daqiqalik LC-MS/MS-MRM usuli ishlab chiqildi.
• Tahlil qilingan moddalar 0,013 µg/g dan 315,430 µg/g gacha bo‘lgan keng miqdor oralig‘ini qamradi.
• QZTBD sichqonlarda siydik kislotasi va yallig‘lanish belgilarini yaxshiladi.
• Antibiotik aralashuvi ushbu ta’sirlarni qisman kuchsizlantirdi.
• Natijalar mikrobiota konversiyasini analitik saralashga kiritish amaliy jihatdan mumkinligini ko‘rsatdi.

Manba va uslubiyot eslatmasi

Ushbu sharh Xi Chen, Yi Zhao, Siyue Song, Fei Luo, Xixian Kong, Yu Lou, Ye Xu, Fusen Chen, Yanfang Bai, Kaiyue Shi, Yuqing Wang, Yutong Hua va Tiejuan Shao tomonidan tayyorlangan “A microbiota-informed UPLC-Q-TOF-MS^E and LC-MS/MS strategy for prioritizing potential bioactive constituents from complex herbal formulas: Application to Qu-Zhuo-Tong-Bi decoction” nomli ilmiy ishga asoslanadi.

Tadqiqot murakkab o‘simlik vositalaridagi potensial biologik faol komponentlarni saralash uchun yuqori aniqlikdagi kimyoviy profil, kalamush zardobi, kalamush najasi, antibiotikli mikrobiota modeli, inson najas mikrobiotasi inkubatsiyasi, maqsadli LC-MS/MS miqdoriy tahlili va podagrasimon sichqon modelini birlashtirgan eksperimental preprint maqoladir.

Matnda ochiqchasiga “This preprint research paper has not been peer reviewed” ogohlantirishi keltirilgan. Shu sababli tadqiqot ilmiy taqrizdan o‘tmagan. PDF da jurnal qabuli yoki tasdiqlangan rasmiy nashr ma’lumotlari berilmagan.

Tadqiqot insonlar ustidagi klinik davolash sinovi emas. Inson ishtirokchilaridan faqat najas namunalari olingan va laboratoriya sharoitida QZTBD bilan inkubatsiya qilingan. Odamlarga QZTBD berilmagan, ularda siydik kislotasi o‘zgarishi tekshirilmagan.

Farmakodinamik natijalar yuqori yog‘li parhez va MSU kristallari bilan chaqirilgan sichqon modeliga tayanadi. Sichqonlardagi ijobiy o‘zgarishlar insonlar uchun davolash kafolati, doza xavfsizligi yoki klinik samara deb qabul qilinmasligi kerak.

“Mikrobiota tomonidan o‘zgartirilishi mumkin bo‘lgan komponent” iborasi asosiy modda signalining antibiotikli va in vitro sharoitlarda kamayishiga asoslanadi. Hosil bo‘lgan mikrobial metabolitlar strukturaviy tavsiflanmagan.

UPLC-Q-TOF-MS^E bilan aniqlangan 221 moddaning bir qismi standartlar bilan tasdiqlangan, qolganlari esa massa, parchalanish va adabiyotlar asosida taxminiy ko‘rsatilgan.

Maqsadli LC-MS/MS usuli 15 ta moddani bir vaqtda o‘lchash uchun validatsiyalangan. Biroq har bir moddaning to‘liq sonli natijalari qo‘shimcha materiallarda berilgan.

Hayvonlar ustidagi tajribalar Chjejiang Xitoy Tibbiyoti Universiteti etik qo‘mitasi tomonidan IACUC-20240219-15 raqami bilan; inson najasi tadqiqoti esa 20240329-6 raqami bilan tasdiqlangan. Ishtirokchilardan yozma rozilik olingan.

Mualliflar manfaatlar to‘qnashuvi yo‘qligini bildirganlar. Tadqiqot Xitoy Milliy Tabiiy Fanlar Jamg‘armasi, Chjejiang Provinsiyasi Tabiiy Fanlar Jamg‘armasi va Yuqori Darajali Iste’dodlarni Qo‘llab-quvvatlash Dasturi tomonidan moliyalashtirilgan.

Ushbu maqola faqatgina yuklangan PDF dagi eksperimental protokollar, xromatogrammalar, parchalanish sxemalari, jadvallar, hayvonlar ma’lumotlari va mualliflar muhokamasiga asoslanib tayyorlangan. PDF da mavjud bo‘lmagan klinik muvaffaqiyat, mutlaq faol modda, tasdiqlangan mikrobial metabolit, inson xavfsizligi yoki tijoriy samara da’volari qo‘shilmagan.