Paklitaksel — hujayra bo‘linishiga ta’sir ko‘rsatuvchi va saraton kasalligini davolashda qo‘llaniladigan taksanlar sinfiga mansub birikmadir. Bakkatin III esa paklitakselni yarim sintetik yo‘l bilan ishlab chiqarishda qo‘llaniladigan asosiy taksan karkaslari va prekursorlaridan biridir. Ushbu birikmalar tarixan asosan Taxus (tiss) turlari bilan bog‘langan bo‘lsa-da, mazkur tadqiqot paklitaksel va Bakkatin III ning funduqning (o‘rmon yong‘og‘i) turli to‘qimalarida ham uchrashi mumkinligi haqidagi ilmiy izlanishlarga asoslanadi.

Mohammad Sina va uning hamkasblari beshta Eron funduq navining bargi, yashil tashqi po‘stlog‘i (g‘ilofi), qattiq qobig‘i, xom mag‘zi va qovurilgan mag‘zi namunalarida paklitaksel hamda Bakkatin III miqdorlarini o‘rgandilar. Tadqiq qilingan navlar: Segoush, Eshkevar, Nakhoni, Paraki va Shirvani. Shu tariqa beshta nav va beshta turli matritsaning kombinatsiyasidan iborat 25 ta nav-matritsa namunasi baholandi.

Funduq mag‘zini qovurish jarayoni 150°C haroratda bir soat davomida amalga oshirildi. Tadqiqotning muhim maqsadlaridan biri qovurish jarayoni paklitaksel va Bakkatin III ning o‘lchanadigan miqdorlarini o‘zgartiradimi-yo‘qmi, shuni aniqlashdan iborat edi.

Tahlildan oldin o‘simlik va yong‘oq matritsasi ultratovush yordamida dastlabki ekstraksiyadan o‘tkazildi, oqsillar va polisaxaridlar Karrez (Carrez) eritmalari yordamida cho‘ktirildi, so‘ngra dispersiv suyuqlik-suyuqlik mikroekstraksiyasi (DLLME) qo‘llanildi. DLLME bosqichida etanol disperslovchi erituvchi, 1-oktanol esa ekstraksiya erituvchisi sifatida ishlatildi.

Markaziy kompozit dizayn va javob yuzasi metodologiyasi (RSM) orqali optimallashtirilgan DLLME sharoitlari: 600 µl etanol, 60 µl 1-oktanol, 1 g NaCl va pH 6,5 deb belgilandi. Etanol va 1-oktanol hajmlarining bundan yuqori bo‘lishi suyulish effektini keltirib chiqarishi, 1 grammdan ortiq tuz miqdori esa o‘ta to‘yinish sharoitlari tufayli ekstraksiya unumdorligini pasaytirishi qayd etildi.

Xromatografik tahlil Agilent 1260 HPLC tizimi va UB-ko‘rinadigan (UV-Vis) detektori yordamida bajarildi. Ajratish uchun 250 × 4,6 mm o‘lchamdagi, 5 µm zarrachali C18 ustuni qo‘llanildi. Harakatchan faza metanol va deionizatsiyalangan suvdan 80:20 hajm/hajm nisbatida tayyorlandi; oqim tezligi 1,0 ml/daqiqa, aniqlash to‘lqin uzunligi 230 nm deb belgilandi.

Metodologiya bo‘limiga ko‘ra, Bakkatin III taxminan 3,0-daqiqada, paklitaksel esa taxminan 4,5-daqiqada elutsiya bo‘ldi. Moddalarning kimyoviy mansubligi namunalar cho‘qqilarini sertifikatlangan standartlarning ushlanish vaqtlari (RT) bilan solishtirish orqali aniqlandi.

Tadqiqotning eng yaqqol umumiy topilmasi shuki, paklitaksel va ayniqsa Bakkatin III ning eng yuqori darajalari funduq barglarida o‘lchandi. Paklitaksel barg namunalarida 4,54–17,56 µg/g quruq og‘irlik oralig‘ida, Bakkatin III esa 2-jadvalda 6 851,67–8 660 µg/g quruq og‘irlik oralig‘ida qayd etildi.

Bakkatin III uchun berilgan barg qiymatlari milligramm hisobiga o‘tkazilganda taxminan 6,85–8,66 mg/g quruq og‘irlikka to‘g‘ri keladi:

\[ 1000\ \mu\mathrm{g/g} = 1\ \mathrm{mg/g} \]

Shu sababli Bakkatin III ning barglarda o‘lchangan miqdori paklitaksel darajasidan yuzlab barobar yuqoridir. Biroq ushbu yuqori natijalarning faqat HPLC-UV ushlanish vaqti mosligiga tayanishi ularni mustaqil va strukturaviy jihatdan ancha selektiv usul (masalan, LC-MS/MS) bilan tasdiqlashni ayniqsa muhim qilib qo‘yadi.

Paklitaksel bo‘yicha barglarda eng yuqori ko‘rsatkich Segoush navida 17,56 ± 0,92 µg/g, eng past ko‘rsatkich esa Eshkevar navida 4,54 ± 0,24 µg/g deb bildirildi.

Bakkatin III ning barg natijalarida matn bilan jadval o‘rtasida hisobot farqi mavjud. Natijalar matnida eng yuqori qiymat Segoush navi uchun 8 515,32 ± 408,7 µg/g deb ko‘rsatilgan bo‘lsa, 2-jadval va issiqlik xaritasida Paraki navi 8 660 ± 415,6 µg/g bilan son jihatdan yuqoriroq turadi. Matnda Shirvani uchun 6 921,07 µg/g yozilgan bo‘lsa, jadvalda 6 851,67 µg/g berilgan.

Yashil tashqi po‘stloqda paklitakselning eng yuqori darajasi Shirvani navida 5,70 ± 0,28 µg/g, Bakkatin III ning eng yuqori darajasi ham Shirvani navida 6 662,37 ± 355,1 µg/g deb o‘lchandi.

Qattiq qobiqda eng yuqori paklitaksel miqdori Shirvani navida 5,30 ± 0,29 µg/g, eng yuqori Bakkatin III miqdori ham Shirvani navida taxminan 1 000,67 µg/g bo‘ldi.

Xom mag‘izda paklitaksel darajasi Segoush navida 4,15 ± 0,17 µg/g bilan eng yuqori nuqtaga yetdi. Paraki va Eshkevar navlarida esa mos ravishda taxminan 0,05 va 0,04 µg/g kabi juda past qiymatlar o‘lchandi.

Xom mag‘izda Bakkatin III faqat Segoush navida sezilarli miqdorda, ya’ni 43,72 ± 1,56 µg/g darajasida aniqlandi. Boshqa to‘rtta navda natijalar uslubiyotning aniqlash chegarasidan (LOD) past bo‘lib qoldi. Statistik tahlil maqsadida ushbu aniqlanmagan natijalar yarim LOD qiymati bo‘lgan 0,004 µg/g bilan ifodalangani tushuntirildi.

Qovurilgan mag‘izda paklitakselning eng yuqori darajasi Paraki navida 4,81 ± 0,23 µg/g, Bakkatin III ning eng yuqori darajasi esa Shirvani navida 67,22 ± 3,06 µg/g deb qayd etildi.

Tadqiqotning annotatsiyasi va xulosa qismi qovurilgan mag‘izlarda xom mag‘izlarga qaraganda yuqoriroq paklitaksel va Bakkatin III miqdorlari mavjudligini ta’kidlaydi. Biroq navlar kesimida qaralganda, bu o‘sish barcha namunalarda bir xil yo‘nalishda kechmagan.

Paklitaksel miqdori Segoush navida 4,15 dan 1,05 µg/g ga, Nakhoni navida esa 2,75 dan 2,46 µg/g ga kamaydi. Eshkevar, Paraki va Shirvani navlarida esa aksincha oshdi. Bakkatin III xom mag‘izda aniqlanmagan to‘rtta navda qovurilgandan so‘ng o‘lchanadigan darajaga chiqdi; ammo Segoush navida 43,72 dan taxminan 23,90 µg/g ga tushib ketdi.

Binobarin, ma’lumotlar qovurish jarayoni ko‘plab navlarda o‘lchanadigan taksanlar miqdorini oshirishi mumkinligini, biroq bu ta’sir birikmaga va funduq naviga bog‘liqligini ko‘rsatadi. “Qovurish barcha navlarda taksan miqdorini oshiradi” degan mutlaq xulosa mavjud ma’lumotlar bilan tasdiqlanmaydi.

Tadqiqotchilar qovurishdan keyin kuzatilgan o‘sishni yangi paklitaksel sintezining qat’iy isboti deb baholamadilar. Taklif etilgan tushuntirishlar qatoriga hujayra devorlarining parchalanishi, bog‘langan yoki yopiq taksanlarning erkin holatga o‘tishi, erituvchining matritsaga osonroq kirishi, ekstraksiya unumining ortishi hamda taksanlarni parchalovchi endogen fermentlarning issiqlik ta’sirida faolsizlanishi kiradi.

Bakkatin III o‘sishining bir qismi paklitakselning yon zanjirini yo‘qotishi yoki bog‘langan prekursorlarning ajralishi bilan bog‘liq bo‘lishi mumkinligi ham muhokama qilindi. Biroq tadqiqotda qovurishdan oldingi va keyingi kimyoviy konversiya mahsulotlari kuzatilmagan, massalar balansi tuzilmagan va paklitakselning Bakkatin III ga aylangani to‘g‘ridan-to‘g‘ri ko‘rsatilmagan.

Ishlab chiqilgan usul uchun paklitakselning qaytarib olish unumi 92,05–99,42%, Bakkatin III ning qaytarib olish unumi 92,59–98,53% oralig‘ida ekani bildirildi. Nisbiy standart og‘ish (%RSD) qiymatlari paklitaksel uchun 4,11–5,50%, Bakkatin III uchun 3,59–5,33% oralig‘ida bo‘ldi.

Paklitaksel uchun aniqlash chegarasi (LOD) 1,86–2,17 ng/g, miqdoriy aniqlash chegarasi (LOQ) 6,13–7,16 ng/g; Bakkatin III uchun LOD 2,11–2,35 ng/g, LOQ esa 6,96–7,75 ng/g deb berildi.

Shu bilan birga, to‘g‘ri chiziqli diapazon bo‘yicha maqola ichida jiddiy tafovutlar mavjud. Metodologiya va validatsiya matnida 1–1000 ng/g oralig‘i bildirilgan bo‘lsa, 1-jadvalda 1–500 000 ng/g, taqqoslash jadvalida esa 10–200 000 ng/g oraliqlari keltirilgan. Shu sababli uslubiyotning tasdiqlangan aniq ishchi diapazoni PDF dan yagona va izchil qiymat sifatida olinmaydi.

Bundan tashqari, 3-rasm izohida birinchi cho‘qqi paklitaksel, ikkinchi cho‘qqi Bakkatin III deb nomlangan. Bunga zid ravishda, metodologiya qismida 3,0-daqiqadagi birinchi cho‘qqi Bakkatin III ga, 4,5-daqiqadagi ikkinchi cho‘qqi esa paklitakselga tegishli deb yozilgan. Ushbu teskari nomlanish ham xromatogramma talqinida aniqlashtirilishi lozim bo‘lgan hisobot kamchiligidir.

Tadqiqot funduq yoki qovurilgan funduqni iste’mol qilish saratonni oldini oladi yoki davolaydi, degan xulosani bermaydi. Taksanlarning ozuqadan so‘rilishi, inson organizmidagi biologik o‘zlashtirilishi, metabolizmi, xavfsizligi, samarali dozasi yoki klinik natijalari o‘rganilmagan. O‘simlik to‘qimalarida o‘lchangan birikmalar miqdorini tibbiy paklitaksel terapiyasi bilan tenglashtirib bo‘lmaydi.

Tadqiqotning asosiy ilmiy muammosi

Paklitaksel murakkab molekulyar tuzilishga ega taksandir. Maqolaning kirish qismida uning tabiiy manbalardan ajratib olinishi va murakkab to‘liq sintez jarayonlari muqobil o‘simlik manbalarini izlashga turtki bergani ta’kidlanadi.

Funduq daraxtining bargi, tashqi po‘stlog‘i va qattiq qobig‘i kabi iste’mol qilinmaydigan qismlarida taksanlar uchrashi mumkinligi avvalroq qayd etilgan edi. Bunga qaramay, turli funduq navlari va to‘qimalarining ayni bir analitik usul bilan qiyoslanishi, ayniqsa qovurish jarayoni mag‘izdagi paklitaksel va Bakkatin III signalini qanday o‘zgartirishi yetarlicha o‘rganilmagan edi.

Tadqiqot uchta asosiy savolni ko‘rib chiqadi:

1. Paklitaksel va Bakkatin III funduqning qaysi to‘qimalarida yuqori miqdorda to‘planadi?
2. Beshta funduq navi o‘rtasida taksanlar taqsimoti qanday farqlanadi?
3. 150°C da bir soat davomida qovurish mag‘izda o‘lchanadigan paklitaksel va Bakkatin III miqdorlariga qanday ta’sir qiladi?

Tadqiqotning analitik tomonidagi ikkinchi masala yog‘, oqsil, uglevodlar va boshqa o‘simlik moddalariga boy murakkab funduq matritsasidan kam miqdordagi taksanlarni qisqa vaqtda va samarali ajratib olishdan iboratdir.

Paklitaksel va Bakkatin III o‘rtasidagi bog‘liqlik

Tadqiqotda paklitaksel bevosita saratonga qarshi qo‘llaniladigan dori moddasi, Bakkatin III esa paklitakselni ishlab chiqarishda ishlatiladigan prekursor tuzilma sifatida qaraladi.

Bakkatin III paklitakselning to‘liq molekulasi emas. U paklitakselga xos yon zanjirlarga ega bo‘lmagan asosiy taksan yadrosidir. Shu sababli namunada yuqori miqdorda Bakkatin III bo‘lishi aynan shuncha miqdorda paklitaksel borligini bildirmaydi.

Tadqiqotda Bakkatin III miqdorining ko‘plab to‘qimalarda paklitakseldan yuzlab barobar yuqori chiqishi funduq to‘qimalari tayyor paklitakseldan ko‘ra taksan prekursorlari yoki taksan karkasiga ancha boy bo‘lishi mumkinligini ko‘rsatadi. Biroq biosintetik oqim yoki o‘tish tezligi eksperimental o‘lchanmagan.

Qaysi funduq navlari va to‘qimalari o‘rganildi?

Namunalar Eronning Gilon viloyatiga qarashli Roudsar hududidan yig‘ib olindi. Beshta funduq navi quyidagilardir:

• Segoush,
• Eshkevar,
• Nakhoni,
• Paraki,
• Shirvani.

Har bir navda beshta matritsa baholandi:

• Barg,
• Yashil tashqi po‘stloq (g‘ilof),
• Qattiq jigarrang qobiq,
• Xom mag‘iz,
• Qovurilgan mag‘iz.

Shu tariqa 25 ta nav-matritsa kombinatsiyasi shakllantirildi. PDF da har bir navning nechta alohida daraxtdan, bog‘dan yoki mustaqil biologik namunadan terib olingani ochiq aytilmagan. Bunga qaramay, tayyorlangan har bir namuna asbobga uch marta kiritilgani (uch texnik takroriylik) bildirilgan.

Uch karra kiritish asbob va tahlilning takrorlanuvchanligini ko‘rsatadi, ammo mustaqil biologik namunalar bilan bir xil narsa emas. Biologik takroriyliklar sonining aniq berilmasligi navlar orasidagi tabiiy biologik tafovutlar qanchalik to‘liq aks etganini noaniq qoldiradi.

Namunalarni quritish va tayyorlash

Barglar va tashqi po‘stloqlar xona haroratida bir hafta davomida quritildi. Barglar tuyilgach 70 mesh, tashqi po‘stloqlar esa 25 mesh elakdan o‘tkazildi.

Butun funduq yong‘oqlari bir hafta xona haroratida quritildi, qolgan namlikni yo‘qotish uchun qo‘shimcha 24 soat to‘g‘ridan-to‘g‘ri quyosh nuri ostida qoldirildi. Xom mag‘izlar ajratilgach maydalandi, 25 mesh elakdan o‘tkazildi va keyingi tahlillar uchun 4°C da saqlandi.

Quyoshda quritishning taksanlar barqarorligiga ehtimoliy ta’siri alohida baholanmagan. Shu sababli o‘lchangan miqdorlar nafaqat yangi to‘qimaning dastlabki darajasini, balki quritish va saqlashdan keyin saqlanib qolgan o‘lchanadigan miqdorni ifodalaydi.

Qovurish jarayoni qanday o‘tkazildi?

Quritish pechi 150°C ga oldindan qizdirildi va namunalar bir soat davomida qovurildi. Issiqlik bir tekis taqsimlanishi uchun namunalar vaqti-vaqti bilan aralashtirib turildi.

Qovurishdan so‘ng namunalar xona haroratiga keltirildi va tahlil qilindi. Tadqiqotda:

• Mahsulotning ichki harorati,
• Namlik yo‘qotilishi,
• Suv faolligi,
• Pech ichidagi harorat taqsimoti,
• Qovurish oxiridagi rang yoki massa o‘zgarishi qayd etilmagan.

Shu sababli 150°C va 1 soat nominal sharoitlardir; har bir namunaning ichida erishilgan haqiqiy harorat yoki termik doza noma’lum.

Dastlabki ekstraksiya nima sababdan matritsalarga qarab o‘zgartirildi?

Funduq bargi, yashil po‘stlog‘i, qattiq qobig‘i va mag‘zi bir xil kimyoviy tarkibga ega emas. Barg lignotsellyuloza va pigmentlarga boy bo‘lsa, mag‘iz yuqori yog‘ miqdoriga ega mutlaqo boshqa matritsadir.

Tadqiqotchilar dastlabki etanol miqdorini har bir matritsa uchun bitta o‘zgaruvchili tajribalar bilan alohida baholadilar. Har bir sinovda 0,5 g maydalangan namuna ishlatildi; etanol hajmi 0 dan 4 ml gacha o‘zgartirildi.

Bu natijalar bir xil ekstraksiya erituvchisi barcha matritsalarda bir xil unum bermasligini ko‘rsatadi. Shunday bo‘lsa-da, umumiy mikroekstraksiya protokolida barcha namunalarga 3 ml etanol qo‘shilgani yozilgan, keyingi natijalar qismida esa matritsaga xos hajmlar ishlatilgani ta’kidlangan. Protokolni aniq qayta takrorlash uchun bu ikki ma’lumot uyg‘unlashtirilishi lozim.

Ultratovush yordamidagi ishlov berish

Namuna eritmasi ultratovush vannasida 40°C da ishlandi. Metodologiya bo‘limida ultratovush vaqti 30 daqiqa deb berilgan. Qovurish natijalari muhokama qilingan qismda esa “40°C da 15 daqiqa” iborasi ishlatilgan.

Ushbu vaqt tafovuti usulni takrorlashda muhimdir; chunki ultratovush davomiyligi hujayralar parchalanishiga, ekstraksiya unumiga va moddalarning ehtimoliy o‘zgarishiga ta’sir ko‘rsatishi mumkin.

Karrez (Carrez) eritmalari nima uchun ishlatildi?

Ultratovushdan va dastlabki santrifugalashdan so‘ng yuqori suyuqlikka 1 ml dan Carrez I va Carrez II eritmalari qo‘shildi. Maqsad oqsillar va polisaxaridlarni cho‘ktirib, toza ustki faza olish edi.

Biroq eritma tayyorlash izohida noaniqlik mavjud. Carrez I uchun kaliy geksatsianoferrati ishlatilgani aytilgan bo‘lsa, Carrez II uchun ham ayni kaliy geksatsianoferrati yozilgan. Materiallar bo‘limida esa rux asetat ham sotib olingan reaktivlar qatorida sanab o‘tilgan.

Demak, Carrez II ning aynan qaysi tuz bilan tayyorlangani PDF dan qat’iy aniqlanmaydi. Bu detal oqsillarni cho‘ktirish samaradorligi va usulni boshqa laboratoriyada qo‘llash uchun oydinlashtirilishi zarur.

DLLME usuli qanday ishlaydi?

Dispersiv suyuqlik-suyuqlik mikroekstraksiyasida (DLLME) kichik hajmdagi ekstraksiya erituvchisi disperslovchi erituvchi yordamida namuna eritmasi ichida juda mayda tomchilar holida tarqaladi. Tomchilarning umumiy kontakt yuzasi keskin kattalashgani sababli maqsadli birikmalar suvli namunadan ekstraksiya fazasiga juda tez o‘tadi.

Tadqiqotda:

• Disperslovchi erituvchi sifatida etanol,
• Ekstraksiya erituvchisi sifatida 1-oktanol,
• Tuzlash (salting-out) effekti uchun NaCl qo‘llanildi.

Optimallashtirilgan bosqichda namunaga 600 µl etanol va 60 µl 1-oktanol qo‘shildi, aralashma kuchli vortekslendi va 9 000 ayl/daqiqada 5 daqiqa santrifugalandi. Ajralgan 1-oktanol fazasi HPLC tizimiga kiritildi.

Tuzlash (Salting-out) effekti

Namunaga 1 g NaCl qo‘shilishi maqsadli moddalarning suvli fazadagi eruvchanligini pasaytirib, ularning 1-oktanol fazasiga o‘tishini kuchaytiradi deb qabul qilindi.

Tadqiqotda 0–2 g NaCl oralig‘i baholandi va eng yaxshi natija 1 g da olindi. 1 grammdan yuqori miqdorlarda eritmaning o‘ta to‘yinishi va ekstraksiya samaradorligining pasayishi kuzatildi.

Nima uchun 60 µL 1-oktanol ishlatildi?

Ekstraksiya erituvchisining hajmi juda kichik bo‘lganda maqsadli moddalar to‘plangan faza ancha yuqori konsentratsiyaga erishadi. Hajm oshgan sari esa ayni modda miqdori kattaroq hajmga tarqalib, suyulib ketadi.

Tadqiqotda eng yuqori boyitish ko‘rsatkichi 60 µl 1-oktanol bilan olindi. Yuqoriroq hajmlarda suyulish effekti ustunlik qilgani bildirildi.

Nima uchun 600 µL etanol tanlandi?

Etanol 1-oktanolning namuna eritmasi ichida mayda tomchilar holida bir tekis tarqalishini ta’minlaydi. Etanol hajmi 600 µl gacha ko‘tarilganda namuna bilan ekstraksiya fazasi kontakti yaxshilandi; undan yuqori hajmlarda esa moddalarning eritmada ko‘proq erib qolishi sababli signal kamaydi.

pH 6,5 tanlovining ma’nosi

Ekstraksiya pH qiymati 3 dan 9 gacha o‘rganildi va maksimal signal pH 6,5 da olindi. Tadqiqot kuchli kislotali yoki ishqoriy sharoitlarda analitlar strukturasi o‘zgarishi va ekstraksiya samarasiz bo‘lishini ta’kidlaydi.

Biroq kislota yoki ishqorda hosil bo‘lgan parchalanish mahsulotlari alohida tahlil qilinmagan. Shu sababli pH ta’siri xromatografik signalning kamayishiga asoslangan amaliy optimizatsiya natijasidir.

Markaziy kompozit dizayn va javob yuzasi usuli

DLLME ning to‘rtta o‘zgaruvchisi beshta darajada birgalikda o‘rganildi:

• Etanol hajmi: 300–1000 µl,
• 1-oktanol hajmi: 60–120 µl,
• pH: 3–9,
• NaCl miqdori: 0–2 g.

Jami 30 ta tajribadan iborat markaziy kompozit dizayn qo‘llanildi. Bu usul omillarning o‘zaro ta’sirlarini ham baholash imkonini berdi.

Tuzilgan ikkinchi darajali model uchun:

• F = 24,88,
• p < 0,0001,
• R² = 0,9587,
• Tuzatilgan R² = 0,9202,
• Bashorat qilingan R² = 0,8484,
• Adekvat aniqlik (adequate precision) = 20,449 deb qayd etildi.

Moslik yetishmovchiligi (lack of fit) testi F = 0,53 va p = 0,8135 bo‘ldi. Ushbu statistik ahamiyatsiz qiymat model eksperimental ma’lumotlarni yaxshi ifodalashini ko‘rsatadi.

R² qiymatlari qanday talqin qilinadi?

Determinatsiya koeffitsiyenti model tajribadagi o‘zgarishlarning qancha qismini tushuntirayotganini bildiradi:

\[ R^2 = 1 - \frac{\sum(y_i-\hat{y}_i)^2}{\sum(y_i-\bar{y})^2} \]

• \(y_i\) — tajribada o‘lchangan qiymatni,
• \(\hat{y}_i\) — model bashorat qilgan qiymatni,
• \(\bar{y}\) — barcha tajribalarning o‘rtacha qiymatini bildiradi.

R² = 0,9587 model tajriba natijalaridagi o‘zgarishlarning taxminan 95,87 foizini tushuntirishini bildiradi. Bashorat qilingan R² ning 0,8484 bo‘lishi model yangi sharoitlarni ham yetarlicha yuqori aniqlikda bashorat qila olishini ko‘rsatadi.

1-rasm nimani ko‘rsatadi?

1-rasmning birinchi panelida model bashoratlari bilan haqiqiy tajriba natijalari taqqoslangan. Nuqtalarning diagonal chiziq atrofida zich joylashishi modelning to‘g‘riligini tasdiqlaydi.

Ikkinchi panel qoldiqlarning normal ehtimollik grafigidir. Nuqtalarning to‘g‘ri chiziq bo‘ylab yotishi xatoliklarning normal taqsimlanganini bildiradi.

Uchinchi panel Box-Cox transformatsiyasi grafigidir. Optimal lambda 0,88 bo‘lib, ishonchlilik oralig‘i 0,65–1,05 ni tashkil etdi. Lambda = 1 ushbu oraliqqa kirgani sababli qo‘shimcha matematik o‘zgartirishga ehtiyoj yo‘qligi ma’lum bo‘ldi.

Quyi qatordagi uch o‘lchamli javob yuzalari:

• NaCl va etanol hajmi,
• pH va etanol hajmi,
• NaCl va 1-oktanol hajmi o‘rtasidagi o‘zaro ta’sirlarni aks ettiradi.

Yuzalarda eng yuqori unumdorlik 600 µl etanol, pH 6,5, 1 g NaCl va 60 µl 1-oktanol atrofida to‘plangani ko‘rinadi.

HPLC ajratish sharoitlari

Moddalarning identifikatsiyasi qanchalik ishonchli?

Paklitaksel va Bakkatin III ning aniqlanishi namuna cho‘qqilarining standartlar bilan bir xil ushlanish vaqtida chiqishiga asoslangan. Shuningdek, qovurilgan Eshkevar namunasiga standart qo‘shilganda cho‘qqilarning o‘sishi ko‘rsatilgan.

Bu yondashuv dastlabki identifikatsiya uchun xizmat qiladi, ammo HPLC-UV ushlanish vaqti molekulyar tuzilishni to‘liq tasdiqlash uchun mutlaq yetarli emas. Murakkab o‘simlik matritsasida ayni vaqtda elutsiya bo‘luvchi boshqa birikma 230 nm da yutilish berishi mumkin.

Tadqiqotda:

• Mass-spektrometriya (MS),
• Spektral cho‘qqi sofligi tahlili,
• Ikkinchi xromatografik ustun bilan tekshirish,
• Turli harakatchan fazada tasdiqlash,
• NMR tahlillari qo‘llanilmagan.

Ayniqsa barglarda qayd etilgan juda yuqori Bakkatin III miqdorlarini LC-MS/MS kabi selektiv usullar bilan mustaqil tekshirish zarur.

Kalibrlash tenglamalari

To‘g‘ri chiziqli kalibrlash tenglamasi:

[ y = mx + b ]

• \(y\) — xromatografik cho‘qqi maydoni,
• \(x\) — analit konsentratsiyasi,
• \(m\) — sezgirlik qiyaligi,
• \(b\) — erkin had.

Tadqiqotda berilgan tenglamalar:

Paklitaksel:

\[ y = 18242x - 27{,}593 \]

\[ R^2 = 0{,}9997 \]

Bakkatin III:

\[ y = 110{,}6x + 137{,}8 \]

\[ R^2 = 0{,}9991 \]

Har ikkala R² qiymati kuchli to‘g‘ri chiziqlilikni bildiradi. Biroq kalibrlash diapazoni matn va jadvallarda turlicha ko‘rsatilgan:

• Metodologiya va validatsiya matnida: 1–1000 ng/g,
• Standart tayyorlash qismida: 1–10 000 ng/ml,
• 1-jadvalda: 1–500 000 ng/g,
• 3-jadvalda: 10–200 000 ng/g.

Ushbu nomuvofiqliklar tufayli usulning aynan qaysi oraliqda tasdiqlangani to‘liq oydin emas.

Aniqlash va miqdoriy aniqlash chegaralari

Tadqiqotda aniqlash chegarasi signalning shovqinga nisbati 3 bo‘lganda, miqdoriy aniqlash chegarasi esa 10 bo‘lganda hisoblangan:

\[ S/N_{\mathrm{LOD}} = 3 \]

\[ S/N_{\mathrm{LOQ}} = 10 \]

3-jadvaldagi taqqoslash matnida “1 ng/ml LOD” iborasi ham ishlatilgan. Bu qiymat 1-jadvaldagi ng/g birligidagi matritsaga xos natijalar bilan to‘g‘ridan-to‘g‘ri taqqoslanmaydi.

Takrorlanuvchanlik: Nisbiy standart og‘ish (%RSD)

Nisbiy standart og‘ish formulasi:

\[ \mathrm{RSD}(\%) = \frac{s}{\bar{x}} \times 100 \]

• \(s\) — standart og‘ish,
• \(\bar{x}\) — o‘rtacha qiymat.

Paklitaksel uchun RSD qiymatlari 4,11–5,50%; Bakkatin III uchun 3,59–5,33% oralig‘ida bo‘ldi. Bu natijalar usulning o‘lchov o‘zgaruvchanligi taxminan 3,6–5,5 foiz doirasida ekanligini ko‘rsatadi.

Qaytarib olish unumi (Recovery)

Qaytarib olish unumi namunaga qo‘shilgan ma’lum miqdordagi standartning butun jarayondan so‘ng qancha qismi o‘lchanganini ko‘rsatadi:

\[ \mathrm{Qaytarib\ olish}(\%) = \frac{C_{\mathrm{qo‘shilgan\ namuna}}-C_{\mathrm{boshlang‘ich}}} {C_{\mathrm{qo‘shilgan}}} \times 100 \]

Eng past paklitaksel qaytarilishi qattiq qobiqda (92,05%), eng yuqorisi bargda (99,42%) bo‘ldi. Bakkatin III uchun eng pasti xom mag‘izda (92,59%), eng yuqorisi qattiq qobiqda (98,53%) qayd etildi.

Boyitish koeffitsiyenti (EF)

Tadqiqotda boyitish koeffitsiyenti ekstraksiya fazasidagi analit konsentratsiyasining boshlang‘ich eritmadagi konsentratsiyaga nisbati sifatida berilgan:

\[ EF = \frac{C_{\mathrm{ekstraksiya\ fazasi}}}{C_{\mathrm{namuna\ eritmasi}}} \]

Paklitaksel uchun 9,70–12,31; Bakkatin III uchun 10,30–12,82 oralig‘idagi EF qiymatlari olindi. Natijalar matnida Bakkatin III qiymatlari yoniga foiz belgisi qo‘yilgan bo‘lsa, 1-jadvalda ular o‘lchovsiz nisbat sifatida berilgan.

MANOVA natijalari: Matritsa muhimmi yoki nav?

Paklitaksel va Bakkatin III birgalikda bog‘liq o‘zgaruvchilar sifatida o‘rganilganda:

• Nav ta’siri: Pillai’s Trace = 1,325; F(8,50) = 12,26; p < 0,001; qisman η² = 0,662,
• Matritsa ta’siri: Pillai’s Trace = 1,819; F(8,50) = 62,63; p < 0,001; qisman η² = 0,909,
• Nav × matritsa o‘zaro ta’siri: Pillai’s Trace = 1,785; F(32,50) = 12,99; p < 0,001; qisman η² = 0,893 deb qayd etildi.

Qisman η² qiymatlariga ko‘ra, eng kuchli ta’sir matritsa turiga to‘g‘ri keladi. Nav bilan matritsa o‘rtasidagi o‘zaro ta’sir ham juda yuqori. Bu natija ma’lum bir navdagi taksanlar miqdori o‘simlik to‘qimasiga bog‘liq holda keskin o‘zgarishini ko‘rsatadi.

Masalan, Shirvani navi tashqi va qattiq qobiqda yuqori ko‘rsatkich bergan bo‘lsa, xom mag‘izda paklitaksel bo‘yicha Segoush, qovurilgan mag‘izda esa Paraki navi yetakchilik qildi.

2-rasm: Issiqlik xaritalarining tahlili

2-rasmning chap tomonidagi paklitaksel issiqlik xaritasi barglarning eng yuqori darajalarga ega ekanligini ko‘rsatadi:

• Segoush bargi 17,56 µg/g bilan eng yuqori paklitaksel qiymatiga ega.
• Shirvani tashqi po‘stlog‘i 5,70 µg/g, qattiq qobig‘i 5,30 µg/g bilan ajralib turadi.
• Paraki qovurilgan mag‘zi 4,81 µg/g bilan qovurilgan namunalar ichida eng yuqori bo‘ldi.
• Eshkevar va Paraki xom mag‘izlarida paklitaksel juda past miqdorda bo‘ldi.

O‘ng tomondagi Bakkatin III issiqlik xaritasida barglar taxminan 6 852–8 660 µg/g oralig‘i bilan boshqa barcha to‘qimalardan keskin ajralib turadi. Tashqi po‘stloq ikkinchi, qattiq qobiq uchinchi darajani egallagan. Mag‘izdagi qiymatlar ularga nisbatan juda past bo‘lib qolgan.

Barg natijalari

Paklitaksel bo‘yicha dispersiyalar teng bo‘lmagani sababli Uelch (Welch) ANOVA ishlatildi va navlar orasida kuchli farq aniqlandi (Welch F = 902,79; p < 0,001).

Bakkatin III uchun esa Welch F = 0,39 va p = 0,81 bo‘ldi. O‘rtacha qiymatlar farq qilsa-da, guruh ichidagi yuqori o‘zgaruvchanlik tufayli navlar o‘rtasidagi farq statistik jihatdan ahamiyatsiz deb topildi.

Yashil tashqi po‘stloq natijalari

Paklitaksel va Bakkatin III uchun eng yuqori tashqi po‘stloq ko‘rsatkichlari Shirvani navida qayd etildi.

Qattiq qobiq natijalari

Shirvani qattiq qobig‘i har ikkala modda bo‘yicha ham eng yuqori natijalarni ko‘rsatdi.

Xom mag‘iz natijalari

Xom mag‘izda Bakkatin III faqat Segoush navida aniqlandi, qolgan to‘rtta navda LOD dan past bo‘ldi.

Qovurilgan mag‘iz natijalari

Qovurilgan namunalarda paklitaksel bo‘yicha Paraki, Bakkatin III bo‘yicha esa Shirvani navi ustun keldi.

Xom va qovurilgan mag‘izlarning to‘g‘ridan-to‘g‘ri qiyosi

Ushbu jadval qovurish ta’sirining yo‘nalishi nav va moddaga qarab turlicha ekanligini yaqqol ko‘rsatadi.

Qovurish haqiqatan ham yangi paklitaksel hosil qildimi?

Tadqiqot bunga qat’iy javob bermaydi. Qovurishdan keyin xromatografik signalning oshishi quyidagi sabablar oqibati bo‘lishi mumkin:

• Hujayra strukturasining yemirilishi va ekstraksiyaning osonlashishi,
• Bog‘langan yoki yopiq taksanlarning erkin holatga o‘tishi,
• Taksanlarni parchalovchi fermentlarning issiqlikda faolsizlanishi,
• Biror taksan hosilasining kimyoviy transformatsiyasi.

Shuningdek, qovurish paytida namlik yo‘qolishi quruq og‘irlik hisobidagi konsentratsiyani sun’iy ravishda oshirib ko‘rsatishi mumkin. Biroq tadqiqotda kütle balansi berilmagani sababli bu ta’sir alohida hisoblanmagan.

3-rasm: Standart qo‘shilgan xromatogramma

3-rasmda qovurilgan Eshkevar namunasining standart qo‘shilishidan oldingi va 50 ng/g aralash standart qo‘shilgandan keyingi xromatogrammalari berilgan.

Standart qo‘shilgach cho‘qqilarning mutanosib o‘sishi maqsadli moddalarning to‘g‘ri aniqlanganini tasdiqlaydi.

Biroq rasm izohida 1-cho‘qqi paklitaksel, 2-cho‘qqi Bakkatin III deb nomlangan. Metodologiyada esa Bakkatin III 3,0-daqiqada, paklitaksel 4,5-daqiqada chiqishi aytilgan. Rasmda birinchi cho‘qqi taxminan 3,0, ikkinchisi 4,5-daqiqada joylashgan. Shu sababli rasm izohidagi nomlar teskari yozilgan ko‘rinadi.

Funduq barglarining xomashyo sifatidagi ahamiyati

Tadqiqot eng yuqori taksan miqdorlari barglarda bo‘lgani sababli funduq bog‘lari barglarini potensial tabiiy taksan manbasi sifatida ko‘rib chiqadi.

Biroq sanoat xomashyosi bo‘lishi uchun quyidagilar ham zarur:

• Barg biomassasining umumiy hajmi,
• Mavsumiy o‘zgarishlar,
• Tozalash unumi va xarajatlari,
• Taksanlarning to‘liq kimyoviy tasdig‘i,
• Partiyalararo barqarorlik.

Funduq iste’moli va saraton haqida tadqiqot nima deydi?

Maqolaning amaliy qo‘llanilish bo‘limida paklitaksel va Bakkatin III ning saratonga qarshi xususiyatlariga tayanib, funduqni kundalik ovqatlanish ratsioniga kiritish tavsiya etiladi.

Biroq tadqiqotda:

• Odamlar yoki hayvonlar funduq bilan oziqlantirilmagan,
• Taksanlarning hazm bo‘lishi va so‘rilishi o‘rganilmagan,
• Qondagi taksan darajalari o‘lchanmagan,
• Saraton hujayralari yoki o‘sma modellari sinab ko‘rilmagan.

Shu sababli “funduq yeyish saratonni davolaydi” yoki “qovurilgan funduq saratonning oldini oladi” degan xulosalarni chiqarish mutlaqo asossizdir.

Tadqiqotning kuchli tomonlari

• Beshta nav va beshta to‘qima/matritsa bir tadqiqotda qiyoslangan.
• Iste’mol qilinadigan va qilinmaydigan qismlar birga o‘rganilgan.
• Xom va qovurilgan mag‘izlar to‘g‘ridan-to‘g‘ri solishtirilgan.
• DLLME sharoitlari markaziy kompozit dizayn va RSM bilan optimallashtirilgan.
• LOD, LOQ, RSD, qaytarib olish unumi va boyitish koeffitsiyenti keltirilgan.
• MANOVA orqali nav, matritsa va ularning o‘zaro ta’siri baholangan.
• Standart qo‘shilgan xromatogrammalar bilan maqsadli cho‘qqilar tasdiqlangan.

Tadqiqotning cheklovlari

• Tadqiqot ilmiy taqrizdan o‘tmagan preprint hisoblanadi.
• Identifikatsiya faqat HPLC-UV ushlanish vaqtiga asoslangan, LC-MS/MS bilan tasdiqlanmagan.
• Barglardagi o‘ta yuqori Bakkatin III miqdorlari mustaqil tasdiqlanmagan.
• Mustaqil biologik takroriyliklar soni ochiq ko‘rsatilmagan.
• Qovurish paytidagi haqiqiy ichki harorat va namlik yo‘qotilishi o‘lchanmagan.
• Qovurish faqat bitta harorat (150°C) va bitta vaqtda (1 soat) sinab ko‘rilgan.
• Matn va 2-jadval o‘rtasida ayrim konsentratsiya qiymatlarida tafovutlar bor.
• 3-rasm izohidagi cho‘qqi nomlari teskari yozilgan.
• To‘g‘ri chiziqli diapazon matn va jadvallarda turlicha berilgan.
• Carrez II tarkibi aniq emas.
• Ultratovush vaqti bir joyda 30, boshqa joyda 15 daqiqa deb yozilgan.
• Insonlar tomonidan iste’mol qilinishi yoki klinik ta’siri o‘rganilmagan.

Tadqiqot nima demoqda?

• Paklitaksel va Bakkatin III signallari beshta Eron funduq navining turli to‘qimalarida o‘lchandi.
• Matritsa turi taksanlar taqsimotida nav ta’siridan ancha kuchli omildir.
• Barglar har ikki birikma uchun eng yuqori darajalarni ko‘rsatdi.
• Bakkatin III ko‘plab to‘qimalarda paklitakseldan ancha ko‘p miqdorda qayd etildi.
• Yashil po‘stloq va qattiq qobiq ham o‘lchanadigan taksanlarni saqlaydi.
• Qovurish ko‘pgina navlarda o‘lchanadigan miqdorlarni oshirdi, ammo bu ta’sir nav va moddaga bog‘liq bo‘ldi.
• 600 µl etanol, 60 µl 1-oktanol, 1 g NaCl va pH 6,5 DLLME uchun optimal sharoit deb topildi.
• Usul taxminan 92–99% qaytarish va 10–13 barobar boyitish berdi.

Tadqiqot nima demayapti?

• Funduq iste’mol qilish saratonni davolashi yoki oldini olishini ko‘rsatmaydi.
• Funduqdagi paklitaksel ichakdan so‘rilishini isbotlamaydi.
• Qovurish barcha navlarda taksanlarni oshiradi degan mutlaq qoidani bermaydi.
• Qovurishda yangi paklitaksel sintezlanganini bevosita isbotlamaydi.
• Cho‘qqilarning kimyoviy tuzilishini mass-spektrometriya bilan tasdiqlamaydi.
• Funduq barglari iqtisodiy jihatdan tayyor farmatsevtik manba ekanini ko‘rsatmaydi.

Tadqiqot usullari va natijalari

Tajriba dizaynining texnik xulosasi

Optimallashtirilgan DLLME sharoitlari

Javob yuzasi modelining statistik ko‘rsatkichlari

HPLC usulining validatsiya xulosasi

Matritsalar bo‘yicha umumiy taqsimot

MANOVA va ANOVA natijalari

Rasmlarning asosiy xabarlari

Texnik xulosalar

• Ikki taksan darajasiga eng kuchli ta’sir ko‘rsatgan omil to‘qima/matritsa turi bo‘ldi.
• Nav ta’siri ayniqsa paklitakselda yaqqol namoyon bo‘ldi.
• Nav va matritsa o‘rtasidagi kuchli o‘zaro ta’sir yagona “eng boy nav”ni belgilashga yo‘l qo‘ymaydi.
• Barglar har ikki birikma bo‘yicha eng yuqori darajalarga ega bo‘ldi.
• Bakkatin III miqdori barg va qobiqlarda paklitakseldan yuzlab barobar yuqori bo‘ldi.
• Qovurish uchta navda paklitakselni oshirdi, ikkitasida kamaytirdi.
• Bakkatin III to‘rtta navda qovurishdan so‘ng o‘lchanadigan darajaga chiqdi; Segoush da kamaydi.
• Qovurish ta’siri bir tomonlama emas va navga bog‘liqdir.
• DLLME-HPLC usuli qisqa vaqt va 10–13 barobar boyitishni ta’minladi.

Manba va uslubiyot eslatmasi

Ushbu sharh Mohammad Sina, Seyedeh Zahra Nasirifar, Sahar Shamsifar, Seyede Marzieh Hosseini, Marzieh Kamankesh va Abdorreza Mohammadi tomonidan tayyorlangan “Monitoring of Paclitaxel and Baccatin III in different hazelnut matrices and varieties: Investigation of roasting effects in hazelnut kernel using an efficient microextraction method coupled with liquid chromatography” nomli ilmiy ishga asoslanadi.

Tadqiqot beshta Eron funduq navining barg, yashil po‘stloq, qattiq qobiq, xom mag‘iz va qovurilgan mag‘iz namunalarida paklitaksel hamda Bakkatin III darajalarini o‘lchagan eksperimental preprint maqoladir.

Matnda ochiqchasiga “This preprint research paper has not been peer reviewed” ogohlantirishi keltirilgan. Shu sababli tadqiqot ilmiy taqrizdan o‘tmagan. PDF da jurnal qabuli yoki tasdiqlangan rasmiy nashr ma’lumotlari berilmagan.

Tahlil ultratovushli dastlabki ekstraksiya, Karrez cho‘ktirish, DLLME va HPLC-UV o‘lchovlariga tayanadi. Moddalar sertifikatlangan standartlar bilan ushlanish vaqtini solishtirish orqali aniqlangan.

Tadqiqotda mass-spektrometriya kabi mustaqil strukturaviy tasdiqlovchi usul qo‘llanilmagan. Shu sababli barglardagi o‘ta yuqori Bakkatin III natijalarini LC-MS/MS kabi selektiv usullar bilan tasdiqlash talab etiladi.

Chiziqli diapazon, ayrim ushlanish vaqtlari, Carrez II tarkibi va ultratovush vaqti bo‘yicha matn ichida tafovutlar mavjud.

Qovurish tajribasi 150°C da 1 soatlik bitta sharoit bilan cheklangan. Ko‘payishning yangi sintez yoki osonroq ajralish hisobiga ekani to‘g‘ridan-to‘g‘ri isbotlanmagan.

Tadqiqot klinik sinov emas. Insonlarda funduq iste’moli, paklitaksel so‘rilishi, saraton xavfi yoki davolash ta’siri o‘rganilmagan. O‘lchangan taksan darajalari funduqni saratonga qarshi vosita sifatida qo‘llash mumkinligini isbotlamaydi.

Mualliflar manfaatlar to‘qnashuvi yo‘qligini bildirganlar.

Ushbu maqola faqatgina yuklangan PDF dagi eksperimental protokollar, jadvallar, rasmlar, raqamli natijalar va mualliflar muhokamasiga asoslanib tayyorlangan. Unda mavjud bo‘lmagan klinik foyda, saratonni oldini olish, iste’mol tavsiyasi yoki sanoat ishlab chiqarishi kafolatlari qo‘shilmagan.