Tuberomeba capitovia, Rusya'daki Ladoga Gölü'nde yetiştirilen gökkuşağı alabalıklarının bulunduğu bir kafesten alınan su ve organik madde örneğinden izole edilen, küçük ve monotaktik hareket gösteren yeni bir Amoebozoa türüdür. İzolat W215SH8 başlangıçta tatlı su kültüründe kolayca fark edilmemiş; örneğin tuzluluğu yapay olarak 18‰'ye çıkarıldığında aktif trofozoitler belirgin hale gelmiş ve klonal kültüre alınmıştır. Işık mikroskobisi, transmisyon elektron mikroskobisi, SSU rRNA ve aktin gen dizileri ile filogenetik analizlerin birlikte değerlendirilmesi, bu amibin daha önce taksonomik olarak tanımlanmamış “Tubulinea group 02” soyuna ait olduğunu göstermiştir. Araştırmacılar bu soy için Tuberomeba gen. nov. adında yeni bir cins, W215SH8 izolatı için ise Tuberomeba capitovia sp. nov. adında yeni bir tür önermiştir.

T. capitovia'nın hareketli hücreleri yaklaşık 11-22 µm uzunluğunda, 3,5-6 µm genişliğinde ve çoğunlukla silindirik-uzamış biçimdedir. Uroid olarak adlandırılan arka bölgede 3-4 adet yapışkan villus görülebilir. Hücreler tek çekirdek, tek kontraktil vakuol, çok sayıda sindirim vakuolü ve çekirdek çevresinde kümelenmiş tübüler kristalı mitokondriler içerir. Tür ayrıca 4,5-7 µm çapında, tek katmanlı fibröz duvarlı kistler oluşturur. Moleküler filogenide Tuberomeba soyunun en yakın bilinen akrabası Ptolemeba olarak belirlenmiştir. Bununla birlikte balıklarla tekrarlayan birliktelik gözlenmiş olsa da çalışma T. capitovia'nın balık hastalığına yol açan bir patojen olduğunu göstermemektedir.

Monotaktik amip nedir?

Monotaktik morfotip, hücrenin tek ana eksen boyunca ilerlediği, genellikle silindirik veya uzamış monopodial bir gövde oluşturduğu ve granüloplazmanın tek yönlü aktığı bir amip hareket biçimidir.

Bu görünüm farklı Amoebozoa soylarında bağımsız olarak gelişebildiği için yalnız hücre şekline bakarak güvenilir taksonomik sınıflandırma yapmak mümkün değildir. Birbirine mikroskobik olarak çok benzeyen iki monotaktik amip, genetik açıdan uzak akraba olabilir.

Bu nedenle günümüzde morfoloji ile SSU rRNA, aktin ve diğer moleküler belirteçlerin birlikte değerlendirilmesi özellikle önemlidir.

Tuberomeba capitovia Nereden İzole Edildi?

W215SH8 suşu, Rusya'nın Karelya bölgesindeki Ladoga Gölü'nün Mustalahti Körfezi'nde kültüre alınan gökkuşağı alabalıklarının bulunduğu bir kafesten toplanan su ve askıda organik madde örneğinden elde edilmiştir.

Önemli nokta, organizmanın doğrudan alabalığın karaciğer, böbrek veya solungaç dokusundan değil, balık yetiştirme kafesinin çevresindeki sudan izole edilmiş olmasıdır.

Örnekler üç farklı tuzluluk koşuluna aktarılmıştır:

• 0,3‰
• 18‰
• 30‰

Aktif monotaktik amipler 18‰ kültürde fark edilmiş, tek hücre izolasyonu yapılarak iki kez klonlanmış ve daha sonra 15-18‰ yapay deniz suyunda kültürde tutulmuştur.

Neden Tatlı Su Örneğine Tuz Eklendiğinde Amip Ortaya Çıktı?

Çalışmanın ilginç sonuçlarından biri, W215SH8'in deneylerde tatlı suda iyi çoğalabilmesine rağmen başlangıçtaki 0,3‰ kültürde kolayca tespit edilememesidir.

Yazarlar bunun en olası nedenini amiplerin tatlı su koşullarında uzun süre kistleşmiş halde kalması olarak yorumlamaktadır. Aktif trofozoit sayısı çok düşük olduğunda organizma rutin mikroskobik taramada gözden kaçabilir.

18‰'lik yapay mineralizasyon ise hücrelerin aktif hale gelip çoğalmasını ve dolayısıyla mikroskop altında fark edilmesini kolaylaştırmıştır.

Hücrelerin genel görünümü

Hareket sırasında trofozoitler monopodial ve sub-silindirik yapıdadır. Arka kısım hafif daralırken ön uç yuvarlaktır.

Ölçülen 100 canlı hücre için:

İki farklı hareket stratejisi

Çalışmada T. capitovia'nın iki belirgin hareket biçimi gözlenmiştir.

Hızlı hareket stratejisinde hücre uzar, daha solucansı bir görünüm alır ve uzunluk/genişlik oranı 4'ün üzerine çıkabilir. Hücre sinüzoidal bir güzergâhta ilerleyebilir ve yönünü tüm hücreyi kıvırarak değiştirir.

Daha yavaş hareket stratejisinde hücre daha kısa ve geniştir. Belirli bir doğrultu izlemez ve yön değiştirirken lateral psödopodlar çıkarır.

Sayfa 45'teki Şekil 1A-C hızlı hareketi, D-G ise lateral psödopod kullanılarak gerçekleşen yön değişimini göstermektedir.

Tuberomeba'yı Diğer Küçük Monotaktik Amiplerden Ayıran Özellikler Nelerdir?

Tuberomeba cinsinin tanısında birkaç morfolojik özellik birlikte kullanılmaktadır.

• Belirsiz veya süreksiz ön hyalin bölge
• Tek eksenli monotaktik hareket
• Uroid bölgesinde yapışkan villuslar
• Plazma membranında görünür glikokaliks bulunmaması
• Tek katmanlı fibröz kist duvarı
• Çekirdek çevresinde kümelenmiş mitokondriler
• Dallanmış ve bükülmüş tübüler mitokondri kristaları

Özellikle uroid üzerindeki yapışkan villuslar ve mitokondri ultrastrüktürü, morfolojik olarak benzer diğer monotaktik cinslerden ayrımda önemlidir.

Uroidal villuslar

Hareketli hücrelerin arka ucunda genellikle 3-4 adet ince, ışınsal yapışkan villus oluşmaktadır.

Bu özellik Ptolemeba ile yüzeysel benzerlik gösterse de Ptolemeba türlerinde villuslar bulböz bir uroid üzerinden gelişir ve yapışkan değildir.

Çekirdek ve kontraktil vakuol

Hücrelerde tek bir veziküler çekirdek bulunmaktadır.

Kontraktil vakuol hareket sırasında çoğunlukla hücrenin arka kısmında bulunur.

Elektron mikroskobunda ne görüldü?

Transmisyon elektron mikroskobisi hücrelerin ultrastrüktürünü ayrıntılı biçimde göstermiştir.

Mitokondriler:

• çekirdeğin çevresinde yoğunlaşır,
• elektron yoğun matrikse sahiptir,
• tübüler, kıvrımlı ve düzensiz kristalar içerir.

Mitokondrilerin kesit çapı yaklaşık 0,1-0,8 µm arasındadır.

Kaba endoplazmik retikulum hücre periferinde yığınlar halinde görülmektedir.

Plazma membranının üzerinde belirgin bir glikokaliks tabakası saptanmamıştır.

Tuberomeba capitovia Kist Oluşturuyor mu?

Evet. W215SH8 kültürde düzenli olarak kist oluşturmuştur.

Kistler:

• küreseldir,
• 4,5-7 µm çapındadır,
• ortalama yaklaşık 6 µm'dir,
• tek katmanlı fibröz bir duvara sahiptir,
• kist duvarı yaklaşık 0,2 µm kalınlıktadır.

Elektron mikroskobisinde kist sitoplazmasının trofozoit sitoplazmasından daha elektron yoğun olduğu ve mitokondrilerin yine çekirdek çevresinde toplandığı görülmüştür.

Sayfa 45'teki Şekil 1K-L ışık mikroskobundaki kistleri, Şekil 1O ve R ise elektron mikroskobunda kist ve tek katmanlı fibröz duvarı göstermektedir.

SSU rRNA sonucu

W215SH8 için elde edilen SSU rRNA dizisi:

• 1231 baz çifti uzunluğundadır.
• G+C içeriği %39,4'tür.

Filogenetik analiz W215SH8'i daha önce “Tubulinea group 02” olarak anılan soyun içine güçlü biçimde yerleştirmiştir.

En yakın suş:

Tubulinea sp. 4388

olmuştur.

İki suş arasındaki SSU rRNA dizi farkı yalnızca:

%0,41

olarak hesaplanmıştır.

Yazarlar morfolojik farkların da belirgin olmaması nedeniyle W215SH8 ve 4388 suşunu aynı tür içinde değerlendirmektedir.

SSU rRNA Tek Başına Yeni Cinsi Tanımlamak İçin Yeterli miydi?

Hayır. Araştırmacılar yalnız SSU rRNA dizisine dayanmamış, aktin genini ve iki genin birlikte analiz edildiği birleştirilmiş filogenetik veri setini de kullanmıştır.

Bunun nedeni, Tubulinea group 02 soyunun çok uzun bir filogenetik dal oluşturması ve long-branch attraction olarak bilinen analiz artefaktına açık olmasıdır.

Aktin geni ne gösterdi?

W215SH8'den iki farklı aktin paralogu elde edilmiştir.

Diziler:

• 1108 bp
• 742 bp

uzunluğundadır.

Nükleotid düzeyindeki fark %23,6 olsa da bunun büyük bölümü kodlamayan bölgelerde yer almaktadır. Aminoasit düzeyinde paraloglar yalnız tek aminoasit bakımından farklıdır ve bu yaklaşık %0,54 fark anlamına gelir.

İlk paralogda daha önce başka Amoebozoa türlerinde tanımlanmamış üç intron bulunmuştur.

Ptolemeba ile akrabalık

SSU rRNA ağacında Tubulinea group 02, Ptolemeba cinsinin kardeş grubu olarak ortaya çıkmıştır.

Aktin gen analizinde de W215SH8 ile Ptolemeba bulliensis güçlü destek alan ortak bir klad oluşturmuştur.

SSU rRNA + aktin birleştirilmiş analizinde Tuberomeba–Ptolemeba kardeşliği:

1 / 100 / 92

Bayesçi posterior / IQ-TREE bootstrap / RAxML bootstrap desteği almıştır.

Sayfa 48'deki birleşik filogenetik ağaç, bu ilişkinin tek bir gen analizine bağlı olmadığını açık biçimde göstermektedir.

Long-Branch Attraction Nedir ve Bu Çalışmada Neden Önemlidir?

Long-branch attraction (LBA), hızlı evrimleşen ve uzun filogenetik dallara sahip soyların gerçek akrabalıkları nedeniyle değil, aynı pozisyonlarda bağımsız olarak çok sayıda mutasyon biriktirmeleri nedeniyle yanlış biçimde birbirine yakın yerleştirilmesidir.

Tubulinea group 02 oldukça uzun bir dal oluşturduğu için önceki bazı analizlerde Centropyxis gibi ilgisiz uzun dallı taksonlara yanlış biçimde yaklaşmıştır.

Bu çalışmada araştırmacılar başka bir LBA'ya duyarlı soy olan Flabellula'yı da veri setine eklemiştir.

Flabellula beklendiği gibi bazı analizlerde ilgisiz gruplara kayma eğilimi gösterirken Tubulinea group 02 bütün analizlerde Ptolemeba'nın kardeşi olarak kalmıştır.

Yazarlar bu sonucu Tuberomeba'nın filogenetik yerleşiminin LBA artefaktına karşı nispeten dayanıklı olduğunun kanıtı olarak yorumlamaktadır.

Tuberomeba capitovia Hangi Tuzluluklarda Yaşayabiliyor?

Tuzluluk toleransı deneyleri 0,3‰, 15‰, 20‰ ve 25‰ koşullarında gerçekleştirilmiştir. İlk örnekleme aşamasında ayrıca 30‰ kültür de kullanılmıştır.

Bu sonuçlar W215SH8'in yaklaşık 0,3-20‰ arasında geniş bir tuzluluk toleransına sahip olduğunu göstermektedir.

Tatlı suda en yüksek büyüme neden izolasyon sırasında görülmedi?

Deneylerde 0,3‰ tatlı su en yüksek hücre yoğunluklarından birini oluşturmuştur.

Buna rağmen orijinal örnek tatlı su ortamında kültüre edildiğinde aktif amipler fark edilmemiştir.

Yazarların açıklamasına göre bunun nedeni hücrelerin tatlı su ortamında hızla kistleşmesi olabilir.

Bu durum Tuberomeba gibi küçük türlerin rutin kültür ve mikroskop çalışmalarında olduğundan daha nadir görünmesine neden olabilir.

Balıklarla İlişki Ne Kadar Güçlü?

Yeni cinsle ilişkilendirilen bilinen suşların tamamına yakını tatlı su balıklarıyla bağlantılı örneklerden elde edilmiştir.

Önceki Tubulinea group 02 suşları:

• kadife balığının karaciğerinden,
• sazanın karaciğerinden,
• tatlı su kedi balığının karaciğer ve böbreğinden

izole edilmiştir.

W215SH8 ise gökkuşağı alabalığı yetiştirme kafesinin suyundan elde edilmiştir.

Balık bulunmayan sulardan bu soyun şimdiye kadar raporlanmamış olması, araştırmacılara göre tekrarlayan bir balık ilişkisine işaret edebilir.

Tuberomeba capitovia Balıklarda Hastalık Yapan Bir Parazit midir?

Bu çalışma buna dair kanıt sunmamaktadır.

Önceki suşların izole edildiği balıkların sağlık durumları bilinmemektedir ve W215SH8 doğrudan balık dokusundan değil, balık kafesindeki sudan izole edilmiştir.

Ayrıca bu amiplerin standart besiyerlerinde balık hücresine ihtiyaç duymadan çoğalabilmesi, varsa balık ilişkilerinin zorunlu bir parazitlik olmadığını düşündürmektedir.

Bu nedenle çalışma Tuberomeba'nın:

• patojen olduğunu,
• alabalık hastalığına neden olduğunu,
• balıklarda doku hasarı oluşturduğunu

göstermemektedir.

Balıklarla ilişkinin ekolojik niteliğinin belirlenmesi için deneysel enfeksiyon, histopatoloji ve saha taramalarına ihtiyaç vardır.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Bütünleşik taksonomik yaklaşım

Filogenetik veri setleri

Maximum likelihood analizleri IQ-TREE ve RAxML ile, Bayesçi analiz ise MrBayes ile gerçekleştirilmiştir.

Maximum likelihood destekleri 1000 bootstrap tekrarına dayanmıştır. Bayesçi analiz 20 milyon jenerasyonluk MCMC zincirleriyle yürütülmüştür.

Tuberomeba cinsinin resmi tanısı

Yeni cins şu temel özelliklerle tanımlanmıştır:

• Monotaktik amipler
• İleri hareket sırasında granüloplazmayla birleşen belirsiz hyalin kap
• Yön değiştirirken belirginleşen frontal hyaloplazma
• Uroid üzerinde yapışkan villuslar
• Belirgin glikokaliks olmaması
• Tek katmanlı fibröz kistler
• Dallanmış, kıvrılmış tübüler kristalı mitokondriler
• Mitokondrilerin çekirdek çevresinde kümelenmesi

Yeni türün resmi tanısı

Tuberomeba capitovia için:

• Hücre uzunluğu: 11-22 µm
• Hücre genişliği: 3,5-6 µm
• Çekirdek: 1,9-3 µm
• Nükleolus: 1,1-1,9 µm
• Kist çapı: 4,5-7 µm
• Kist duvarı: yaklaşık 0,2 µm

tanısal ölçüler olarak verilmiştir.

İsim nereden geliyor?

Tuberomeba adı Latince “tuber”, yani yumru kelimesinden türetilmiştir.

Yazarlar yavaş hareket eden ve arka tarafında villuslar bulunan hücrelerin filizlenmiş patates yumrularını andırdığını belirtmektedir.

capitovia tür adı ise Rusça “Kartoshka-Kapitoshka” adlı yumuşak oyuncak patatesin latinleştirilmiş adından türetilmiştir.

ZooBank kayıtları

Çalışmada yeni cins ve tür için ZooBank LSID kayıtları verilmiştir.

Tuberomeba gen. nov. ve Tuberomeba capitovia sp. nov. bu kayıtlarla nomenklatür sistemine dahil edilmiştir.

Çalışmanın doğrudan desteklediği sonuçlar

• W215SH8, Tubulinea içinde bağımsız ve yüksek destekli bir soyun üyesidir.
• Bu soy morfolojik ve moleküler olarak yeni bir cins tanımını desteklemektedir.
• Tuberomeba'nın en yakın bilinen akrabası Ptolemeba'dır.
• W215SH8 ile Tubulinea sp. 4388 muhtemelen aynı türdür.
• T. capitovia geniş bir tatlısu-brakik su toleransına sahiptir.
• Tür tatlı suda hızlı kistleşebildiği için mikroskobik taramalarda gözden kaçabilir.
• Tuberomeba ile tatlı su balıkları arasında tekrarlayan bir ekolojik ilişki olasılığı bulunmaktadır.

Çalışmanın desteklemediği sonuçlar

• Tuberomeba capitovia'nın balık patojeni olduğu kanıtlanmamıştır.
• Balıklarda enfeksiyona veya hastalığa neden olduğu gösterilmemiştir.
• Balıklarla ilişkinin zorunlu parazitlik olduğu gösterilmemiştir.
• 0,3-20‰ toleransın bütün Tuberomeba türleri için evrensel olduğu söylenemez.
• Tuberomeba'nın deniz ortamında yaşayabildiği gösterilmemiştir.
• Tubulinea group 02 içindeki tüm suşların aynı tür olduğu kesinleştirilmemiştir.
• Bu soyun gerçek coğrafi dağılımı mevcut sınırlı örneklerle belirlenemez.

Kaynak ve Yöntem Notu

Özgün çalışma: Tuberomeba capitovia gen. et sp. nov. (Amoebozoa, Tubulinea) accommodates an incertae sedis lineage of monotactic amoebae associated with freshwater fish.

Yazarlar: Uliana Ryabusheva, Maria Palataicova ve Alexander Kudryavtsev.

Kurumlar: Laboratory of Cellular and Molecular Protistology, Zoological Institute of the Russian Academy of Sciences; Department of Invertebrate Zoology, Faculty of Biology, Saint-Petersburg State University.

Yayın durumu: SSRN preprint; hakem değerlendirmesinden geçmemiştir.

SSRN: 6968487.

Tip lokalitesi: Lake Ladoga, Mustalahti Bay, Karelia; gökkuşağı alabalığı yetiştirme kafesinden su ve askıda organik madde örneği.

Tip kültür: ZIN.2024.12.

SSU rRNA GenBank erişim numarası: PZ158404.

Başlıca yöntemler: klonal kültür, DIC ışık mikroskobisi, Nuclear Fast Red boyama, transmisyon elektron mikroskobisi, tuzluluk tolerans deneyi, PCR, Sanger dizileme, MAFFT, trimAl, IQ-TREE, RAxML, MrBayes ve birleştirilmiş SSU rRNA + aktin filogenisi.

Finansman: Russian Science Foundation Grant No. 26-14-00278 ve Zoological Institute RAS State Assignment No. 125012800894-6.

Çıkar çatışması: Yazarlar bilinen finansal veya kişisel çıkar çatışması olmadığını bildirmiştir.

Temel sınırlılıklar: Çalışma preprinttir. Balıklarla ilişkinin gerçek biyolojik niteliği bilinmemektedir. Patojenite test edilmemiştir. Bazı Tubulinea group 02 suşları için morfolojik veri sınırlıdır. Klad içindeki tür çeşitliliği iç düğümlerdeki düşük destek nedeniyle henüz çözülememiştir. Doğal dağılımı belirlemek için balıksız habitatlardan daha geniş çevresel örnekleme gerekmektedir.