Ферменти табдилдиҳандаи ангиотензин, бо номи англисии angiotensin-converting enzyme (ACE), ферментест, ки дар танзими фишори хун нақш дорад ва метавонад аз ҷониби баъзе пептидҳои кӯтоҳ боздорӣ шавад. Ин таҳқиқот барои афзалиятбандии номзадҳои пептидҳои боздорандаи ACE, ки метавонанд аз гидролизи сафедаҳои ғизоӣ бо протеазаҳо ҳосил шаванд, пеш аз анҷоми таҷриба қоидаи скрининги C-терминалии ҳассос ба дарозӣ-ро таҳия кардааст. Қоидае, ки муҳаққиқон онро “Rule 5” номидаанд, дар мавқеи P1′, яъне аминокислотаи охирини пептид, мавҷудияти W, Y, F ё P ва дар мавқеи P2′, яъне аминокислотаи дуюм аз охир, мавҷудияти L, I, V, K, R ё H-ро талаб мекунад. Қоида дар 24 гидролизати сафеда–протеаза таҳия шуда, баъдан дар 16 гидролизати тиҷоратии сафеда мустақилона арзёбӣ ва бо маҷмуаи берунии додаҳо, ки 1429 пептиди миқдоран тавсифшудаи боздорандаи ACE-ро дар бар мегирифт, вобаста ба дарозии пептид санҷида шудааст.

Басомади Rule 5 дар маҷмуаи таҳияи иборат аз 24 гидролизат бо боздории ACE r = 0.711, p < 0.001 ва бо \( \log_{10}(1/IC_{50}) \) r = 0.741, p < 0.001 ҳамбастагӣ нишон додааст. Аммо фарқи ададӣ байни ҳамбастагии Rule 3 ва боздории ACE дар озмоиши Steiger Z аҳамиятнок нест; бинобар ин, хулосаи “Rule 5 аз ҷиҳати оморӣ ба таври қатъӣ аз Rule 3 бартар аст” бароварда намешавад. Дар 16 гидролизати тиҷоратии мустақил басомади Rule 5 бо боздории ACE дар сатҳи r = 0.608 ва бо \( \log_{10}(1/IC_{50}) \) дар сатҳи r = 0.581 робита нишон додааст.

Панҷ пептиди кӯтоҳ бо номҳои VF, GIF, LP, IP ва VP аз буриши се меъёр интихоб шуданд: пешгӯии ҳосилшавӣ дар протеолизи виртуалӣ, мувофиқат ба Rule 5 ва мавҷудияти сигнали эҳтимолан марбут ба онҳо дар минтақаи каммассаи MALDI-и гидролизатҳои таҷрибавӣ. Ҳамаи панҷ пептиди мустақилона синтезшуда ACE-ро боздоштанд; қиматҳои IC50 дар байни 19.50–93.19 µM қарор доштанд. VF ва GIF боздории навъи омехта, LP, IP ва VP бошад боздории рақобатӣ нишон доданд.

Муҳимтарин маҳдудияти таҳқиқот дарозии пептид аст. Ҳангоми арзёбии якҷояи 1429 пептиди боздорандаи ACE байни тақсимоти IC50-и пептидҳои мувофиқ ва номувофиқ ба Rule 5 фарқи аҳамиятнок дида нашуд. Аммо вақте танҳо 470 пептиди 2–3 аминокислотаӣ баррасӣ шуданд, медианаи IC50 барои пептидҳои мувофиқ ба Rule 5 28.0 µM ва барои пептидҳои номувофиқ 79.0 µM буд ва фарқ пас аз ислоҳи санҷишҳои сершумор низ аҳамиятнок монд. Аз ин рӯ Rule 5 модели универсалии пешгӯии пептидҳои боздорандаи ACE барои ҳамаи дарозиҳо нест; он махсусан барои дипептидҳо ва трипептидҳо филтри марҳилаи аввали афзалиятбандӣ мебошад, ки ҳавзи номзадҳоро ғанӣ мегардонад.

Ин таҳқиқот санҷиши самаранокии доруи зиддифишорбаландӣ ё таҳқиқоти клиникии табобатӣ нест. Коҳиши фишори хун дар одамон, устуворӣ дар рӯдаи ҳозима, ҷаббиши воқеӣ аз рӯда, рафтор дар матритсаи ғизоӣ ва таъсири in vivo зиддифишорбаландӣ дар ин таҳқиқот санҷида нашудаанд.

Шарҳи Муфассал

Чаро ACE муҳим аст?

ACE дар низоми ренин–ангиотензин ба табдили ангиотензин I ба ангиотензин II-и вазоконстрикторӣ мусоидат мекунад ва ҳамзамон брадикинини вазодилататориро таҷзия менамояд. Аз ин рӯ коҳиш додани фаъолияти ACE аз ҷиҳати фармакологӣ барои танзими фишори хун ҳадафи муҳим аст. Бо вуҷуди ин, ин таҳқиқот нишон намедиҳад, ки пептидҳои аз ғизо гирифташуда метавонанд дар одамон ҷойгузини табобати зиддифишорбаландӣ шаванд. Мавзӯи таҳқиқот интихоби самараноктари пептидҳои кӯтоҳест, ки метавонанд боздории ACE нишон диҳанд, бо истифода аз усулҳои лабораторӣ ва ҳисоббарорӣ.

Гидролизати сафеда ва пептиди боздорандаи ACE чист?

Вақте сафеда бо ферментҳои сафедашикан, ки протеаза ном доранд, бурида мешавад, ба порчаҳои кӯтоҳтари пептидӣ ҷудо мегардад. Омехтаи ин порчаҳо гидролизати сафеда номида мешавад. Ҳамаи пептидҳои ҳосилшуда хусусияти биологии яксон надоранд. Баъзе пайдарпайиҳо метавонанд ба ACE пайваст шуда, фаъолияти ферментро кам кунанд; онҳо пептидҳои боздорандаи ACE номида мешаванд.

Мушкилоти амалӣ чунин аст: гидролизи ферментии як сафеда метавонад садҳо пептиди гуногун ҳосил кунад. Ҷудо кардан, муайян намудан, синтез кардан ва чен кардани IC50-и ҳар пептид вақт ва захира талаб мекунад. Аз ин рӯ саволи асосии таҳқиқот чунин аст: “Кадом комбинатсияҳои сафеда–протеаза бояд барои ҳосил кардани пептидҳои кӯтоҳи боздорандаи ACE пеш аз дигарон таҳқиқ шаванд?”

Rule 5 Чист ва Дар Кадом Пептидҳо Бояд Истифода Шавад?

Rule 5 филтри содаи афзалиятбандӣ мебошад, ки аз ду мавқеи охирини аминокислота дар C-терминали пептид истифода мекунад: агар дар мавқеи P1′ W, Y, F ё P ва дар мавқеи P2′ L, I, V, K, R ё H бошад, пептид мувофиқ ба қоида ҳисобида мешавад. Санҷиши берунӣ нишон дод, ки қувваи аҳамиятноки ғанигардонии ин филтр асосан дар дипептидҳо ва трипептидҳои 2–3 аминокислотаӣ дида мешавад; он набояд ба пептидҳои дарозтар ба таври универсалӣ татбиқ карда шавад.

Намоиши равшани Rule 5

Шарҳи рамзҳои якҳарфии аминокислотаҳо чунин аст: W = триптофан, Y = тирозин, F = фенилаланин, P = пролин, L = лейсин, I = изолейсин, V = валин, K = лизин, R = аргинин ва H = гистидин.

Фарқи муҳими номенклатурӣ дар номгузории P1′ ва P2′

Дар ин таҳқиқот истилоҳи P1′ мувофиқи истифода дар адабиёти QSAR оид ба пептидҳои боздорандаи ACE барои аминокислотаи мустақими C-терминалии пептид ва P2′ барои аминокислотаи дуюм аз охир истифода шудааст. Муаллифон ба таври равшан қайд мекунанд, ки ин бо таърифи P1′ дар номенклатураи аслии буриши протеазаи Schechter–Berger яксон нест. Аз ин рӯ ҳангоми хондани нишонаҳои P1′ ва P2′ дар мақола бояд ҳатман таърифи амалии худи ҳамин таҳқиқот истифода шавад.

Rule 5 чӣ гуна ҳосил карда шуд?

Муҳаққиқон аввал нуқтаҳои муштараки афзалиятҳои C-терминалиро дар чор равиши қаблан нашршудаи сохтор–фаъолият муқоиса карданд. Ядрои муштараки P1′ барои чор модел W, Y, F ва P муайян карда шуд. Маҷмуаи P2′ барои Rule 3 бошад аминокислотаҳои L, I, V, K, R, H, W, Y ва F-ро дар бар мегирифт.

Ҳангоми сохтани Rule 5 аз маҷмуаи P2′-и Rule 3 аминокислотаҳои ароматии W, Y ва F хориҷ шуда, маҷмуаи P2′ бо L, I, V, K, R ва H маҳдуд гардид. Муаллифон ин амалро ҳамчун қадами содасозии модел пешниҳод мекунанд, ки ҳам ба фаъолияти эмпирикӣ дар маҷмуаи таҳияи 24 гидролизат ва ҳам ба хусусиятҳои сохтории зерҷайби ACE S2′ асос ёфтааст. Rule 5 ҳамчун “қонуни ягона ва мутлақан дурусти биохимиявӣ” барои пайвастшавии S2′ пешниҳод намешавад.

Чаро дарозии пептид муҳим аст?

Дар дипептидҳо ва трипептидҳо ду аминокислотаи C-терминалӣ қисми хеле бузурги тамоми пайдарпайиро ташкил медиҳанд. Масалан, дар дипептид P1′ ва P2′ аллакай тамоми пептидро ташкил медиҳанд. Дар трипептид бошад онҳо ду аминокислота аз се аминокислотаро тавсиф мекунанд. Баръакс, дар пептиди 8 ё 12 аминокислотаӣ ҳамин ду аминокислотаи терминалӣ танҳо қисми хурди тамоми сохторро намояндагӣ мекунанд. Аминокислотаҳои боқимонда метавонанд конформатсия, ҳаҷми стерикӣ, таъсирҳои электростатикӣ ва тарзи тамос бо ферментро тағйир диҳанд.

Аз ин рӯ “ҳассос ба дарозӣ” будани таҳқиқот танҳо ҷузъиёти оморӣ нест; ин сарҳади асосии илмиест, ки муайян мекунад Rule 5 кай маълумоти маънодор медиҳад.

Ҷараёни умумии кори таҳқиқот

IC50 Чист ва IC50-и Паст Чӣ Маъно Дорад?

IC50 консентратсияи ингибиторест, ки барои 50% кам кардани фаъолияти ченшудаи фермент дар шароити муайяни таҷрибавӣ лозим аст. Дар як низоми таҷрибавӣ IC50-и пасттар маънои қувваи бештари ингибиторро дорад, зеро бо миқдори камтари модда ба ҳамон сатҳи 50% боздорӣ мерасад; аммо қиматҳои IC50, ки бо усулҳои гуногуни таҷрибавӣ, субстратҳо ё шароити реаксия чен шудаанд, набояд мустақиман баробар дониста шаванд.

Чаро \(\log_{10}(1/IC_{50})\) истифода шудааст?

Ҳар қадар IC50 кам шавад, қувваи ингибитор зиёд мешавад. Муҳаққиқон дар таҳлили ҳамбастагӣ инчунин \(1/IC_{50}\)-ро истифода бурда, самтро баръакс карданд: барои ингибитори қавитар \(1/IC_{50}\) калон мешавад. Сипас табдили \(\log_{10}\) қиматҳои дар доираи васеъ бударо ба миқёси фишурдатар мегузаронад. Ҳамин тавр ҳамбастагии мусбати басомади баланди Rule 5 бо афзоиши қувваи ингибитор мустақимтар тафсир мешавад.

Манбаъ қиматҳои IC50-ро бо татбиқи регрессияи ғайрихаттии муодилаи Hill ба додаҳои боздорӣ–консентратсия ҳисоб кардааст; аммо азбаски шакли пурраи параметрии алгебравии функсияи Hill дар матни асосии нашршуда алоҳида навишта нашудааст, дар ин ҷо “муодилаи аслии Hill”, ки дар манбаъ нест, сохта намешавад.

Ҳамбастагӣ чиро нишон медиҳад ва чиро нишон намедиҳад?

Коэффисиенти ҳамбастагии Pearson \(r\) тағйирёбии хаттии муштараки ду тағйирёбандаи миқдориро чен мекунад. \(r=1\) робитаи хаттии мусбати комил, \(r=0\) набудани робитаи хаттӣ ва \(r=-1\) робитаи хаттии манфии комилро ифода мекунад. Аммо ҳамбастагӣ сабабият нест. Афзоиши ҳамзамони басомади Rule 5 ва боздории ACE худ аз худ исбот намекунад, ки ҳар як пептиди Rule 5 ба ҳамон дараҷа сабаби фаъолияти гидролизат мешавад.

Миқдори воқеии ҳосилшавии пептид дар гидролизат метавонад аз омилҳое мисли печиши сафеда, дастрасии фермент ба ҷойҳои буриш, кинетикаи гидролиз, боздории маҳсулот, устувории пептид ва шароити коркард вобаста бошад. Басомади Rule 5 ин фаровонии воқеии пептидро чен намекунад; он потенсиали назариявии ҳосилшавии пайдарпайиҳои аз ҷиҳати сохторӣ мувофиқро ифода мекунад.

Он чизе ки таҳқиқот мегӯяд

• Басомади Rule 5 дар маҷмуаи таҳия бо нишондиҳандаи боздорандагии ACE робитаи мусбати қавӣ нишон дод.
• Самти робита дар маҷмуаи алоҳидаи арзёбӣ аз 16 гидролизати тиҷоратӣ низ нигоҳ дошта шуд.
• Ҳамаи панҷ пептиди кӯтоҳи синтетикии афзалиятдодашуда дар озмоиши лаборатории ACE боздорӣ нишон доданд.
• Дар пойгоҳи додаҳои берунии пептидҳо Rule 5 дар пептидҳои 2–3 аминокислотаӣ ингибиторҳои қавитарро ғанӣ гардонд.
• Бо зиёд шудани дарозии пептид арзиши фарқкунандаи иттилои ду мавқеи C-терминалӣ зуд коҳиш ёфт.

Он чизе ки таҳқиқот намегӯяд

• Наметавон гуфт, ки ҳар пептиди мувофиқ ба Rule 5 ингибитори қавии ACE аст.
• Rule 5 барои пептидҳои дароз таснифгари универсалӣ нест.
• Скори docking энергияи воқеии озоди пайвастшавӣ нест.
• Нигоҳ доштани тамос дар тӯли 200 ns устувории термодинамикии пайвастшавиро исбот намекунад.
• Сигналҳои каммассаи MALDI нишон намедиҳанд, ки ҳар яке аз пайдарпайиҳои VF, GIF, LP, IP ва VP дар гидролизат ба таври қатъӣ муайян шудаанд.
• Таҳқиқот нишон надодааст, ки фишори хунро дар одамон паст мекунад.
• Устуворӣ ба ҳазми gastrointestinal, суръати ҷаббиш аз рӯда ва биодастрасии воқеӣ дар ғизои функсионалӣ чен карда нашудаанд.

Усул ва Натиҷаҳои Таҳқиқот

1. Сафедаҳо ва протеазаҳои истифодашуда

Барои гидролизи таҷрибавӣ нуҳ манбаи сафеда истифода шуд: β-лактоглобулин A, κ-казеин, α-лакталбумин, лактоферрин, миоглобин, глиадин, глютен, гӯшти гов ва хокаи шири серсафеда.

Дар гидролиз ҳафт ферменти протеолитикӣ истифода шуд: трипсин, пепсин, термолизин, папаин, бромелайн, α-химотрипсин ва эндопептидазаи махсуси пролин. Азбаски пепсин дар ду шароити гуногуни pH арзёбӣ шуд, дар скрининги виртуалӣ ҳамагӣ ҳашт шароити протеолитикӣ ба вуҷуд омад.

2. Гидролизи виртуалӣ ва 672 комбинатсияи сафеда–фермент

Аз сафедаҳои ғизоии BIOPEP-UWM бо меъёри дастрасии тиҷоратӣ 84 сафеда ба ҳавзи ибтидоӣ дохил карда шуданд. Ҳар сафеда дар ҳашт шароити протеолитикӣ ба таври виртуалӣ пора карда шуда, ҳамагӣ:

\(84 \times 8 = 672\)

комбинатсияи сафеда–фермент арзёбӣ шуданд.

Аз онҳо 591, яъне %87.9, ҳадди ақал як порчаи пептидии мувофиқ ба P1′ ҳосил карданд. 81 комбинатсияи боқимонда ба синфи “Zero”-и %12.1 дохил шуданд.

Муодилаи 1: Басомади P1′

\[ \mathrm{P1^\prime\ frequency}(\%)= \frac{N_{\mathrm{P1^\prime\in\{W,Y,F,P\}\ olan\ peptitler}}} {N_{\mathrm{toplam\ peptit\ parçası,\ uzunluk\geq2}}} \times100 \]

Ин формула чиро ҳисоб мекунад? Он ҳисоб мекунад, ки чӣ қадар аз пептидҳои ҳадди ақал ду аминокислотаӣ, ки дар гидролизи виртуалӣ ҳосил шуданашон пешгӯӣ мешавад, бо W, Y, F ё P анҷом меёбанд.

Сурат: Шумораи пептидҳое мебошад, ки дар мавқеи P1′ W, Y, F ё P доранд.

Махраҷ: Шумораи ҳамаи порчаҳои виртуалии пептидӣ мебошад, ки ҳадди ақал ду аминокислота доранд.

Чаро маҳсулоти як-аминокислотаӣ хориҷ карда шуданд? Азбаски маҳсулоти як-аминокислотаӣ мавқеи P2′ надорад, қоидаи ду-мавқеии C-терминалӣ татбиқ карда намешавад.

Воҳид: Натиҷа бо фоиз дода мешавад ва беандоза аст.

Қабатҳои басомади P1′

Барои маҷмуаи таҳияи Rule аз ҳар яке аз қабатҳои High, Medium ва Low ҳашт комбинатсия интихоб шуда, ҳамагӣ 24 комбинатсияи сафеда–протеаза гирифта шуд.

3. Басомади Rule 5

Барои ҳар як комбинатсияи виртуалии сафеда–фермент басомади Rule k дар манбаъ бо Муодилаи (2) муайян шудааст:

\[ \mathrm{Rule\ k\ frequency}(\%)= \frac{N_{\mathrm{rule\ k}}}{N_{\mathrm{total}}}\times100 \]

\(N_{\mathrm{rule\ k}}\) шумораи пептидҳои ҳадди ақал ду аминокислотаиро нишон медиҳад, ки шартҳои аминокислотавии қоидаи дахлдорро иҷро мекунанд; \(N_{\mathrm{total}}\) бошад шумораи умумии пептидҳои ҳадди ақал ду аминокислотаиро, ки дар гидролизи виртуалӣ ҳосил шудаанд, нишон медиҳад.

Пептиди мувофиқ ба Rule 5 бояд ҳам:

• \(\mathrm{P1^\prime}\in\{W,Y,F,P\}\)
• ва ҳам \(\mathrm{P2^\prime}\in\{L,I,V,K,R,H\}\)

шартҳоро ҳамзамон иҷро кунад.

4. Гидролизи таҷрибавии сафеда

Сафедаҳо дар оби дистиллятшудаи деионизатсияшуда дар сатҳи %4 (w/v) ҳал ё дисперсия карда шуданд. Барои ҳар як комбинатсияи сафеда–протеаза се партияи мустақили гидролиз омода карда шуд; барои ҳар партия 1 g сафеда ва таносуби фермент/субстрат %3 (w/w) истифода шуд.

Гидролиз бо усули TNBS тавассути пайгирии гурӯҳҳои аминҳои озод то нуқтае, ки дараҷаи гидролиз ба плато мерасид, идома дода шуд. Вобаста ба комбинатсияи сафеда–протеаза вақти анҷомёбӣ дар байни 0.33–4.0 соат тағйир ёфт. pH ҳангоми зарурат бо 1 M NaOH ё 1 M HCl дар қимати ҳадаф нигоҳ дошта шуд. Пас аз гидролиз намунаҳо дар 100 °C барои 15 дақиқа бо гармӣ ғайрифаъол карда шуда, дар 12,100 × g барои 10 дақиқа ва 4 °C центрифуга, лиофилиз ва дар −20 °C нигоҳдорӣ шуданд.

Муодилаи 3: Дараҷаи гидролиз

\[ DH(\%)= \frac{L_t-L_0}{L_{\max}-L_0}\times100 \]

\(DH\): Дараҷаи гидролиз.

\(L_t\): Миқдори гурӯҳҳои аминҳои озод дар лаҳзаи \(t\)-и гидролиз.

\(L_0\): Миқдори ибтидоии гурӯҳҳои аминҳои озод.

\(L_{\max}\): Миқдори умумии гурӯҳҳои аминҳои озод, ки пас аз гидролизи пурраи кислотаӣ чен шудааст. Дар манбаъ барои гидролизи пурра шароити 6 N HCl, 110 °C ва 24 соат истифода шудааст.

Ин таносуб ба таври ғайримустақим нишон медиҳад, ки пайвандҳои пептидӣ дар занҷирҳои сафеда то чӣ андоза кушода шудаанд. Аммо яке аз натиҷаҳои муҳими таҳқиқот ин аст, ки DH-и баланд худкор маънои боздории баланди ACE-ро надорад. Дар 24 комбинатсия DH-и ниҳоӣ тақрибан дар байни %0.34–34.25 тағйир ёфт; баъзе гидролизатҳои термолизини дорои DH-и баланд боздории миёнаи ACE нишон доданд, дар ҳоле ки баъзе гидролизатҳои эндопептидазаи махсуси пролин бо DH-и паст боздории қавӣ нишон доданд. Аз ин рӯ на танҳо “чӣ қадар зиёд бурида шуд”, балки “кадом пайдарпайиҳои пептидӣ ҳосил шуданд” муҳим аст.

5. Озмоиши боздории ACE

Фаъолияти ACE бо FAPGG, яъне субстрати N-[3-(2-furyl)acryloyl]-Phe-Gly-Gly чен карда шуд. Консентратсияи ниҳоии FAPGG 0.5 mM буд. ACE аз шуши харгӯш ба миқдори 2 mU барои ҳар чоҳ истифода шуд.

• 20 µL намунаи санҷишӣ
• 20 µL ACE
• 160 µL маҳлули FAPGG
• Ҳаҷми умумии реаксия: 200 µL
• Пешинкубатсия: 37 °C барои 10 дақиқа
• Буфер: 80 mM HEPES-NaOH, pH 8.3, 300 mM NaCl
• Ченкунӣ: суръати пайвастаи реаксия дар 340 nm барои 20 дақиқа
• Назорати мусбат: 1 nM каптоприл

Муодилаи 4: Фоизи боздории ACE

\[ \mathrm{ACE\ inhibition}(\%)= \frac{\mathrm{Slope}_{blank}-\mathrm{Slope}_{sample}} {\mathrm{Slope}_{blank}}\times100 \]

\(\mathrm{Slope}_{blank}\): нишебии реаксияи истинодӣ, ки дар муодилаи манбаъ ҳамчун “blank” муайян шудааст.

\(\mathrm{Slope}_{sample}\): суръати тағйири абсорбсия дар реаксияе, ки намунаи санҷишӣ дорад.

Суръати гидролизи FAPGG фаъолияти ACE-ро ифода мекунад. Ҳар қадар намуна ACE-ро боздорад, суръати табдили субстрат коҳиш ёфта, фоизи ҳисобшудаи боздорӣ зиёд мешавад.

Қиматҳои IC50 тавассути татбиқи регрессияи ғайрихаттии Hill ба додаҳои боздорӣ–консентратсия дар консентратсияҳои гуногуни намуна ҳисоб карда шуданд. Натиҷаҳои гидролизат аз се партияи мустақили гидролиз ва натиҷаҳои пептидҳои синтезшуда аз се такрори мустақили таҷрибавӣ дода шуданд.

6. Натиҷаҳои маҷмуаи таҳияи 24 гидролизат

Дар консентратсияи 0.5 mg mL⁻¹ гидролизат боздории ACE аз %7.8 то %96.3 тағйир ёфт. Баландтарин қимат дар комбинатсияи миоглобин/олигопептидазаи махсуси пролин %96.3 ва пасттарин қимат дар комбинатсияи κ-казеин/stem bromelain %7.8 гузориш шуд.

Қиматҳои IC50 дар байни 0.03–2.75 mg mL⁻¹ тағйир ёфтанд. Басомади P1′ танҳо бо боздории ACE \(r=0.550, p=0.005\) ва бо \( \log_{10}(1/IC_{50}) \) \(r=0.503, p<0.05\) ҳамбастагӣ нишон дод.

Ҳангоми муқоисаи қоидаҳои ду-мавқеӣ барои Rule 3 ҳамбастагӣ бо боздории ACE \(r=0.691\) ва барои \( \log_{10}(1/IC_{50}) \) \(r=0.704\) буд. Барои Rule 5 қиматҳо мутаносибан чунин буданд:

• Боздории ACE: \(r=0.711, p<0.001\)
• \(\log_{10}(1/IC_{50})\): \(r=0.741, p<0.001\)

Қимати \(r=0.711\)-и Rule 5 барои боздории ACE аз \(r=0.691\)-и Rule 3 аз ҷиҳати ададӣ баландтар аст; аммо дар Steiger Z-тесте, ки ду ҳамбастагии вобастаро муқоиса мекунад, \(Z=0.42, p=0.674\) ба даст омад. Аз ин рӯ дар маҷмуаи таҳия бартарии омории Rule 5 нисбат ба Rule 3 исбот нашудааст. Интихоби Rule 5 ба арзёбии якҷояи фаъолият, содагӣ ва санҷишҳои мустақили минбаъда асос ёфтааст.

7. Арзёбии мустақил бо 16 гидролизати тиҷоратӣ

Чор манбаи тиҷоратии сафеда — сафедаи шир, сафедаи гов, глютени гандум ва глиадини гандум — бо чор протеаза арзёбӣ шуда, 16 комбинатсия ташкил гардид. Азбаски сафедаҳои тиҷоратӣ таносубҳои гуногуни зервоҳид доранд, басомади Rule 5 мувофиқи таркиб вазн дода шуд.

Басомади вазншуда дар манбаъ бо чунин мантиқ ҳисоб шудааст:

\[ \mathrm{Ağırlıklı\ Rule\ 5\ frekansı} = \sum_i \left( \frac{\%\mathrm{alt\ birim}_i} {\sum \%\mathrm{alt\ birim}} \times \mathrm{Rule\ 5\ frekansı}_i \right) \]

Дар ин 16 комбинатсия ҳамбастагии басомади вазншудаи Rule 5 бо боздории ACE r = 0.608, p < 0.05 ва бо \( \log_{10}(1/IC_{50}) \) r = 0.581, p < 0.05 муайян шуд.

Азбаски ин маҷмуа барои тағйир додани таърифи аминокислотавии Rule 5 истифода нашудааст, он арзёбии асосии мустақили гидролизат дар таҳқиқот мебошад. Бо вуҷуди ин, 16 мушоҳида аз комбинатсияҳои факториалии чор сафеда ва чор фермент иборатанд, бинобар ин нуқтаҳо комилан аз ҳам мустақил нестанд. Вақте манбаи сафеда ва ҳувияти протеаза назорат шуданд, барои \( \log_{10}(1/IC_{50}) \) ҳамбастагии қисман \(r=0.518, p=0.040\) ва дараҷаи озодӣ 8 гузориш шуд; муаллифон қайд мекунанд, ки бинобар ҳаҷми хурди намуна қувваи оморӣ маҳдуд аст.

8. Скрининги MALDI-TOF/TOF ва чаро “муайянсозии қатъӣ” гуфта намешавад?

24 гидролизат бо MALDI-TOF/TOF таҳқиқ шуданд. Доираи пурраи скан m/z 200–2000 буд. Қисме аз ионҳои шиддатбаланд ба таҳлили CID-MS/MS гирифта шуда, таъиноти пайдарпайиҳо бо пешгӯиҳои гидролизи виртуалӣ муқоиса шуданд.

Панҷгонаи VF, GIF, LP, IP ва VP дар буриши се шарт интихоб шуд:

1. Пешгӯӣ шудани ҳосилшавӣ дар гидролизи виртуалӣ бо протеазаи дахлдор,
2. мувофиқат ба Rule 5,
3. мавҷудияти хусусияти каммассаи MALDI дар гидролизати таҷрибавӣ, ки метавонад ба пептид марбут бошад.

Аммо бинобар дахолати матритса дар минтақаи пасти m/z ва маҳдудияти дақиқии масса, ин сигналҳо ҳамчун муайянсозии қатъии пайдарпайӣ қабул нашуданд. Махсусан LP ва IP изомерҳое мебошанд, ки таркиби элементӣ ва массаи прекурсории яксон доранд. Азбаски лейсин ва изолейсин изобарӣ мебошанд, онҳоро танҳо бо массаи MALDI-TOF ба таври қатъӣ аз ҳам ҷудо кардан имконнопазир буд.

Аз ин рӯ қиматҳои минбаъдаи боздории ACE исбот намекунанд, ки кадом изомер дар гидролизат ба таври қатъӣ мавҷуд аст; онҳо фаъолиятҳои биохимиявии пептидҳои мустақилона синтезшуда ва ҳувияташон тасдиқшуда мебошанд.

9. Қувваи боздорандагии ACE-и панҷ пептиди синтезшуда

Дар байни ин панҷ пептид пасттарин IC50 дар VF ва баландтарин IC50 дар VP чен карда шуд. Аммо аз панҷ намуна хулосаи универсалии “ҳама пептидҳои бо F анҷомёбанда навъи омехта ва ҳама пептидҳои бо P анҷомёбанда рақобатӣ мебошанд” бароварда намешавад. Муаллифон низ ба таври равшан қайд мекунанд, ки намуна хурд ва аз ҷиҳати сохторӣ маҳдуд аст.

10. Таҳлили Lineweaver–Burk чӣ гуна хонда мешавад?

Дар манбаъ суръатҳои ибтидоӣ дар консентратсияҳои 0.1, 0.2, 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 ва 4.0 mM FAPGG ва дар ҳузури 0, 10, 25 ва 50 µM ингибитор чен карда шуданд.

Робитаи стандартии Lineweaver–Burk, ки натиҷаи ин таҳқиқот нест ва танҳо барои шарҳи усул оварда шудааст, чунин аст:

\[ \frac{1}{V} = \frac{K_m}{V_{\max}} \frac{1}{[S]} + \frac{1}{V_{\max}} \]

Дар ин ҷо \(V\) суръати ибтидоии реаксия, \([S]\) консентратсияи субстрат, \(K_m\) собити Michaelis ва \(V_{\max}\) суръати максималии реаксияро ифода мекунанд.

Дар график:

• буриши меҳвари y \(1/V_{\max}\),
• нишебӣ \(K_m/V_{\max}\) мебошад.

Дар LP, IP ва VP хатҳои ба консентратсияҳои гуногуни ингибитор тааллуқдошта дар меҳвари y ба як нуқта наздик шуданд; ин ҳолат бо модели боздории рақобатӣ мувофиқ буд, ки дар он \(V_{\max}\) тақрибан нигоҳ дошта шуда, \(K_m\)-и намоён тағйир меёбад.

Дар VF ва GIF хатҳо дар минтақаи дуюм бурида шуданд; азбаски ҳам \(K_m\)-и намоён ва ҳам \(V_{\max}\) тағйир ёфтанд, модели боздории навъи омехта бартарӣ дода шуд. Барои VF \(K_i^\prime/K_i=2.7\) ва барои GIF 2.2 буд; ин бо моделе мувофиқ аст, ки ин ду пептид ба ACE-и озод аффинитети баландтар доранд, вале метавонанд ба комплекси фермент–субстрат низ пайваст шаванд.

11. Санҷиши берунӣ: 1429 пептиди боздорандаи ACE

Барои арзёбии умумиятпазирии Rule 5 берун аз таҷрибаҳои таҳия ва гидролизат, аз манбаъҳои AHTPDB, BIOPEP-UWM ва Milk Bioactive Peptide Database 1429 пептиди нодири боздорандаи ACE, ки қимати миқдории IC50 доштанд, муттаҳид карда шуданд.

Дар курасияи додаҳо назорати сифат аз 12 марҳила татбиқ шуд, аз ҷумла хориҷ кардани сабтҳои бе IC50-и ададӣ, стандарткунонии воҳидҳо ба µM, хориҷ кардани сабтҳое, ки бе маълум будани массаи молекулавӣ бо mg mL⁻¹ ё mM дода шудаанд, ва муттаҳид кардани пайдарпайиҳои такрорӣ.

Бо тағйир додани ҳадҳои поёнӣ ва болоии дарозии пептид ҳамагӣ 87 равзанаи дарозӣ санҷида шуд; тақсимоти IC50-и гурӯҳҳои мувофиқ ва номувофиқ ба Rule 5 бо санҷиши Mann–Whitney U муқоиса ва муқоисаҳои сершумор бо ислоҳи сатҳи кашфи бардурӯғи Benjamini–Hochberg танзим шуданд.

Mann–Whitney ва \(p_{adj}\) чиро нишон медиҳанд?

Санҷиши Mann–Whitney U ҷойгиршавии тақсимоти ду гурӯҳро бидуни вобастагӣ ба фарзияи тақсимоти нормалии параметрӣ муқоиса мекунад. Саволи асосӣ дар ин ҷо чунин аст: “Оё қиматҳои IC50-и пептидҳои мувофиқ ба Rule 5 нисбат ба пептидҳои номувофиқ ба таври низомманд пасттаранд?”

Азбаски 87 равзанаи гуногуни дарозӣ санҷида шуд, танҳо ба қиматҳои хоми p нигоҳ кардан хавфи натиҷаҳои мусбати бардурӯғро зиёд мекунад. Ислоҳи Benjamini–Hochberg ин бори санҷишҳои сершуморро ба назар мегирад. \(p_{adj}\) қимати аҳамиятнокӣ баъд аз ин ислоҳ аст.

12. Сарҳади воқеии татбиқи Rule 5

Ин натиҷа қавитарин далели берунӣ мебошад, ки сарҳади татбиқи Rule 5-ро ҳамчун ≤3 аминокислота муайян мекунад.

Барои назорати эҳтимоли даврагӣ, ҳатто баъд аз хориҷ кардани 155 пептид, ки бо додаҳои пешини омӯзишии Wu ва ҳамкоронаш ҳампӯшонӣ доштанд, ғанигардонӣ дар гурӯҳи 2–3 аминокислотаӣ бо \(z=-3.006, p=0.003\) нигоҳ дошта шуд. Аммо равзанаи 2–4 аминокислотаӣ баъд аз ин хориҷкунӣ аҳамиятнокии худро нигоҳ надошт.

13. Омили ғанигардонӣ чист?

Омили ғанигардонӣ дар таҳқиқот ба чунин мантиқ асос ёфтааст:

\[ EF= \frac{\mathrm{Rule\ 5\ sonrasında\ güçlü\ peptit\ oranı}} {\mathrm{Filtrelenmemiş\ kümedeki\ güçlü\ peptit\ oranı}} \]

Агар EF = 1 бошад, филтр ҳиссаи пептидҳои қавиро тағйир намедиҳад. Агар EF > 1 бошад, филтр ҳиссаи пептидҳои қавиро дар ҳавзи номзадҳо зиёд мекунад.

Rule 5 аз 470 пептиди кӯтоҳ 99-тояшро интихоб кардааст; ин тақрибан %21.1-и тамоми ҳавз аст. Ҳамин тавр, бо тамаркуз ба тақрибан панҷяки номзадҳо, он махсусан ҳиссаи ингибиторҳои хеле қавии субмикромоляриро 2.5 маротиба зиёд кардааст. Ин “кафолати муваффақият” нест; балки таъсири филтркунии ибтидоист, ки ҳавзи номзадҳои барои санҷиши таҷрибавӣ пешбинишударо самараноктар мекунад.

14. Docking-и молекулавӣ

Docking бо AutoDock Vina v1.2.7 дар сохтори кристаллии C-domain-и ACE-и тестикулярии инсон анҷом дода шуд. Сохтори истифодашуда PDB 1O86 буд. Аз сохтори кристаллӣ лизиноприл ва молекулаҳои об хориҷ шуда, иони каталитикии Zn²⁺ ва ду иони хлорид нигоҳ дошта шуданд.

Пептидҳо дар се минтақа арзёбӣ шуданд:

• Site 1: минтақаи пайвастшавии каталитикии Zn²⁺,
• Site 2: ҷайби дисталии CL1,
• Site 3: ҷайби проксималии CL2.

Қиматҳои ин ҷо бояд на ҳамчун натиҷаи қатъии термодинамикӣ бо номи “энергияи пайвастшавӣ”, балки ҳамчун скори docking тафсир шаванд.

Дар Site 1, 16 пептиди дарози муқоисавӣ аз −35.1 то −45.2 kJ mol⁻¹ ва панҷ номзади кӯтоҳи Rule 5 аз −24.3 то −31.0 kJ mol⁻¹ скор доданд. Имкони ташкили тамосҳои бештари пептидҳои дароз метавонад яке аз шарҳҳои ин фарқ бошад.

Дар Site 2, скорҳои 16 пептиди дароз аз +10.9 то +493.1 kJ mol⁻¹ номусоид буданд, дар ҳоле ки панҷ пептиди кӯтоҳ аз −12.6 то −23.4 kJ mol⁻¹ скорҳои мусоид доданд. Ин натиҷа нишон медиҳад, ки канали танги марбут ба CL1 метавонад аз ҷиҳати геометрӣ барои пептидҳои кӯтоҳ мувофиқтар бошад.

Аммо дар ин ҷо омили муҳими омехтакунанда вуҷуд дорад: ҳамаи пептидҳои гурӯҳи Rule 5 2–3 аминокислотаӣ мебошанд, дар ҳоле ки ҳамаи пептидҳои гурӯҳи муқоиса 5–13 аминокислотаӣ ҳастанд. Аз ин рӯ таъсири “фарқ аз мотиви Rule 5 сар мезанад” ва “фарқ аз дарозии пептид сар мезанад” аз ҳам ҷудо карда намешаванд.

15. Скори docking-и нормализатсияшуда ба дарозӣ

Барои кам кардани бартарии табиии энергетикии пептидҳои дароз, ки бо атомҳо ва тамосҳои эҳтимолии бештар ба вуҷуд меояд, беҳтарин скори docking ба шумораи аминокислотаҳо тақсим карда шуд.

Қимати миёна дар номзадҳои кӯтоҳ −12.6 ± 1.8 kJ mol⁻¹ боқимонда⁻¹ ва дар пептидҳои дароз −5.9 ± 1.5 kJ mol⁻¹ боқимонда⁻¹ буд ва фарқ p < 0.001 гардид.

Бо вуҷуди ин, муаллифон ин натиҷаро далели комплементарияти махсус ба мотиви Rule 5 намешуморанд. Азбаски метрика бо дарозии пептид сахт вобаста аст, он пеш аз ҳама бастабандии самараноктари пептидҳои кӯтоҳро ба ҳисоби ҳар як боқимонда тавсиф мекунад.

16. Симулятсияи динамикаи молекулавӣ

Ҳар яке аз комплексҳои VF, GIF, LP, IP ва VP–ACE барои 200 ns ба симулятсияи all-atom динамикаи молекулавӣ ворид карда шуданд.

Қимати RMSD-и сутунмуҳраи ACE дар тақрибан 20 ns-и аввал ба мувозинат расид ва дар давраи таҳлили 20–200 ns вобаста ба комплекси пептидӣ тақрибан дар доираи 1.67 ± 0.09 то 2.09 ± 0.17 Å боқӣ монд.

Фосилаи ҳадди ақал байни ACE ва атомҳои вазнини пептид дар панҷ пептид 2.66–2.71 Å буд; миёнаи панҷ низом 2.70 ± 0.02 Å гузориш шуд. Дар давоми 200 ns ҷудошавии пурра мушоҳида нашуд.

Аммо ин чӣ маъно надорад? Нигоҳ доштани фосилаи ҳадди ақали атомҳо энергияи озоди пайвастшавӣ, бетағйир мондани геометрии ҳамон позаи docking дар тӯли 200 ns, residence time-и воқеии биологӣ ё механизми боздориро дар таҷриба исбот намекунад. Симулятсия танҳо нишон медиҳад, ки аз позаҳои ибтидоии интихобшуда тамоси пептид–сафеда нигоҳ дошта шудааст.

17. Маҳдудиятҳои асосии таҳқиқот

• Гидролизи виртуалии BIOPEP-UWM буриши назариявии пурраро дар ҷойҳои дастрас пешбинӣ мекунад; печиши воқеии сафеда ва дастрасии протеаза мураккабтаранд.
• Rule 5 дар дохили маҷмуаи таҳияи 24 гидролизат такмил дода шудааст.
• 16 гидролизати тиҷоратӣ ва пойгоҳи додаҳои 1429 пептид дастгирии мустақил медиҳанд; бо вуҷуди ин дар низомҳои дигари сафеда санҷиши иловагӣ лозим аст.
• Басомади Rule 5 фаровонии миқдории пептидҳоро дар гидролизати воқеӣ чен намекунад.
• Хусусиятҳои каммассаи MALDI панҷ пайдарпайии номзадро ба таври қатъӣ муайян накарданд.
• LP ва IP танҳо бо маълумоти массаи MALDI-и истифодашуда ҳамчун изомерҳо аз ҳам ҷудо карда нашуданд.
• Дар таҳлили docking дарозии пептид ва мувофиқат ба Rule 5 бо ҳам омехта буданд.
• Симулятсияҳои MD аз позаҳои ибтидоии dockшуда оғоз шуданд ва энергияи озоди пайвастшавӣ ҳисоб карда нашуд.
• Устувории gastrointestinal ба таври таҷрибавӣ чен карда нашуд.
• Суръати интиқол аз рӯда ё биодастрасии воқеӣ чен карда нашуд.
• Таъсири матритсаи ғизоӣ арзёбӣ нашуд.
• Самаранокии зиддифишорбаландӣ дар ҳайвонот нишон дода нашуд.
• Самаранокии клиникӣ дар одамон нишон дода нашуд.

18. Натиҷаи илмӣ чӣ гуна дуруст хонда шавад?

Натиҷаи қавии ин таҳқиқот ин нест, ки “мотиви терминалии ду-аминокислотаӣ фишори хунро паст мекунад”. Натиҷаи дурусттар чунин аст: ҳангоми баррасии номзадҳои пептидҳои кӯтоҳи боздорандаи ACE, махсусан пептидҳои ду ва се аминокислотаӣ, афзалият додан ба пайдарпайиҳои дорои комбинатсияҳои муайяни P1′ ва P2′ метавонад ҳиссаи ингибиторҳои қавитарро дар ҳавзи скрининги таҷрибавӣ зиёд кунад.

Дар ин замина арзиши Rule 5 дар он аст, ки он пеш аз занҷири гарон ва тӯлонии фраксиякунӣ–муайянсозӣ–синтез–кинетикаи фермент шумораи номзадҳоро кам карда метавонад. Қоида ҷойгузини валидасияи ниҳоии биохимиявӣ нест; он филтри шаффоф ва осонтафсир барои муайян кардани он медиҳад, ки кадом номзадҳоро аввал санҷидан арзанда аст.

Ёддошт оид ба Манбаъ ва Усул

Унвони аслӣ: A Length-Aware C-Terminal Rule for Prioritizing Short ACE-Inhibitory Peptides from Food Protein Hydrolysates

Муаллифон: Mei-Ling Li; Ying-Jang Lai; Pei-Yu Wu; Jen-Chieh Li; Shang-Ming Huang; Kuo-Chiang Hsu.

Саҳми баробар: Mei-Ling Li ва Ying-Jang Lai.

Муаллифони масъул: Shang-Ming Huang ва Kuo-Chiang Hsu.

Муассисаҳо: Department of Nutrition, China Medical University, Taichung, Taiwan; Department of Food Science, National Quemoy University, Kinmen, Taiwan; Department of Food Nutrition and Health Biotechnology, Asia University, Taichung, Taiwan.

Маҷалла: Foods.

Ношир: MDPI.

Ҷилд / шумора / рақами мақола: 15(15), 2764.

DOI: 10.3390/foods15152764

Ирсол: 16 Июл 2026.

Бознигарӣ: 31 Июл 2026.

Қабул: 5 Август 2026.

Нашр: 6 Август 2026.

Навъи манбаъ: Мақолаи таҳқиқоти аслӣ.

Баррасии ҳамтоён: Мақолаи нашршудаи баррасишуда; ношир сабти кушодаи баррасии ҳамтоён дорад.

Иҷозатнома: Creative Commons Attribution (CC BY).

Навъи таҳқиқот: Таҳқиқоти таҷрибавӣ-ҳисоббарорӣ, ки гидролизи виртуалии сафеда, гидролизи таҷрибавии сафеда, санҷиши in vitro боздории ACE, скрининги MALDI-TOF/TOF, валидасияи пептидҳои синтетикӣ, кинетикаи фермент, таҳлили benchmark-и пойгоҳи додаҳои берунии пептид, docking-и молекулавӣ ва симулятсияи динамикаи молекулавиро якҷо мекунад.

Таҳқиқоти инсон/клиникӣ: Не.

Таҳқиқоти самаранокии зиддифишорбаландӣ дар ҳайвонот: Не.

Кумитаи ахлоқии муассиса: Дар мақола ҳамчун “Not applicable” гузориш шудааст.

Дастрасии додаҳо: Маҷмуаи додаҳои дар таҳқиқот ҳосилшуда дар Zenodo бо DOI 10.5281/zenodo.21708604 ҳамчун кушода гузориш шудааст; маводи иловагӣ инчунин тавассути ношир пешниҳод шудааст.

Маблағгузорӣ: Taiwan National Science and Technology Council, MOST 105-2320-B-039-036-MY3; China Medical University, CMU114-S-37.

Бархӯрди манфиатҳо: Муаллифон бархӯрди манфиатҳоро гузориш накардаанд.

Саҳми муаллифон: Mei-Ling Li усул, валидасия ва лоиҳаи аввал; Ying-Jang Lai усул, валидасия ва курасияи додаҳо; Pei-Yu Wu захираҳо, таҳлили формалӣ ва курасияи додаҳо; Jen-Chieh Li таҳқиқот, усул ва курасияи додаҳо; Shang-Ming Huang назорат ва бознигарӣ/таҳрир; Kuo-Chiang Hsu консептуализатсия, назорат, бознигарӣ/таҳрир ва маблағгузориро иҷро кардааст.

Изҳороти истифодаи зеҳни сунъӣ: Муаллифон гузориш додаанд, ки ҳангоми омода кардани таҳқиқот аз ChatGPT (OpenAI, GPT-5.5) ва Claude (Anthropic, Claude Opus 4.6) танҳо барои беҳтар кардани возеҳӣ ва хонданбобии забон истифода кардаанд; барои эҷод ё тафсири додаҳои аслӣ, сохтани расмҳо ё баровардани натиҷаҳои илмӣ истифода набурдаанд. Қайд шудааст, ки муҳтавои ниҳоӣ аз ҷониби муаллифон бознигарӣ шуда ва масъулият ба зиммаи муаллифон аст.

Ёддошти гузоришдиҳии дохили манбаъ: Дар тавсифи усули BIOPEP-UWM барои пойгоҳи додаҳои гидролизи виртуалӣ ибораи “13 Декабр 2023 дастрас шудааст” омадааст, дар ҳоле ки фавран баъд аз он барои 773 пайдарпайии сафедаи ғизоӣ ибораи “Октябр–Декабр 2024 дастрас шудааст” оварда мешавад. Азбаски ҳар ду ибора дар манбаъ якҷо мавҷуданд, Verianla онҳоро ба як сана табдил надодааст.

Ёддошти номенклатура: Дар таърифи амалии мақола P1′ аминокислотаи C-терминалии пептид ва P2′ аминокислотаи дуюм аз охир мебошад. Муаллифон ба таври равшан қайд мекунанд, ки ин истифода аз таърифи аслии P1′ дар номенклатураи буриши протеазаи Schechter–Berger фарқ мекунад. Дар ин мақола шарҳҳои Rule 5 мувофиқи таърифи амалии ACE-QSAR-и муҳаққиқон дода шудаанд.

Сарҳади асосии тафсири методологӣ: Rule 5 консентратсияи воқеии пептидро дар гидролизат чен намекунад; он потенсиали ҳосил кардани мотиви сохториро пешгӯӣ мекунад. Доираи қавии татбиқи Rule 5, ки бо benchmark-и мустақили берунӣ дастгирӣ мешавад, пептидҳои 2–3 аминокислотаӣ мебошанд. Дар пептидҳои дарозтар иттилои мотиви терминалӣ танҳо худ аз худ боэътимод нест.