Myxochelin A сидерофори синфи катехолат мебошад, ки ба бактерияҳо дар гирифтани оҳан кумак мекунад. Гарчанде ки онро табиатан баъзе миксобактерияҳо истеҳсол мекунанд, миқдори пасти истеҳсоли табиӣ ба даст овардани миқдори кофии ин пайвастагиро барои таҳқиқот ва истифодаҳои эҳтимолии биотехнологӣ душвор мегардонад. Franziska Kofler ва ҳамкоронаш ҳадаф гузоштанд, ки ин мушкилро тавассути интиқоли генҳои биосинтези myxochelin A ба бактерияи Pseudomonas taiwanensis VLB120, ки парвариш ва тағйири генетикии он осонтар аст, ҳал кунанд.

Дар таҳқиқот танҳо ба интиқоли як кластери генӣ ба бактерияи дигар қонеъ нашудаанд. Тамоми раванди истеҳсол бо марҳилаҳои интихоби бактерияи мизбон, ҷойгир кардани генҳои биосинтетикӣ ба хромосома, баланд бардоштани сатҳи ифодаи генҳо, тағйир додани манбаъҳои карбон ва энергия, дастгирии молекулаҳои пешгузашта, пайгирии табдилёбии маҳсулот ва гузаронидани раванд ба биореактори идорашаванда ба таври низомманд такмил дода шудааст.

Штамми ибтидоии тарҳрезишудаи истеҳсолӣ аз глюкоза ҳамагӣ тақрибан 0,6 mg/L myxochelin A истеҳсол кардааст. Дар натиҷаи тағйироти генетикӣ ва оптимизатсияи муҳити ғизоӣ, консентратсияи myxochelin A дар биореактори 2 литрӣ то 226,4 ± 1,3 mg/L баланд шудааст. Дар ҳамин раванд сидерофори дигари аз ҷиҳати сохторӣ монанд — azotochelin — низ дар сатҳи 56,6 ± 8,7 mg/L ҳосил шудааст. Дар муқоиса бо арзиши ибтидоии 0,6 mg/L, афзоиши титри myxochelin A зиёда аз 300 маротиба мебошад.

Яке аз бозёфтҳои муҳим ва ғайричашмдошти таҳқиқот ин аст, ки интиқоли генҳои истеҳсоли myxochelin A ба ҳуҷайраи P. taiwanensis боиси ташаккули azotochelin низ шудааст. Таҷрибаҳои силсилаи вақт нишон доданд, ки пас аз марҳилаи муайяни истеҳсол миқдори myxochelin A кам шуда, миқдори azotochelin метавонад зиёд шавад. Муҳаққиқон ин ҳолатро бо он шарҳ медиҳанд, ки маҳсулоти мобайнии альдегидӣ дар биосинтези myxochelin тавассути ферментҳои оксидкунандаи худи бактерияи мизбон ба самти azotochelin равона мешавад.

Аммо ҳувияти azotochelin бо спектрометрияи масса тасдиқ нашудааст. Азбаски муҳаққиқон стандарти тиҷоратии azotochelin надоштанд, онҳо вақти нигоҳдории қуллаи HPLC ва спектри UV-VIS-ро дар фарҳанги Azotobacter vinelandii, ки azotochelin истеҳсол мекунад, бо қуллаи номаълуми штамми истеҳсолӣ муқоиса карданд. Монандӣ тафсири аз azotochelin будани пайвастагиро дастгирӣ мекунад; аммо тасдиқи қатъии сохторӣ бо LC-MS ё стандарти тозашуда пешниҳод нашудааст.

Маълум гардид, ки маҳдудияти аввалини истеҳсол танҳо норасоии молекулаи пешгузашта набудааст. Оптимизатсияи кодонии ферменти MxcG ва махсусан илова кардани нусхаҳои дуюми генҳои mxcE ва mxcF ҷаҳиши намоёни истеҳсолро таъмин кардааст. Ин натиҷа нишон медиҳад, ки миқдори ферментҳо дар марҳилаҳои фаъолсозии молекулаи пешгузаштаи 2,3-dihidroksibenzoat, пайвастани он ба сафедаи интиқолдиҳанда ва якҷояшавӣ бо lysin маҳдудкунанда будааст.

Интихоби манбаи карбон низ ба истеҳсол таъсири қавӣ расонд. Дар муқоиса бо истифодаи танҳо глюкоза ё глисерол, якҷоя додани глисерол ва октаноат сатҳи баландтари маҳсулоти умумиро таъмин кард. Баррасӣ шудааст, ки октаноат тавассути beta oksidasyon ба asetil-KoA табдил ёфта, метавонад ба метаболизми энергетикӣ саҳм гузорад; глисерол бошад, ҳамчун манбаи карбонии нисбат ба глюкоза бештар барқароршуда метавонад ба таъмини эквивалентҳои барқароркунанда кумак кунад. Бо вуҷуди ин, ин шарҳҳои метаболикӣ бо таҳлили мустақими ҷараён исбот нашудаанд.

Ҳангоми гузаронидани беҳтарин штамми истеҳсолӣ ба биореактори 2 литрии идорашаванда, дар шароити дорои 80 mM глисерол, 30 mM октаноат ва 2 mM 2,3-dihidroksibenzoat дар соати 34-ум 226,4 mg/L myxochelin A ва 56,6 mg/L azotochelin ба даст омад. Ин натиҷа дар муҳити муайяни минералӣ ба даст оварда шуд ва тибқи муқоисаи муаллифон аз сатҳҳои қаблан гузоришшудаи myxochelin A барои истеҳсолкунандагони табиӣ зиёдтар буд.

Бо вуҷуди ин, таҳқиқот омӯзиши таҳияи дору, самаранокии клиникӣ ё табобати саратон нест. Боздории 5-липоксигеназа аз ҷониби Myxochelin A ва таъсирҳои биологии дар моделҳои ҳуҷайравӣ гузоришшуда ба адабиёти қаблӣ тааллуқ доранд, ки асоси ангезаи ин таҳқиқотро ташкил медиҳанд. Дар ин таҳқиқот ҳуҷайраҳои инсон, моделҳои ҳайвонотии варам, амнияти дору ё муваффақияти табобат омӯхта нашудаанд.

Мушкилоти асосии таҳқиқот чист?

Маҳсулоти табиӣ молекулаҳое мебошанд, ки аз ҷониби микроорганизмҳо, растаниҳо ё дигар организмҳо истеҳсол шуда, метавонанд вазифаҳои мураккаби биологӣ дошта бошанд. Қисме аз онҳо дорои хосиятҳое мебошанд, ки метавонанд дар таҳқиқоти дору, кишоварзӣ, коркарди экологӣ ё биотехнологияи саноатӣ истифода шаванд. Аммо агар истеҳсолкунандаи табиӣ молекулаи ҳадафро дар миқдори хеле кам тавлид кунад, тозакунии пайвастагӣ ва омӯзиши муфассали он душвор мегардад.

Myxochelin A намунаи хуби ин мушкил аст. Пайвастагӣ метавонад табиатан аз ҷониби Myxococcus xanthus, Stigmatella aurantiaca ва дигар миксобактерияҳо истеҳсол шавад. Гарчанде миксобактерияҳо метаболитҳои дуюмдараҷаи арзишманд ба вуҷуд меоранд, шароити парвариш, шаклҳои афзоиш ва низомҳои танзимии онҳо барои истеҳсоли саноатӣ мураккаб буда метавонанд. Истеҳсоли myxochelin инчунин аз шароити муҳитӣ, ба монанди сатҳи оҳан, таъсир мегирад.

Мушкилоти асосие, ки муҳаққиқон ҳал кардан мехоҳанд, чунин аст: оё метавон Myxochelin A-ро бе вобастагӣ ба истеҳсолкунандаи табиии он дар бактерияи аз ҷиҳати генетикӣ осонтар идорашаванда ба миқдори баланд ва ба таври идорашаванда истеҳсол кард?

Myxochelin A ва мафҳуми сидерофор

Сидерофорҳо молекулаҳои хурде мебошанд, ки микроорганизмҳо барои бастани оҳани муҳит истеҳсол мекунанд. Гарчанде оҳан барои бисёр реаксияҳои ҳуҷайравӣ зарур аст, махсусан дар муҳитҳои дорои оксиген он метавонад дар шакли озод ва ба осонӣ дастрас кам бошад. Аз ин рӯ микроорганизмҳо молекулаҳои дорои майли баланди пайвастшавӣ ба оҳанро хориҷ мекунанд. Пас аз он ки сидерофор оҳанро мебандад, комплекси ҳосилшуда метавонад тавассути системаҳои интиқолии рӯи ҳуҷайра ба дохили ҳуҷайра гирифта шавад.

Myxochelin A сидерофоре мебошад, ки гурӯҳҳои катехолии пайвасткунандаи оҳан дорад. Скелети молекула аз пайвастани ду воҳиди 2,3-dihidroksibenzoat бо як молекулаи lysin иборат аст. Azotochelin низ сидерофори наздики сохторӣ мебошад, ки аз ҳамон пешгузаштаҳои асосӣ иборат аст, аммо аз ҷиҳати ҳолати оксидшавии гурӯҳи функсионалии ниҳоӣ фарқ мекунад.

Хосиятҳои қавии пайвасткунии металл аз ҷониби сидерофорҳо барои комплексонидани металлҳо дар муҳит, рақобати микробӣ, робитаҳои растанӣ–микроб ва таҳқиқоти маҳсулоти табиӣ аҳамият доранд. Бо вуҷуди ин, дар таҳқиқоти мазкур ҳеҷ яке аз ин истифодаҳо мустақиман санҷида нашудааст; он танҳо низоми истеҳсолро такмил додааст.

Чаро Myxochelin A таваҷҷуҳи илмӣ ҷалб мекунад?

Дар муқаддимаи таҳқиқот ба корҳои қаблӣ ишора шудааст, ки myxochelin A ва баъзе ҳосилаҳои он фаъолияти боздорандаи қавӣ нисбат ба ферменти инсонӣ 5-липоксигеназа нишон медиҳанд. 5-липоксигеназа ферментест, ки дар биосинтези лейкотриенҳо иштирок мекунад ва бо ҷавобҳои илтиҳобӣ алоқаманд аст. Барои Myxochelin A таъсирҳои зиддиомосӣ ё зиддиметастазии дар асоси ҳуҷайра ва лаборатория гузоришшуда низ қаблан зикр шудаанд.

Ин маълумот шарҳ медиҳад, ки чаро истеҳсоли myxochelin A дар миқдори бештар барои мақсадҳои таҳқиқотӣ метавонад арзишманд бошад. Аммо боздоштани як фермент дар муҳити лабораторӣ маънои онро надорад, ки молекула барои инсон доруи самаранок ва бехатар аст. Таҳқиқоти мазкур тасдиқи фармакологӣ анҷом надодааст; он танҳо истеҳсоли микробиро беҳтар кардааст.

Истеҳсоли гетерологӣ чӣ маъно дорад?

Истеҳсоли гетерологӣ ин интиқоли генҳои биосинтетикие мебошад, ки организм табиатан надорад, ба организми дигар ва истеҳсоли молекулаи ҳадаф дар мизбони нав. Дар ин ҷо генҳои биосинтези myxochelin аз заминаи табиии миксобактериявӣ гирифта шуда, ба ҳуҷайраи Pseudomonas taiwanensis VLB120 интиқол дода шудаанд.

Ин равишро метавон ба кӯчонидани хатти истеҳсолӣ ба корхонаи дигар монанд кард. Аммо дар истеҳсоли биологӣ мошинҳо генҳо ва ферментҳо мебошанд. Низоми энергетикӣ, ҷараёни ашёи хом, ферментҳои ёрирасон, сафедаҳои интиқолдиҳанда ва механизмҳои коркарди партов дар корхонаи нав аз корхонаи пешина фарқ мекунанд. Аз ин рӯ, танҳо интиқоли генҳо бисёр вақт кофӣ нест.

Чаро Pseudomonas taiwanensis VLB120 интихоб шуд?

P. taiwanensis VLB120 мизбони бактериявие мебошад, ки метавонад манбаъҳои гуногуни карбонро истифода барад, нисбат ба пайвастагиҳои ароматикӣ то ҳадде таҳаммулпазир аст, аз ҷиҳати генетикӣ тағйирпазир мебошад ва қаблан дар таҳқиқоти биопроцесс истифода шудааст. Штаммҳои шассии дорои геноми содакардашудае, ки гурӯҳи таҳқиқотӣ барои ин бактерия таҳия кардааст, ва таҷрибаи онҳо дар истеҳсоли пайвастагиҳои ароматикӣ низ дар интихоб нақш доштаанд.

Муаллифон инчунин озмоиши таҳаммулпазирӣ илова кардаанд, ки нишон медиҳад штамми истеҳсолӣ метавонад дар муҳити дорои то 50 mg/L myxochelin A афзоиш ёбад. Ин натиҷа дастгирӣ мекунад, ки бактерия метавонад то сатҳи муайян ба фишоре, ки аз таъсири пайвасткунии металл аз ҷониби myxochelin A ба вуҷуд меояд, тоб оварад.

Бо вуҷуди ин, васеъ будани метаболизми Pseudomonas танҳо бартарӣ нест. Альдегиддегидрогеназаҳои табиии ҳуҷайраи мизбон метавонанд маҳсулоти мобайнии роҳи биосинтези ҳадафро ба маҳсулоти дигар табдил диҳанд. Ташаккули ғайричашмдошти azotochelin дар ин таҳқиқот намунаи равшани ҳамин чандирии дуҷонибаи метаболикӣ мебошад.

Роҳи биосинтези Myxochelin чӣ гуна кор мекунад?

Шакли 1 ферментҳои асосӣ ва марҳилаҳои мобайниро, ки истеҳсоли myxochelin A-ро ташкил медиҳанд, ба таври схемавӣ нишон медиҳад. Раванд аз метаболити марказӣ chorismate оғоз меёбад.

1. MxcD chorismate-ро ба isochorismate табдил медиҳад.
2. Қисмати isochorismatase-и MxcF isochorismate-ро ба самти 2,3-dihidroksi-2,3-dihidrobenzoat мебарад.
3. MxcC ин маҳсулоти мобайниро ба 2,3-dihidroksibenzoat табдил медиҳад.
4. MxcE 2,3-dihidroksibenzoat-ро бо истифода аз ATP фаъол мекунад.
5. Пешгузаштаи ароматии фаъолшуда ба қисми aryl carrier protein-и MxcF пайваст мешавад.
6. Lysin ба қисми интиқолдиҳандаи non-ribosomal peptide synthetase бо номи MxcG бор карда мешавад.
7. Қисмати конденсатсионии MxcG ду воҳиди 2,3-dihidroksibenzoat-ро бо lysin пайваст мекунад.
8. Қисмати редуктазии MxcG tioester-и ба сафедаи интиқолдиҳанда пайвастаро барқарор карда, маҳсулоти мобайнии альдегидиро ба вуҷуд меорад, ки ба ташаккули myxochelin A меравад.

Барои он ки MxcF ва MxcG пешгузаштаҳоро интиқол дода тавонанд, онҳо бояд аз ҷониби MtaA бо коферменти 4’-fosfopantetein пас аз тарҷума тағйир дода шаванд. Ин кофермент мисли дасти ҳаракаткунанда амал мекунад, ки молекулаҳои пешгузаштаро тавассути пайванди муваққатии tioester ба фермент мепайвандад.

Агар дар роҳи табиӣ transaminase бо номи MxcL мавҷуд бошад, маҳсулоти мобайнии альдегидӣ метавонад ба myxochelin B равона шавад. Барои пешгирии ташаккули myxochelin B муҳаққиқон гени mxcL-ро ба модули истеҳсолӣ дохил накардаанд. MxcK бошад, ҳамчун сафедаи содиротӣ илова шудааст, ки ба берунбарории маҳсулоти ҳосилшуда аз ҳуҷайра мусоидат мекунад.

Фарқи байни Myxochelin A ва azotochelin

Azotochelin низ аз ду воҳиди 2,3-dihidroksibenzoat ва як воҳиди lysin иборат аст. Фарқи асосӣ дар он аст, ки дар марҳилаи охирини биосинтез маҳсулоти мобайнии ба сафедаи интиқолдиҳанда пайвастшуда дар кадом шакли химиявӣ озод мешавад.

Ферменти EntF дар бактерияи Azotobacter vinelandii, бар хилофи MxcG, ба ҷойи қисми редуктаза қисми tioesterase дорад ва маҳсулоти мобайниро ба самти azotochelin мебарад. Дар роҳи myxochelin бошад, фаъолияти редуктазии MxcG ташаккули альдегид ва баъдан myxochelin A дар шакли спиртиро дастгирӣ мекунад.

Гарчанде штамми P. taiwanensis дар таҳқиқот кластери генҳои azotochelin надошт, маҳсулоти монанд ба azotochelin ҳосил шуд. Муҳаққиқон чунин мешуморанд, ки маҳсулоти мобайнии альдегидӣ, ки ҳангоми синтези myxochelin ба вуҷуд меояд, метавонад тавассути ферментҳои оксидкунандаи альдегиди ҳуҷайраи мизбон ба кислотаи карбоксилӣ табдил дода шавад.

Чаро модулҳои аввалини истеҳсолӣ кофӣ набуданд?

Муҳаққиқон дар ибтидо бо мақсади зиёд кардани таъминоти 2,3-dihidroksibenzoat модулҳои гуногуни биосинтетикиро муқоиса карданд. Дар баъзе модулҳо ба ҷойи генҳои миксобактериявӣ генҳои аз Escherichia coli гирифташуда, ба монанди entC, menF, entB ва entA, ки вазифаҳои монанд доранд, истифода шуданд.

Илова бар ин, бо мақсади коҳиш додани вайроншавии lysin гени davB ҳазф карда шуд, барои зиёд кардани миқдори MtaA низоми иловагии ифода санҷида шуд ва миқдори глюкоза зиёд карда шуд. Бо вуҷуди ин, истеҳсол афзоиш наёфт ва дар баъзе тарҳҳо ҳатто камтар шуд.

Модули ибтидоии муваффақтарин ҳамагӣ 0,6 ± 0,0 mg/L myxochelin A истеҳсол кард. Яке аз модулҳои алтернативии пешгузашта то 0,2 ± 0,0 mg/L коҳиш ёфт. Зиёд кардани глюкоза аз 20 mM ба 30 mM низ истеҳсолро аз 0,7 mg/L боло набурд.

Ин натиҷаҳо нишон доданд, ки мушкил танҳо таъмини карбон ё пешгузаштаи бештар нест. Муҳаққиқон ба хулоса омаданд, ки сатҳи ифодаи генҳои биосинтетикӣ ва махсусан марҳилаҳои баъдии ферментативии роҳ метавонанд маҳдудкунанда бошанд.

Чаро тартиби кластери генҳо муҳим буд?

Дар кластерҳои калони генҳои биосинтетикӣ на танҳо мавҷудияти кадом генҳо, балки тартиби онҳо, масофа аз промотор, устувории mRNA ва таъсири қутбии генҳои ҳамсоя ба ифода низ муҳим аст. Иваз кардани як ген бо гени дигаре, ки аз ҷиҳати вазифа монанд аст, метавонад ҳатто агар аз ҷиҳати назариявӣ ҳамон реаксияро таъмин кунад, тавозуни ифодаи тамоми operon-ро вайрон намояд.

Аз ин рӯ муҳаққиқон инчунин модули истеҳсолии мукаммалтареро санҷиданд, ки тартиби табиии генҳои миксобактериявиро нигоҳ медошт. Ин модул тавонист дар маҷмӯъ 3,8 ± 2,4 mg/L маҳсулот диҳад, аммо натиҷаҳои афзоиш ва истеҳсол такроршаванда набуданд. Модули дорои титри пасттари 0,6 ± 0,2 mg/L бошад, аз сабаби устуворӣ ва такроршаванда будан барои оптимизатсияҳои баъдӣ интихоб шуд.

Ин интихоб нишон медиҳад, ки ба ҷойи баландтарин ченаки ягона платформаи боэътимоди истеҳсолӣ интихоб шудааст. Дар рушди биопроцесс, баробари миқдори миёнаи маҳсулот, ба даст овардани ҳамон натиҷа дар фарҳангҳои гуногун низ аҳамият дорад.

Ташаккули azotochelin чӣ гуна ошкор шуд?

Шакли 3 тағйироти myxochelin A-ро бо мурури вақт дар штаммҳои гуногуни назоратӣ ва истеҳсолӣ нишон медиҳад. Myxochelin A-и аз берун илова кардашуда дар муҳити бе ҳуҷайра ва дар штамми асосие, ки генҳои биосинтезро надошт, ба таври намоён вайрон нашуд.

Баръакс, дар штаммҳои истеҳсолие, ки роҳи биосинтези myxochelin-ро доштанд, myxochelin A пас аз расидан ба қулла тақрибан дар атрофи 24 соат ба камшавӣ оғоз кард. Дар ҳамин давра қуллаи дуюми HPLC пайдо шуд ва ҳангоми кам шудани myxochelin A ин маҳсулот ҷамъшавиро идома дод.

Ин намуна нишон дод, ки пайвастагии дуюм танҳо дар муҳити ғизоӣ худ аз худ ба вуҷуд намеояд; эҳтимол ферментҳои биосинтези myxochelin ё метаболизми штамми истеҳсолӣ дар ин табдилёбӣ нақш доранд.

Муҳаққиқон қуллаи номаълумро бо қуллаи моеъи болоии фарҳанги истеҳсолкунандаи табиии azotochelin — A. vinelandii — муқоиса карданд. Вақти нигоҳдории якхелаи HPLC ва спектрҳои монанди UV-VIS барои ду қулла асоси тафсири аз azotochelin будани пайвастагии номаълум гардид.

Аммо ин шиносоӣ ғайримустақим аст. Барои azotochelin стандарти тоза ва тасдиқшуда истифода нашудааст, LC-MS ё спектрометрияи массаи баландҳалкунанда анҷом дода нашудааст ва шаклҳои ба оҳан пайваст ва бе оҳани молекула алоҳида нишон дода нашудаанд. Аз ин рӯ, дар мақола ибораи “маҳсулоте, ки ба таври ғайримустақим ҳамчун azotochelin шиносоӣ шудааст” аз ҷиҳати илмӣ дақиқтар аст.

Аз нав ба ҳуҷайра гирифта шудани маҳсулот чиро нишон дод?

Дар штамми истеҳсолие, ки myxochelin A аз берун илова шуда буд, дида шуд, ки пайвастагӣ метавонад аз ҷониби ҳуҷайра гирифта шуда, ба маҳсулоти монанд ба azotochelin табдил ёбад. Ин мушоҳида нишон медиҳад, ки реаксия танҳо дар маҳсулоти мобайнии навсинтезшуда ва ба фермент пайвастшуда рух намедиҳад; myxochelin A-и аз ҳуҷайра хориҷшуда низ метавонад дубора ба дохил гирифта шуда, ба табдилёбии метаболикӣ дучор шавад.

Муҳаққиқон баррасӣ мекунанд, ки MxcG метавонад дар ин табдил нақш дошта бошад ва myxochelin A дубора ба маҳсулоти мобайнии альдегидӣ равона шавад. Аммо бояд дар назар дошт, ки реаксияи баръакс бо озмоиши мустақими ферментӣ нишон дода нашудааст.

Чаро манбаъҳои карбон якҷоя истифода шуданд?

Иқтидори истеҳсолии як корхонаи ҳуҷайравӣ танҳо аз миқдори умумии карбон вобаста нест. Манбаъҳои гуногуни карбон бо суръатҳои гуногун ба ҳуҷайра дохил мешаванд, ба роҳҳои гуногуни метаболикӣ мепайванданд ва ба ташаккули миқдорҳои гуногуни ATP, NADH ё NADPH саҳм мегузоранд.

Азбаски синтези myxochelin марҳилаҳои adenylation-и ниёзманд ба ATP, фаъолсозии сафедаи интиқолдиҳанда, ташаккули пайванди пептидӣ ва реаксияҳои барқароршавиро дар бар мегирад, ин раванд аз ҷиҳати энергия ва эквивалентҳои барқароркунанда серталаб аст.

Дар Шакли 4 глюкоза ва глисерол дар якҷоягӣ бо цитрат, ацетат, сукцинат ё октаноат арзёбӣ шудаанд. Дар шароите, ки танҳо глюкоза истифода шуд, истеҳсоли умумӣ 3,3 ± 0,1 mg/L буд. Манбаъҳои дуюмдараҷаи карбоне, ки ба глюкоза илова шуданд, истеҳсоли умумиро тақрибан ба диапазони 4,4–5,8 mg/L расониданд.

Глисерол танҳо дар 24 соат 1,9 ± 0,0 mg/L маҳсулот дод. Самаранокии пасттари ибтидоии глисерол бо давраи тӯлонии мутобиқшавӣ алоқаманд карда шуд. Вақте вақти фарҳанг то 48 соат дароз карда шуд, истеҳсол бо глисерол ба 6,1 ± 0,1 mg/L расид.

Илова кардани цитрат, ацетат, сукцинат ё октаноат ба глисерол истеҳсоли умумиро тақрибан ба диапазони 6,1–9,6 mg/L баланд кард. Яке аз таркибҳои аввалини ҷолиб 40 mM глисерол бо 12 mM октаноат буд; дар ин шароит 1,5 mg/L myxochelin A ва 8,1 mg/L azotochelin, яъне дар маҷмӯъ 9,6 mg/L маҳсулот ба даст омад.

Нақши эҳтимолии октаноат

Октаноат кислотаи равғании дорои ҳашт атоми карбон мебошад. Дар ҳуҷайраи бактерия он метавонад тавассути beta oksidasyon ба воҳидҳои asetil-KoA табдил ёбад. Asetil-KoA метавонад ба давраи кислотаҳои трикарбоксилӣ ворид шуда, ба истеҳсоли энергия саҳм гузорад.

Робитаи асосии пешниҳодшуда дар таҳқиқотро метавон чунин ҷамъбаст кард:

\[ \mathrm{Oktanoat} \xrightarrow{\beta\text{-oksidasyon}} \mathrm{Asetil\!-\!KoA} \rightarrow \mathrm{TCA\ döngüsü} \rightarrow \mathrm{enerji\ ve\ indirgeme\ eşdeğerleri} \]

Ин ифода дар мақола ҳамчун як муодилаи ягонаи химиявӣ дода нашудааст; он мантиқи метаболикии дар муҳокима пешниҳодшударо нишон медиҳад. Бо кадом ген ё ҷараёни метаболикӣ октаноат истеҳсолро дақиқ зиёд кардааст, бо нишонагузории изотопӣ ё таҳлили ҷараёни метаболикӣ тасдиқ нашудааст.

Маҳдудияти муҳими таҷрибаи манбаи карбон

Миқдори умумии молии карбон дар муҳитҳои ғизоии муқоисашуда баробар нигоҳ дошта нашудааст. Масалан, таркибҳои глюкоза, глисерол, цитрат ва октаноат миқдори умумии гуногуни карбон доранд. Аз ин рӯ дақиқ ҷудо кардан душвор аст, ки чӣ қадар аз фарқи мушоҳидашудаи истеҳсол аз хусусияти метаболикии манбаи карбон ва чӣ қадар аз миқдори умумии карбон бармеояд.

Муҳаққиқон қайд карданд, ки гарчанде бо афзоиши консентратсияи октаноат миқдори умумии карбон зиёд шуд, дар шароити дорои глюкоза истеҳсол бо ҳамон таносуб зиёд нашуд ва онҳо баҳс карданд, ки таъсир танҳо бо миқдори умумии карбон шарҳ дода намешавад. Бо вуҷуди ин, тарҳи таҷриба бо карбони баробар метавонист муқоисаи қавитаре фароҳам оварад.

Баланд бардоштани сатҳи MxcG

MxcG non-ribosomal peptide synthetase-и бисёрдоменӣ мебошад, ки lysin-ро мебарад, пайвастани пешгузаштаҳои ароматиро бо lysin таъмин мекунад ва дар марҳилаи охирини барқароршавӣ иштирок мекунад. Аз ин рӯ, он яке аз ферментҳои марказии энергияталаби роҳ мебошад.

Муҳаққиқон гени mxcG-ро барои P. taiwanensis аз ҷиҳати кодон оптимизатсия карда, онро аз плазмиди аз салисилат фаъолшаванда ба таври иловагӣ ифода намуданд. Ҳадафи оптимизатсияи кодон ин аст, ки кодонҳои камистифодашаванда дар бактерияи мизбон бо кодонҳои ҳаммаънои мувофиқтар иваз шуда, синтези сафеда самараноктар гардад.

Дар набудани октаноат, ифодаи иловагии MxcG афзоиши намоёни истеҳсолро ба вуҷуд наовард. Аммо вақте октаноат бо глюкоза ё глисерол якҷоя дода шуд, фоидаи MxcG-и иловагӣ ошкор гардид.

Ин натиҷа нишон медиҳад, ки танҳо истеҳсоли ферменти бештар кофӣ нест. Вақте миқдори MxcG зиёд карда мешавад, талаботи фермент ба энергия ва эквивалентҳои барқароркунанда низ бояд таъмин гардад. Ба ибораи дигар, иқтидори фермент ва иқтидори энергетикии ҳуҷайра бояд якҷоя зиёд карда шаванд.

Бо ифодаи иловагии mxcG ва 12 mM октаноат, дар фарҳангҳои 48-соата истеҳсоли умумӣ дар асоси глюкоза ба 28,1 ± 6,5 mg/L ва дар асоси глисерол ба 44,5 ± 16,7 mg/L расид.

Ҷаҳиши асосӣ: нусхаи дуюми генҳои mxcE ва mxcF

Бо вуҷуди истеҳсоли иловагии MxcG, танҳо қисми маҳдуди 2,3-dihidroksibenzoat ба маҳсулот табдил ёфт. Аз ин рӯ муҳаққиқон ба марҳилаҳои фаъолсозии пешгузашта ва пайвастани он ба сафедаи интиқолдиҳанда диққат доданд.

MxcE 2,3-dihidroksibenzoat-ро бо истифода аз ATP аденилатсия мекунад. MxcF бошад ҳам қисми ферментие дорад, ки дар табдили isochorismate иштирок мекунад, ва ҳам қисми aryl carrier protein, ки пешгузаштаи ароматии фаъолшударо мебарад.

Ба хромосомаи штамми истеҳсолӣ нусхаи дуюми mxcEF зери промотори қавӣ ва доимӣ фаъол илова карда шуд. Пас аз ин тағйирот, ҳатто дар шароите, ки глюкоза ягона манбаи карбон буд, маҳсулоти умумӣ ба 85,2 ± 3,4 mg/L баланд шуд.

Бе иловаи октаноат бо 40 mM глисерол 100,4 ± 16,1 mg/L; ҳангоми якҷоя истифода шудани 10 mM глюкоза ва 20 mM глисерол 125,2 ± 7,0 mg/L маҳсулоти умумӣ ба даст омад.

Дар шароити дорои 20 mM глюкоза, 15 mM октаноат ва 75 mg/L 2,3-dihidroksibenzoat-и аз берун иловашуда, 51,7 ± 0,0 mg/L myxochelin A ва 99,5 ± 0,6 mg/L azotochelin истеҳсол шуданд; титри умумӣ тақрибан ба 151,2 mg/L расид.

Ин ҷаҳиш дастгирӣ мекунад, ки миқдори MxcE ва MxcF дар штаммҳои қаблӣ маҳдудияти муҳим будааст. Бо вуҷуди ин, то кадом андоза ҳар як фермент алоҳида маҳдудкунанда аст ва афзоиши миқдори сафедаҳо бо ҳам чӣ гуна таъсир мекунанд, бо озмоишҳои ҷудогонаи ферментӣ нишон дода нашудааст.

Таъсирҳои эҳтимолии байни сафедаҳои MxcE, MxcF ва MxcG

MxcF ду вазифаи гуногун дорад: дар табдили isochorismate иштирок мекунад ва ҳамзамон қисми сафедавие дорад, ки 2,3-dihidroksibenzoat-ро интиқол медиҳад. Аз ин рӯ самаранокии MxcF метавонад на танҳо аз миқдори он, балки аз таъсирҳои физикии он бо MxcE ва MxcG низ вобаста бошад.

Муҳаққиқон барои шарҳи фоидаи нусхаҳои иловагии mxcEF якчанд имконотро муҳокима карданд:

• Фаъол кардани миқдори бештари 2,3-dihidroksibenzoat аз ҷониби MxcE,
• Қобилияти MxcF барои интиқоли миқдори бештари пешгузаштаи ароматӣ,
• Ташаккули самараноктари комплекси MxcE-MxcF-MxcG,
• Қабули тезтари пешгузаштаи ба MxcF пайвастшуда аз ҷониби MxcG,
• Иҷрои вазифаи қисман монанд ба MxcE аз ҷониби ферменти дигаре дар ҳуҷайраи мизбон.

Дар таҳқиқот ин имконот мустақиман санҷида нашудаанд. Азбаски озмоишҳои таъсири сафеда–сафеда, pull-down, кинетикаи ферментӣ ё таҳлили сохторӣ анҷом дода нашудаанд, механизм ҳамчун саволи кушодаи таҳқиқотӣ боқӣ мондааст.

Самаранокии биотрансформатсия чӣ гуна ҳисоб карда шуд?

Дар таҳқиқот самаранокии биотрансформатсия ҳамчун нисбати миқдори умумии молии myxochelin A ва azotochelin-и ҳосилшуда ба миқдори молии 2,3-dihidroksibenzoat-и ба муҳити ғизоӣ илова кардашуда арзёбӣ шудааст:

\[ Y_{\mathrm{BT}} = \frac{n_{\mathrm{myxochelin\ A}} + n_{\mathrm{azotochelin}}}{n_{\mathrm{eklenen\ 2,3\!-\!dihidroksibenzoat}}} \times 100 \]

Дар ин ҷо:

• Y_BT самаранокии биотрансформатсияро бо воҳиди mol/mol ифода мекунад,
• n_{myxochelin A} миқдори молии myxochelin A-и ҳосилшударо,
• n_azotochelin миқдори молии azotochelin-и ҳосилшударо,
• n_{eklenen 2,3-dihidroksibenzoat} миқдори молии пешгузаштаеро, ки аз берун ба муҳити ғизоӣ дода шудааст, ифода мекунад.

Азбаски барои ҳар як молекулаи myxochelin A ё azotochelin ду молекулаи 2,3-dihidroksibenzoat лозим аст, агар танҳо пешгузаштаи аз берун иловашуда истифода шавад, ҳадди назариявии болоӣ 50 фоиз mol/mol мебошад.

Дар баъзе таҷрибаҳо самаранокии ҳисобшуда аз 50 фоиз ҳам зиёд шуда, масалан ба 73,3 ± 0,9 фоиз расид. Муҳаққиқон инро хатои ҳисоб не, балки натиҷаи он донистанд, ки бактерия илова бар пешгузаштаи беруна аз манбаъҳои карбон 2,3-dihidroksibenzoat-и нав тавлид мекунад.

Дар шароите, ки аз тақрибан 0,5 mM пешгузаштаи беруна 0,37 mM маҳсулоти умумӣ ҳосил шуд, ҳисоб карда шуд, ки 0,12 mM маҳсулот на аз пешгузаштаи беруна, балки аз 2,3-dihidroksibenzoat-и de novo дар метаболизми худи ҳуҷайра тавлидшуда сарчашма мегирад. Ин миқдор тақрибан 31,7 фоизи маҳсулоти умумиро ташкил медиҳад.

Фоида ва маҳдудияти додани пешгузашта аз берун

Пас аз баланд бардоштани сатҳҳои MxcEFG, маҳдудияти нави истеҳсол таъминоти 2,3-dihidroksibenzoat гардид. Аз ин рӯ ба муҳити ғизоӣ 0,5, 1 ва 2 mM пешгузашта илова карда шуд.

Дар якҷоягӣ бо 40 mM глисерол ва 15 mM октаноат, зиёд кардани дастгирии пешгузашта титри myxochelin A-ро ба 117,8 ± 5,9 mg/L ва титри azotochelin-ро ба 45,3 ± 0,9 mg/L расонд. Истеҳсоли умумӣ 163,1 ± 6,8 mg/L буд.

Аммо дар ҳамин шароит тақрибан 140,7 ± 6,6 mg/L 2,3-dihidroksibenzoat бе истифода дар муҳит боқӣ монд. Ин натиҷа нишон медиҳад, ки ҳатто бо зиёд кардани таъминоти пешгузашта иқтидори ферментативии қисмҳои поёнии роҳ метавонад маҳдуд боқӣ монад.

Агар мошинҳои баъдии хатти истеҳсолӣ нокифоя бошанд, додани ашёи хоми бештар ба ҷойи табдил ёфтан ба маҳсулот боиси ҷамъшавии он дар муҳит мегардад. Аз ин рӯ оптимизатсияҳои баъдӣ бояд на танҳо синтези пешгузашта, балки ифода ва фаъолияти мутавозини ферментҳои Mxc-ро низ ба назар гиранд.

Чаро дастгирии Lysin истеҳсолро зиёд накард?

Пешгузаштаи дуюми асосии Myxochelin A lysin мебошад. Аз ин рӯ интизор мерафт, ки илова кардани lysin аз берун истеҳсолро афзоиш диҳад. Аммо дар таҷрибаҳо дастгирии 0,5 mM lysin дар аксари шароитҳо истеҳсолро кам карда, истеъмоли 2,3-dihidroksibenzoat-ро коҳиш дод.

Ин ҳолат заҳролуд будани мустақими lysin ё як механизми ягонаи мушаххасро исбот намекунад. Дастгирии lysin метавонад ба танзими метаболикӣ, интиқол, тавозуни ферментҳо ё таносуби мувофиқи пешгузаштаҳо таъсири манфӣ расонда бошад. Таҳқиқот ин механизмро ба таври муфассал ҳал накардааст.

Чаро таносуби Myxochelin A ва azotochelin тағйир ёфт?

Дар муҳитҳои ғизоии гуногун ҳиссаи myxochelin A дар маҳсулоти умумӣ байни 15 фоиз ва 72 фоиз тағйир ёфт. Ин диапазони васеъ нишон медиҳад, ки ду маҳсулот аз як ҳавзи умумии метаболитҳои мобайнӣ ғизо мегиранд ва шароити муҳит тавозуни байни барқароршавӣ ва оксидшавии маҳсулоти мобайнии альдегидиро таъсир медиҳад.

Ҳангоми зиёд шудани карбон ва истифодаи чанд манбаи карбон истеҳсоли умумӣ зиёд шуд, дар баъзе шароитҳо зиёд кардани дастгирии 2,3-dihidroksibenzoat ҳиссаи myxochelin A-ро низ зиёд кард. Яке аз баландтарин ҳиссаҳои myxochelin A дар таркиби 40 mM глисерол, 15 mM октаноат ва 2 mM 2,3-dihidroksibenzoat мушоҳида шуд.

Аммо механизми дақиқи ферментативӣ ва редоксие, ки таносуби маҳсулотро муайян мекунад, чен карда нашудааст. Сатҳҳои NADH/NADPH, фаъолияти aldehyde dehydrogenase ё ҷараёнҳои дохилиҳуҷайравии метаболитҳо мустақиман таҳлил нашудаанд.

Гузариш аз таҷрибаҳои микроплата ба биореактор

Скринингҳои аввал дар плитаҳои 24-чоҳагии System Duetz бо истифода аз 1,5 mL муҳити ғизоӣ дар ҳар чоҳ анҷом дода шуданд. Ин система имкон дод, ки шумораи зиёди сохторҳои генетикӣ ва шароити муҳити ғизоӣ ба таври параллелӣ муқоиса шаванд.

Беҳтарин штамм баъдан ба биореакторҳои 2 литрии DASGIP гузаронида шуда, дар ҳаҷми кори 1 литр парвариш ёфт. Дар биореактор:

• pH дар 7 нигоҳ дошта шуд.
• Шиддати оксигени ҳалшуда ба 30 фоиз танзим карда шуд.
• Омехтакунӣ дар байни 400–800 rpm ба таври худкор тағйир дода шуд.
• Ҷараёни ҳаво дар диапазони 1–2 vvm идора карда шуд.
• Ҳангоми зарурат ҳиссаи оксиген дар гази таъминотӣ аз 21 фоиз то 100 фоиз зиёд карда шуд.
• Намунаҳо бо намунагирандаи автоматӣ ҳар се соат гирифта шуданд.

Ин назорат имкон дод, ки афзоиши ҳуҷайра, истеъмоли карбон, истеъмоли пешгузашта ва ташаккули маҳсулот бо мурури вақт муфассалтар пайгирӣ карда шаванд.

Таҷрибаи аввалини биореактор

Дар шароити аввалини биореактор 40 mM глисерол, 15 mM октаноат ва 1 mM 2,3-dihidroksibenzoat истифода шуд. Зичии ҳуҷайра дар соати 22-юм ба OD₆₀₀ = 7,8 ± 0,1 расид.

Баландтарин суръатҳои истеҳсол байни соатҳои 16–25 чен шуданд:

• Барои Myxochelin A — 11,6 ± 0,5 mg L⁻¹ соат⁻¹,
• Барои Azotochelin — 2,2 ± 0,3 mg L⁻¹ соат⁻¹.

Дар соати 25-ум 115,7 ± 1,8 mg/L myxochelin A ва 23,2 ± 1,4 mg/L azotochelin ба даст омад. 90,9 ± 0,3 фоизи маҳсулоти умумиро myxochelin A ташкил дод.

Гарчанде 1 mM 2,3-dihidroksibenzoat-и иловашуда пурра истеъмол шуд, маҳсулоти умумӣ ҳамагӣ 0,34 ± 0,01 mM буд. Самаранокии биотрансформатсия 33,6 ± 1,0 фоиз ҳисоб карда шуд.

Суръати ҳаҷмии истеҳсол чӣ маъно дорад?

Space-time yield-и гузоришшуда дар таҳқиқот нисбати миқдори маҳсулоти ҳосилшуда дар як литр фарҳанг дар фосилаи муайяни вақт ба давомнокии он мебошад:

\[ \mathrm{STY} = \frac{\Delta C_{\mathrm{ürün}}}{\Delta t} \]

Дар ин ҷо:

• STY суръати ҳаҷмии истеҳсолро,
• ΔC_ürün тағйироти консентратсияи маҳсулотро дар фосилаи муайян,
• Δt вақти гузаштаро ифода мекунад.

Воҳид ҳамчун mg L⁻¹ соат⁻¹ дода шудааст. Титр нишон медиҳад, ки дар охир дар зарф чӣ қадар маҳсулот мавҷуд аст, дар ҳоле ки суръати истеҳсол нишон медиҳад, ки ба ин миқдор чӣ қадар зуд расида шудааст.

Таҷрибаи дуюми биореактор ва баландтарин истеҳсол

Дар таҷрибаи дуюми биореактор миқдори карбон ва пешгузашта ду баробар зиёд карда шуд:

• 80 mM глисерол,
• 30 mM октаноат,
• 2 mM 2,3-dihidroksibenzoat.

Зичии ҳуҷайра дар соати 28-ум ба OD₆₀₀ = 15,0 ± 0,3 расид. Дар байни соатҳои 22–31 баландтарин суръати ҳаҷмии истеҳсол барои маҳсулоти якҷоя 26,7 ± 1,8 mg L⁻¹ соат⁻¹ ва танҳо барои myxochelin A 21,7 ± 1,0 mg L⁻¹ соат⁻¹ буд.

Дар соати 34-ум:

• 226,4 ± 1,3 mg/L myxochelin A,
• 56,6 ± 8,7 mg/L azotochelin,
• Дар маҷмӯъ 0,70 ± 0,02 mM маҳсулот ба даст омад.

Дар ҳамин вақт 1,64 ± 0,12 mM 2,3-dihidroksibenzoat истеъмол шуд ва самаранокии биотрансформатсия 34,8 ± 1,2 фоиз ҳисоб карда шуд.

Дарозтар идома додани фарҳанг истеъмоли пурраи пешгузаштаи боқимондаро таъмин кард, аммо миқдори маҳсулотро зиёд накард. Ин ҳолат нишон медиҳад, ки пешгузашта метавонад ба равандҳои дигари метаболикӣ ғайр аз маҳсулоти ҳадаф рафта бошад, дар маҳсулоти мобайнии ба фермент пайвастшуда боқӣ монда бошад ё маҳсулоти ҳосилшуда вайрон шуда бошад.

Равзанаи истеҳсолие, ки Шакли 6 нишон медиҳад

Графикҳои вақтӣ дар Шакли 6 нишон медиҳанд, ки пас аз як давраи тӯлонии мутобиқшавии ибтидоӣ як давраи кӯтоҳ ва шадиди истеҳсол вуҷуд дорад. Myxochelin A ва azotochelin дар оғоз якҷоя ҷамъ мешаванд, аммо бо кам шудани манбаъҳои карбон табдилёбии myxochelin A ба azotochelin равшантар мегардад.

Барои расидан ба титри баланд фарҳанг бояд ба қадри кофӣ идома ёбад; аммо идома додани он аз ҳад зиёд метавонад ба талафоти маҳсулот оварда расонад. Аз ин рӯ вақти ҷамъоварии маҳсулот бояд на танҳо аз рӯйи афзоиши ҳуҷайра, балки аз рӯйи профили вақтии myxochelin A ва azotochelin муайян карда шавад.

Таҷрибаҳои Pyoverdine чиро нишон доданд?

Намудҳои Pseudomonas метавонанд siderofor-ҳои худ бо номи pyoverdine истеҳсол кунанд. Пайваст кардани оҳан дар муҳит аз ҷониби Myxochelin A аз ҷиҳати назариявӣ метавонист ҷавоби норасоии оҳанро дар ҳуҷайра ва истеҳсоли pyoverdine-ро ангезад.

Муҳаққиқон флуорессенсияи pyoverdine-ро бо ҳаяҷондиҳӣ дар 398 nm ва эмиссия дар 456 nm чен карданд. Дар фарҳангҳои биореактор баландтарин сигнали pyoverdine 469 ± 83 воҳиди нисбии флуорессенсия буд.

Штамми назоратӣ, ки дар ҳамон сатҳи оҳан парвариш шуда, myxochelin истеҳсол намекард, 981 ± 338 воҳиди нисбӣ нишон дод. Дар муҳити бе оҳан бошад, сигнал ба 17.166 ± 371 воҳиди нисбӣ расид. Илова кардани оҳани иловагӣ ба муҳит флуорессенсияи назоратиро то 125 ± 5 воҳид коҳиш дод.

Илова кардани 200 mg/L myxochelin A ба фарҳанги назоратӣ ба ҷойи зиёд кардани сигнали pyoverdine онро каме коҳиш дод. Аз ин рӯ таҳқиқот ба хулоса омад, ки myxochelin A барои P. taiwanensis ҷавоби қавии норасоии оҳанро ба вуҷуд намеорад. Муҳаққиқон имкони истифодаи myxochelin A аз ҷониби бактерия ҳамчун сидерофори хориҷӣ, яъне xenosiderofor, муҳокима мекунанд.

Аммо нишон дода нашудааст, ки комплекси myxochelin–оҳан тавассути кадом ретсептор ба ҳуҷайра гирифта мешавад. Тафсири “метавонад ҳамчун xenosiderofor истифода шавад” як эҳтимолест, ки бо натиҷаи флуорессенсия мувофиқ аст, на далели мустақими интиқол.

Чаро дар ферментатсияи тӯлонӣ маҳсулотҳо кам шуданд?

Дар таҷрибаҳои дарозмуддати биореактор пас аз марҳилаи муайян миқдори ҳам myxochelin A ва ҳам azotochelin коҳиш ёфт. Ин ҳолатро танҳо бо табдилёбии myxochelin A ба azotochelin шарҳ додан мумкин нест, зеро ҳар ду маҳсулот ҳамзамон аз байн мераванд.

Гурӯҳҳои катехол ба оксидшавӣ ва полимеризатсия ҳассосанд. Зичии баланди ҳуҷайра, интиқоли баланди оксиген ва намудҳои реактивии оксиген метавонанд ин равандҳоро тезонанд. Ба ранги аввал гулобии равшан, сипас қаҳваранг ва торик табдил ёфтани фарҳанг низ метавонад бо маҳсулоти катехолии оксидшуда ё полимеризатсияшуда мувофиқ бошад.

Бо вуҷуди ин, таҳқиқот маҳсулоти вайроншавиро аз ҷиҳати химиявӣ муайян накардааст. Ба вуҷуд омадани ранги қаҳваранг танҳо худ аз худ роҳи муайяни полимеризатсияро исбот намекунад. Механизми талафоти маҳсулот ба таҳқиқоти минбаъдаи аналитикӣ ниёз дорад.

Чаро титр, самаранокӣ ва суръат бояд якҷоя арзёбӣ шаванд?

Муваффақияти як биопроцесс одатан бо се нишондиҳандаи асосӣ арзёбӣ мешавад:

Бо сабаби хароҷоти баланди ҷудокунӣ ва тозакунӣ, таҳқиқот ба титр афзалият додааст. Титри баланд имкон медиҳад, ки аз як литр фарҳанг маҳсулоти бештар гирифта шавад ва бори downstream processing кам гардад.

Аммо титри баланд ҳамеша маънои самаранокии баланди ашёи хомро надорад. Гарчанде дар беҳтарин шароити биореактор миқдори зиёди маҳсулот ба даст омад, тамоми пешгузашта ба маҳсулот табдил нашуд. Барои арзёбии саноатӣ хароҷоти ашёи хом, вақти истеҳсол, масрафи энергия, талафоти тозакунӣ ва устувории маҳсулот низ заруранд.

Шакли 2 чиро нишон медиҳад?

Шакли 2 таъсири кластерҳои гуногуни генӣ ва модулҳои истеҳсоли пешгузаштаро ба истеҳсоли ибтидоии myxochelin A нишон медиҳад. Дар қисми болоии схема модулҳое ҷой доранд, ки генҳои миксобактериявӣ ва аз E. coli гирифташударо бо тартибҳои гуногун якҷоя мекунанд.

Графики сутунӣ дар поён нишон медиҳад, ки танҳо тағйир додани генҳои истеҳсоли пешгузашта, боздоштани вайроншавии lysin ё зиёд кардани ифодаи MtaA барои истеҳсоли баланд кофӣ набудааст. Беҳтарин натиҷаи ибтидоӣ тақрибан дар сатҳи 0,6 mg/L буд.

Шакли 3 чиро нишон медиҳад?

Дар Шакли 3 назорати бе ҳуҷайра, штамми асосие, ки генҳои истеҳсолиро надорад, ва штаммҳои гуногуни истеҳсолӣ бо мурури вақт муқоиса шудаанд. Дар назоратҳои бе ҳуҷайра ва штамми асосӣ myxochelin A-и аз берун иловашуда асосан устувор боқӣ мондааст.

Дар штамми истеҳсолӣ бошад, ҳангоми кам шудани myxochelin A қуллаи монанд ба azotochelin зиёд шудааст. Ин муқоиса дастгирӣ мекунад, ки табдил бо роҳи истеҳсолӣ ё заминаи ҳуҷайравие, ки ин роҳ дар он ҷой дорад, алоқаманд аст.

Шакли 4 чиро нишон медиҳад?

Шакли 4 истифодаи глюкоза ва глисеролро бо цитрат, ацетат, сукцинат ва консентратсияҳои гуногуни октаноат муқоиса мекунад. Баландии умумии сутунҳо титри якҷояи myxochelin A ва azotochelin-ро, қисмҳои ранга бошад саҳми ҷудогонаи ҳар ду маҳсулотро нишон медиҳанд.

Истифодаи глисерол дар якҷоягӣ бо манбаъҳои дуюмдараҷаи карбон метавонад нисбат ба таркибҳои глюкоза маҳсулоти умумии бештар диҳад. Октаноат махсусан дар оптимизатсияҳои генетикии баъдӣ дар якҷоягӣ бо дастгирии энергетикӣ муфид гардид.

Шакли 5 чиро нишон медиҳад?

Шакли 5 таъсири оптимизатсияи кодонии mxcG, нусхаи дуюми mxcEF, таносубҳои манбаи карбон, октаноат, 2,3-dihidroksibenzoat ва дастгирии lysin-ро якҷоя нишон медиҳад.

Баландшавии равшантарин пас аз иловаи нусхаи дуюми mxcEF ба вуҷуд меояд. Шакл инчунин нишон медиҳад, ки дастгирии lysin муфид набуд, миқдори пешгузашта ва карбон таносуби маҳсулотро тағйир дод ва байни myxochelin A ва azotochelin тақсимоти вобаста ба шароит мавҷуд аст.

Шакли 6 чиро нишон медиҳад?

Панелҳои A ва B-и Шакли 6 афзоиши ҳуҷайра, манбаъҳои карбон, истеъмоли 2,3-dihidroksibenzoat ва тағйироти вақтии ду маҳсулотро дар шароити таъминоти паст ва баланд нишон медиҳанд.

Панелҳои C ва D флуорессенсияи pyoverdine-ро дар якҷоягӣ бо раванди истеҳсол пайгирӣ мекунанд. Панели E бошад фарҳангҳои назоратии бе оҳан, дорои оҳани муқаррарӣ, дорои оҳани баланд, бо myxochelin A иловашуда ва бо 2,3-dihidroksibenzoat иловашударо муқоиса мекунад.

Шакл нишон медиҳад, ки баландтарин истеҳсол тақрибан дар соати 34-ум ба даст омадааст, дароз кардани вақти фарҳанг ба талафоти маҳсулот овардааст ва ҷавоби pyoverdine нисбат ба назорати норасоии қавии оҳан паст боқӣ мондааст.

Аҳамияти таҳқиқот аз нигоҳи таърихӣ

Таҳқиқоти қаблии myxochelin асосан ба истеҳсолкунандагони табиӣ, системаҳои ферментии in vitro ё тавлиди ҳосилаҳои myxochelin равона шуда буданд. Ин таҳқиқот, то ҷое ки муаллифон медонанд, аввалин корест, ки истеҳсоли гетерологии myxochelin A-ро дар мизбони бактериявии дигар гузориш медиҳад.

Таҳқиқот платформаи алтернативии истеҳсолиро пешниҳод мекунад, ки аз системаҳои мураккаби танзимии истеҳсолкунандаи табиӣ мустақил буда, аз ҷиҳати генетикӣ тағйирпазир аст ва дар муҳити минералии муайяншуда кор карда метавонад.

Аҳамияти он барои имрӯз

Таҳқиқот нишон медиҳад, ки интиқоли кластери генҳои биосинтетикӣ танҳо нуқтаи оғоз аст. Барои истеҳсоли баланд ифодаи генҳо, ҷараёни пешгузашта, ҳолати энергетикӣ, метаболизми мизбон, табдилёбии маҳсулот ва вақти процесс бояд якҷоя танзим карда шаванд.

Ташаккули ғайричашмдошти azotochelin махсусан муҳим аст, зеро нишон медиҳад, ки метаболизми мизбони гетерологӣ метавонад ба роҳи истеҳсолӣ дахолат кунад. Ҳангоми иҷрои реаксияҳои дилхоҳ ҳуҷайраи мизбон метавонад бо ферментҳои худ маҳсулоти номатлуб ё алтернативӣ низ ба вуҷуд орад.

Аҳамияти он барои оянда

Таҳқиқот якчанд самти кушодаи такмилро боқӣ мегузорад:

• Тасдиқи ҳувияти azotochelin бо LC-MS ва стандарти тоза,
• Муайян кардани aldehyde dehydrogenase-ҳое, ки Myxochelin A-ро ба azotochelin табдил медиҳанд,
• Санҷидани ҳазфи генҳое, ки табдилёбии номатлубро коҳиш медиҳанд,
• Омӯхтани таъсирҳои физикии байни MxcE, MxcF ва MxcG,
• Ба таври мутавозин зиёд кардани истеҳсоли de novo-и 2,3-dihidroksibenzoat,
• Истифодаи промотори доимӣ ба ҷойи низоми бо салисилат ангезишёбанда,
• Дароз кардани давраи истеҳсол бо ферментатсияи Fed-batch,
• Хориҷ кардани маҳсулот аз фарҳанг ҳангоми истеҳсол бо resin-и adsorbent,
• Таҳияи шароити процесс барои кам кардани оксидшавӣ ва полимеризатсия,
• Муайян кардани самаранокӣ ва хароҷоти тозакунии маҳсулот.

Маънои он барои саноат ва биотехнология

Сатҳи 226 mg/L дар миқёси таҳқиқотӣ афзоиши назаррас буда, нисбат ба истеҳсолкунандагони табиӣ титри баландтар пешниҳод мекунад. Истифодаи муҳити минералии муайяншуда метавонад нисбат ба муҳитҳои органикии мураккабе, ки таркибашон тағйирпазир аст, назорати процессро осон кунад.

Бо вуҷуди ин, аз биореактори 2 литрӣ бевосита ба истеҳсоли саноатӣ гузаштан мумкин нест. Омехтакунӣ, интиқоли оксиген, ташаккули кафк, интиқоли гармӣ, стерилизатсия, хароҷоти ашёи хом, устувории генетикӣ ва downstream processing бояд дар миқёси калонтар аз нав арзёбӣ шаванд.

Таҳқиқот хароҷоти истеҳсоли тиҷоратӣ, барқарорсозии маҳсулоти тоза, давомнокии маъракаи истеҳсолӣ ё таҳлили қобилияти иқтисодиро пешниҳод намекунад. Аз ин рӯ хулосаи “истеҳсоли саноатӣ омода аст” бароварда намешавад.

Маънои он барои саломатӣ

Миқдори зиёди истеҳсол метавонад омӯзиши муфассалтари таъсирҳои биологии myxochelin A-ро осон кунад. Аммо ин таҳқиқот таъсири myxochelin A-ро ба илтиҳоб, саратон ё дигар бемориҳо дар инсон арзёбӣ накардааст.

Тозагии фармасевтӣ, заҳролудӣ, фармакокинетика, интихобпазирии ҳуҷайравӣ ё амнияти пайвастагиҳои истеҳсолшуда дар ҳайвонот чен карда нашудааст. Аз ин рӯ ин таҳқиқот далели табобат нест, балки кори инфрасохтории истеҳсолӣ барои таҳқиқоти маҳсулоти табиӣ мебошад.

Ҷиҳатҳои қавии таҳқиқот

• Тамоми занҷири рушд аз кластери генҳои маҳсулоти табиӣ то истеҳсол дар биореактори идорашаванда омӯхта шудааст.
• Якчанд модули генетикӣ ба таври таҷрибавӣ муқоиса шудаанд.
• Манбаъҳои карбон ва дастгирии пешгузашта ба таври низомманд скрининг шудаанд.
• Маҳдудиятҳои ифодаи генҳо марҳила ба марҳила муайян шудаанд.
• Таъсири оптимизатсияи кодонии mxcG ва нусхаи дуюми mxcEF дар марҳилаҳои ҷудогона арзёбӣ шудааст.
• Ташаккули маҳсулот бо силсилаи вақт пайгирӣ шудааст.
• Ташаккули ғайричашмдошти azotochelin нодида гирифта нашуда, ҳамчун маҳсулоти алоҳида таҳқиқ шудааст.
• Аз миқёси микроплата ба биореактори 2 литрии идорашаванда гузаронида шудааст.
• pH, оксигени ҳалшуда, омехтакунӣ ва намунагирӣ дар биореактор зери назорат анҷом дода шудаанд.
• Ғайр аз титр, суръати истеҳсол ва самаранокии биотрансформатсия низ гузориш шудаанд.
• Таъсири эҳтимолии норасоии оҳан аз ҷониби Myxochelin A бо назоратҳои флуорессенсияи pyoverdine омӯхта шудааст.
• Муҳити минералии муайяншуда истифода шудааст.

Маҳдудиятҳои таҳқиқот

• Таҳқиқот preprint мебошад ва аз арзёбии ҳамтоён нагузаштааст.
• Гарчанде дар файл шарҳҳои доварон мавҷуданд, қабули маҷалла нишон дода нашудааст.
• Барои azotochelin стандарти тиҷоратӣ ё стандарти тозашуда ва тасдиқшуда истифода нашудааст.
• Ҳувияти azotochelin бо LC-MS ё NMR тасдиқ нашудааст.
• Шаклҳои ба оҳан пайваст ва бе оҳани маҳсулот алоҳида чен карда нашудаанд.
• Myxochelin A ва azotochelin ба миқдори кофӣ тоза карда нашудаанд, то ба тасдиқи сохторӣ бурда шаванд.
• Дар муқоисаҳои манбаъҳои карбон миқдори умумии молии карбон баробар нигоҳ дошта нашудааст.
• Дар баъзе таҷрибаҳои микроплата шумораи такрорҳои биологӣ се, ва дар шароитҳое, ки арзиши берунӣ хориҷ шудааст, ду мебошад.
• Таҷрибаҳои биореактор бо ду такрори биологӣ анҷом дода шудаанд.
• Таъсирҳои MxcE, MxcF ва MxcG мустақиман чен карда нашудаанд.
• Ферментҳои мизбоне, ки барои ташаккули azotochelin масъуланд, муайян нашудаанд.
• Механизми баргардони табдили Myxochelin A ба azotochelin мустақиман исбот нашудааст.
• Аз ҷиҳати химиявӣ нишон дода нашудааст, ки талафоти маҳсулот аз оксидшавӣ, полимеризатсия ё раванди дигар бармеояд.
• Тавозуни пурраи массаи карбон ва метаболитҳо пешниҳод нашудааст.
• Fed-batch ё истеҳсоли пайваста санҷида нашудааст.
• Самаранокии тозакунӣ, барқарорсозии маҳсулот ва таҳлили иқтисодӣ анҷом дода нашудаанд.
• Тасдиқи фармакологӣ, ҳайвонотӣ ё клиникӣ вуҷуд надорад.

Таҳқиқот чӣ мегӯяд?

• Биосинтези Myxochelin A дар P. taiwanensis VLB120 ба таври гетерологӣ барқарор карда шудааст.
• Сатҳи ибтидоии истеҳсол тақрибан 0,6 mg/L мебошад.
• Комбинатсияҳои манбаъҳои карбон ва энергия истеҳсолро зиёд кардаанд.
• Фоидаи октаноат махсусан дар якҷоягӣ бо иқтидори афзудаи MxcG равшан шудааст.
• Нусхаи дуюми mxcEF афзоиши бузурги истеҳсолро таъмин кардааст.
• Таъминоти 2,3-dihidroksibenzoat дар марҳилаи баъдӣ ба маҳдудият табдил ёфтааст.
• Бо оптимизатсияи муҳити ғизоӣ ва штамм истеҳсоли myxochelin A ба 226,4 mg/L расидааст.
• Дар ҳамин раванд маҳсулоти дуюми монанд ба azotochelin ҳосил шудааст.
• Myxochelin A метавонад аз ҷониби штамми истеҳсолӣ дубора гирифта шуда, ба маҳсулоти монанд ба azotochelin табдил ёбад.
• Вақти истеҳсол ва ҷамъоварӣ барои пешгирии талафоти маҳсулот муҳим аст.

Таҳқиқот чӣ намегӯяд?

• Ҳувияти azotochelin-ро бо усулҳои қатъии молекулавӣ исбот намекунад.
• Нишон намедиҳад, ки кадом aldehyde dehydrogenase табдилро иҷро мекунад.
• Таъсири октаноатро дар сатҳи ҷараёни метаболикӣ исбот намекунад.
• Механизми молекулавии ифодаи афзудаи mxcEFG-ро ҳал намекунад.
• Нишон намедиҳад, ки штамми истеҳсолӣ дар миқёси саноатӣ аз ҷиҳати иқтисодӣ муфид аст.
• Нишон намедиҳад, ки Myxochelin A дар инсон табобати бехатар ё самаранок аст.
• Далели фоидаи клиникӣ барои саратон, илтиҳоб ё дигар бемориҳо пешниҳод намекунад.
• Нишон намедиҳад, ки маҳсулоти истеҳсолшуда барои истифодаи фармасевтӣ омодаанд.

Усул ва Натиҷаҳои Таҳқиқот

Хулосаи техникии тарҳи таҳқиқот

Тағйироти асосии штаммҳои истифодашуда

• Бо ҳазфи роҳҳои вайроншавии pobA, hpd, quiC, quiC1, quiC2 ва benABCD талафоти пешгузаштаҳои ароматикӣ коҳиш дода шуд.
• Бо ҳазфи pykA ва тағйироти TrpE P290S ва AroF-1 P148L ҷараёни карбон ба роҳи shikimate зиёд карда шуд.
• Модулҳои генӣ бо низоми асосёфтаи mini-Tn7 ба минтақаи attTn7 дар хромосома ҷойгир карда шуданд.
• Промоторҳои синтетикии P14f ва P14c истифода шуданд.
• Сафедаи содиротии MxcK ба модули истеҳсолӣ дохил карда шуд.
• Барои кам кардани ташаккули Myxochelin B, mxcL хориҷ карда шуд.
• Барои фосфопантетеинатсияи MxcF ва MxcG, mtaA ифода карда шуд.
• mxcG мувофиқи бактерияи мизбон аз ҷиҳати кодон оптимизатсия шуд.
• Нусхаи дуюми mxcEF ба хромосома илова карда шуд.

Шароити фарҳанги миқёси хурд

• Низоми фарҳанг: плитаҳои 24-чоҳагии System Duetz.
• Ҳаҷми корӣ: 1,5 mL.
• Ҳарорати инкубатсия: 30°C.
• Такондиҳӣ: 300 rpm, диаметри ҳаракат 50 mm.
• Зичии ибтидоии ҳуҷайра: OD₆₀₀ = 0,05.
• Пешфарҳанги глюкоза: 20 mM глюкоза.
• Пешфарҳанги мутобиқшавӣ ба глисерол: 40 mM глисерол ва 2 mM глюкоза.
• Барои низоми salicylate-inducible — 0,1 mM натрий салисилат.
• Давомнокии фарҳанг: вобаста ба таҷриба 24 ё 48 соат.

Шароити биореактор

• Ҳаҷми реактор: 2 L.
• Ҳаҷми корӣ: 1.000 mL.
• Муҳити ғизоӣ: муҳити намакҳои минералии дукарата буферӣ.
• OD₆₀₀-и ибтидоӣ: 0,05.
• Омехтакунии ибтидоӣ: 400 rpm.
• Диапазони назорати омехтакунӣ: 400–800 rpm.
• Аэратсияи ибтидоӣ: 60 литри стандартӣ/соат.
• Назорати ҷараёни ҳаво: 1–2 vvm.
• Оксигени ҳалшуда: %30.
• pH: 7.
• Назорати pH: 2 M NaOH ва 2 M H₂SO₄.
• Фосилаи намунагирӣ: 3 соат.

Усулҳои аналитикӣ

Хулосаи марҳилавии афзоиши истеҳсол

Хулосаи ададии беҳтарин иҷрои биореактор

Арзёбии техникии натиҷаҳо

• Дар марҳилаи аввал на таъминоти пешгузашта, балки ифодаи мутавозини генҳои биосинтетикӣ маҳдудкунанда буд.
• Баланд кардани миқдори MxcG танҳо ҳангоми мавҷуд будани дастгирии кофии энергия фоида дод.
• Баланд кардани сатҳҳои MxcE ва MxcF бузургтарин ҷаҳиши генетикии истеҳсолро ба вуҷуд овард.
• Пас аз ин беҳбудӣ таъминоти 2,3-dihidroksibenzoat ба маҳдудияти нав табдил ёфт.
• Глисерол ва октаноат якҷоя истеҳсоли баландро дастгирӣ карданд.
• Метаболизми мизбон боиси табдил ёфтани маҳсулоти ҳадаф ба маҳсулоти дуюми монанд ба azotochelin гардид.
• Таносуби Myxochelin A ва azotochelin аз таркиби муҳити ғизоӣ ва давомнокии фарҳанг вобаста аст.
• Идома додани ферментатсия пас аз расидан ба миқдори максималии маҳсулот ба талафоти маҳсулот овард.
• Миқёсбандии биореактор нисбат ба титри микроплата истеҳсоли бештар дод.
• Бо вуҷуди титри баланд, самаранокии табдили пешгузашта ва устувории маҳсулот ба такмилдиҳии бештар ниёз доранд.

Ёддошт оид ба Манбаъ ва Усул

Ин муҳтаво ба таҳқиқоти Franziska Kofler, Astrid Wirtz, Amelie Jäger, Dominik Oskamp, Seung-Hyun Paik, Thomas Drepper, Benedikt Wynands ва Nick Wierckx бо унвони “Metabolic Engineering of Pseudomonas Taiwanensis for Heterologous Production of Myxochelin” асос ёфтааст.

Файли боршуда шарҳҳои арзёбии ҳамтоён, ҷавобҳои муаллифон ба ин шарҳҳо, матни асосии ислоҳшуда ва шаклҳоро дар якҷоягӣ дар бар мегирад. Бо вуҷуди ин, дар ҳар саҳифа огоҳии “This preprint research paper has not been peer reviewed” мавҷуд аст. Аз ин рӯ, таҳқиқот бояд на ҳамчун мақолаи нашршудаи рецензияшуда, балки ҳамчун preprint-и аз арзёбии ҳамтоён нагузашта баррасӣ шавад.

Дар ҷавобҳои муаллифон аз интиқоли таҳқиқот ба маҷаллаи дигар ёд шудааст; аммо дар файл қабули маҷалла, версияи ниҳоии нашршуда ё маълумоти анҷомёфтаи рецензия вуҷуд надорад.

Таҳқиқот омӯзиши клиникӣ нест. Он аз муҳандисии метаболикӣ дар бактерияҳои аз ҷиҳати генетикӣ тағйирёфтаи P. taiwanensis, фарҳанги микроплата, таҳлили HPLC, ченкунии флуорессенсия ва таҷрибаҳои биореактори 2 литрӣ иборат аст.

Myxochelin A тавассути HPLC бо стандарти тиҷоратӣ чен карда шуд. Азбаски барои azotochelin стандарти тасдиқшуда мавҷуд набуд, қуллаи номаълум дар штамми истеҳсолӣ бо вақти нигоҳдорӣ ва спектри UV-VIS-и қулла дар фарҳанги Azotobacter vinelandii муқоиса карда шуд. Дар ҷавоби муаллифон ба доварон равшан гуфта шудааст, ки онҳо таҳлили LC-MS анҷом дода натавонистанд. Аз ин рӯ шиносоии azotochelin ба далели аналитикии қавӣ, аммо ғайримустақим асос меёбад.

Анҷом додани таҳлилҳои HPLC дар шароити кислотаӣ барои ҷудо шудани оҳани ба сидерофорҳо пайваст ва пешгирӣ кардани тағйири қуллаҳо вобаста ба оҳани аз таҷҳизоти аналитикӣ гирифташуда пешбинӣ шудааст. Аммо шаклҳои holo-и ба оҳан пайваст ва apo-и бе оҳани маҳсулот алоҳида тавсиф нашудаанд.

Хосиятҳои фармакологии дар таҳқиқот гузоришшуда аз адабиёти қаблӣ гирифта шудаанд. Дар таҳқиқоти мазкур боздории 5-липоксигеназа, таъсири зиддиомосӣ, амнияти инсон ё муваффақияти табобати клиникӣ санҷида нашудаанд.

Ин мақолаи тоҷикӣ бар асоси тарҳҳои таҷрибавӣ, натиҷаҳои ададӣ, шаклҳо, тафсирҳои муаллифон ва маҳдудиятҳои ошкоро зикршудаи таҳқиқоти боршуда омода шудааст. Даъвоҳои таъсири клиникӣ, кафолати табобат, муваффақияти саноатӣ, фоидаоварии тиҷоратӣ ё амният, ки дар PDF вуҷуд надоранд, илова нашудаанд.