Myxochelin A — bakteriyalarga temirni tutib olishga yordam beruvchi katexolatlar sinfiga mansub siderofordir. Tabiiy ravishda ayrim miksobakteriyalar tomonidan sintezlanishiga qaramay, tabiiy ishlab chiqarish miqdorining kamligi moddani ilmiy tadqiqotlar va biotexnologik maqsadlar uchun yetarli hajmda olishni qiyinlashtiradi. Franziska Kofler va uning hamkasblari myxochelin A biosintezi genlarini osonroq o‘stiriladigan va genetik jihatdan qulay boshqariladigan Pseudomonas taiwanensis VLB120 bakteriyasiga kiritish orqali ushbu muammoni hal qilishga harakat qildilar.

Tadqiqotda shunchaki bitta gen klasterining boshqa bakteriyaga ko‘chirilishi bilan cheklanib qolinmadi. Butun ishlab chiqarish jarayoni: xo‘jayin bakteriyani tanlash, biosintetik genlarni xromosomaga integratsiya qilish, genlar ekspressiyasi darajasini oshirish, uglerod va energiya manbalarini o‘zgartirish, prekursor (boshlang‘ich modda) bilan ta’minlash, oraliq mahsulotlar transformatsiyasini kuzatish va jarayonni nazorat qilinadigan bioreaktorga o‘tkazish bosqichlari bilan tizimli ravishda takomillashtirildi.

Dastlabki ishlab chiqilgan shtamm glyukozadan atigi 0,6 mg/l atrofida myxochelin A hosil qildi. Genetik o‘zgartirishlar va ozuqa muhitini optimallashtirish natijasida 2 litrli bioreaktorda myxochelin A konsentratsiyasi 226,4 ± 1,3 mg/l ga ko‘tarildi. Ayni jarayonda strukturaviy jihatdan o‘xshash boshqa bir siderofor — azotoxelin (azotochelin) ham 56,6 ± 8,7 mg/l darajasida hosil bo‘ldi. Dastlabki 0,6 mg/l qiymati bilan taqqoslaganda, myxochelin A titridagi o‘sish 300 barobardan oshdi.

Tadqiqotning muhim va kutilmagan topilmalaridan biri shuki, myxochelin A biosintezi genlarining P. taiwanensis hujayrasiga kiritilishi azotoxelin hosil bo‘lishiga ham olib keldi. Vaqt seriyalari bo‘yicha o‘tkazilgan tajribalar ishlab chiqarishning ma’lum bir bosqichidan so‘ng myxochelin A miqdori kamayib, azotoxelin miqdori ko‘payishi mumkinligini ko‘rsatdi. Tadqiqotchilar bu holatni myxochelin biosintezidagi aldegid oraliq mahsulotining xo‘jayin bakteriyaning o‘z oksidlanish fermentlari tomonidan azotoxelinga yo‘naltirilishi bilan izohlaydilar.

Biroq azotoxelinning kimyoviy tuzilishi mass-spektrometriya bilan to‘liq tasdiqlanmagan. Tadqiqotchilarda tijoriy azotoxelin standarti bo‘lmagani sababli, tabiiy azotoxelin ishlab chiqaruvchi Azotobacter vinelandii kulturasidagi HPLC cho‘qqisining tutilish vaqti va UV-VIS spektrini o‘z shtammlaridagi noma’lum cho‘qqi bilan solishtirdilar. Ushbu o‘xshashlik birikmaning azotoxelin ekanligi haqidagi talqinni qo‘llab-quvvatlaydi; biroq LC-MS yoki tozalangan standart orqali qat’iy strukturaviy tasdiq taqdim etilmagan.

Ishlab chiqarishdagi dastlabki to‘siq faqatgina prekursor molekulalarining yetishmovchiligi emasligi ma’lum bo‘ldi. MxcG fermentining kodon optimizatsiyasi va ayniqsa mxcE hamda mxcF genlarining ikkinchi nusxalarini qo‘shish ishlab chiqarishda keskin sakrashni ta’minladi. Bu natija prekursor 2,3-digidroksibenzoatni faollashtirish, tashuvchi oqsilga biriktirish va lizin bilan birlashtirish bosqichlaridagi fermentlar miqdori cheklovchi omil bo‘lganini ko‘rsatadi.

Uglerod manbasini tanlash ham unumdorlikka kuchli ta’sir ko‘rsatdi. Glyukoza yoki glitserinning yolg‘iz ishlatilishiga qaraganda, glitserin bilan oktanoatning birga berilishi ancha yuqori umumiy mahsulot darajasini ta’minladi. Oktanoat beta-oksidlanish orqali asetil-KoA ga aylanib, energiya metabolizmiga hissa qo‘shishi; glitserin esa glyukozaga nisbatan ko‘proq qaytarilgan uglerod manbasi sifatida qaytarilish ekvivalentlarini ta’minlashga yordam berishi muhokama qilindi. Shunga qaramay, ushbu metabolik tushuntirishlar to‘g‘ridan-to‘g‘ri oqim tahlili (flux analysis) bilan isbotlanmagan.

Eng yaxshi ishlab chiqaruvchi shtamm nazorat qilinadigan 2 litrli bioreaktorga o‘tkazilganda, 80 mM glitserin, 30 mM oktanoat va 2 mM 2,3-digidroksibenzoat saqlagan sharoitda 34-soatda 226,4 mg/l myxochelin A va 56,6 mg/l azotoxelin olindi. Bu natija aniq mineral ozuqa muhitida amalga oshirildi va mualliflarning qiyosiga ko‘ra, tabiiy ishlab chiqaruvchilar uchun avval qayd etilgan myxochelin A darajalaridan ancha oshib ketdi.

Shu bilan birga, ushbu tadqiqot dori yaratish, klinik samaradorlik yoki saratonni davolash ishi hisoblanmaydi. Myxochelin A ning 5-lipoksigenazani bostirishi va hujayra modellarida xabar qilingan biologik ta’sirlari tadqiqotga asos bo‘lgan oldingi adabiyotlarga tegishlidir. Ushbu tadqiqotda inson hujayralari, hayvonlardagi o‘sma modellari, dori xavfsizligi yoki davolash natijalari o‘rganilmagan.

Tadqiqotning asosiy muammosi nimada?

Tabiiy birikmalar mikroorganizmlar, o‘simliklar yoki boshqa tirik organizmlar tomonidan sintezlanadigan va murakkab biologik funksiyalarga ega bo‘lgan molekulalardir. Ularning bir qismi farmatsevtika, qishloq xo‘jaligi, atrof-muhitni tozalash yoki sanoat biotexnologiyasida qo‘llanilishi mumkin bo‘lgan xususiyatlarga ega. Biroq agar tabiiy ishlab chiqaruvchilar maqsadli molekulani juda kam miqdorda ishlab chiqarsa, moddani tozalash va batafsil o‘rganish qiyinlashadi.

Myxochelin A ushbu muammoga yaqqol misoldir. Ushbu birikma tabiiy ravishda Myxococcus xanthus, Stigmatella aurantiaca va boshqa miksobakteriyalar tomonidan sintezlanadi. Miksobakteriyalar qimmatli ikkilamchi metabolitlarni hosil qilsa-da, ularning o‘sish sharoitlari, rivojlanish sur’ati va regulyator tizimlari sanoat ishlab chiqarishi uchun murakkablik tug‘dirishi mumkin. Myxochelin ishlab chiqarilishi, shuningdek, temir miqdori kabi atrof-muhit omillariga kuchli bog‘liqdir.

Tadqiqotchilar hal qilmoqchi bo‘lgan asosiy masala quyidagicha: Myxochelin A ni tabiiy ishlab chiqaruvchisiga bog‘lanib qolmasdan, genetik jihatdan ancha oson boshqariladigan bakteriyada yuqori miqdorda va nazorat ostida ishlab chiqarish mumkinmi?

Myxochelin A va siderofor tushunchasi

Sideroforlar mikroorganizmlar tomonidan atrof-muhitdagi temirni bog‘lash uchun ajratiladigan kichik molekulalardir. Temir ko‘plab hujayraviy reaksiyalar uchun zarur bo‘lsa-da, ayniqsa kislorodli muhitda erkin va oson o‘zlashtiriladigan shaklda bo‘lmasligi mumkin. Shu sababli mikroorganizmlar temirga yuqori moyillik ko‘rsatuvchi molekulalarni ajratadi. Siderofor temirni bog‘lagach, hosil bo‘lgan kompleks hujayra yuzasidagi transport tizimlari orqali ichkariga qabul qilinadi.

Myxochelin A temirni bog‘lovchi katexol guruhlariga ega siderofordir. Molekula karkasi ikkita 2,3-digidroksibenzoat birligi va bitta lizin molekulasining birikishiga asoslanadi. Azotoxelin ham xuddi shu asosiy prekursorlardan hosil bo‘ladigan, biroq chetki funksional guruhining oksidlanish darajasi bilan farqlanuvchi yaqin qardosh siderofordir.

Sideroforlarning metallarni kuchli bog‘lash xususiyatlari atrof-muhitdagi metallarni komplekslash, mikroblararo raqobat, o‘simlik-mikrob aloqalari va tabiiy birikmalar tadqiqotida muhim o‘rin tutadi. Biroq joriy tadqiqot ushbu amaliy sohalarning birortasini bevosita sinab ko‘rmagan; faqatgina ishlab chiqarish tizimini takomillashtirgan.

Myxochelin A nima uchun ilmiy qiziqish uyg‘otmoqda?

Tadqiqotning kirish qismida myxochelin A va uning ayrim hosilalari insonning 5-lipoksigenaza fermentiga nisbatan kuchli ingibitsiya faolligini ko‘rsatgani haqidagi oldingi ishlarga to‘xtalib o‘tilgan. 5-lipoksigenaza leykotriyenlar biosintezida ishtirok etuvchi va yallig‘lanish jarayonlari bilan bog‘liq fermentdir. Myxochelin A uchun hujayra va laboratoriya modellarida o‘smaga qarshi yoki antimetastatik ta’sirlar ham avvalroq qayd etilgan.

Bu ma’lumotlar myxochelin A ni tadqiqot maqsadlarida ko‘proq miqdorda ishlab chiqarish nima sababdan muhimligini tushuntiradi. Ammo fermentning laboratoriya sharoitida bloklanishi moddaning insonlarda samarali va xavfsiz dori bo‘lishini anglatmaydi. Ushbu tadqiqot farmakologik tekshiruv o‘tkazmagan; faqatgina mikrobial sintezni rivojlantirgan.

Geterologik ishlab chiqarish nimani anglatadi?

Geterologik ishlab chiqarish — bu bir organizmda tabiiy ravishda mavjud bo‘lmagan biosintetik genlarni boshqa organizmga kiritish va maqsadli molekulani ushbu yangi xo‘jayinda sintezlash jarayonidir. Bu yerda myxochelin biosintezi genlari tabiiy miksobakteriya muhitidan olinib, Pseudomonas taiwanensis VLB120 hujayrasiga ko‘chirildi.

Ushbu yondashuv ishlab chiqarish liniyasini boshqa zavodga ko‘chirishga o‘xshaydi. Biroq biologik ishlab chiqarishda mashinalar genlar va fermentlardir. Yangi zavodning energiya ta’minoti, xomashyo oqimi, yordamchi fermentlari, tashuvchi oqsillari va chiqindi qayta ishlash mexanizmlari eskisidan farq qiladi. Shu sababli genlarni kiritishning o‘zi ko‘pincha yetarli bo‘lmaydi.

Nima uchun Pseudomonas taiwanensis VLB120 tanlandi?

P. taiwanensis VLB120 turli uglerod manbalarini o‘zlashtira oladigan, aromatik birikmalarga nisbatan chidamli, genetik jihatdan oson modifikatsiya qilinadigan va bioprotsesslar tadqiqotida avval qo‘llanilgan bakterial xo‘jayindir. Tadqiqot guruhining ushbu bakteriyada genomi soddalashtirilgan shassi shtammlarini yaratish va aromatik birikmalar ishlab chiqarish bo‘yicha tajribasi ham bu tanlovda rol o‘ynadi.

Mualliflar, shuningdek, ishlab chiqaruvchi shtammning 50 mg/l gacha myxochelin A mavjud muhitda o‘sa olishini ko‘rsatuvchi chidamlilik testini ham kiritdilar. Bu natija bakteriyaning myxochelin A keltirib chiqarishi mumkin bo‘lgan metall yetishmovchiligi stressiga ma’lum darajada bardosh bera olishini tasdiqlaydi.

Biroq Pseudomonas metabolizmining boyligi faqatgina afzallik emas. Xo‘jayin hujayraning tabiiy aldegid degidrogenazalari maqsadli biosintez yo‘lidagi oraliq mahsulotlarni boshqa mahsulotga aylantirib yuborishi mumkin. Tadqiqotdagi kutilmagan azotoxelin hosil bo‘lishi ayni shu metabolik moslashuvchanlikning yaqqol namunasidir.

Myxochelin biosintez yo‘li qanday ishlaydi?

1-rasm myxochelin A ishlab chiqarilishini ta’minlovchi asosiy fermentlar va oraliq bosqichlarni sxematik ravishda ko‘rsatadi. Jarayon markaziy metabolit xorizmat (chorismate) orqali boshlanadi.

1. MxcD xorizmatni izoxorizmatga aylantiradi.
2. MxcF ning izoxorizmataza domeni izoxorizmatni 2,3-digidroksi-2,3-digidrobenzoatga yo‘naltiradi.
3. MxcC ushbu oraliq moddani 2,3-digidroksibenzoatga aylantiradi.
4. MxcE 2,3-digidroksibenzoatni ATF sarflab faollashtiradi.
5. Faollashtirilgan aromatik prekursor MxcF ning aril tashuvchi oqsil sohasiga birikadi.
6. Lizin MxcG nomli ribosomasiz peptid sintetazaning tashuvchi sohasiga yuklanadi.
7. MxcG ning kondensatsiya domeni ikkita 2,3-digidroksibenzoat birligi bilan lizinni birlashtiradi.
8. MxcG ning reduktaza domeni tashuvchi oqsilga bog‘langan tioefirni qaytaradi va myxochelin A hosil bo‘lishiga olib boruvchi aldegid oraliq moddasini yaratadi.

MxcF va MxcG prekursorlarni tashi olishi uchun MtaA fermenti tomonidan 4’-fosfopantetein kofaktori bilan post-translyatsion modifikatsiyalanishi lozim. Ushbu kofaktor prekursor molekulalarning fermentga vaqtinchalik tioefir bog‘i bilan birikishini ta’minlovchi harakatchan qo‘l kabi ishlaydi.

Tabiiy yo‘lda MxcL nomli transaminaza mavjud bo‘lsa, aldegid oraliq moddasi myxochelin B ga yo‘naltirilishi mumkin. Tadqiqotchilar myxochelin B hosil bo‘lishining oldini olish uchun mxcL genini ishlab chiqarish moduliga kiritmadilar. MxcK esa hosil bo‘lgan mahsulotni hujayradan tashqariga chiqarishga yordam beruvchi eksport oqsili sifatida qo‘shildi.

Myxochelin A bilan azotoxelin o‘rtasidagi farq

Azotoxelin ham ikkita 2,3-digidroksibenzoat va bitta lizin birligidan iborat. Asosiy farq shundaki, biosintezning yakuniy bosqichida tashuvchi oqsilga bog‘langan oraliq mahsulot qaysi kimyoviy shaklda ajralib chiqadi.

Azotobacter vinelandii bakteriyasidagi EntF fermenti MxcG dan farqli ravishda reduktaza o‘rniga tioesteraza domeniga ega va oraliq moddani azotoxelinga aylantiradi. Myxochelin yo‘lida esa MxcG ning reduktaza faolligi aldegid va so‘ngra spirt shaklidagi myxochelin A hosil bo‘lishini ta’minlaydi.

Ushbu tadqiqotdagi P. taiwanensis shtammida azotoxelin gen klasteri bo‘lmasa-da, azotoxelinga o‘xshash mahsulot hosil bo‘ldi. Tadqiqotchilar myxochelin sintezida paydo bo‘lgan aldegid oraliq mahsulotining xo‘jayin hujayradagi aldegid oksidlanish fermentlari ta’sirida karbon kislotasiga aylangan bo‘lishi mumkinligini taxmin qilmoqdalar.

Dastlabki ishlab chiqarish modullari nima uchun yetarli bo‘lmadi?

Tadqiqotchilar dastlab 2,3-digidroksibenzoat ta’minotini oshirish maqsadida turli biosintetik modullarni taqqosladilar. Ayrim modullarda miksobakteriya genlari o‘rniga Escherichia coli ga tegishli funksional o‘xshash entC, menF, entB va entA kabi genlar ishlatildi.

Shuningdek, lizin parchalanishini kamaytirish uchun davB geni o‘chirildi, MtaA miqdorini oshirish uchun qo‘shimcha ekspressiya tizimi sinab ko‘rildi va glyukoza miqdori ko‘paytirildi. Shunga qaramay, ishlab chiqarish oshmadi, ayrim konstruksiyalarda esa yanada pasaydi.

Eng muvaffaqiyatli birinchi modul atigi 0,6 ± 0,0 mg/l myxochelin A hosil qildi. Muqobil prekursor modullaridan biri 0,2 ± 0,0 mg/l gacha tushib ketdi. Glyukozaning 20 mM dan 30 mM ga oshirilishi ham mahsulotni 0,7 mg/l dan yuqoriga ko‘tara olmadi.

Bu natijalar muammo faqat ko‘proq uglerod yoki ko‘proq prekursor berishda emasligini ko‘rsatdi. Tadqiqotchilar biosintetik genlarning ekspressiya darajasi va ayniqsa yo‘lning keyingi fermentativ bosqichlari cheklovchi bo‘lishi mumkin degan xulosaga keldilar.

Gen klasterining tuzilishi nima uchun muhim edi?

Yirik biosintetik gen klasterlarida faqat qaysi genlar borligi emas, genlarning ketma-ketlik tartibi, promotorga yaqinligi, mRNK barqarorligi va qo‘shni genlarning transkripsiyaga qutbli (polyar) ta’sirlari ham muhimdir. Funksional jihatdan o‘xshash genni boshqasiga almashtirish nazariy jihatdan ayni reaksiyani ta’minlasa-da, butun operonning ifodalanish muvozanatini buzishi mumkin.

Shu sababli tadqiqotchilar miksobakteriya genlarining tabiiy tartibini saqlagan yaxlit ishlab chiqarish modulini ham sinovdan o‘tkazdilar. Ushbu modul jami 3,8 ± 2,4 mg/l mahsulot berdi, ammo o‘sish va ishlab chiqarish natijalari barqaror bo‘lmadi. Titri pastroq bo‘lgan 0,6 ± 0,2 mg/l lik modul esa ancha barqaror va takrorlanuvchan bo‘lgani sababli keyingi optimizatsiyalarda tanlandi.

Ushbu tanlov eng yuqori bitta ko‘rsatkich o‘rniga ishonchli ishlab chiqarish platformasi afzal ko‘rilganini ko‘rsatadi. Biotexnologik jarayonlarni rivojlantirishda o‘rtacha unumdorlik bilan birga turli tajribalarda bir xil natija olish ham muhimdir.

Azotoxelin hosil bo‘lishi qanday payqaldi?

3-rasm myxochelin A ning vaqt o‘tishi bilan turli nazorat va ishlab chiqaruvchi shtammlardagi dinamikasini ko‘rsatadi. Tashqaridan qo‘shilgan myxochelin A hujayrasiz muhitda va biosintez genlariga ega bo‘lmagan boshlang‘ich shtammda sezilarli darajada parchalanmadi.

Aksincha, myxochelin biosintezi yo‘lini tashuvchi ishlab chiqaruvchi shtammlarda myxochelin A taxminan 24-soat atrofida eng yuqori darajaga yetgach, kamaya boshladi. Ayni shu davrda ikkinchi HPLC cho‘qqisi paydo bo‘ldi va myxochelin A kamaygan sari ushbu mahsulot to‘planishda davom etdi.

Ushbu qonuniyat ikkinchi birikma shunchaki muhitda o‘z-o‘zidan hosil bo‘lmayotganini, balki myxochelin biosintezi fermentlari yoki ishlab chiqaruvchi shtamm metabolizmi ushbu o‘zgarishda ishtirok etayotganini ko‘rsatdi.

Tadqiqotchilar noma’lum cho‘qqini tabiiy azotoxelin ishlab chiqaruvchisi bo‘lgan A. vinelandii kulturasining yuqori suyuqligidagi cho‘qqi bilan solishtirdilar. Ikkala cho‘qqining bir xil HPLC tutilish vaqtiga va o‘xshash UV-VIS spektriga ega ekanligi noma’lum birikmaning azotoxelin ekanligi haqidagi talqinga asos bo‘ldi.

Biroq bu identifikatsiya bilvosita xarakterga ega. Azotoxelin uchun toza va tasdiqlangan standart ishlatilmagan, LC-MS yoki yuqori aniqlikdagi mass-spektrometriya o‘tkazilmagan hamda molekulaning temir bilan bog‘langan yoki erkin shakllari alohida ko‘rsatilmagan. Shu sababli tadqiqotda “azotoxelin sifatida bilvosita aniqlangan mahsulot” iborasini qo‘llash ilmiy jihatdan to‘g‘riroqdir.

Mahsulotning hujayraga qayta yutilishi nimani ko‘rsatdi?

Tashqaridan myxochelin A qo‘shilgan ishlab chiqaruvchi shtammda moddaning hujayra tomonidan yutilishi va azotoxelinga o‘xshash mahsulotga aylantirilishi kuzatildi. Ushbu kuzatuv reaksiya faqatgina yangi sintezlanayotgan va fermentga bog‘langan oraliq moddada sodir bo‘lmayotganini, balki hujayradan tashqariga chiqqan myxochelin A qayta ichkariga kirib metabolik o‘zgarishga uchrashi mumkinligini ko‘rsatadi.

Tadqiqotchilar bu transformatsiyada MxcG ishtirok etishi va myxochelin A yana aldegid oraliq moddasiga qaytarilishi mumkinligini muhokama qiladilar. Biroq teskari reaksiya to‘g‘ridan-to‘g‘ri fermentativ tajriba bilan isbotlanmaganini unutmaslik kerak.

Uglerod manbalari nima uchun birga qo‘llanildi?

Hujayra fabrikasining ishlab chiqarish samaradorligi faqat umumiy uglerod miqdoriga bog‘liq emas. Turli uglerod manbalari hujayraga turlicha tezlikda kiradi, turli metabolik yo‘llarga ulanadi va turlicha miqdorda ATF, NADH yoki NADPH hosil bo‘lishiga hissa qo‘shadi.

Myxochelin sintezi ATF talab qiluvchi adenillash bosqichlari, tashuvchi oqsil faollashuvi, peptid bog‘i hosil bo‘lishi va qaytarilish reaksiyalarini o‘z ichiga olgani sababli energiya va qaytarilish ekvivalentlari jihatidan talabchan jarayondir.

4-rasmda glyukoza va glitserin; sitrat, asetat, suktsinat yoki oktanoat bilan birgalikda baholandi. Glyukoza yakka holda ishlatilgan sharoitda umumiy ishlab chiqarish 3,3 ± 0,1 mg/l bo‘ldi. Glyukozaga qo‘shilgan ikkilamchi uglerod manbalari umumiy ishlab chiqarishni taxminan 4,4–5,8 mg/l oralig‘iga ko‘tardi.

Glitserin yakka holda 24 soatda 1,9 ± 0,0 mg/l mahsulot berdi. Glitserinning pastroq boshlang‘ich ko‘rsatkichi uzoq moslashish davri bilan izohlandi. Kultura davomiyligi 48 soatga uzaytirilganda glitserin bilan ishlab chiqarish 6,1 ± 0,1 mg/l ga yetdi.

Glitseringa sitrat, asetat, suktsinat yoki oktanoat qo‘shilishi umumiy hosildorlikni taxminan 6,1–9,6 mg/l oralig‘iga chiqardi. Eng samarali dastlabki kombinatsiyalardan biri 40 mM glitserin va 12 mM oktanoat bo‘ldi; 1,5 mg/l myxochelin A va 8,1 mg/l azotoxelin bo‘lib, jami 9,6 mg/l mahsulot olindi.

Oktanoatning ehtimoliy roli

Oktanoat sakkiz uglerodli yog‘ kislotasidir. Bakteriya hujayrasida beta-oksidlanishga uchrab, asetil-KoA birliklariga aylanishi mumkin. Asetil-KoA trikarbon kislotalar sikliga (TCA) kirib, energiya hosil bo‘lishiga hissa qo‘shishi mumkin.

Tadqiqotda ilgari surilgan asosiy munosabatni quyidagicha umumlashtirish mumkin:

\[ \mathrm{Oktanoat} \xrightarrow{\beta\text{-oksidlanish}} \mathrm{Asetil\!-\!KoA} \rightarrow \mathrm{TCA\ sikli} \rightarrow \mathrm{energiya\ va\ qaytarilish\ ekvivalentlari} \]

Bu ifoda maqolada bitta kimyoviy tenglama sifatida berilmagan, muhokamada taklif etilgan metabolik mantiqni ifodalaydi. Oktanoat ishlab chiqarishni aynan qaysi gen yoki metabolik oqim orqali oshirgani izotop tamg‘alash yoki metabolik oqim tahlili bilan tasdiqlanmagan.

Uglerod manbasi tajribasining muhim cheklovi

Taqqoslangan ozuqa muhitlarining umumiy uglerod mol miqdori tenglashtirilmagan. Masalan, glyukoza, glitserin, sitrat va oktanoat kombinatsiyalari turlicha umumiy uglerod miqdoriga ega. Shu sababli kuzatilgan ishlab chiqarish farqining qanchasi uglerod manbasining metabolik sifatiga, qanchasi esa umumiy uglerod miqdoriga bog‘liqligini qat’iy ajratish qiyin.

Tadqiqotchilar turli oktanoat konsentratsiyalarida umumiy uglerod miqdori oshishiga qaramay, glyukozali sharoitlarda mahsulot ayni nisbatda ko‘tarilmaganini ta’kidlab, ta’sir faqat umumiy uglerod bilan tushuntirilmasligini himoya qildilar. Shunga qaramay, teng uglerodli tajriba dizayni yanada aniqroq qiyoslashni ta’minlagan bo‘lar edi.

MxcG darajasini oshirish

MxcG lizinni tashuvchi, aromatik prekursorlarni lizin bilan biriktiruvchi va oxirgi qaytarilish bosqichida xizmat qiluvchi ko‘p domenli ribosomasiz peptid sintetazadir. Shu sababli u zanjirning energiya talab qiluvchi markaziy fermentlaridan biridir.

Tadqiqotchilar mxcG genini P. taiwanensis uchun kodon-optimallashtirdilar va salitsilat bilan induksiyalanadigan plazmida orqali qo‘shimcha ifodaladilar. Kodon optimizatsiyasi xo‘jayin bakteriyada kam uchraydigan kodonlarni qulayroq sinonim kodonlarga almashtirib, oqsil sintezini samaraliroq qilishga qaratilgan.

Oktanoat bo‘lmaganda qo‘shimcha MxcG ekspressiyasi sezilarli o‘sish bermadi. Aksincha, glyukoza yoki glitserin bilan birga oktanoat berilganda qo‘shimcha MxcG ning foydasi yaqqol namoyon bo‘ldi.

Bu natija faqat ko‘proq ferment ishlab chiqarishning o‘zi yetarli emasligini ko‘rsatadi. MxcG miqdori oshirilganda, fermentning energiya va qaytarilish ehtiyojlari ham qondirilishi kerak. Boshqacha aytganda, ferment quvvati bilan hujayraning energiya quvvati parallel ravishda oshirilishi lozim.

Qo‘shimcha mxcG ekspressiyasi va 12 mM oktanoat bilan 48 soatlik kulturalarda umumiy ishlab chiqarish glyukoza asosida 28,1 ± 6,5 mg/l ga, glitserin asosida 44,5 ± 16,7 mg/l darajasiga yetdi.

Asosiy burilish: mxcE va mxcF genlarining ikkinchi nusxasi

Qo‘shimcha MxcG ishlab chiqarilishiga qaramay, 2,3-digidroksibenzoatning faqat cheklangan qismigina mahsulotga aylandi. Shu sababli tadqiqotchilar prekursorni faollashtirish va tashuvchi oqsilga biriktirish bosqichlariga e’tibor qaratdilar.

MxcE 2,3-digidroksibenzoatni ATF yordamida adenillaydi. MxcF esa ham izoxorizmat konversiyasida ishtirok etuvchi ferment domenini, ham faollashtirilgan aromatik prekursorni tashuvchi aril tashuvchi oqsil sohasini saqlaydi.

Ishlab chiqaruvchi shtammning xromosomasiga kuchli va doimiy ishlovchi promotor ostida ikkinchi mxcEF nusxasi kiritildi. Ushbu o‘zgarishdan so‘ng glyukoza yagona uglerod manbasi bo‘lgan sharoitda ham umumiy mahsulot 85,2 ± 3,4 mg/l ga ko‘tarildi.

Oktanoat qo‘shilmasdan, 40 mM glitserin bilan 100,4 ± 16,1 mg/l; 10 mM glyukoza va 20 mM glitserin birga ishlatilganda 125,2 ± 7,0 mg/l umumiy mahsulot olindi.

20 mM glyukoza, 15 mM oktanoat va tashqaridan 75 mg/l 2,3-digidroksibenzoat berilgan sharoitda 51,7 ± 0,0 mg/l myxochelin A hamda 99,5 ± 0,6 mg/l azotoxelin sintezlandi; umumiy titr taxminan 151,2 mg/l ga yetdi.

Bu katta sakrash avvalgi shtammlarda MxcE va MxcF miqdorlari asosiy to‘siq bo‘lganini tasdiqlaydi. Shunga qaramay, aynan qaysi ferment yakka holda qanchalik cheklovchi bo‘lgani va ortgan oqsil miqdorlarining o‘zaro qanday ta’sirlashgani alohida fermentativ testlar bilan ko‘rsatilmagan.

MxcE, MxcF va MxcG o‘rtasidagi ehtimoliy oqsil o‘zaro ta’sirlari

MxcF ikkita turli funksiyani bajaradi: izoxorizmat o‘zgarishida qatnashadi va ayni vaqtda 2,3-digidroksibenzoatni tashuvchi oqsil sohasini saqlaydi. Shu bois MxcF ning faolligi nafaqat uning miqdoriga, balki MxcE va MxcG bilan o‘rnatadigan jismoniy kontaktlariga ham bog‘liq bo‘lishi mumkin.

Tadqiqotchilar qo‘shimcha mxcEF nusxalarining foydasini izohlash uchun bir nechta ehtimolni muhokama qildilar:

• MxcE ning ko‘proq 2,3-digidroksibenzoatni faollashtirishi,
• MxcF ning ko‘proq aromatik prekursor tashi olishi,
• MxcE-MxcF-MxcG kompleksining samaraliroq yig‘ilishi,
• MxcG ning MxcF ga bog‘langan prekursorni tezroq qabul qilishi,
• Xo‘jayin hujayradagi boshqa bir fermentning MxcE ga qisman o‘xshash vazifani bajarishi.

Tadqiqot ushbu ehtimollarni bevosita sinab ko‘rmagan. Oqsil-oqsil o‘zaro ta’siri testlari, pull-down tahlillari, ferment kinetikasi yoki strukturaviy tahlillar o‘tkazilmagani sababli mexanizm ochiq savol bo‘lib qolmoqda.

Biotransformatsiya unumi qanday hisoblandi?

Tadqiqotda biotransformatsiya unumi hosil bo‘lgan umumiy myxochelin A va azotoxelin mol miqdorining muhitga qo‘shilgan 2,3-digidroksibenzoat mol miqdoriga nisbati orqali baholandi:

\[ Y_{\mathrm{BT}} = \frac{n_{\mathrm{myxochelin\ A}} + n_{\mathrm{azotochelin}}}{n_{\mathrm{qo‘shilgan\ 2,3\!-\!digidroksibenzoat}}} \times 100 \]

Bunda:

• Y_BT — mol/mol hisobidagi biotransformatsiya unumini,
• n_{myxochelin A} — hosil bo‘lgan myxochelin A molini,
• n_azotochelin — hosil bo‘lgan azotoxelin molini,
• n_{qo‘shilgan 2,3-digidroksibenzoat} — muhitga tashqaridan berilgan prekursorning mol miqdorini ifodalaydi.

Har bir myxochelin A yoki azotoxelin molekulasi uchun ikkita 2,3-digidroksibenzoat molekulasi talab qilingani sababli, agar faqat tashqaridan berilgan prekursor ishlatilsa, nazariy yuqori chegara 50 foiz mol/mol bo‘ladi.

Ayrim tajribalarda hisoblangan unum 50 foizdan oshib ketdi, masalan 73,3 ± 0,9 foizga yetdi. Tadqiqotchilar buni hisoblash xatosi emas, balki tashqaridan berilgan prekursorga qo‘shimcha ravishda bakteriya uglerod manbalaridan yangi 2,3-digidroksibenzoat ishlab chiqargani bilan izohladilar.

Taxminan 0,5 mM tashqi prekursordan 0,37 mM umumiy mahsulot hosil bo‘lgan sharoitda, 0,12 mM mahsulot tashqi prekursordan emas, hujayraning o‘z metabolizmida de novo sintezlangan 2,3-digidroksibenzoatdan kelib chiqqani hisoblab chiqildi. Bu miqdor umumiy mahsulotning taxminan 31,7 foiziga to‘g‘ri keladi.

Tashqaridan prekursor berishning foydasi va chegarasi

MxcEFG darajalari oshirilgach, ishlab chiqarishning yangi to‘sig‘i 2,3-digidroksibenzoat ta’minoti bo‘lib qoldi. Shu sababli ozuqa muhitiga 0,5, 1 va 2 mM prekursor qo‘shildi.

40 mM glitserin va 15 mM oktanoat bilan birga orttirilgan prekursor ta’minoti myxochelin A titrini 117,8 ± 5,9 mg/l ga, azotoxelin titrini esa 45,3 ± 0,9 mg/l ga chiqardi. Jami ishlab chiqarish 163,1 ± 6,8 mg/l bo‘ldi.

Biroq bu sharoitda taxminan 140,7 ± 6,6 mg/l 2,3-digidroksibenzoat ishlatilmasdan muhitda qolib ketdi. Bu natija prekursor ta’minoti oshirilganda ham zanjirning quyi fermentativ quvvati cheklangan bo‘lib qolishi mumkinligini ko‘rsatadi.

Ko‘proq xomashyo berish, agar ishlab chiqarish liniyasining keyingi apparatlari yetarli bo‘lmasa, mahsulotga aylanish o‘rniga muhitda to‘planib qolishiga olib keladi. Shu sababli keyingi optimizatsiyalar nafaqat prekursor sintezini, balki Mxc fermentlarining mutanosib ekspressiyasi va faolligini ham hisobga olishi kerak.

Lizin qo‘shilishi nima uchun unumdorlikni oshirmadi?

Myxochelin A ning ikkinchi asosiy prekursori lizindir. Shu sababli tashqaridan lizin qo‘shilishi ishlab chiqarishni oshirishi kutilgan edi. Biroq tajribalarda 0,5 mM lizin qo‘shilishi aksariyat sharoitlarda unumdorlikni pasaytirdi va 2,3-digidroksibenzoat sarflanishini kamaytirdi.

Bu holat lizinning to‘g‘ridan-to‘g‘ri toksik ekanligini yoki yagona muayyan mexanizmni isbotlamaydi. Lizin qo‘shimchasi metabolik boshqaruv, transport, fermentlar balansi yoki prekursorlarning mos nisbatiga salbiy ta’sir ko‘rsatgan bo‘lishi mumkin. Tadqiqot ushbu mexanizmni batafsil oydinlashtirmagan.

Myxochelin A va azotoxelin nisbati nima sababdan o‘zgardi?

Turli ozuqa muhitlarida myxochelin A ning umumiy mahsulotdagi ulushi 15 foizdan 72 foizgacha o‘zgardi. Bu keng oraliq ikkala mahsulot ayni bir oraliq metabolit zaxirasidan oziqlanishini va muhit sharoitlari aldegid oraliq moddasining qaytarilishi hamda oksidlanishi o‘rtasidagi muvozanatga ta’sir qilishini ko‘rsatadi.

Ko‘proq uglerod va bir nechta uglerod manbai umumiy ishlab chiqarishni oshirgan bo‘lsa, 2,3-digidroksibenzoat ta’minotining oshirilishi ayrim sharoitlarda myxochelin A ulushini ko‘paytirdi. Myxochelin A ning eng yuqori ulushlaridan biri 40 mM glitserin, 15 mM oktanoat va 2 mM 2,3-digidroksibenzoat kombinatsiyasida kuzatildi.

Biroq mahsulotlar nisbatini belgilovchi aniq fermentativ va redoks mexanizmlari o‘lchanmagan. NADH/NADPH darajalari, aldegid degidrogenaza faolligi yoki hujayra ichidagi metabolit oqimlari bevosita tahlil qilinmagan.

Mikroplanka tajribalaridan bioreaktorga o‘tish

Dastlabki skrininglar 24 o‘rinli System Duetz plastinkalarida, har bir katakchada 1,5 ml ozuqa muhiti ishlatilgan holda o‘tkazildi. Bu tizim ko‘plab genetik konstruksiyalar va ozuqa sharoitlarini parallel taqqoslash imkonini berdi.

Eng yaxshi shtamm keyinchalik 2 litrli DASGIP bioreaktorlariga ko‘chirildi va 1 litr ishchi hajmda yetishtirildi. Bioreaktorda:

• pH ko‘rsatkichi 7 da ushlab turildi.
• Erimagan kislorod darajasi 30 foizga sozlandi.
• Aralashtirish 400–800 ayl/daqiqa oralig‘ida avtomatik boshqarildi.
• Havo oqimi 1–2 vvm oralig‘ida nazorat qilindi.
• Zarurat tug‘ilganda berilayotgan gazdagi kislorod ulushi 21 foizdan 100 foizgacha oshirildi.
• Namunalar avtomatik namuna olgich yordamida har uch soatda olindi.

Ushbu nazorat hujayra o‘sishi, uglerod sarflanishi, prekursor sarflanishi va mahsulot hosil bo‘lishini vaqt bo‘yicha batafsil kuzatish imkonini berdi.

Birinchi bioreaktor tajribasi

Dastlabki bioreaktor sharoitida 40 mM glitserin, 15 mM oktanoat va 1 mM 2,3-digidroksibenzoat ishlatildi. Hujayra zichligi 22-soatda OD₆₀₀ = 7,8 ± 0,1 qiymatiga yetdi.

Eng yuqori ishlab chiqarish tezligi 16–25 soatlar oralig‘ida qayd etildi:

• Myxochelin A uchun 11,6 ± 0,5 mg l⁻¹ soat⁻¹,
• Azotoxelin uchun 2,2 ± 0,3 mg l⁻¹ soat⁻¹.

25-soatda 115,7 ± 1,8 mg/l myxochelin A va 23,2 ± 1,4 mg/l azotoxelin olindi. Umumiy mahsulotning 90,9 ± 0,3 foizini myxochelin A tashkil etdi.

Qo‘shilgan 1 mM 2,3-digidroksibenzoat to‘liq sarflanganiga qaramay, umumiy mahsulot atigi 0,34 ± 0,01 mM bo‘ldi. Biotransformatsiya unumi 33,6 ± 1,0 foiz deb hisoblandi.

Hajmiy unumdorlik (Space-time yield) nimani anglatadi?

Tadqiqotda keltirilgan space-time yield ma’lum vaqt oralig‘ida bir litr kulturada hosil bo‘lgan mahsulot miqdorining vaqtga nisbatidir:

\[ \mathrm{STY} = \frac{\Delta C_{\mathrm{mahsulot}}}{\Delta t} \]

Bunda:

• STY — hajmiy unumdorlikni,
• ΔC_mahsulot — ma’lum vaqt ichida mahsulot konsentratsiyasidagi o‘zgarishni,
• Δt — o‘tgan vaqtni bildiradi.

Birlik mg l⁻¹ soat⁻¹ ko‘rinishida berilgan. Titr bioreaktorda qancha mahsulot borligini ko‘rsatsa, ishlab chiqarish tezligi o‘sha miqdorga qanchalik tez erishilganini ifodalaydi.

Ikkinchi bioreaktor tajribasi va eng yuqori ishlab chiqarish

Ikkinchi bioreaktor tajribasida uglerod va prekursor miqdorlari ikki barobar oshirildi:

• 80 mM glitserin,
• 30 mM oktanoat,
• 2 mM 2,3-digidroksibenzoat.

Hujayra zichligi 28-soatda OD₆₀₀ = 15,0 ± 0,3 ga yetdi. 22–31 soatlar orasida birlashgan mahsulotlar uchun eng yuqori hajmiy unumdorlik 26,7 ± 1,8 mg l⁻¹ soat⁻¹, faqat myxochelin A uchun esa 21,7 ± 1,0 mg l⁻¹ soat⁻¹ bo‘ldi.

34-soatda:

• 226,4 ± 1,3 mg/l myxochelin A,
• 56,6 ± 8,7 mg/l azotoxelin,
• Jami 0,70 ± 0,02 mM mahsulot olindi.

Bu vaqtda 1,64 ± 0,12 mM 2,3-digidroksibenzoat sarflangan va biotransformatsiya unumi 34,8 ± 1,2 foiz deb hisoblangan.

Kulturani yanada uzoqroq davom ettirish qolgan prekursorni to‘liq sarflashga imkon berdi, biroq mahsulot miqdorini oshirmadi. Bu holat prekursorning maqsadli mahsulotlardan tashqari boshqa metabolik jarayonlarga ketgan bo‘lishi, fermentga bog‘langan oraliq moddalarda qolib ketishi yoki hosil bo‘lgan mahsulotning parchalanishi mumkinligini ko‘rsatadi.

6-rasm ko‘rsatgan ishlab chiqarish darchasi

6-rasmdagi vaqt grafiklari uzoq boshlang‘ich moslashuv davridan so‘ng qisqa va intensiv ishlab chiqarish davri mavjudligini ko‘rsatadi. Myxochelin A va azotoxelin avval birga to‘planadi, uglerod manbalari kamayishi bilan myxochelin A ning azotoxelinga aylanishi yaqqolroq bo‘lib qoladi.

Yuqori titrga erishish uchun kultura yetarlicha uzoq davom etishi kerak; biroq ortiqcha cho‘zish mahsulot yo‘qotilishiga olib keladi. Shu sababli yig‘ib olish vaqti faqat hujayra o‘sishiga emas, myxochelin A va azotoxelinning vaqt profiliga qarab belgilanishi lozim.

Pioverdin tajribalari nimani ko‘rsatdi?

Pseudomonas turlari o‘zlarining shaxsiy sideroforlari bo‘lgan pioverdinlarni (pyoverdine) sintezlash xususiyatiga ega. Myxochelin A ning muhitdagi temirni bog‘lab olishi nazariy jihatdan hujayrada temir tanqisligi reaksiyasini va pioverdin ishlab chiqarilishini qo‘zg‘atishi mumkin edi.

Tadqiqotchilar pioverdin fluoressensiyasini 398 nm qo‘zg‘atish va 456 nm emissiya to‘lqin uzunliklarida o‘lchadilar. Bioreaktor kulturalarida eng yuqori pioverdin signali 469 ± 83 nisbiy fluoressensiya birligi bo‘ldi.

Ayni temir darajasida o‘stirilgan va myxochelin ishlab chiqarmaydigan nazorat shtammi 981 ± 338 nisbiy birlikni ko‘rsatdi. Temirsiz muhitda esa signal 17 166 ± 371 nisbiy birlikkacha ko‘tarildi. Muhitga qo‘shimcha temir berilishi nazorat fluoressensiyasini 125 ± 5 birlikkacha tushirdi.

Nazorat kulturasiga 200 mg/l myxochelin A qo‘shilishi pioverdin signalini oshirish o‘rniga biroz kamaytirdi. Shu sababli tadqiqot myxochelin A ning P. taiwanensis uchun kuchli temir ochligi javobini yaratmasligi haqida xulosaga keldi. Tadqiqotchilar bakteriyaning myxochelin A ni begona siderofor (ksenosiderofor) sifatida o‘zlashtira olish ehtimolini muhokama qiladilar.

Biroq myxochelin-temir kompleksining hujayraga qaysi retseptor orqali kirishi ko‘rsatilmagan. “Ksenosiderofor sifatida ishlatilishi mumkin” degan talqin fluoressensiya natijasi bilan mos keluvchi ehtimoldir, ammo to‘g‘ridan-to‘g‘ri transport isboti emas.

Uzoq fermentatsiyada mahsulotlar nima sababdan kamaydi?

Uzoq muddatli bioreaktor tajribalarida ma’lum bosqichdan so‘ng myxochelin A ham, azotoxelin ham kamaydi. Bu holat faqat myxochelin A ning azotoxelinga aylanishi bilan tushuntirilmaydi, chunki ikkala mahsulot birga yo‘qolmoqda.

Katexol guruhlari oksidlanish va polimerizatsiyaga moyildir. Yuqori hujayra zichligi, yuqori kislorod o‘tkazuvchanligi va reaktiv kislorod shakllari bu jarayonlarni tezlashtirishi mumkin. Kulturaning avval och pushti, so‘ngra jigarrang va qoramtir rangga kirishi ham oksidlangan yoki polimerlangan katexol mahsulotlariga mos keladi.

Shunga qaramay, tadqiqot parchalanish mahsulotlarini kimyoviy jihatdan aniqlamagan. Jigarrang rang hosil bo‘lishining o‘zi muayyan polimerizatsiya yo‘lini isbotlamaydi. Mahsulot yo‘qolishi mexanizmi chuqurroq analitik izlanishlarni talab qiladi.

Titr, unum va tezlik nima uchun birgalikda baholanishi kerak?

Biotexnologik jarayonning muvaffaqiyati odatda uchta asosiy ko‘rsatkich bilan baholanadi:

Tadqiqot yuqori ajratish va tozalash xarajatlari tufayli asosiy e’tiborni titrga qaratgan. Yuqori titr bir litr kulturadan ko‘proq mahsulot olish imkonini beradi va quyi oqim (downstream) tozalash yukini kamaytiradi.

Biroq yuqori titr har doim xomashyodan yuqori unum olishni anglatmaydi. Eng yaxshi bioreaktor sharoitida yuqori mahsulot miqdori olingan bo‘lsa-da, prekursorning hammasi mahsulotga aylanmadi. Sanoat miqyosida baholash uchun xomashyo tannarxi, ishlab chiqarish davomiyligi, energiya sarfi, tozalashdagi yo‘qotishlar va mahsulot barqarorligi ham hisobga olinishi lozim.

2-rasm nimani ko‘rsatadi?

2-rasm turli gen klasterlari va prekursor ishlab chiqarish modullarining dastlabki myxochelin A unumdorligiga ta’sirini ko‘rsatadi. Sxemaning yuqori qismida miksobakteriya va E. coli genlari turli tartibda birlashtirilgan modullar joylashgan.

Quyi ustunli grafik faqatgina prekursor ishlab chiqarish genlarini o‘zgartirish, lizin parchalanishini to‘xtatish yoki MtaA ekspressiyasini oshirish orqali yuqori mahsulotga erishib bo‘lmasligini ko‘rsatadi. Eng yaxshi dastlabki natija taxminan 0,6 mg/l atrofida bo‘lgan.

3-rasm nimani ko‘rsatadi?

3-rasmda hujayrasiz nazorat, ishlab chiqarish genlariga ega bo‘lmagan boshlang‘ich shtamm va turli ishlab chiqaruvchi shtammlar vaqt bo‘yicha taqqoslanadi. Hujayrasiz va boshlang‘ich shtamm nazoratlarida tashqaridan berilgan myxochelin A asosan barqaror qolgan.

Ishlab chiqaruvchi shtammda esa myxochelin A kamaygan sari azotoxelinga o‘xshash cho‘qqi ko‘tarilgan. Bu taqqoslash konversiya jarayoni ishlab chiqarish yo‘li yoki ushbu yo‘l joylashgan hujayraviy muhit bilan bog‘liqligini tasdiqlaydi.

4-rasm nimani ko‘rsatadi?

4-rasm glyukoza va glitserinning sitrat, asetat, suktsinat va turli oktanoat konsentratsiyalari bilan birga qo‘llanilishini taqqoslaydi. Ustunlarning umumiy balandligi myxochelin A va azotoxelinning birlashgan titrini, rangli bo‘limlar esa ikki mahsulotning alohida hissalarini ko‘rsatadi.

Glitserinning ikkilamchi uglerod manbalari bilan ishlatilishi glyukoza kombinatsiyalariga qaraganda yuqoriroq umumiy mahsulot bergan. Oktanoat ayniqsa keyingi genetik optimizatsiyalarda energiya ta’minoti bilan birga juda foydali bo‘lib chiqdi.

5-rasm nimani ko‘rsatadi?

5-rasm mxcG kodon optimizatsiyasi, ikkinchi mxcEF nusxasi, uglerod manbalari nisbati, oktanoat, 2,3-digidroksibenzoat va lizin qo‘shimchasining ta’sirlarini birgalikda aks ettiradi.

Eng keskin o‘sish ikkinchi mxcEF nusxasidan so‘ng kuzatiladi. Rasm, shuningdek, lizin qo‘shilishi foyda bermaganini, prekursor va uglerod miqdorlari mahsulotlar nisbatini o‘zgartirishini hamda myxochelin A va azotoxelin o‘rtasida sharoitga bog‘liq taqsimot mavjudligini ko‘rsatadi.

6-rasm nimani ko‘rsatadi?

6-rasmning A va B panellari past va yuqori to‘yintirish sharoitlaridagi hujayra o‘sishi, uglerod manbalari, 2,3-digidroksibenzoat sarflanishi va ikki mahsulotning vaqt bo‘yicha o‘zgarishini ko‘rsatadi.

C va D panellari pioverdin fluoressensiyasini ishlab chiqarish jarayoni bilan birga kuzatadi. E paneli esa temirsiz, normal temirli, yuqori temirli, myxochelin A qo‘shilgan va 2,3-digidroksibenzoat qo‘shilgan nazorat kulturalarini taqqoslaydi.

Rasm eng yuqori hosildorlikka taxminan 34-soatda erishilganini, kultura vaqti uzaytirilganda mahsulot yo‘qotilishi yuz berganini va pioverdin reaksiyasi kuchli temir tanqisligi nazoratiga nisbatan past bo‘lib qolganini ko‘rsatadi.

Tadqiqotning o‘tmish nuqtayi nazaridan ahamiyati

Oldingi myxochelin tadqiqotlari asosan tabiiy ishlab chiqaruvchilarga, in vitro ferment tizimlariga yoki myxochelin hosilalarini sintezlashga qaratilgan edi. Ushbu tadqiqot, mualliflar ma’lumotiga ko‘ra, myxochelin A ning boshqa bakterial xo‘jayinda geterologik tarzda ishlab chiqarilgani haqidagi birinchi ishdir.

Tadqiqot tabiiy ishlab chiqaruvchining murakkab regulyator tizimlariga bog‘liq bo‘lmagan, genetik jihatdan oson o‘zgartiriladigan va aniq mineral muhitda ishlay oladigan muqobil ishlab chiqarish platformasini namoyish etadi.

Bugungi kun nuqtayi nazaridan ahamiyati

Tadqiqot biosintetik gen klasterini kiritish faqat boshlang‘ich qadam ekanligini ko‘rsatadi. Yuqori hosildorlik uchun genlar ekspressiyasi, prekursorlar oqimi, energiya holati, xo‘jayin metabolizmi, mahsulot transformatsiyasi va jarayon vaqti birgalikda boshqarilishi lozim.

Kutilmagan azotoxelin hosil bo‘lishi geterologik xo‘jayin metabolizmi ishlab chiqarish yo‘liga aralashishi mumkinligini ko‘rsatgani bilan alohida ahamiyatga ega. Xo‘jayin hujayra kerakli reaksiyalarni bajarish bilan birga o‘z fermentlari orqali kutilmagan yoki muqobil mahsulotlarni ham hosil qilishi mumkin.

Kelajak nuqtayi nazaridan ahamiyati

Tadqiqot kelgusida o‘rganilishi lozim bo‘lgan bir nechta yo‘nalishlarni qoldiradi:

• Azotoxelin tuzilishini LC-MS va sof standart yordamida tasdiqlash,
• Myxochelin A ni azotoxelinga aylantiruvchi aldegid degidrogenazalarni aniqlash,
• Keraksiz o‘zgarishlarni kamaytirish uchun genlarni o‘chirish (nokaut) usullarini sinash,
• MxcE, MxcF va MxcG o‘rtasidagi jismoniy o‘zaro ta’sirlarni o‘rganish,
• 2,3-digidroksibenzoatning de novo sintezini mutanosib tarzda oshirish,
• Salitsilat bilan induksiyalanadigan tizim o‘rniga doimiy ishlovchi promotordan foydalanish,
• Fed-batch fermentatsiyasi orqali ishlab chiqarish davrini uzaytirish,
• Adsorbent smolalar yordamida mahsulotni ishlab chiqarish davomida ajratib olish (in situ product recovery),
• Oksidlanish va polimerizatsiyani kamaytiruvchi jarayon sharoitlarini yaratish,
• Mahsulotni tozalash unumi va xarajatlarini aniqlash.

Sanoat va biotexnologiya nuqtayi nazaridan ahamiyati

226 mg/l darajasi tadqiqot miqyosida katta o‘sish bo‘lib, tabiiy ishlab chiqaruvchilarga qaraganda ancha yuqori titrni taqdim etadi. Aniq tarkibli mineral ozuqa muhitining ishlatilishi tarkibi o‘zgaruvchan murakkab organik muhitlarga nisbatan jarayon nazoratini osonlashtiradi.

Shunga qaramay, 2 litrli bioreaktordan sanoat ishlab chiqarishiga to‘g‘ridan-to‘g‘ri o‘tib bo‘lmaydi. Aralashtirish, kislorod uzatish, ko‘pik hosil bo‘lishi, issiqlik almashinuvi, sterilizatsiya, xomashyo narxi, genetik barqarorlik va mahsulotni ajratib olish kattaroq miqyosda qayta baholanishi shart.

Tadqiqot tijoriy ishlab chiqarish tannarxi, toza mahsulot unumi yoki iqtisodiy maqsadga muvofiqlik tahlilini taqdim etmagan. Binobarin, “sanoat ishlab chiqarishi tayyor” degan xulosa chiqarish mumkin emas.

Tibbiyot nuqtayi nazaridan ahamiyati

Ko‘proq miqdorda mahsulot olish myxochelin A ning biologik xususiyatlarini chuqurroq o‘rganishga imkon beradi. Biroq ushbu tadqiqot myxochelin A ning insonlarda yallig‘lanish, saraton yoki boshqa kasalliklarga ta’sirini baholamagan.

Olingan moddalarning farmatsevtik sofligi, toksikligi, farmakokinetikasi, hujayra selektivligi yoki hayvonlardagi xavfsizligi o‘lchanmagan. Shu sababli tadqiqot davolash vositasi emas, balki tabiiy birikmalar tadqiqoti uchun ishlab chiqarish platformasi hisoblanadi.

Tadqiqotning kuchli tomonlari

• Tabiiy gen klasteridan tortib nazorat qilinadigan bioreaktor ishlab chiqarishigacha bo‘lgan butun zanjir o‘rganilgan.
• Bir nechta genetik modullar eksperimental tarzda taqqoslangan.
• Uglerod manbalari va prekursor ta’minoti tizimli ravishda tahlil qilingan.
• Genlar ekspressiyasidagi to‘siqlar bosqichma-bosqich aniqlangan.
• mxcG kodon optimizatsiyasi va ikkinchi mxcEF nusxasining ta’sirlari alohida bosqichlarda baholangan.
• Mahsulot hosil bo‘lishi vaqt seriyalari bilan kuzatilgan.
• Kutilmagan azotoxelin paydo bo‘lishi e’tibordan chetda qoldirilmay, alohida mahsulot sifatida o‘rganilgan.
• Mikroplanka miqyosidan nazorat qilinadigan 2 litrli bioreaktorga o‘tilgan.
• pH, erigan kislorod, aralashtirish va namuna olish bioreaktorda aniq nazorat qilingan.
• Titr bilan birga ishlab chiqarish tezligi va biotransformatsiya unumi ham hisoblangan.
• Myxochelin A ning ehtimoliy temir tanqisligi ta’siri pioverdin fluoressensiyasi nazoratlari bilan tekshirilgan.
• Aniq mineral ozuqa muhiti qo‘llanilgan.

Tadqiqotning cheklovlari

• Tadqiqot ilmiy taqrizdan o‘tmagan preprint hisoblanadi.
• Hujjatda taqrizchilar fikrlari bo‘lsa-da, jurnal tomonidan rasmiy qabul qilingani ko‘rsatilmagan.
• Azotoxelin uchun tijoriy yoki tozalangan tasdiqlangan standart ishlatilmagan.
• Azotoxelinning kimyoviy tuzilishi LC-MS yoki NMR bilan tasdiqlanmagan.
• Mahsulotlarning temir bilan bog‘langan va erkin shakllari alohida o‘lchanmagan.
• Myxochelin A va azotoxelin yetarli miqdorda tozalanib, to‘liq strukturaviy tahlilga kiritilmagan.
• Uglerod manbalarini taqqoslashda umumiy uglerod mol miqdori tenglashtirilmagan.
• Ayrim mikroplanka tajribalarida biologik takroriylik soni uchta, chetga chiquvchi qiymatlar chiqarilganda ikkita bo‘lgan.
• Bioreaktor tajribalari ikkita biologik takroriylik asosida o‘tkazilgan.
• MxcE, MxcF va MxcG o‘zaro ta’sirlari bevosita o‘lchanmagan.
• Azotoxelin hosil bo‘lishiga javobgar bo‘lgan xo‘jayin fermentlari aniqlanmagan.
• Myxochelin A ning azotoxelinga aylanishining teskari mexanizmi to‘g‘ridan-to‘g‘ri isbotlanmagan.
• Mahsulot yo‘qolishi oksidlanish, polimerizatsiya yoki boshqa jarayondan kelib chiqqani kimyoviy ko‘rsatilmagan.
• To‘liq uglerod va metabolitlar massasi balansi berilmagan.
• Fed-batch yoki doimiy ishlab chiqarish sinab ko‘rilmagan.
• Tozalash unumi, mahsulotni ajratib olish va iqtisodiy tahlil o‘tkazilmagan.
• Farmakologik, hayvonlar ustidagi yoki klinik sinovlar mavjud emas.

Tadqiqot nima demoqda?

• Myxochelin A biosintezi P. taiwanensis VLB120 da geterologik tarzda muvaffaqiyatli yo‘lga qo‘yildi.
• Dastlabki ishlab chiqarish darajasi taxminan 0,6 mg/l ni tashkil qildi.
• Uglerod va energiya manbalari kombinatsiyasi hosildorlikni oshirdi.
• Oktanoatning foydasi ayniqsa oshirilgan MxcG quvvati bilan birga yaqqol namoyon bo‘ldi.
• Ikkinchi mxcEF nusxasi ishlab chiqarishda katta o‘sishni ta’minladi.
• 2,3-digidroksibenzoat ta’minoti keyingi bosqichda asosiy to‘siqqa aylandi.
• Ozuqa muhiti va shtammni optimallashtirish orqali myxochelin A hosildorligi 226,4 mg/l ga yetdi.
• Ayni jarayonda azotoxelinga o‘xshash ikkinchi mahsulot hosil bo‘ldi.
• Myxochelin A ishlab chiqaruvchi shtamm tomonidan qayta yutib olinib, azotoxelinga aylantirilishi mumkin.
• Ishlab chiqarish va hosilni yig‘ib olish vaqti mahsulot yo‘qotilishining oldini olishda hal qiluvchi ahamiyatga ega.

Tadqiqot nima demayapti?

• Azotoxelin tuzilishini qat’iy molekulyar usullar bilan isbotlamayapti.
• Qaysi aldegid degidrogenaza ushbu o‘zgarishni amalga oshirganini ko‘rsatmayapti.
• Oktanoat ta’sirini metabolik oqim darajasida isbotlamayapti.
• Ortgan mxcEFG ifodalanishining molekulyar mexanizmini to‘liq yechmayapti.
• Ishlab chiqaruvchi shtamm sanoat miqyosida iqtisodiy jihatdan foydali ekanligini ko‘rsatmayapti.
• Myxochelin A insonlarda xavfsiz yoki samarali davo ekanligini ko‘rsatmayapti.
• Saraton, yallig‘lanish yoki boshqa kasalliklarda klinik foyda dalillarini taqdim etmayapti.
• Olingan moddalar farmatsevtik qo‘llashga tayyor ekanligini bildirmayapti.

Tadqiqot usullari va natijalari

Tadqiqot dizaynining texnik xulosasi

Qo‘llanilgan asosiy shtamm modifikatsiyalari

• pobA, hpd, quiC, quiC1, quiC2 va benABCD parchalanish yo‘llari o‘chirilib, aromatik prekursor yo‘qotilishi kamaytirildi.
• pykA geni o‘chirilishi hamda TrpE P290S va AroF-1 P148L mutatsiyalari bilan shikimat yo‘liga uglerod oqimi oshirildi.
• Gen modullari mini-Tn7 tizimi yordamida xromosomadagi attTn7 sohasiga kiritildi.
• P14f va P14c sintetik promotorlari qo‘llanildi.
• MxcK eksport oqsili ishlab chiqarish moduliga kiritildi.
• Myxochelin B hosil bo‘lishini kamaytirish uchun mxcL chiqarib tashlandi.
• MxcF va MxcG ning fosfopanteteinlanishi uchun mtaA ifodalandi.
• mxcG xo‘jayin bakteriyaga moslab kodon-optimallashtirildi.
• Ikkinchi mxcEF nusxasi xromosomaga kiritildi.

Kichik miqyosdagi kultura sharoitlari

• Kultura tizimi: 24 o‘rinli System Duetz plastinkalari.
• Ishchi hajm: 1,5 ml.
• Inkubatsiya harorati: 30°C.
• Chayqatish: 300 ayl/daqiqa, 50 mm harakat diametri.
• Dastlabki hujayra zichligi: OD₆₀₀ = 0,05.
• Glyukoza dastlabki kulturasi: 20 mM glyukoza.
• Glitseringa moslashish dastlabki kulturasi: 40 mM glitserin va 2 mM glyukoza.
• Salitsilat bilan induksiyalanish uchun 0,1 mM natriy salitsilati.
• Kultura davomiyligi: tajribaga qarab 24 yoki 48 soat.

Bioreaktor sharoitlari

• Reaktor hajmi: 2 L.
• Ishchi hajm: 1 000 ml.
• Ozuqa muhiti: Ikki barobar buferlangan mineral tuzlar muhiti.
• Dastlabki OD₆₀₀: 0,05.
• Boshlang‘ich aralashtirish: 400 ayl/daqiqa.
• Aralashtirish nazorati: 400–800 ayl/daqiqa.
• Boshlang‘ich shamollatish: 60 standart litr/soat.
• Havo oqimi nazorati: 1–2 vvm.
• Erigan kislorod: 30%.
• pH: 7.
• pH nazorati: 2 M NaOH va 2 M H₂SO₄.
• Namuna olish oralig‘i: 3 soat.

Analitik usullar

Ishlab chiqarish o‘sishining bosqichma-bosqich xulosasi

Eng yaxshi bioreaktor unumdorligining raqamli xulosasi

Natijalarning texnik xulosasi

• Dastlabki bosqichda prekursor ta’minotidan ko‘ra biosintetik genlarning mutanosib ekspressiyasi cheklovchi bo‘ldi.
• MxcG miqdorini oshirish faqat yetarli energiya manbai bo‘lgandagina samara berdi.
• MxcE va MxcF darajalarining oshirilishi ishlab chiqarishda eng katta genetik sakrashni hosil qildi.
• Ushbu yaxshilanishdan so‘ng 2,3-digidroksibenzoat ta’minoti yangi to‘siqqa aylandi.
• Glitserol va oktanoat birgalikda yuqori hosildorlikni ta’minladi.
• Xo‘jayin metabolizmi maqsadli mahsulotning azotoxelinga o‘xshash ikkinchi mahsulotga aylanishiga sabab bo‘ldi.
• Myxochelin A bilan azotoxelin nisbati ozuqa tarkibi va yetishtirish davomiyligiga bog‘liq.
• Eng yuqori mahsulot darajasiga erishilgach, fermentatsiyani davom ettirish mahsulot yo‘qotilishiga olib keldi.
• Bioreaktor miqyosi mikroplanka titridan yuqori ishlab chiqarishni ta’minladi.
• Yuqori titrga qaramay, prekursor konversiyasi unumi va mahsulot barqarorligi yanada takomillashtirishni talab etadi.

Manba va uslubiyot eslatmasi

Ushbu material Franziska Kofler, Astrid Wirtz, Amelie Jäger, Dominik Oskamp, Seung-Hyun Paik, Thomas Drepper, Benedikt Wynands va Nick Wierckx tomonidan tayyorlangan “Metabolic Engineering of Pseudomonas Taiwanensis for Heterologous Production of Myxochelin” nomli ilmiy ishga asoslanadi.

Yuklangan fayl taqrizchilar izohlarini, mualliflarning ushbu izohlarga javoblarini, qayta ko‘rib chiqilgan asosiy matn va rasmlarni o‘z ichiga oladi. Shunga qaramay, har bir sahifada “This preprint research paper has not been peer reviewed” ogohlantirishi mavjud. Shu sababli tadqiqot taqrizli nashr etilgan maqola sifatida emas, ilmiy taqrizdan o‘tmagan preprint sifatida ko‘rib chiqilishi lozim.

Mualliflar javoblarida maqolaning boshqa jurnalga o‘tkazilgani qayd etilgan; ammo faylda jurnal tomonidan qabul qilingani, yakuniy nashr holati yoki tugallangan taqriz haqida ma’lumot berilmagan.

Tadqiqot klinik sinov emas. U genetik modifikatsiyalangan P. taiwanensis bakteriyalarida amalga oshirilgan metabolik muhandislik, mikroplanka kulturalari, HPLC tahlillari, fluoressensiya o‘lchovlari va 2 litrli bioreaktor tajribalaridan iborat.

Myxochelin A tijoriy standart yordamida HPLC orqali o‘lchandi. Azotoxelin uchun tasdiqlangan standart bo‘lmagani sababli, ishlab chiqaruvchi shtammdagi noma’lum cho‘qqi Azotobacter vinelandii kulturasidagi cho‘qqining tutilish vaqti va UV-VIS spektri bilan solishtirildi. Mualliflarning taqrizchilarga javobida LC-MS tahlilini bajara olmaganliklari ochiq aytilgan. Shu sababli azotoxelin identifikatsiyasi kuchli, ammo bilvosita analitik dalilga tayanadi.

HPLC tahlillarining kislotali sharoitda o‘tkazilishi sideroforlarga birikkan temirning ajralishini va analitik uskunadan olinadigan temirga qarab cho‘qqilarning o‘zgarishining oldini olishga qaratilgan. Biroq mahsulotlarning temir bog‘lagan holo shakllari va erkin apo shakllari alohida tavsiflanmagan.

Tadqiqotda keltirilgan farmakologik xususiyatlar oldingi adabiyotlardan olingan. Ushbu tadqiqot 5-lipoksigenaza ingibitsiyasini, o‘smaga qarshi ta’sirni, inson xavfsizligini yoki klinik davolash muvaffaqiyatini sinovdan o‘tkazmagan.

Ushbu sharh yuklangan tadqiqotdagi tajriba tizimlari, raqamli natijalar, rasmlar, mualliflar talqinlari va ochiq ko‘rsatilgan cheklovlarga asoslanib tayyorlangan. PDF da mavjud bo‘lmagan klinik ta’sir, davolash kafolati, sanoat muvaffaqiyati, tijoriy daromad yoki xavfsizlik da’volari qo‘shilmagan.