Dört buçuk LIM alanı proteini 2, kısa adıyla FHL2, hücre içinde çok sayıda proteini birbirine bağlayabilen modüler bir düzenleyici proteindir. Hücre iskeleti, gen ifadesi ve hücresel sinyal yolları arasında bağlantı kurabilen FHL2’nin 90’dan fazla etkileşim ortağı tanımlanmıştır. Bununla birlikte tam uzunluktaki FHL2 proteininin yeterli miktarda, çözünür ve yapısal analizlere uygun biçimde üretilmesi uzun süredir güçtür. Bu zorluk, proteinin tamamının çözeltide nasıl davrandığını ve β-katenin gibi önemli ortaklarına hangi moleküler düzenle bağlandığını anlamayı sınırlandırmıştır.

Tina Logonder, Uroš Prešern ve Aljaž Gaber tarafından yürütülen çalışmada, tam uzunlukta ve son aşamada füzyon etiketi taşımayan FHL2 proteininin Escherichia coli bakterilerinde miligram ölçeğinde üretilmesini sağlayan bir yöntem geliştirilmiştir. Araştırmacılar farklı çözünürlük etiketlerini karşılaştırmış, sfGFP füzyonunun en yüksek çözünür protein miktarını sağladığını göstermiş ve FHL2’nin çinko içeren LIM alanlarının doğru katlanmasını desteklemek için üretim ortamındaki ZnCl₂ düzeyini optimize etmiştir.

sfGFP etiketi, FHL2’nin bakterilerdeki toplam ifade düzeyini yaklaşık 7 kat, çözünür fraksiyondaki oranını yaklaşık 6,2 kat artırmıştır. Çözünür FHL2 miktarındaki toplam artış, His etiketli FHL2’nin çözünür fraksiyonuna göre 45,3 ± 8,5 kat olarak hesaplanmıştır. Çinko desteği çözünür protein üretimini artırırken yüksek çinko düzeyleri bakteri büyümesini azaltmıştır. Çözünür protein verimi ile hücre büyümesi birlikte değerlendirildiğinde 250 ve 500 µM ZnCl₂ en uygun aralık olarak belirlenmiş, büyük ölçekli üretimde 250 µM kullanılmıştır.

Saflaştırma sonunda yaklaşık yüzde 90 saflıkta, 19 mg/mL’ye kadar yoğunlaştırılabilen ve kültürün litresi başına yaklaşık 5,9 mg etiketsiz FHL2 elde edilmiştir. Dairesel dikroizm ölçümleri, saflaştırılmış proteinin ikincil yapı içeriğinin AlphaFold modelinden hesaplanan değerlerle uyumlu olduğunu göstermiştir. Statik ışık saçılımıyla birleştirilmiş boyut dışlama kromatografisi ise FHL2’nin çözeltide esas olarak tek moleküllü, yani monomerik durumda bulunduğunu göstermiştir.

Küçük açılı X-ışını saçılımı sonuçları, FHL2’nin sert ve doğrusal bir çubuk gibi davranmadığını ortaya koymuştur. Deneysel dönme yarıçapı 37,8 Å, maksimum moleküler boyut 137 Å olarak ölçülmüştür. Tamamen uzatılmış AlphaFold modelinde bu değerler sırasıyla 50,7 ve 177 Å’dır. Bu fark, çözeltideki FHL2 moleküllerinin önemli bir bölümünün uzatılmış biçimden daha kompakt ve bükülmüş konformasyonlar aldığını göstermektedir.

SAXS ve çapraz bağlama-kütle spektrometrisi verilerinin birlikte kullanıldığı bütünleştirici modelleme, tek bir sabit yapı yerine birbirine dönüşebilen yapısal toplulukların varlığını desteklemiştir. Farklı model ailelerinde FHL2 moleküllerinin yüzde 35–57’si uzatılmış, yüzde 11–34’ü kompakt biçimde bükülmüş, geri kalan yüzde 12–54’ü ise ara konformasyonlarda sınıflandırılmıştır. Bu esneklik, FHL2’nin farklı protein ortaklarına veya aynı anda birden fazla etkileşim yüzeyine uyum sağlayabilen moleküler bir iskele gibi çalışmasını açıklayabilir.

Çalışmanın en dikkat çekici sonucu, FHL2 ile β-katenin arasındaki kompleksin bağlanma oranıdır. Boyut dışlama kromatografisi, statik ışık saçılımı ve izotermal titrasyon kalorimetrisi sonuçları; bir β-katenin molekülüne iki FHL2 molekülünün bağlanabildiğini göstermiştir. Kompleksin deneysel moleküler kütlesi 140,2 kDa olarak ölçülmüş; bu değer 1:1 kompleks için beklenen 117,7 kDa’dan yüksek, iki FHL2 ve bir β-kateninden oluşan kompleks için hesaplanan 149,8 kDa’ya yakın bulunmuştur.

Kalorimetri ölçümlerinde bağlanma stokiyometrisi 2,040 ± 0,001, ayrışma sabiti ise 530 ± 30 nM olarak belirlenmiştir. Bu değer, etkileşimin mikromoların altında bir bağlanma gücüne sahip olduğunu göstermektedir. Etkileşim güçlü ve elverişli moleküller arası temaslarla desteklenirken, kompleks oluşumu sırasında proteinlerin hareket özgürlüğünün azalması entropik bir bedel meydana getirmiştir.

Çalışma, FHL2’nin kanserde kesin olarak tedavi edilebilir bir hedef olduğunu veya 2:1 kompleksin tüm hücrelerde aynı biçimde oluştuğunu göstermemektedir. Araştırma, saflaştırılmış rekombinant proteinlerle yapılan laboratuvar deneylerine ve yapısal modellemeye dayanmaktadır. Hücre içinde kompleksin gerçek zamanlı yapısı, bağlanma yüzeyleri, iki FHL2 molekülünün aynı mı yoksa farklı bölgelerden mi bağlandığı ve bu düzenin gen ifadesini nasıl değiştirdiği henüz doğrudan gösterilmemiştir.

FHL2 nasıl bir proteindir?

FHL2’nin tam adı “Four-and-a-half LIM domains protein 2”, Türkçe karşılığıyla dört buçuk LIM alanı proteini 2’dir. Protein, bir yarım LIM alanı ile dört tam LIM alanından oluşan beş modüler bölüme sahiptir. Çalışmadaki yapısal gösterimlerde bu bölümler LIM0, LIM1, LIM2, LIM3 ve LIM4 olarak adlandırılmıştır.

Her tam LIM alanı iki ardışık çinko parmağından meydana gelir. Yarım LIM alanı ise tek bir çinko parmağı içerir. Böylece tam uzunluktaki FHL2’de toplam dokuz çinko parmağı bulunur. LIM alanları arasında yaklaşık dokuz amino asitlik kısa ve esnek bağlayıcı diziler yer almaktadır.

Buradaki “çinko parmağı” ifadesi, klasik DNA’ya bağlanan çinko parmağı proteinleriyle karıştırılmamalıdır. FHL2’nin LIM alanları temel olarak nükleik asitlere bağlanmak için değil, protein-protein etkileşimlerini kurmak için kullanılır. Çinko iyonları, alanların üç boyutlu yapısını koruyarak proteinin düzgün katlanmasına yardımcı olur.

FHL2’nin 90’dan fazla etkileşim ortağı bildirilmiştir. Bunlar arasında:

• Transkripsiyon faktörleri ve transkripsiyon yardımcıları,
• Hücre zarı reseptörleri,
• Hücre iskeleti proteinleri,
• Enzimler,
• Sinyal yolu bileşenleri bulunmaktadır.

Bu geniş etkileşim ağı FHL2’yi, kendi başına tek bir enzimatik reaksiyon gerçekleştiren proteinden çok, farklı proteinleri aynı düzenleyici ortamda bir araya getiren bir adaptör veya iskele proteini hâline getirir.

FHL2 ile kanser arasındaki ilişki neden karmaşıktır?

FHL2’nin hücresel işlevi bulunduğu dokuya, hücre tipine, etkileşim ortaklarına ve etkinleşen sinyal yoluna göre değişebilir. Çalışmada özetlenen literatüre göre FHL2 bazı kanserlerde tümörü destekleyen bir onkogen gibi, bazı bağlamlarda ise tümör baskılayıcı bir protein gibi davranabilmektedir.

Meme kanserinin belirli BRCA1 ilişkili biçimlerinde ve hepatoselüler kanserde FHL2 ifadesinin azaldığı bildirilmiştir. Buna karşılık mide, kolorektal, küçük hücreli dışı akciğer, serviks, yumurtalık, prostat, pankreas duktal adenokarsinomu, melanom ve bazı lösemi türlerinde artmış FHL2 ifadesi rapor edilmiştir. Bazı meme, kolon ve akciğer kanseri çalışmalarında yüksek FHL2 düzeyi kötü prognozla ilişkilendirilmiştir.

Ancak bu bilgiler, mevcut deneyin yeni klinik sonuçları değildir. Araştırmacılar hasta örneklerini, tümör büyümesini veya tedavi yanıtını ölçmemiştir. Çalışmanın kanser açısından önemi, FHL2’nin β-katenin ile kurduğu yapısal ilişkinin Wnt/β-katenin sinyal yolunu anlamaya yardımcı olabilecek olmasıdır.

Wnt/β-katenin sinyal yolunda FHL2’nin yeri

β-katenin, hücre yapışması ve gen ifadesinin düzenlenmesi gibi iki önemli işleve sahip bir proteindir. Wnt sinyal yolu etkinleştiğinde β-kateninin hücre içindeki miktarı, fosforilasyonu, parçalanması ve hücre çekirdeğine taşınması değişebilir. Çekirdekte biriken β-katenin, belirli hedef genlerin ifadesini etkileyebilir.

FHL2’nin β-katenine doğrudan bağlandığı, β-kateninin fosforilasyonunu ve hücre içindeki konumunu etkileyebildiği daha önce bildirilmiştir. Bununla birlikte iki proteinin hangi yüzeylerden bağlandığı konusunda önceki çalışmalar tam olarak uyuşmamıştır.

Bir çalışma β-kateninin N-uç bölgesi ile ilk armadillo tekrarının gerekli olduğunu bildirirken, başka bir çalışma ARM1–9 bölgesini ve özellikle ARM3–8 tekrarlarını öne çıkarmıştır. Ayrıca FHL2’nin LIM alanlarından herhangi birinin silinmesinin etkileşimi ciddi biçimde azaltabildiği bildirilmiştir.

Bu anlaşmazlıkların önemli nedenlerinden biri, önceki araştırmalarda tam uzunlukta olmayan β-katenin parçalarının veya GST ve MBP gibi büyük füzyon etiketleri taşıyan FHL2 örneklerinin kullanılması olabilir. Büyük bir etiket, proteinin esnekliğini sınırlayabilir, bağlanma yüzeyini örtebilir veya kompleksin gerçek moleküler ağırlığını yorumlamayı zorlaştırabilir.

Temel teknik problem: Tam uzunluktaki FHL2 neden zor üretiliyor?

Bir proteinin yapısını ve etkileşimlerini incelemek için öncelikle yeterli miktarda, çözünür ve doğru katlanmış protein elde edilmesi gerekir. FHL2 açısından bu aşama özellikle zordur. Bunun başlıca nedenleri şunlardır:

• Protein çok sayıda çinko koordinasyon bölgesi içerir.
• Çinko yetersizliği LIM alanlarının eksik katlanmasına yol açabilir.
• Yanlış katlanan proteinler bakteride çözünmeyen kümeler oluşturabilir.
• FHL2’nin alanlar arası esnekliği, proteini agregasyona açık hâle getirebilir.
• Çözünürlüğü artıran büyük etiketler çıkarıldığında protein yeniden çökelebilir.

Araştırmacıların ilk etiketsiz FHL2 üretme girişimleri başarısız olmuştur. Düşük sıcaklık ve farklı ZnCl₂ düzeyleri denenmesine rağmen protein çoğunlukla çözünmeyen fraksiyonda kalmıştır. Çözünmeyen proteini yeniden katlama girişimleri de anlamlı miktarda çözünür FHL2 sağlamamıştır.

Farklı füzyon etiketleri nasıl karşılaştırıldı?

FHL2’nin çözünürlüğünü artırmak amacıyla dört farklı yapı karşılaştırılmıştır:

• HT-FHL2: His etiketi taşıyan FHL2,
• GST-FHL2: Glutatyon S-transferaz ile birleştirilmiş FHL2,
• MBP-FHL2: Maltoz bağlayıcı protein ile birleştirilmiş FHL2,
• sfGFP-FHL2: Süper katlanan yeşil floresan protein ile birleştirilmiş FHL2.

Şekil 1A’daki western blot görüntüleri, her yapının çözünür ve çözünmeyen fraksiyonlardaki dağılımını göstermektedir. GST toplam ifade düzeyini artırmış, ancak çözünürlük oranını iyileştirmemiştir. Hatta GST-FHL2’nin çözünür fraksiyondaki payı His etiketli yapıya göre daha düşük kalmıştır.

MBP toplam ifade miktarını belirgin biçimde değiştirmemiş, ancak çözünür protein oranını 2,5 ± 0,7 kat artırmıştır. En büyük gelişme sfGFP füzyonunda görülmüştür:

• Toplam ifade düzeyi 7,0 ± 0,7 kat artmıştır.
• Çözünür fraksiyon oranı 6,2 ± 1,6 kat artmıştır.
• Çözünür protein miktarındaki toplam artış 45,3 ± 8,5 kata ulaşmıştır.

Bu sonuçlar nedeniyle büyük ölçekli üretim için sfGFP-FHL2 yapısı seçilmiştir. sfGFP burada nihai deney proteininin bir parçası olarak bırakılmamış; üretim ve katlanma aşamasında yardımcı olduktan sonra TEV proteazıyla kesilerek uzaklaştırılmıştır.

Çinko neden gerekliydi ve neden sınırsız artırılamadı?

FHL2’nin dokuz çinko parmağı içerdiği düşünüldüğünde, hücre içinde yeterli Zn²⁺ bulunması doğru katlanma açısından önemlidir. Araştırmacılar üretim ortamına 0, 100, 250, 500 ve 1.000 µM ZnCl₂ ekleyerek çözünür sfGFP-FHL2 miktarını karşılaştırmıştır.

ZnCl₂ eklenmesi toplam protein ifadesini belirgin biçimde değiştirmemiş, ancak çözünür fraksiyondaki protein miktarını artırmıştır. İyileşme 100 µM düzeyinde başlamış, 250 ve 500 µM düzeylerinde daha güçlü hâle gelmiştir.

Bununla birlikte çinko bakteriler için yüksek konsantrasyonlarda toksiktir. Şekil 1E’de üretim sonunda ölçülen OD₆₀₀ değerleri, ZnCl₂ düzeyi arttıkça bakteri büyümesinin azaldığını göstermektedir. En güçlü büyüme kaybı 1.000 µM’de görülmüştür.

Bu nedenle yalnızca hücre başına üretilen çözünür proteine değil, bir litre kültürden elde edilebilecek toplam çözünür proteine bakılmıştır. Şekil 1F’deki karşılaştırma 250 ve 500 µM ZnCl₂ düzeylerinin en uygun dengeyi sağladığını göstermiştir. Büyük ölçekli üretimde hücre büyümesini daha az baskılayan 250 µM düzeyi seçilmiştir.

Saflaştırma süreci nasıl ilerledi?

FHL2, 18°C’de gece boyunca ifade edilmiştir. Düşük sıcaklık, bakteride sentezlenen proteinin daha yavaş ve doğru katlanmasına yardımcı olmak amacıyla kullanılmıştır.

Saflaştırma sırası şu şekilde yürütülmüştür:

1. His etiketi taşıyan sfGFP-FHL2 ilk immobilize metal afinite kromatografisiyle yakalanmıştır.
2. TEV proteazı eklenerek sfGFP ile FHL2 arasındaki bağ kesilmiştir.
3. Kesim sırasında örnek gece boyunca diyaliz edilmiştir.
4. His etiketi taşıyan sfGFP ve TEV proteazı ikinci metal afinite kolonunda tutulmuştur.
5. Etiketsiz FHL2 akış fraksiyonunda toplanmıştır.
6. Son saflaştırma ve tampon değişimi boyut dışlama kromatografisiyle gerçekleştirilmiştir.

TEV kesimi ve diyaliz sırasında önemli miktarda çökelme meydana gelmiş, santrifüjden sonra 280 nm absorbansında yaklaşık yüzde 50 azalma görülmüştür. Bu durum, sfGFP’nin yalnızca üretimi değil, bazı FHL2 moleküllerinin çözünür kalmasını da desteklediğini; etiket uzaklaştırıldığında yanlış katlanmış veya kararsız moleküllerin çökelebildiğini düşündürmektedir.

Buna rağmen kalan çözünür protein yaklaşık yüzde 90 saflığa ulaştırılmış, 19 mg/mL’ye kadar yoğunlaştırılmış ve kültürün litresi başına yaklaşık 5,9 mg etiketsiz FHL2 elde edilmiştir. Bu miktar, SAXS, kalorimetri ve kütle spektrometrisi gibi yöntemlerin uygulanmasına yeterli olmuştur.

Saflaştırılan FHL2 gerçekten doğru katlanmış mıydı?

Dairesel dikroizm, proteinlerdeki alfa heliks ve beta tabaka gibi ikincil yapıların yaklaşık oranlarını ölçmek için kullanılır. Deneysel CD verilerinin ayrıştırılması sonucunda:

Deneysel ve hesaplanan oranların birbirine yakın olması, saflaştırılmış FHL2’nin ikincil yapısının genel olarak beklenen katlanmayla uyumlu olduğunu göstermiştir.

FHL2 çözeltide monomer mi, dimer mi?

Boyut dışlama kromatografisinde ana monomer pikinden önce çıkan küçük bir ek pik gözlenmiştir. Bu erken pik yaklaşık 64,4 kDa’lık bir yapıya karşılık geldiğinden ilk bakışta FHL2 dimeri olabileceği düşünülmüştür.

Gerçek bir monomer-dimer dengesi bulunuyorsa protein konsantrasyonu yükseldiğinde dimer miktarının artması ve buna karşılık monomer oranının azalması beklenir. Araştırmacılar bu olasılığı sınamak için FHL2’yi 1–7 mg/mL, yani yaklaşık 31–218 µM aralığında SEC-SLS ile incelemiştir.

Erken çıkan pik protein konsantrasyonuyla birlikte artmış, ancak monomer pikinde karşılık gelen bir azalma görülmemiştir. Monomer ve erken pik arasındaki göreli dağılım test edilen konsantrasyonlarda değişmemiştir. Bu nedenle erken pik, çözeltide dengeli biçimde oluşup ayrışan gerçek bir FHL2 homodimeri olarak yorumlanmamıştır.

Ana pikin ölçülen moleküler kütlesi teorik 32,2 kDa değerine yakın bulunmuş ve FHL2’nin çözeltide ağırlıklı olarak monomer olduğu sonucuna varılmıştır.

SAXS, FHL2’nin esnekliğini nasıl gösterdi?

Küçük açılı X-ışını saçılımı, proteinleri kristalleştirmeden çözeltideki genel boyutları, şekilleri ve esneklikleri hakkında bilgi sağlar. Bu yöntem her atomun kesin konumunu tek başına belirlemez; fakat molekülün kompakt mı, uzatılmış mı veya esnek mi olduğunu ortaya koyabilir.

Şekil 3A’daki Kratky grafiğinde FHL2’nin eğrisi, sert ve küresel bir protein olan BSA’nın çan biçimli profilinden belirgin şekilde ayrılmıştır. FHL2 eğrisinin yüksek değerlerde geniş biçimde devam etmesi, proteinin önemli derecede esnek olduğunu göstermektedir.

AlphaFold modelinin tamamen uzatılmış yapısından hesaplanan teorik SAXS eğrisi deneysel veriye iyi uyum göstermemiştir. Tek model uyumundaki χ² değeri 15,231’dir. Bu yüksek uyumsuzluk, çözeltideki bütün FHL2 moleküllerinin tek ve tam uzatılmış bir yapı olarak temsil edilemeyeceğini göstermektedir.

R_g ve D_max değerleri ne anlatıyor?

Dönme yarıçapı, R_g, moleküler kütlenin merkez çevresinde ne kadar yayıldığını ifade eder. Büyük R_g değeri genellikle daha uzatılmış, küçük değer ise daha kompakt bir yapıya işaret eder.

Maksimum boyut, D_max, moleküldeki birbirinden en uzak iki nokta arasındaki yaklaşık en büyük mesafeyi temsil eder.

Her iki deneysel değerin de uzatılmış modelden küçük olması, çözeltideki proteinin ortalama olarak daha kısa ve daha kompakt bir yapı topluluğu oluşturduğunu göstermektedir.

Çiftler arası uzaklık dağılımında 22,5 Å civarında belirgin bir tepe gözlenmiştir. Bu mesafe tek bir LIM alanının karakteristik boyutuyla uyumludur. Dağılımın 137 Å’ye kadar uzun bir kuyruk oluşturması ise FHL2’nin tamamen küresel değil, genel olarak uzatılmış fakat farklı derecelerde bükülebilen çok alanlı bir mimariye sahip olduğunu göstermektedir.

Tek bir yapı yerine neden “konformasyon topluluğu” kullanıldı?

Esnek proteinler çözeltide tek bir sabit biçimde durmaz. Aynı protein molekülü zaman içinde daha açık, daha bükülmüş veya ara yapılara geçebilir. Bu nedenle esnek bir proteini yalnızca tek bir üç boyutlu modelle açıklamak yanıltıcı olabilir.

Araştırmacılar SAXS verilerini, çapraz bağlama-kütle spektrometrisiyle elde edilen mesafe kısıtlamalarıyla birleştirmiştir. XL-MS yönteminde proteinin birbirine yakın bölgeleri kimyasal olarak çapraz bağlanır. Daha sonra hangi amino asit çiftlerinin bağlandığı kütle spektrometrisiyle belirlenir. Bir modelde iki kalıntı çapraz bağlayıcının ulaşabileceğinden çok uzaksa model o deneysel kısıtlamayla uyumlu değildir.

Modelleme için iki RRT örneklemesi ve bir BioEmu örneklemesi kullanılmıştır. Bu üç yaklaşım sırasıyla yaklaşık 10.315, 10.404 ve 9.461 farklı FHL2 konformasyonu üretmiştir. Böylece yaklaşık 30 bin farklı yapısal olasılık değerlendirilmiştir.

Modeller SAXS eğrisine uyum ve XL-MS kısıtlamalarını karşılama derecelerine göre puanlanmıştır. Bütünleştirilmiş puanı 0,887 veya üzerinde olan 104 topluluk seçilmiş, daha sonra yapısal benzerliklerine göre 28 farklı topluluğa ve son aşamada beş ana aileye ayrılmıştır.

Beş yapısal aile ne gösterdi?

Şekil 4’te bir, iki, dört, on dört ve yirmi beş numaralı liderlerin temsil ettiği beş topluluk ailesi gösterilmiştir. Bu ailelerin SAXS uyumlarındaki χ² değerleri 2,302 ile 2,512 arasında değişmiştir. Bu değerler, tek uzatılmış AlphaFold modelinin 15,231’lik değerine göre çok daha iyi uyumu göstermektedir.

Her bir topluluk, 46 XL-MS çapraz bağının yüzde 57,4–69,6’sını aynı anda karşılamıştır. Tek bir topluluğun bütün çapraz bağları karşılayamaması, proteinin sürekli hareket eden yapısıyla uyumludur. Farklı topluluklar birlikte değerlendirildiğinde 46 çapraz bağın 43’ü en az bir topluluk tarafından karşılanmıştır. Yalnızca yaklaşık yüzde 6’lık bölüm açıklanamamıştır.

Modeller R_g değerlerine göre üç gruba ayrılmıştır:

• Bükülmüş konformasyon: R_g, AlphaFold modelinin yüzde 75’inden küçük; yaklaşık 38,0 Å’nin altında.
• Uzatılmış konformasyon: R_g, AlphaFold modelinin yüzde 90’ından büyük; yaklaşık 45,6 Å’nin üzerinde.
• Ara konformasyon: Bu iki sınır arasında kalan yapılar.

Beş topluluk ailesine göre dağılımlar şu aralıklarda bulunmuştur:

• Uzatılmış konformasyonlar: %35–57,
• Kompakt ve bükülmüş konformasyonlar: %11–34,
• Ara konformasyonlar: %12–54.

Bu sonuç, FHL2’nin zamanın yaklaşık yarısında uzatılmış biçimler alabilmesine rağmen yalnızca düz ve sert bir çubuk olmadığını göstermektedir. Moleküllerin anlamlı bir bölümü kendi üzerine doğru bükülebilmektedir.

Esneklik FHL2’nin işlevi için neden önemli olabilir?

FHL2’yi farklı bağlantı noktalarına sahip esnek bir moleküler kol olarak düşünmek mümkündür. Sert bir çubuk yalnızca belirli geometrilere sahip proteinlere bağlanabilir. Esnek bir protein ise alanları arasındaki açıları değiştirerek farklı büyüklükteki ve farklı konumdaki ortaklara uyum sağlayabilir.

FHL2’nin dört tam ve bir yarım LIM alanı, farklı proteinleri aynı anda tutabilecek çoklu etkileşim yüzeyleri oluşturabilir. Alanlar arasındaki kısa bağlayıcılar proteine sınırsız değil, kontrollü bir esneklik sağlamaktadır. Bu özellik:

• Birden fazla proteinin aynı kompleks içinde bir araya getirilmesini,
• Farklı sinyal yollarında farklı bağlanma düzenlerinin kurulmasını,
• Bağlanma sırasında proteinin daha düzenli bir yapıya geçmesini,
• Uzak bölgeler arasında geçici temasların oluşmasını sağlayabilir.

Ancak çalışma, belirli bir konformasyonun belirli bir hücresel işlevi doğrudan gerçekleştirdiğini göstermemiştir. Esnekliğin iskele işlevini kolaylaştırdığı yorumu deneysel verilerle uyumlu bir mekanistik açıklamadır.

FHL2 ile β-katenin arasındaki doğrudan etkileşim nasıl gösterildi?

İlk olarak FHL2 ve β-katenin ayrı ayrı ve karışım hâlinde boyut dışlama kromatografisine uygulanmıştır. İki protein birlikte verildiğinde daha düşük elüsyon hacminde yeni bir pik ortaya çıkmış, ayrı proteinlere ait piklerin büyüklüğü azalmıştır.

Boyut dışlama kromatografisinde büyük moleküler kompleksler kolondan daha erken çıkar. Bu nedenle yeni pikin düşük elüsyon hacminde ortaya çıkması, FHL2 ile β-kateninin daha büyük bir kompleks oluşturduğunu göstermektedir.

Yeni pikten alınan fraksiyonların SDS-PAGE analizinde hem β-katenin hem de FHL2 bantları görülmüştür. Bu sonuç iki proteinin aynı kromatografi fraksiyonunda birlikte bulunduğunu ve kararlı bir kompleks oluşturduğunu doğrulamıştır.

Beklenmedik 2:1 stokiyometri nasıl belirlendi?

SEC-SLS yöntemi, kromatografi pikinden geçen moleküllerin ışığı saçma özelliklerini kullanarak moleküler kütleyi doğrudan tahmin eder. Çalışmada ölçülen ve teorik değerler şu şekildedir:

Bir FHL2 ve bir β-kateninden oluşan 1:1 kompleksin teorik kütlesi 117,7 kDa’dır. Ölçülen 140,2 kDa değeri bu değerden belirgin biçimde yüksektir. Buna karşılık iki FHL2 ve bir β-katenin için beklenen 149,8 kDa değerine daha yakındır.

Bu nedenle kompleksin baskın yapısının:

\[ 2\,\mathrm{FHL2}+1\,\beta\text{-katenin} \]

olduğu sonucuna varılmıştır. Bu gösterim bir kimyasal reaksiyon denklemi değil, kompleksin moleküler bileşimini ifade eden stokiyometrik bir gösterimdir.

Protein oranı değişince kompleks neden değişti?

FHL2 ve β-katenin konsantrasyonları değiştirildiğinde ölçülen kompleks kütlesi de değişmiştir:

• 4 mg/mL FHL2 + 4 mg/mL β-katenin: 140,2 kDa; 2:1 kompleksle uyumlu.
• 4 mg/mL FHL2 + 1 mg/mL β-katenin: 113,9 kDa; yaklaşık 1:1 kompleksle uyumlu.
• 2 mg/mL FHL2 + 2 mg/mL β-katenin: Pik boyunca yaklaşık 125–135 kDa arasında değişen kütle; 1:1 ve 2:1 düzenleri arasında heterojen bir topluluk.

Bu bulgu, 2:1 kompleksin oluşumunun proteinlerin mutlak konsantrasyonuna ve birbirlerine göre oranlarına bağlı olabileceğini göstermektedir. Kompleks, bütün koşullarda değişmez tek bir yapı olarak bulunmamıştır.

ITC bağlanma gücünü ve oranını nasıl doğruladı?

İzotermal titrasyon kalorimetrisi, iki molekül bağlandığında açığa çıkan veya alınan ısıyı ölçer. Araştırmacılar 276 µM FHL2’yi 13,8 µM β-katenin içeren hücreye titre etmiş ve bağlanma eğrisini tek tip bağlanma bölgeleri modeliyle değerlendirmiştir.

ITC sonuçları:

Bağlanmanın termodinamiği ne anlatıyor?

Çalışmadaki termodinamik değerlerin ilişkisini açıklamak için temel serbest enerji eşitliği kullanılabilir:

\[ \Delta G=\Delta H-T\Delta S \]

Burada:

• ΔG, toplam Gibbs serbest enerji değişimini,
• ΔH, moleküller arası bağlar ve temaslarla ilişkili entalpi değişimini,
• T, mutlak sıcaklığı,
• ΔS, sistemin düzensizlik ve hareket özgürlüğündeki değişimi ifade eder.

Çalışma sonuçları −TΔS değerini 22,8 kcal/mol olarak vermektedir. Bu gösterim kullanıldığında ilişki şu şekilde okunabilir:

\[ \Delta G=\Delta H+(-T\Delta S) \]

\[ \Delta G\approx-31{,}4+22{,}8=-8{,}6\ \mathrm{kcal/mol} \]

Bu değer bildirilen −8,57 kcal/mol sonucuyla uyumludur. Güçlü negatif ΔH, FHL2 ile β-katenin arasında çok sayıda elverişli moleküller arası temas oluştuğunu düşündürür. Pozitif −TΔS ise bağlanma sırasında proteinlerin hareket ve konformasyon özgürlüğünün azaldığını gösterir.

Esnek FHL2’nin β-katenine bağlandığında belirli konformasyonlara kısıtlanması, entropik maliyetin olası açıklamalarından biridir. β-kateninin düzensiz N- ve C-uç bölgelerinin de kompleks oluşurken daha düzenli hâle gelmesi mümkündür. Ancak çalışma, bağlanma sonrası atomik yapıyı çözmediği için hangi bölgelerin düzenlendiğini doğrudan göstermemiştir.

Neden tek bağlanma olayı görülürken oran 2:1 çıktı?

ITC eğrisi yaklaşık iki FHL2’nin bağlandığını göstermesine rağmen iki ayrı termodinamik geçiş yerine tek baskın bağlanma olayı göstermiştir. Araştırmacılar bunu, β-katenindeki iki FHL2 bağlanma bölgesinin benzer bağlanma enerjilerine sahip olabileceğiyle açıklamaktadır.

Başka bir olasılık, ilk FHL2’nin bağlanmasının ikinci FHL2’nin bağlanmasını kolaylaştırması veya kompleks içinde FHL2-FHL2 temasının oluşmasıdır. Çalışma bu seçenekleri birbirinden ayırmamıştır.

2:1 kompleks için iki temel model gündeme getirilmiştir:

• β-katenin üzerinde aynı anda iki ayrı FHL2 molekülünü tutan birden fazla bağlanma yüzeyi bulunması,
• Bir FHL2 bağlandıktan sonra ikinci FHL2’nin kompleks içinde birinci FHL2 ile ilişki kurması.

FHL2’nin tek başına konsantrasyona bağlı oligomerleşme göstermemesi, ikinci olasılığın ancak β-katenin tarafından oluşturulan kompleks ortamında gerçekleşebileceğini düşündürmektedir.

Önceki 1:1 sonucu ile bu çalışmanın 2:1 sonucu neden farklı olabilir?

Daha önceki bir ITC çalışmasında FHL2 ile β-katenin için 1:1 stokiyometri ve 1,08 µM K_d bildirilmiştir. Ancak o deneyde:

• β-kateninin tam uzunluğu yerine 138–781 amino asitlik kesilmiş bir yapısı,
• Etiketsiz FHL2 yerine MBP-FHL2 füzyonu kullanılmıştır.

β-kateninin çıkarılmış N-uç bölgesi ikinci bir bağlanma yüzeyine katkı sağlıyor olabilir. Benzer biçimde büyük MBP etiketi, FHL2’nin bükülmesini veya ikinci FHL2 molekülünün komplekse yaklaşmasını sterik olarak engellemiş olabilir.

Mevcut çalışma tam uzunlukta β-katenin ve etiketsiz tam uzunlukta FHL2 kullanarak daha doğal benzeri bir deney düzeni kurmuştur. Bununla birlikte bu sonuç da saflaştırılmış proteinlerin kullanıldığı in vitro bir sistemden elde edilmiştir; hücre içindeki stokiyometri ayrıca doğrulanmalıdır.

Şekil 1 ne anlatıyor?

Şekil 1’in sol bölümü farklı füzyon etiketlerinin FHL2 üretimine etkisini göstermektedir. Western blot bantları ve bunlardan hesaplanan çubuk grafikler, sfGFP’nin hem toplam ifade hem de çözünür fraksiyon açısından açık ara en iyi sonucu verdiğini göstermektedir.

Şeklin sağ bölümü ZnCl₂ optimizasyonunu göstermektedir. Çinko arttıkça çözünür sfGFP-FHL2 miktarı yükselmiş, ancak OD₆₀₀ ile ölçülen bakteri büyümesi azalmıştır. Litre başına çözünür protein miktarı açısından 250 ve 500 µM düzeyleri en yüksek verimi sağlamıştır.

Şekil 2 ne anlatıyor?

Şekil 2A’daki CD eğrisi ve ikincil yapı tablosu, saflaştırılmış FHL2’nin beklenen genel yapısal içeriğe sahip olduğunu göstermektedir. Şekil 2B’de farklı FHL2 konsantrasyonlarındaki SEC-SLS eğrileri aynı ana elüsyon hacminde toplanmakta ve ölçülen moleküler kütle monomerle uyumlu kalmaktadır.

Bu şekil, üretim yönteminin yalnızca çözünür protein üretmediğini; elde edilen proteinin katlanmış ve yüksek konsantrasyonlarda belirgin agregasyon göstermeyen bir örnek olduğunu desteklemektedir.

Şekil 3 ne anlatıyor?

Şekil 3A’daki Kratky grafiği FHL2’nin esnekliğini BSA ile karşılaştırmaktadır. Şekil 3B uzatılmış AlphaFold modelini ve LIM alanlarının yaklaşık boyutlarını gösterir. Şekil 3C’de bu tek modelin deneysel SAXS verisine iyi uymadığı görülmektedir.

Şekil 3D’deki çiftler arası uzaklık dağılımı 22,5 Å civarında tepe yapmakta ve 137 Å’ye kadar uzanmaktadır. Bu, tek tek LIM alanlarının kompakt olmasına rağmen bütün proteinin uzatılmış ve bükülebilir bir düzen oluşturduğunu göstermektedir.

Şekil 4 ve Şekil 5 ne anlatıyor?

Şekil 4, SAXS ve XL-MS verilerine birlikte uyan beş farklı konformasyon topluluğu ailesini gösterir. Her satırda SAXS uyumu, karşılanan çapraz bağlar ve o toplulukta bulunan temsilci yapılar birlikte verilmiştir.

Modellerin hiçbirinde yalnızca tek bir protein biçimi baskın değildir. Aynı topluluk içinde düz, kısmen bükülmüş ve belirgin şekilde kompaktlaşmış modeller bir arada bulunmaktadır.

Şekil 5, her topluluk ailesindeki uzatılmış, ara ve bükülmüş durumların yüzdesini toplu olarak göstermektedir. Beş ailenin tamamında bükülmüş konformasyon bulunması, kompakt biçimlerin yalnızca modelleme sırasında ortaya çıkan istisnai yapılar olmadığını göstermektedir.

Şekil 6 ne anlatıyor?

Şekil 6A’da FHL2 ile β-katenin birlikte verildiğinde yeni bir kromatografi piki oluşmaktadır. Altındaki jel, yeni pik içinde iki proteinin de bulunduğunu doğrulamaktadır.

Şekil 6B’de kompleksin 140,2 kDa olarak ölçülen moleküler kütlesi, iki FHL2 ve bir β-katenin için hesaplanan 149,8 kDa değerle karşılaştırılmıştır.

Şekil 6C, her FHL2 enjeksiyonunda ortaya çıkan ısı akışı piklerini gösteren ITC termogramıdır. Şekil 6D’de entegre edilen ısı değerleri molar oranla karşılaştırılmış ve n = 2,040, K_d = 530 nM sonucu elde edilmiştir.

Çalışmanın geçmiş, bugün ve gelecek açısından önemi

Geçmiş açısından çalışma, tam uzunluktaki FHL2’nin yapısal analizini sınırlayan üretim sorununa çözüm sunmaktadır. Önceki araştırmalar çoğunlukla büyük füzyon etiketleri taşıyan veya çok düşük miktarlarda elde edilen FHL2 örnekleriyle yürütülmüştür.

Bugün açısından araştırma, FHL2’nin çözeltide monomerik fakat yüksek derecede esnek bir protein olduğunu deneysel olarak göstermektedir. Böylece FHL2’nin yalnızca alanların doğrusal biçimde sıralandığı sert bir yapı olarak çizilmesinin yetersiz olduğu ortaya konulmuştur.

Çalışma aynı zamanda tam uzunlukta ve etiketsiz proteinler kullanıldığında β-katenin ile 2:1 kompleks oluşabildiğini göstermektedir. Bu sonuç, Wnt/β-katenin sinyal komplekslerinde daha önce dikkate alınmamış çok değerli bir bağlanma düzeni bulunabileceğini düşündürmektedir.

Gelecek açısından FHL2 ile β-katenin arasındaki kesin temas bölgelerinin belirlenmesi gerekmektedir. Bunun için kriyo-elektron mikroskobu, NMR, yeni XL-MS deneyleri, hidrojen-döteryum değişimi, mutasyon analizi ve hücre içi görüntüleme yöntemleri kullanılabilir.

Ayrıca iki FHL2 molekülünün:

• β-kateninin aynı yüzeyindeki iki bölgeye mi,
• Birbirinden uzak iki bölgeye mi,
• Birbirleriyle temas ederek mi,
• Sıralı veya eş zamanlı biçimde mi bağlandığı belirlenmelidir.

Benzer yapısal çalışmalar FHL2’nin PI3K/AKT/mTOR, MAPK/ERK ve TGF-β gibi diğer sinyal yollarındaki kompleksleri için de uygulanabilir.

Gündelik yaşam ve sağlık açısından anlamı

Bu çalışma doğrudan bir ilaç, tanı testi veya tedavi geliştirmemiştir. Günlük yaşam açısından hemen uygulanabilecek bir sonuç sunmamaktadır. Önemi daha temel düzeydedir: Hücre içinde kanser, kalp hastalıkları ve doku yanıtlarıyla ilişkilendirilen bir düzenleyici proteinin nasıl şekil değiştirdiğini ve önemli bir sinyal proteiniyle hangi oranda birleştiğini açıklamaktadır.

Hastalıklara yönelik hedefli tedaviler geliştirilebilmesi için yalnızca bir proteinin miktarını değil, hangi moleküler ortakla hangi yüzeyden ve hangi stokiyometriyle bağlandığını bilmek gerekir. Bu çalışma gelecekte FHL2-β-katenin etkileşimini hedefleyecek araştırmalar için gerekli yapısal temelin bir bölümünü sağlamaktadır.

Bununla birlikte 2:1 kompleksin bozulmasının kanseri yavaşlatacağı, FHL2’nin engellenmesinin güvenli olduğu veya bu etkileşimin hastalarda tedavi hedefi olarak kullanılabileceği gösterilmemiştir.

Çalışmanın güçlü yönleri

• Tam uzunlukta ve son aşamada etiketsiz FHL2 miligram ölçeğinde üretilmiştir.
• Farklı füzyon etiketleri deneysel olarak karşılaştırılmıştır.
• Çinko desteğinin çözünürlük ve bakteri büyümesi üzerindeki karşıt etkileri birlikte değerlendirilmiştir.
• Saflaştırılmış proteinin katlanması CD ile kontrol edilmiştir.
• Oligomerik durum SEC-SLS ile farklı konsantrasyonlarda incelenmiştir.
• Esneklik SEC-SAXS ile doğrudan deneysel olarak değerlendirilmiştir.
• SAXS verileri XL-MS kısıtlamalarıyla bütünleştirilmiştir.
• On binlerce konformasyon değerlendirilerek tek yapılı yorumdan kaçınılmıştır.
• FHL2-β-katenin etkileşimi SEC, SDS-PAGE, SEC-SLS ve ITC gibi tamamlayıcı yöntemlerle doğrulanmıştır.
• Stokiyometri iki bağımsız nicel yöntemle 2:1 olarak desteklenmiştir.
• SAXS, proteomik ve modelleme verilerinin önemli bölümü açık veri depolarına aktarılmıştır.

Çalışmanın sınırlılıkları

• Çalışma hakem değerlendirmesinden geçmemiş bir preprinttir.
• Deneyler saflaştırılmış rekombinant proteinlerle in vitro ortamda yapılmıştır.
• 2:1 stokiyometri canlı hücrelerde doğrudan görüntülenmemiştir.
• FHL2 ile β-kateninin kesin bağlanma yüzeyleri haritalanmamıştır.
• İki FHL2 molekülünün aynı veya farklı bağlanma mekanizmalarıyla komplekse katılıp katılmadığı bilinmemektedir.
• SAXS düşük çözünürlüklü genel şekil bilgisi verir; atomik yapı sağlamaz.
• Bütünleştirici modelleme tek bir benzersiz yapı değil, deneysel verilerle uyumlu olası yapılar üretmektedir.
• Tek tek topluluklar XL-MS çapraz bağlarının yalnızca yüzde 57,4–69,6’sını aynı anda karşılamıştır.
• sfGFP çıkarılırken yaklaşık yüzde 50 protein kaybı yaşanması, üretim sürecinde proteinin bir bölümünün kararsız kaldığını göstermektedir.
• Proteinlerin bakterilerde üretilmesi, insan hücrelerindeki post-translasyonel değişikliklerin bulunmadığı anlamına gelir.
• Fosforilasyon veya diğer hücresel değişikliklerin stokiyometriyi nasıl etkilediği incelenmemiştir.
• Çalışma hücresel Wnt hedef genlerini, tümör büyümesini veya tedavi yanıtını ölçmemiştir.

Preprint metninde bazı biçimsel raporlama sorunları da bulunmaktadır. Çok sayıda yerde “Error! Reference source not found.” ifadesi kalmış, ek veriye ait DOI alanı tamamlanmamış ve bazı yöntem listelerinde tekrar veya tutarsız yazılmış konsantrasyonlar bulunmaktadır. Şekil 1 açıklamasında anlamlılık eşikleri “* p ≤ 0,5; ** p ≤ 0,1; *** p ≤ 0,001” biçiminde verilmiştir. İlk iki eşik bilimsel yayınlarda sık kullanılan sınırlarla uyumlu görünmediğinden, bu değerler preprintin sonraki sürümünde doğrulanması gereken raporlama ayrıntılarıdır. Burada çalışma düzeltilmemiş, metinde bildirilen durum aynen dikkate alınmıştır.

Çalışma ne söylüyor?

• sfGFP füzyonu ve uygun çinko desteği, bakterilerde çözünür FHL2 üretimini güçlü biçimde artırmıştır.
• Tam uzunluktaki etiketsiz FHL2 miligram ölçeğinde saflaştırılabilmiştir.
• Saflaştırılmış FHL2’nin ikincil yapısı beklenen modelle uyumludur.
• FHL2 çözeltide ağırlıklı olarak monomerdir.
• FHL2 sert ve tamamen uzatılmış bir protein değildir.
• Protein uzatılmış, ara ve kompakt biçimde bükülmüş konformasyonlar arasında dağılım göstermektedir.
• FHL2 ile β-katenin doğrudan ve mikromoların altında bir afiniteyle bağlanmaktadır.
• Tam uzunluktaki etiketsiz proteinlerle kompleksin baskın stokiyometrisi 2 FHL2:1 β-katenindir.
• Bağlanma elverişli moleküller arası temaslarla yönlendirilmekte, ancak konformasyon özgürlüğü kaybı oluşturmaktadır.

Çalışma ne söylemiyor?

• 2:1 kompleksin bütün hücre tiplerinde zorunlu olarak oluştuğunu göstermemektedir.
• İki FHL2’nin β-katenin üzerindeki kesin bağlanma konumlarını belirlememektedir.
• Kompleksin atomik çözünürlüklü yapısını sunmamaktadır.
• FHL2’nin bütün kanserlerde onkogen veya bütün kanserlerde tümör baskılayıcı olduğunu göstermemektedir.
• FHL2-β-katenin etkileşiminin engellenmesinin tedavi sağlayacağını göstermemektedir.
• Herhangi bir ilaç adayını, güvenlik profilini veya klinik sonucu değerlendirmemektedir.
• Hastalarda tanısal veya prognostik doğrulama sunmamaktadır.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Deneysel çalışma akışı

Protein üretim koşulları

• Konak hücre: E. coli BL21(DE3).
• Büyütme ortamı: LB.
• FHL2 indüksiyonu: 0,25 mM IPTG.
• β-katenin indüksiyonu: 1 mM IPTG.
• Büyük ölçekli FHL2 üretiminde ZnCl₂: 250 µM.
• İndüksiyon sonrası sıcaklık: 18°C.
• İndüksiyon süresi: Gece boyunca.
• FHL2 ve sfGFP arasındaki TEV kesim dizisi: ENLYFQ↓G.

SAXS ölçüm koşulları

• FHL2 örnek konsantrasyonu: 7,5 mg/mL.
• Enjeksiyon hacmi: 100 µL.
• Kolon: Superdex 200 Increase 10/300 GL.
• Akış hızı: 0,7 mL/dakika.
• Işın hattı: PETRA III, P12, DESY Hamburg.
• X-ışını enerjisi: 9 keV.
• Analiz paketi: ATSAS 4.1.0.
• Düşük açılı, 0,01 Å⁻¹ altındaki veriler deneysel artefakt riski nedeniyle çıkarılmıştır.

XL-MS ve modelleme ayrıntıları

• FHL2 konsantrasyonu: 23,36 µM.
• BS3 çapraz bağlayıcı konsantrasyonu: 697 µM.
• Çapraz bağlama: 25°C’de 10 dakika.
• Reaksiyon durdurma: 100 mM Tris-HCl, pH 8,0.
• Protein sindirimi: Tripsin.
• Kütle spektrometresi: Orbitrap Fusion Lumos.
• Modellemede kullanılan alanlar arası lizin çapraz bağları: 46.
• En iyi topluluk seçim eşiği: Bütünleştirilmiş puan ≥ 0,887.
• Seçilen topluluk sayısı: 104.
• Yapısal sadeleştirmeden sonraki farklı topluluk sayısı: 28.
• Nihai topluluk ailesi sayısı: 5.

Temel nicel sonuçlar

Verilerin toplu teknik yorumu

• FHL2 üretimindeki temel sınırlama, proteinin çinko bağımlı katlanması ve agregasyona eğilimidir.
• sfGFP üretim sırasında çözünürlüğü artıran en etkili füzyon ortağı olmuştur.
• Çinko desteği doğru katlanmayı kolaylaştırmış, ancak yüksek konsantrasyonda bakteriyel büyümeyi baskılamıştır.
• Saflaştırılmış FHL2’nin monomerik, katlanmış ve konsantre edilebilir olduğu gösterilmiştir.
• SAXS sonuçları tek bir uzatılmış yapının deneysel veriyi açıklayamadığını göstermiştir.
• XL-MS destekli modelleme, FHL2’nin birden fazla yapısal durum arasında hareket ettiğini göstermiştir.
• FHL2’nin doğal oligomerleşme eğilimi görülmemesine rağmen β-katenin kompleksinde iki FHL2 bulunabilmektedir.
• Bağlanma oranı protein konsantrasyonu ve karışım oranından etkilenmektedir.
• 2:1 stokiyometri hem moleküler kütle ölçümü hem de kalorimetriyle desteklenmiştir.
• Kompleksin kesin moleküler geometrisi henüz belirlenmemiştir.

Kaynak ve Yöntem Notu

Bu içerik, Tina Logonder, Uroš Prešern ve Aljaž Gaber tarafından hazırlanan “FHL2 production enabled new insight into its flexibility and unexpected binding stoichiometry with β-catenin” başlıklı çalışmaya dayanmaktadır.

Çalışma, Ljubljana Üniversitesi Kimya ve Kimya Teknolojisi Fakültesinde gerçekleştirilen deneysel bir preprint araştırma makalesidir. Metinde açıkça “This preprint research paper has not been peer reviewed” uyarısı bulunmaktadır. Bu nedenle çalışma hakem değerlendirmesinden geçmemiştir. PDF’de makalenin bir dergi tarafından kabul edildiğine veya hakemli sürümünün yayımlandığına ilişkin bilgi verilmemektedir.

Araştırma klinik çalışma değildir. Hasta grubu, tedavi kolu, tümör yanıtı veya klinik güvenlik değerlendirmesi bulunmamaktadır. Çalışma; bakterilerde üretilen rekombinant FHL2 ve β-katenin proteinleri üzerinde yapılan in vitro protein üretimi, saflaştırma, biyofiziksel ölçüm, kütle spektrometrisi ve hesaplamalı bütünleştirici modellemeye dayanmaktadır.

SAXS verilerinin Small Angle Scattering Biological Data Bank’a SASDZ36 erişim koduyla aktarıldığı belirtilmiştir. Kütle spektrometrisi verileri PRIDE/ProteomeXchange sistemine PXD078621 veri kümesi olarak yüklenmiştir. Bütünleştirici modelleme verileri ile bazı şekil verileri Zenodo üzerinde 10.5281/zenodo.19680353 DOI’siyle paylaşılmıştır. Bu DOI araştırma verilerine aittir; makalenin hakemli yayımlanmış sürümünü ifade etmemektedir.

Araştırma Slovenya Araştırma ve İnovasyon Ajansı tarafından PS-0140 numaralı destekle finanse edilmiştir. Yazarlar bilinen bir mali çıkar çatışması veya kişisel çıkar ilişkisi bulunmadığını bildirmiştir.

Metinde, analiz kodunun yazılmasına yardımcı olmak amacıyla ChatGPT kullanıldığı; araştırmacıların oluşturulan içeriği gözden geçirip düzenlediği ve makalenin sorumluluğunu üstlendiği açıklanmıştır.

Bu Türkçe makale yalnızca yüklenen çalışmada sunulan yöntemlere, sayısal verilere, şekillere, sonuçlara ve yazarların tartışmasına dayanarak hazırlanmıştır. PDF’de bulunmayan klinik etki, tanı başarısı, ilaç etkinliği, tedavi garantisi, ticari uygulanabilirlik veya hasta yararı iddiaları eklenmemiştir.

Çalışmanın temel bilimsel katkısı, tam uzunluktaki etiketsiz FHL2’nin yeterli miktarda üretilebildiğini, çözeltide esnek bir konformasyon topluluğu oluşturduğunu ve tam uzunluktaki β-kateninle 2:1 oranında kompleks kurabildiğini göstermesidir. Bağlanma yüzeylerinin, hücre içi stokiyometrinin ve biyolojik sonuçların belirlenmesi için yeni deneyler gerekmektedir.