Enzim bağlantılı immünosorbent analizleri, yani ELISA sistemleri, belirli proteinlerin antikorlar aracılığıyla seçici biçimde tanınmasına ve oluşan sinyalin renk değişimi üzerinden ölçülmesine dayanır. Bu sistemlerde renk sinyalinin gücü büyük ölçüde kullanılan enzimin katalitik etkinliğine ve kararlılığına bağlıdır. Ancak doğal enzimler sıcaklık, pH ve iyonik ortam gibi değişkenlerden etkilenebilir.

Dan Li ve çalışma arkadaşları, doğal enzim yerine yapay enzim gibi davranan bir metal-organik kafes nanozimi kullanarak alfa-fetoprotein, yani AFP için kolorimetrik bir immünosensör geliştirmiştir. Araştırmanın merkezinde bakır iyonları ile 4,4’-bipiridinden oluşan CuBPY adlı metal-organik kafes ve bu yapının yüzeyine bağlanan neokuproin ligandı bulunmaktadır.

CuBPY, 4-aminofenil-β-D-galaktopiranozit adlı substratın hidrolizini katalizleyen β-D-galaktosidaz benzeri bir hidrolaz etkinliği göstermiştir. Ancak özgün CuBPY’nin katalitik etkinliği uygulama açısından sınırlıdır. Araştırmacılar bu etkinliği artırmak için 2,9-dimetil-1,10-fenantrolin, yani neokuproin kullanan bir yüzey ligand mühendisliği stratejisi önermiştir.

Neokuproin sistemde iki farklı görev üstlenmektedir. İlk olarak CuBPY üzerindeki bakır merkezleriyle koordinasyon kurarak substrat hidrolizini hızlandırmaktadır. İkinci olarak reaksiyon sırasında oluşan Cu(I) iyonlarıyla parlak sarı renkli bir kompleks meydana getirerek doğrudan kolorimetrik sinyal üretmektedir.

Çalışmada neokuproin desteğinin CuBPY’nin PAPG hidrolizine yönelik katalitik kapasitesini yaklaşık 1,8 kat artırdığı bildirilmiştir. Bununla birlikte bu artış ayrıntılı Michaelis–Menten kinetiği, dönüşüm sayısı veya özgül aktivite değerleriyle değil, oluşan renkli ürünün absorbansındaki değişim üzerinden değerlendirilmiştir.

AFP’yi tanıyan antikor, CuBPY sentezi sırasında tek aşamalı biyomineralizasyon yoluyla yapıya dahil edilmiştir. Elde edilen anti-AFP@CuBPY bileşiği aynı anda antikor taşıyıcısı, katalitik nanozim, renk sinyali üreticisi ve sinyal yükseltici olarak kullanılmıştır.

İmmünosensör, klasik sandviç ELISA’ya benzer bir düzende kurulmuştur. Mikroplaka yüzeyindeki yakalama antikoru önce AFP’yi bağlamış, ardından anti-AFP@CuBPY bu antijen kompleksine tutunmuştur. Sistemde ne kadar fazla AFP bulunuyorsa plaka üzerinde o kadar fazla CuBPY tutulmuş ve sonraki renk reaksiyonunda daha güçlü sarı sinyal oluşmuştur.

Optimize edilen deney koşullarında PAPG ve neokuproin derişimleri 20 mM, reaksiyon pH’sı 7,0 ve renk geliştirme süresi 10 dakika olarak seçilmiştir. CuBPY’ye yüklenen anti-AFP antikor miktarı 100 µg, mikroplakaya kaplanan yakalama antikoru derişimi 10 µg/mL ve bloke edici BSA derişimi yüzde 1 olarak belirlenmiştir.

Geliştirilen sistemde AFP için 5–1000 ng/mL arasında doğrusal yanıt bildirilmiştir. Kalibrasyon denklemi Y = 0,00005X + 0,02610, belirleme katsayısı ise R² = 0,994’tür. Sinyal-gürültü oranının 3 olduğu ölçüt üzerinden hesaplanan algılama sınırı 5 ng/mL olarak verilmiştir.

Seçicilik deneylerinde AFP’ye karşı oluşan absorbans sinyali; BSA, yaban turpu peroksidazı, glikoz oksidaz ve alkalin fosfatazın oluşturduğu sinyallerden belirgin biçimde yüksek bulunmuştur. Bununla birlikte test edilen girişimci paneli sınırlıdır ve insan serumunda bulunabilecek bütün proteinleri, antikorları, lipitleri veya AFP ile yapısal ilişkili biyobelirteçleri kapsamamaktadır.

Pratik uygulanabilirlik deneyi için insan serumları 50 kat seyreltilmiş ve bilinen miktarlarda AFP eklenmiştir. Geri kazanım değerleri yüzde 89,1–116,4, göreli standart sapmalar ise yüzde 15,7’nin altında bulunmuştur. Bu sonuçlar sistemin serum matrisi içinde AFP sinyali üretebildiğini göstermektedir; ancak bazı koşullardaki yüzde 116,4’lük geri kazanım pozitif ölçüm sapmasına işaret etmektedir.

Çalışma gerçek hasta örneklerini, doğal AFP düzeylerini, klinik eşik değerlerini, tanısal duyarlılığı, tanısal özgüllüğü veya hastalık ayırma başarısını incelememiştir. Bu nedenle geliştirilen sistem klinik olarak doğrulanmış bir tanı testi değil, laboratuvar ölçeğinde hazırlanmış deneysel bir kolorimetrik biyosensör platformudur.

Çalışmanın temel problemi nedir?

İmmünolojik analizlerde hedef proteinin antikorla seçici olarak yakalanması kadar, bu bağlanma olayının ölçülebilir bir sinyale dönüştürülmesi de önemlidir. Klasik ELISA sistemlerinde tanıma antikoruna bağlanan doğal enzim, renksiz bir substratı renkli bir ürüne dönüştürür.

Bu yaklaşım yüksek seçicilik sağlayabilse de doğal enzimler:

• Sıcaklık değişimlerinden,
• Aşırı asidik veya bazik ortamlardan,
• İyonik güçten,
• Uzun depolama sürelerinden,
• Protein yapısını bozan kimyasal koşullardan etkilenebilir.

Araştırmanın çözmeye çalıştığı temel problem, doğal enzimlerin yerini alabilecek sağlam ve çok işlevli nanozimlerin çoğunun doğal enzimlerle karşılaştırıldığında düşük katalitik dönüşüm etkinliğine sahip olmasıdır.

Çalışmada bu sorun şu soruyla ele alınmaktadır:

Bakır tabanlı bir metal-organik kafesin yüzeyine uygun bir ligand bağlanarak hem hidrolaz benzeri katalitik etkinlik artırılabilir hem de aynı ligand doğrudan renk sinyali üretmek için kullanılabilir mi?

Nanozim nedir?

Nanozimler, doğal enzimlerin gerçekleştirdiği belirli reaksiyonları taklit edebilen yapay nanomalzemeler veya nano-yapılandırılmış katalitik sistemlerdir. Tek atomlu yapılar, karbon malzemeler, metal oksitler, metal sülfürler ve metal-organik kafesler nanozim olarak kullanılabilir.

Nanozimlerin doğal enzimlere karşı öne çıkarılan olası avantajları şunlardır:

• Daha yüksek fiziksel ve kimyasal kararlılık,
• Daha uzun saklama ömrü,
• Daha düşük üretim maliyeti olasılığı,
• Yüzey özelliklerinin değiştirilebilmesi,
• Birden fazla işlevin aynı yapı içinde birleştirilebilmesi,
• Katalitik ve optik özelliklerin ayarlanabilmesi.

Bununla birlikte “nanozim” ifadesi bir malzemenin doğal enzime her açıdan eşdeğer olduğunu göstermez. Katalitik hız, substrat özgüllüğü, biyouyumluluk ve üretim tekrarlanabilirliği her nanozim için ayrı ayrı değerlendirilmelidir.

Metal-organik kafesler neden seçildi?

Metal-organik kafesler, İngilizce adıyla metal-organic frameworks veya MOF’lar, metal iyonları ya da metal kümeleriyle organik bağlayıcıların düzenli biçimde birleşmesi sonucu oluşan gözenekli kristal yapılardır.

MOF’ların biyosensör geliştirme açısından dikkat çekici özellikleri şunlardır:

• Yüksek yüzey alanı,
• Düzenli gözenek yapısı,
• Ayarlanabilir metal merkezleri,
• Değiştirilebilir organik bağlayıcılar,
• Biyomolekülleri taşıyabilen iç ve dış yüzeyler,
• Sentez sonrası yüzey modifikasyonuna uygunluk.

Çalışmada kullanılan CuBPY yapısı bakır iyonları ile 4,4’-bipiridin bağlayıcılarından oluşturulmuştur. Bakır merkezleri yalnızca MOF iskeletinin yapısal bileşeni değildir; aynı zamanda katalitik ve kolorimetrik reaksiyonun merkezinde yer almaktadır.

Yüzey ligand mühendisliği ne anlama geliyor?

Yüzey ligand mühendisliği, bir nanoparçacığın veya gözenekli malzemenin yüzeyindeki metal merkezlerine belirli organik moleküllerin bağlanarak malzemenin kimyasal davranışının değiştirilmesidir.

Bir yüzey ligandı:

• Substratın katalitik merkeze yaklaşmasını kolaylaştırabilir,
• Yüzeyin hidrofobik veya hidrofilik karakterini değiştirebilir,
• Metal merkezinin elektron yoğunluğunu etkileyebilir,
• Elektron aktarımını hızlandırabilir,
• Katalitik ara ürünleri kararlı hâle getirebilir,
• Optik veya kolorimetrik sinyal oluşturabilir.

Bu çalışmada yüzey ligandı olarak neokuproin seçilmiştir. Neokuproin iki azot atomu üzerinden bakırla koordinasyon kurabilen çift dişli bir ligandır.

Neokuproin sistemde hangi görevleri üstleniyor?

Neokuproinin en önemli özelliği sistemde tek bir görev yerine iki tamamlayıcı görev üstlenmesidir.

1. Katalitik etkinliği artırma

Neokuproinin azot atomları CuBPY’deki Cu(II) merkezlerine bağlanmaktadır. Araştırmacılar, neokuproinin fenantrolin halkasının π–π etkileşimleri için bir merkez oluşturarak substratın katalitik yüzeye erişimini ve hidrolizini kolaylaştırdığını önermektedir.

2. Renk sinyali üretme

Reaksiyonun ilerleyen aşamasında oluşan p-aminofenol, Cu(II)’yi Cu(I)’e indirger. Neokuproin Cu(I) ile parlak sarı renkli bir kompleks oluşturur. Şemada bu ürün Cu(I)-(Nc)₂ biçiminde gösterilmektedir.

Böylece neokuproin hem reaksiyonun hızlanmasına katkıda bulunmakta hem de oluşan Cu(I) miktarını görünür sarı renge dönüştürmektedir.

Katalitik ve kolorimetrik reaksiyon nasıl ilerliyor?

Çalışmanın önerdiği reaksiyon zinciri dört temel aşamada açıklanabilir:

1. Neokuproin, CuBPY’deki Cu(II) merkezleriyle koordinasyon kurar.
2. Neokuproinle değiştirilmiş CuBPY, PAPG substratının hidrolizini katalizler.
3. PAPG’nin hidrolizi sonucunda p-aminofenol, yani PAP oluşur.
4. PAP, Cu(II)’yi Cu(I)’e indirger ve Cu(I) neokuproinle sarı renkli kompleks meydana getirir.

Reaksiyonun açıklayıcı özeti şu şekilde gösterilebilir:

\[ \mathrm{PAPG} \xrightarrow[\mathrm{Nc}]{\mathrm{CuBPY}} \mathrm{PAP} \]

Burada:

• PAPG, 4-aminofenil-β-D-galaktopiranozit substratını,
• CuBPY, hidrolaz benzeri katalitik MOF yapısını,
• Nc, neokuproini,
• PAP, p-aminofenol ürününü ifade eder.

İndirgenme ve renk oluşumu ise çalışma mantığına göre şöyle özetlenebilir:

\[ \mathrm{Cu(II)-Nc} + \mathrm{PAP} \rightarrow \mathrm{Cu(I)-(Nc)_2} + \text{sarı renkli sinyal} \]

Bu gösterim reaksiyonun çalışmada açıklanan genel yönünü anlatmaktadır. Makalede ayrıntılı stokiyometrik denklem, elektron dengesi veya bütün yan ürünler verilmemiştir.

Mekanizma doğrudan kanıtlandı mı?

Çalışmada oluşan sarı kompleksin UV-Vis absorbansı ve neokuproin varlığında katalitik sinyalin artması gösterilmiştir. Ancak önerilen mekanizmanın bütün aşamaları doğrudan spektroskopik veya kinetik yöntemlerle doğrulanmamıştır.

Örneğin çalışmada:

• Cu(II)/Cu(I) oranını doğrudan gösteren XPS analizi,
• Elektron paramanyetik rezonans ölçümü,
• Ara ürünlerin kütle spektrometrisi,
• Neokuproin yüzey kaplama yoğunluğu,
• Bağlanma sabiti,
• Ayrıntılı reaksiyon kinetiği sunulmamıştır.

Bu nedenle mekanizma, gözlenen renk değişimiyle ve literatürde bilinen bakır-neokuproin kimyasıyla uyumlu bir açıklamadır; bütün moleküler basamakları deneysel olarak kesinleştirilmiş bir reaksiyon modeli değildir.

Şema 1 ne anlatıyor?

Çalışmanın beşinci sayfasındaki Şema 1, bütün sensör sistemini tek akış içinde göstermektedir.

Şemanın üst sol bölümünde:

• 4,4’-bipiridin,
• Anti-AFP antikoru,
• Cu²⁺ iyonlarının tek aşamalı sentezde bir araya gelerek anti-AFP@CuBPY oluşturduğu gösterilmektedir.

Alt bölümde mikroplaka yüzeyine bağlı yakalama antikoru AFP’yi tutmakta, ardından anti-AFP@CuBPY kompleksi AFP’ye bağlanarak sandviç yapı oluşturmaktadır.

Şemanın sağ tarafında PAPG ve neokuproin reaksiyona eklenmekte, sarı renkli Cu(I)-(Nc)₂ kompleksi oluşmakta ve absorbans sinyali AFP derişimiyle ilişkilendirilmektedir.

Şema, sistemdeki dört temel işlevi bir araya getirmektedir:

• Antikorla seçici hedef tanıma,
• CuBPY ile kataliz,
• Neokuproinle katalitik güçlendirme,
• Cu(I)-neokuproin kompleksiyle renkli sinyal üretimi.

Anti-AFP@CuBPY nasıl sentezlendi?

Anti-AFP antikorunun CuBPY içine dahil edilmesi tek aşamalı biyomineralizasyon yöntemiyle gerçekleştirilmiştir.

Sentez adımları şöyledir:

1. 100 µg anti-AFP antikoru, yüzde 50 etanol içinde hazırlanmış 1 mL 15,6 mM 4,4’-bipiridin çözeltisine eklenmiştir.
2. Karışım homojenlik sağlamak için vortekslenmiştir.
3. 1 mL 3,9 mM CuCl₂ çözeltisi mikroinfüzyon pompasıyla 5 mL/dakika hızında karışıma verilmiştir.
4. Süspansiyon 4°C’de sürekli karıştırma altında 12 saat tutulmuştur.
5. Oluşan mavi çökelti 10.000 rpm’de 15 dakika santrifüjlenmiştir.
6. Malzeme yüzde 50 etanolle üç kez yıkanmıştır.
7. Son ürün 2,5 mL ultra saf suda dağıtılmış ve 4°C’de saklanmıştır.

Kontrol CuBPY malzemesi aynı işlemle, ancak anti-AFP antikoru eklenmeden hazırlanmıştır.

Biyomineralizasyonun avantajı nedir?

Geleneksel yaklaşımda MOF önce sentezlenebilir, ardından yüzey aktivasyonu ve kimyasal bağlama adımlarıyla antikor eklenebilir. Bu süreç çok aşamalı olabilir ve antikorun etkinliğini azaltabilecek kimyasal koşullar gerektirebilir.

Çalışmada kullanılan tek aşamalı biyomineralizasyon yaklaşımında antikor MOF oluşurken sisteme dahil edilmektedir. Bu yöntem üretim adımlarını azaltabilir ve antikor taşıyan katalitik malzemenin doğrudan elde edilmesini sağlayabilir.

Bununla birlikte çalışmada:

• Antikor yükleme verimi,
• Malzeme başına antikor miktarı,
• Antikorun yönelimi,
• Bağlanabilir epitop sayısı,
• Biyomineralizasyon sonrasında antikor afinitesi nicel olarak ölçülmemiştir.

SEM görüntüleri ve parçacık boyutu ne gösteriyor?

Şekil 1’de CuBPY ve anti-AFP@CuBPY malzemelerinin taramalı elektron mikroskobu görüntüleri sunulmaktadır. Her iki malzeme de çubuk veya kısa prizmatik plaka benzeri yapılar göstermiştir.

Çalışmada bildirilen ortalama boyutlar:

• CuBPY için yaklaşık 3140 nm,
• Anti-AFP@CuBPY için yaklaşık 2102 nm’dir.

Anti-AFP içeren yapının özgün CuBPY’den daha küçük olduğu görülmüştür. Araştırmacılar bu boyut farkının mekanizmasını ayrıntılı olarak açıklamamıştır.

Bildirilen yaklaşık 2,1–3,1 µm büyüklükler mikrometre ölçeğindedir. “Nanozim” terimi burada malzemenin yapay enzim benzeri katalitik işlevini tanımlamaktadır; SEM’de gözlenen bütün çubukların klasik anlamda 100 nm’den küçük bağımsız nanoparçacıklar olduğu gösterilmemiştir.

EDS element haritalaması ne gösterdi?

Enerji dağılımlı X-ışını spektroskopisi analizinde CuBPY ve anti-AFP@CuBPY içinde temel olarak:

• Karbon,
• Azot,
• Oksijen,
• Bakır belirlenmiştir.

Anti-AFP@CuBPY örneğinde kükürt ve oksijen sinyalinin daha yüksek olduğu bildirilmiştir. Araştırmacılar kükürdün antikor proteinindeki sistein veya metiyonin kalıntılarından kaynaklandığını düşünmektedir.

EDS haritalaması karbon, azot, oksijen, bakır ve kükürdün yapı üzerindeki dağılımını göstermiştir. Artan kükürt ve oksijen sinyali antikorun malzemeye dahil edildiğini desteklemektedir; ancak tek başına antikorun biyolojik olarak aktif yönelimde bulunduğunu kanıtlamaz.

XRD sonuçları ne anlatıyor?

CuBPY ve anti-AFP@CuBPY’nin toz X-ışını kırınım desenlerinin büyük ölçüde aynı olduğu bildirilmiştir. Bu sonuç, antikorun biyomineralizasyon sırasında yapıya dahil edilmesinin CuBPY’nin temel kristal kafesini bozmadığını düşündürmektedir.

Başka bir ifadeyle antikor eklenmesi malzemenin kimliğini tamamen farklı, amorf bir yapıya dönüştürmemiştir.

FT-IR sonuçları ne anlatıyor?

İki malzemenin FT-IR spektrumları genel olarak benzer işlevsel gruplar göstermiştir. Anti-AFP@CuBPY’de iki protein ilişkili bant güçlenmiştir:

• 1636 cm⁻¹: Amide I, başlıca C=O gerilmesi,
• 1535 cm⁻¹: Amide II, N-H bükülmesi ve C-N gerilmesi.

Bu bantların güçlenmesi, protein yapısındaki peptit bağlarının malzemede bulunduğunu desteklemektedir. EDS’deki kükürt sinyaliyle birlikte değerlendirildiğinde antikorun CuBPY yapısına immobilize edildiği yorumunu güçlendirmektedir.

Şekil 1’in bütünleşik mesajı

Şekil 1’de dört ayrı karakterizasyon katmanı birleştirilmiştir:

Neokuproin katalitik etkinliği ne kadar artırdı?

CuBPY, PAPG ile neokuproin bulunmadan da hidrolaz benzeri aktivite göstermiştir. Ancak PAPG ve neokuproin karışımı CuBPY bulunmadığında renksiz kalmıştır.

CuBPY sisteme eklendiğinde 455 nm çevresinde belirgin absorbans değişikliği ortaya çıkmıştır. Neokuproinin katalitik reaksiyon sırasında bulunması sinyali daha da artırmıştır.

Araştırmacılar neokuproin destekli CuBPY’nin özgün CuBPY’ye göre 1,8 kat daha yüksek katalitik aktivite gösterdiğini bildirmiştir.

Bu sonuç önemli olmakla birlikte çalışmada aşağıdaki kinetik değerler verilmemiştir:

• Michaelis sabiti, K_m,
• Maksimum hız, V_max,
• Katalitik dönüşüm sayısı, k_cat,
• Katalitik etkinlik, k_cat/K_m,
• Malzeme kütlesi başına özgül aktivite.

Bu nedenle 1,8 katlık değer, çalışmanın belirli PAPG, neokuproin ve reaksiyon koşullarındaki kolorimetrik absorbans karşılaştırmasını temsil etmektedir.

Antikor eklenmesi katalitik etkinliği bozdu mu?

Anti-AFP@CuBPY’nin PAPG hidrolizi için CuBPY’ye benzer katalitik kapasite gösterdiği bildirilmiştir. Bu sonuç, antikorun MOF’a dahil edilmesinin katalitik merkezleri tamamen kapatmadığını veya malzemenin hidrolaz benzeri işlevini ortadan kaldırmadığını göstermektedir.

Anti-AFP@CuBPY 90 gün saklandıktan sonra da neokuproin desteğine yanıt veren katalitik etkinlik göstermiştir. Ancak çalışma:

• Başlangıç aktivitesinin yüzde kaçının korunduğunu,
• Depolama süresince ara zaman noktalarını,
• Farklı sıcaklıklardaki stabiliteyi,
• Antikorun 90 gün sonraki bağlanma afinitesini ayrı olarak raporlamamıştır.

Şekil 2 ne anlatıyor?

Şekil 2a farklı reaksiyon karışımlarının UV-Vis spektrumlarını karşılaştırmaktadır. PAPG ile neokuproin CuBPY olmadığında belirgin sarı sinyal oluşturmamıştır. En yüksek absorbans, CuBPY, PAPG ve neokuproinin birlikte bulunduğu koşulda görülmüştür.

Şekildeki tüp fotoğrafı neokuproin bulunan reaksiyonun, bulunmayan koşula göre daha belirgin sarı renk oluşturduğunu görsel olarak göstermektedir.

Şekil 2b CuBPY, yeni hazırlanmış anti-AFP@CuBPY ve 90 gün saklanmış anti-AFP@CuBPY’nin neokuproin destekli katalitik sinyallerini karşılaştırmaktadır. Eğrilerin genel biçimi ve yaklaşık 455 nm civarındaki tepe korunmuştur.

İmmünosensör nasıl kuruldu?

Geliştirilen sistem klasik sandviç immünolojik analiz mantığına dayanmaktadır.

1. Mikroplakanın antikorla kaplanması

96 kuyulu mikroplakanın her kuyusuna 100 µL, 10 µg/mL yakalama anti-AFP antikoru eklenmiş ve plaka 4°C’de bir gece bekletilmiştir.

2. Yıkama ve bloklama

Bağlanmayan antikorlar 0,01 M PBST ile üç kez uzaklaştırılmıştır. Plakanın boş yüzeyleri 200 µL yüzde 1 BSA çözeltisiyle 37°C’de 40 dakika bloke edilmiştir.

3. AFP’nin yakalanması

Standart AFP çözeltileri veya test örneklerinden 100 µL eklenmiş ve 37°C’de 120 dakika inkübe edilmiştir.

4. Anti-AFP@CuBPY’nin bağlanması

Dört yıkama işleminden sonra kuyulara 100 µL anti-AFP@CuBPY eklenmiş ve 37°C’de 50 dakika tutulmuştur.

5. Renk reaksiyonu

Bağlanmayan nanozim uzaklaştırıldıktan sonra her kuyuya sırasıyla:

• 50 µL 20 mM PAPG,
• 50 µL 20 mM neokuproin,
• 100 µL 0,02 M, pH 7,0 amonyum asetat eklenmiştir.

On dakikalık inkübasyondan sonra UV-Vis absorbans spektrumu ölçülmüştür.

AFP derişimi neden renk yoğunluğunu artırıyor?

Mikroplakada daha fazla AFP bulunması, yakalama antikoruna daha fazla AFP bağlanması anlamına gelir. Daha fazla AFP ise daha fazla anti-AFP@CuBPY’nin kuyuda tutulmasını sağlar.

Bağlanan CuBPY miktarı arttıkça:

• Daha fazla PAPG hidroliz edilir,
• Daha fazla PAP oluşur,
• Daha fazla Cu(II), Cu(I)’e indirgenir,
• Daha fazla sarı Cu(I)-neokuproin kompleksi oluşur,
• Absorbans yükselir.

Dolayısıyla ölçülen renk doğrudan AFP’nin kendi rengi değildir. AFP, mikroplakada tutulacak nanozim miktarını belirleyen biyolojik hedef olarak görev yapmaktadır.

PAPG derişimi nasıl optimize edildi?

PAPG derişimi artırıldıkça absorbans başlangıçta hızla yükselmiş, yaklaşık 20 mM’den sonra artış büyük ölçüde yavaşlamıştır. Bu nedenle 20 mM PAPG seçilmiştir.

Bu plato, çalışma koşullarında katalitik merkezlerin veya renk oluşum basamaklarından birinin substrat bakımından doygunluğa yaklaşmasıyla uyumlu olabilir. Ancak ayrıntılı enzim kinetiği yapılmadığı için kesin doygunluk mekanizması belirlenmemiştir.

Neokuproin derişimi nasıl optimize edildi?

Neokuproin derişimi arttıkça absorbans yükselmiş ve yaklaşık 20 mM’den sonra daha sınırlı değişim göstermiştir. Çalışmada maliyet, sinyal ve kullanım kolaylığı birlikte değerlendirilerek 20 mM seçilmiştir.

pH neden 7,0 olarak seçildi?

CuBPY’nin PAPG hidrolizine yönelik katalitik sinyali pH 3’ten pH 7’ye kadar artmış, daha alkali koşullarda azalmıştır.

Bu sonuç CuBPY’nin asidik ile nötr aralıkta etkin olduğunu göstermektedir. İmmünolojik bağlanma koşullarıyla uyumluluk da dikkate alınarak pH 7,0 seçilmiştir.

pH optimizasyon grafiği ek Şekil S2’ye yönlendirilmiştir. Ana PDF’de bu ek şeklin ayrıntılı sayısal verileri verilmemektedir.

Neden 10 dakikalık reaksiyon süresi seçildi?

Reaksiyon süresi uzadıkça absorbans ilk aşamada artmış ve yaklaşık 10–15 dakikadan sonra plato eğilimine girmiştir. On dakikadan sonraki değişimin sınırlı olduğu belirtilerek optimum süre 10 dakika seçilmiştir.

On dakikalık renk geliştirme süresi, yöntemin uzun enzim inkübasyonlarına ihtiyaç duymadan sinyal üretmesini sağlayan pratik özelliklerinden biridir.

Antikor ve BSA miktarları nasıl seçildi?

CuBPY sentezinde kullanılan etiketli anti-AFP miktarı arttıkça absorbans yükselmiştir. İncelenen aralıkta en yüksek sinyal 100 µg ile elde edilmiş ve bu miktar seçilmiştir.

Mikroplakaya kaplanan yakalama antikoru derişimi 10 µg/mL’ye kadar artırıldığında absorbans yükselmiş, bu değerden sonra plato görülmüştür.

BSA derişimi arttıkça özgül olmayan yüzey bağlanması azalmış ve en uygun sonuç yüzde 1 BSA ile elde edilmiştir. Daha yüksek BSA derişimleri ek yarar sağlamamıştır.

Şekil 3 ne anlatıyor?

Şekil 3, sistemin altı temel optimizasyon değişkenini göstermektedir:

Grafiklerde çoğu parametre için sinyalin önce hızla yükseldiği, ardından plato oluşturduğu görülmektedir. Optimum değerler her durumda yalnızca mutlak maksimum sinyale göre değil, kullanım kolaylığı ve maliyet gerekçeleriyle seçilmiştir.

Kalibrasyon sonucu

Optimize edilmiş sistemde AFP derişimi yükseldikçe absorbans spektrumundaki yaklaşık 455 nm bölgesindeki sinyal artmıştır.

5–1000 ng/mL aralığında bildirilen kalibrasyon denklemi şöyledir:

\[ Y = 0{,}00005X + 0{,}02610 \]

\[ R^2 = 0{,}994 \]

Burada:

• X, AFP derişimini ng/mL cinsinden,
• Y, ölçülen absorbans değerini,
• 0,00005, kalibrasyon eğrisinin eğimini,
• 0,02610, AFP bulunmadığında veya sıfıra yaklaşıldığında tahmin edilen başlangıç sinyalini,
• R², doğrusal modelin ölçüm değişimini açıklama derecesini ifade eder.

R² = 0,994 güçlü bir doğrusal ilişki göstermektedir. Ancak çalışmada kalibrasyon artıklarının dağılımı, varyans homojenliği veya farklı konsantrasyonlarda ölçüm belirsizliği ayrıntılı olarak sunulmamıştır.

Algılama sınırı ne anlama geliyor?

Çalışmada algılama sınırı 5 ng/mL olarak bildirilmiş ve sinyal-gürültü oranı 3 ölçütü kullanılmıştır:

[ S/N = 3 ]

Bu ölçüt, analit sinyalinin arka plan gürültüsünden yaklaşık üç kat yüksek olduğu düzeyi ifade eder.

Algılama sınırının 5 ng/mL olması, yöntemin bu düzeyde AFP varlığını ayırt edebildiği anlamına gelir. Ancak miktar tayin sınırı, yani LOQ ayrı olarak bildirilmemiştir.

Ayrıca 5 ng/mL hem kalibrasyon aralığının alt sınırı hem de LOD olarak verilmiştir. Daha düşük düzeylerde çok sayıda boş örnek ve düşük konsantrasyonlu tekrarlarla yapılacak ek analiz, LOD ve LOQ’nun daha sağlam belirlenmesini sağlayabilirdi.

Şekil 4a ve 4b ne gösteriyor?

Şekil 4a’da 5 ng/mL’den 1000 ng/mL’ye kadar artan AFP derişimlerinin absorbans spektrumları gösterilmektedir. AFP derişimi arttıkça yaklaşık 450–455 nm bölgesindeki absorbans yükselmektedir.

Şekil 4b’de AFP derişimi ile absorbans arasındaki kalibrasyon doğrusu bulunmaktadır. Veri noktaları genel olarak doğrusal çizgiye yakın yerleşmiştir.

Seçicilik deneyi

Sistemin seçiciliği şu proteinlere karşı değerlendirilmiştir:

• BSA,
• Yaban turpu peroksidazı, HRP,
• Glikoz oksidaz, GOx,
• Alkalin fosfataz, ALP,
• AFP.

AFP dışındaki proteinlerin oluşturduğu absorbans değişimi düşük kalırken AFP belirgin sinyal oluşturmuştur.

Bu sonuç, sensörün anti-AFP antikoruna dayalı biyolojik tanıma işlevinin çalıştığını desteklemektedir. Seçicilik esas olarak CuBPY’nin AFP’yi kimyasal olarak ayırt etmesinden değil, antikorların AFP’ye bağlanmasından kaynaklanmaktadır.

Seçicilik deneyinin sınırları

Test edilen protein paneli yöntemin ilk seçicilik değerlendirmesi için yararlıdır. Ancak gerçek insan serumunda yüzlerce farklı protein, lipid, metabolit ve antikor bulunur.

Çalışmada şu olası girişimciler ayrıntılı olarak test edilmemiştir:

• Yüksek miktardaki serum immünoglobulinleri,
• Hemoglobin ve hemoliz etkisi,
• Bilirubin,
• Trigliserit ve lipemi,
• Heterofil antikorlar,
• Romatoid faktör,
• AFP’ye yapısal veya immünolojik yakınlık gösterebilecek proteinler.

Bu nedenle Şekil 4c sistemin sınırlı bir protein paneline karşı seçici olduğunu göstermekte, bütün klinik matris girişimlerini dışlamamaktadır.

Serum örnekleri nasıl analiz edildi?

Pratik uygulanabilirlik çalışmasında insan serumları 50 kat seyreltilmiş ve standart AFP antijeniyle zenginleştirilmiştir. Ölçüm işlemi tampon içindeki AFP standartlarıyla aynı immünosensör protokolü kullanılarak yürütülmüştür.

Her ekleme düzeyi üç kez analiz edilmiştir. Bildirilen sonuçlar:

• Geri kazanım: yüzde 89,1–116,4,
• RSD: yüzde 15,7’nin altında.

Geri kazanımın açıklayıcı matematiksel anlamı şöyledir:

\[ \text{Geri kazanım (\%)} = \frac{\text{ölçülen AFP miktarı}}{\text{eklenen AFP miktarı}} \times 100 \]

Bu formül makalede açık denklem olarak verilmemiştir; ekleme deneyinin nasıl yorumlandığını açıklamak amacıyla gösterilmiştir.

Yüzde 100’e yakın geri kazanım eklenen AFP’nin doğruya yakın ölçüldüğünü gösterir. Yüzde 116,4 gibi yüzde 100’ün üzerindeki değerler ise bazı örneklerde matris kaynaklı pozitif sapma veya ölçüm değişkenliği bulunabileceğini düşündürür.

Göreli standart sapmanın temel açıklayıcı formülü şöyledir:

\[ \mathrm{RSD}(\%) = \frac{s}{\bar{x}} \times 100 \]

• s, tekrar ölçümlerin standart sapmasını,
• \bar{x}, tekrar ölçümlerin ortalamasını ifade eder.

Yüzde 15,7’ye yaklaşabilen RSD, tampon içindeki optimize edilmiş ölçümlere kıyasla serum matrisinde daha yüksek değişkenlik bulunduğunu göstermektedir.

Şekil 4d ne anlatıyor?

Şekil 4d iki ayrı serum örneğinde 50, 500 ve 1000 ng/mL AFP ekleme düzeylerini göstermektedir.

Grafikte örneğin:

• 50 ng/mL ekleme düzeyinde yaklaşık 44,5 ve 56,9 ng/mL,
• 500 ng/mL düzeyinde yaklaşık 477,4 ve 536,2 ng/mL,
• 1000 ng/mL düzeyinde yaklaşık 1133,0 ve 1163,9 ng/mL ölçümleri gösterilmektedir.

Bu sonuçlar düşük ve orta düzeyde nominal değere yakın ölçüm yapılabildiğini; 1000 ng/mL düzeyinde ise iki serumda da pozitif sapma bulunduğunu göstermektedir.

“Gerçek serum analizi” ifadesi nasıl anlaşılmalıdır?

Çalışma insan serumu matrisi kullanmıştır; ancak ölçülen AFP doğal hasta örneklerindeki bilinmeyen AFP değildir. Serumlar 50 kat seyreltilmiş ve bilinen miktarda standart AFP eklenmiştir.

Dolayısıyla çalışma:

• Serum matrisi içinde ölçüm yapılabildiğini göstermektedir.
• Doğal hasta AFP düzeylerini doğrulamamaktadır.
• Sağlıklı ve hasta bireyleri ayırmamaktadır.
• Referans klinik laboratuvar yöntemiyle karşılaştırma yapmamaktadır.
• Tanısal duyarlılık ve özgüllük hesaplamamaktadır.

Diğer nanozim immünosensörlerle karşılaştırma

Çalışmanın Tablo 1’i farklı nanozim tabanlı immünosensörleri sentez adımı, katalitik güçlendirme yaklaşımı, renk sistemi, reaksiyon süresi, hedef, doğrusal aralık ve algılama sınırı açısından karşılaştırmaktadır.

Geliştirilen sistemin bildirilen özellikleri:

• Tek aşamalı sentez,
• Neokuproin yüzey ligand mühendisliği,
• Nc/PAPG renk sistemi,
• 10 dakikalık katalitik reaksiyon,
• 5–1000 ng/mL doğrusal aralık,
• 5 ng/mL algılama sınırıdır.

Tablodaki bazı başka sensörler daha düşük algılama sınırlarına ulaşmıştır. Örneğin AFP için verilen Ps-Pt nanoparçacık sistemi 0,004 ng/mL LOD bildirmiştir. Buna karşılık bu sistemin doğrusal aralığı 0,01–0,5 ng/mL ile daha dardır.

Bu nedenle geliştirilen CuBPY sistemi “en hassas AFP sensörü” değildir. Çalışmanın öne çıkan yönü geniş ölçüm aralığı, tek aşamalı antikor-MOF sentezi, doğal enzim gerektirmemesi ve ligandın hem katalitik hem kolorimetrik işlev üstlenmesidir.

Tablodaki sistemlerin hedefleri ve deney koşulları farklı olduğundan yöntemler arası sayısal karşılaştırmalar doğrudan performans sıralaması olarak yorumlanmamalıdır.

Çalışmanın geçmiş açısından önemi

MOF nanozimlerinin katalitik etkinliğini artırmak için metal düğüm mühendisliği, ikinci metal ekleme, aktif merkez yoğunluğunu artırma veya başka katalitik malzemelerle kompozit oluşturma gibi yaklaşımlar kullanılmıştır.

Bu yöntemlerin bir bölümü çok aşamalı sentez, kaplama, katkılama veya karmaşık yüzey kimyası gerektirebilir. Mevcut çalışma yüzey ligandının daha basit bir katalitik güçlendirme aracı olarak kullanılabileceğini göstermeyi amaçlamıştır.

Çalışmanın özgün yaklaşımı, neokuproinin yalnızca yüzey değiştirici veya renk reaktifi olarak değil, bu iki görevi aynı anda yerine getiren çift işlevli bir bileşen olarak kullanılmasıdır.

Bugün açısından önemi

Geliştirilen sistem, doğal enzim etiketinin yerine antikor taşıyan katalitik bir MOF kullanmaktadır. Bu yaklaşım immünosensör bileşenlerinin aynı malzemede bütünleştirilmesini sağlayabilir.

CuBPY platformunun dört işlevi şunlardır:

• Anti-AFP antikorunun taşınması,
• PAPG hidrolizinin katalizlenmesi,
• Bakır değerlik değişimi üzerinden sinyal oluşturulması,
• Neokuproin koordinasyonuyla sinyalin yükseltilmesi.

On dakikalık renk geliştirme süresi ve mikroplaka formatı, yöntemin laboratuvar iş akışlarına uyarlanabilmesi açısından avantaj sağlayabilir.

Gündelik yaşam ve sağlık açısından olası anlamı

Çalışmanın ana hedefi AFP adlı bir proteinin ölçülmesidir. Kolorimetrik sistemin temel avantajı, hedef derişimi arttıkça çıplak gözle de fark edilebilen sarı renk yoğunluğunun yükselmesidir.

Bu tür sistemler gelecekte:

• Daha basit optik okuyucuların kullanılmasına,
• Doğal enzimlerin saklama sorunlarının azaltılmasına,
• Çok işlevli test reaktiflerinin geliştirilmesine,
• Mikroplaka analizlerinin daha kısa renk geliştirme süresiyle yürütülmesine katkıda bulunabilir.

Ancak mevcut çalışma taşınabilir cihaz, telefon kamerasıyla okuma, ev testi, hızlı test şeridi veya hasta başı kullanım değerlendirmesi yapmamıştır.

Gelecek araştırmalarda neler yapılmalıdır?

• Neokuproinin CuBPY yüzeyine bağlanma miktarı nicel olarak belirlenmelidir.
• Cu(II)’den Cu(I)’e dönüşüm XPS veya başka değerlik duyarlı tekniklerle doğrulanmalıdır.
• PAPG hidrolizi için K_m, V_max ve katalitik etkinlik hesaplanmalıdır.
• Anti-AFP antikorunun yükleme verimi ve bağlanma afinitesi ölçülmelidir.
• Yakalama ve algılama antikorlarının klon ve epitop uyumluluğu açıklanmalıdır.
• Partikül boyutu, dağılımı ve parti-parti tekrarlanabilirliği incelenmelidir.
• LOD ve LOQ daha fazla düşük konsantrasyon tekrarıyla doğrulanmalıdır.
• Daha geniş ve klinik açıdan anlamlı girişimci paneli kullanılmalıdır.
• Hemolizli, lipemik ve ikterik serumların etkisi araştırılmalıdır.
• Doğal AFP içeren hasta serumları analiz edilmelidir.
• Sonuçlar doğrulanmış bir klinik referans yöntemiyle karşılaştırılmalıdır.
• Tanısal duyarlılık, özgüllük, ROC eğrisi ve karar eşikleri değerlendirilmelidir.
• Uzun dönem antikor etkinliği ve reaktif raf ömrü nicel olarak belirlenmelidir.

Çalışmanın güçlü yönleri

• MOF nanozim etkinliğini artırmak için basit bir yüzey ligand mühendisliği yaklaşımı önerilmiştir.
• Neokuproin hem katalitik güçlendirici hem renk geliştirici olarak kullanılmıştır.
• Antikor taşıma, kataliz, sinyal üretimi ve sinyal yükseltme aynı malzemede birleştirilmiştir.
• Anti-AFP@CuBPY tek aşamalı biyomineralizasyonla hazırlanmıştır.
• Malzeme SEM, EDS, XRD ve FT-IR ile çok yönlü olarak karakterize edilmiştir.
• Antikor yüklenmesinden sonra CuBPY’nin kristal yapısının korunduğu gösterilmiştir.
• Neokuproin desteğiyle 1,8 kat katalitik sinyal artışı bildirilmiştir.
• Anti-AFP@CuBPY’nin katalitik etkinliği 90 günlük depolamadan sonra da gözlenmiştir.
• PAPG, neokuproin, pH ve reaksiyon süresi sistematik olarak optimize edilmiştir.
• Yakalama antikoru, etiketli antikor ve BSA koşulları ayrı ayrı değerlendirilmiştir.
• 5–1000 ng/mL gibi geniş bir AFP ölçüm aralığı elde edilmiştir.
• Serum matrisi içinde ekleme-geri kazanım deneyi gerçekleştirilmiştir.
• Doğal enzim gerektirmeyen bir kolorimetrik sistem geliştirilmiştir.

Çalışmanın sınırlılıkları

• Çalışma hakem değerlendirmesinden geçmemiş bir preprinttir.
• Hasta örnekleri veya doğal klinik AFP düzeyleri değerlendirilmemiştir.
• Serumlar 50 kat seyreltilmiş ve standart AFP ile zenginleştirilmiştir.
• Geri kazanım aralığı yüzde 89,1–116,4 gibi geniş bir aralıktadır.
• Serum deneylerinde RSD yüzde 15,7’ye yaklaşabilmektedir.
• Yüksek ekleme düzeylerinde pozitif ölçüm sapması görülmüştür.
• Test edilen girişimci protein sayısı sınırlıdır.
• Hemoliz, lipemi, bilirubin ve heterofil antikor etkileri araştırılmamıştır.
• Klinik referans yöntemle karşılaştırma yapılmamıştır.
• Tanısal duyarlılık, özgüllük veya ROC analizi bulunmamaktadır.
• AFP’nin klinik karar eşikleri çalışma içinde değerlendirilmemiştir.
• LOQ bildirilmemiştir.
• LOD, kalibrasyon aralığının en düşük noktasıyla aynıdır.
• Kalibrasyon artık analizi ve konsantrasyona bağlı ölçüm belirsizliği sunulmamıştır.
• Neokuproinin yüzey kaplama miktarı belirlenmemiştir.
• Cu(II)/Cu(I) dönüşümü doğrudan değerlik analiziyle doğrulanmamıştır.
• Katalitik iyileşme ayrıntılı enzim kinetiğiyle değerlendirilmemiştir.
• Antikor yükleme verimi ve antikor yönelimi nicel olarak belirlenmemiştir.
• Yakalama ve algılama antikorlarının klon veya epitop bilgileri ana metinde verilmemiştir.
• SEM’de bildirilen yapılar yaklaşık 2–3 µm ölçeğindedir.
• Parti-parti üretim tekrarlanabilirliği raporlanmamıştır.
• Yöntem başka bir laboratuvarda bağımsız olarak doğrulanmamıştır.
• Malzeme ve cihaz ayrıntılarının bir bölümünün ek dosyada bulunduğu belirtilmiş, ancak ilgili ayrıntıların tamamı ana PDF’de sunulmamıştır.

Çalışma ne söylüyor?

• CuBPY, PAPG için hidrolaz ve β-D-galaktosidaz benzeri katalitik etkinlik göstermektedir.
• Neokuproin CuBPY’nin oluşturduğu kolorimetrik sinyali yaklaşık 1,8 kat artırmıştır.
• Neokuproin hem katalitik güçlendirici hem Cu(I) için renk geliştirici olarak işlev görmektedir.
• Anti-AFP antikoru CuBPY yapısına tek aşamalı biyomineralizasyonla dahil edilebilmiştir.
• Antikor eklenmesine rağmen CuBPY’nin kristal yapısı ve katalitik işlevi büyük ölçüde korunmuştur.
• Anti-AFP@CuBPY sandviç immünosensörde enzim işaretli antikor yerine kullanılabilmiştir.
• AFP derişimi arttıkça sarı renkli Cu(I)-neokuproin sinyali artmıştır.
• 5–1000 ng/mL aralığında doğrusal AFP yanıtı elde edilmiştir.
• Algılama sınırı 5 ng/mL olarak bildirilmiştir.
• Seyreltilmiş ve AFP eklenmiş serumlarda ölçüm gerçekleştirilebilmiştir.

Çalışma ne söylemiyor?

• Sistemin klinik olarak onaylanmış bir AFP testi olduğunu göstermemektedir.
• Hasta ve sağlıklı bireyleri ayırabildiğini göstermemektedir.
• Belirli bir hastalığın tanısını koyduğunu göstermemektedir.
• Klinik duyarlılık veya özgüllük kanıtı sunmamaktadır.
• Doğal hasta AFP düzeylerini doğrulanmış referans yöntemle karşılaştırmamaktadır.
• Neokuproin-CuBPY mekanizmasının bütün moleküler basamaklarını doğrudan kanıtlamamaktadır.
• Geliştirilen nanozimin doğal enzimlerden genel olarak daha hızlı olduğunu göstermemektedir.
• Sistemin bütün serum girişimlerine dayanıklı olduğunu göstermemektedir.
• Evde, sahada veya hasta başında kullanılmaya hazır bir ürün sunduğunu göstermemektedir.
• Ticari üretim maliyeti veya seri üretim başarısı sunmamaktadır.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Malzeme tasarımının teknik özeti

Anti-AFP@CuBPY sentez koşulları

Malzeme karakterizasyonunun özeti

İmmünosensör uygulama protokolü

Optimize edilen parametreler

Analitik performans sonuçları

Şekillerin temel mesajları

Teknik sonuçların toplu değerlendirmesi

• CuBPY, PAPG için hidrolaz benzeri katalitik merkez olarak çalışmıştır.
• Neokuproin bakır merkezleriyle koordinasyon kurarak renk sinyalini artırmıştır.
• Neokuproin varlığında yaklaşık 1,8 kat daha yüksek katalitik sinyal bildirilmiştir.
• Anti-AFP antikorunun biyomineralizasyonla eklenmesi MOF kristal yapısını belirgin biçimde bozmamıştır.
• Anti-AFP@CuBPY, CuBPY’ye yakın katalitik etkinlik göstermiştir.
• Malzemenin neokuproin destekli katalitik etkinliği 90 günlük depolamadan sonra da gözlenmiştir.
• AFP miktarı arttıkça tutulan nanozim ve oluşan sarı Cu(I)-Nc sinyali artmıştır.
• Yöntem geniş bir kalibrasyon aralığı sağlamış, ancak LOD ile alt kalibrasyon sınırı aynı değerde kalmıştır.
• Serum ekleme sonuçları kullanılabilirlik göstermiş, fakat tampon ölçümlerine göre daha yüksek değişkenlik ve bazı pozitif sapmalar ortaya çıkarmıştır.
• Klinik uygulama için hasta örnekleri ve referans yöntem karşılaştırması gereklidir.

Kaynak ve Yöntem Notu

Bu içerik, Dan Li, Yifan Niu, Yuchen Zhang, Na Li, Siqi Zhang, Jiajia Shi, Yueqi Liu, Xiaoming Chen ve Yong Zhao tarafından hazırlanan “Surface ligand engineering of copper-based MOFs with hydrolase-mimetic activity for colorimetric immunosensing of AFP” başlıklı çalışmaya dayanmaktadır.

Çalışma; CuBPY adlı bakır tabanlı metal-organik kafesin neokuproin yüzey ligandı kullanılarak katalitik açıdan güçlendirilmesini ve AFP ölçümünde kolorimetrik immünosensör olarak kullanılmasını bildiren deneysel bir preprint araştırma makalesidir.

Metinde açıkça “This preprint research paper has not been peer reviewed” ifadesi yer almaktadır. Dolayısıyla çalışma hakem değerlendirmesinden geçmemiştir. PDF’de dergi kabulü veya hakemli nihai yayın bilgisi bulunmamaktadır.

Araştırma klinik çalışma değildir. Hasta grubu, tanı doğruluğu, hastalık sınıflandırması veya tedavi sonucu incelenmemiştir. Serum deneyleri, 50 kat seyreltilmiş insan serumuna bilinen miktarda standart AFP eklenerek gerçekleştirilmiştir.

Geliştirilen sensörün serum geri kazanımları yüzde 89,1–116,4, göreli standart sapmaları yüzde 15,7’nin altında bulunmuştur. Bu değerler serum matrisi içinde ölçüm yapılabileceğini desteklemekle birlikte klinik laboratuvar validasyonu için yeterli değildir.

Neokuproinin CuBPY’nin katalitik etkinliğini 1,8 kat artırdığı absorbans karşılaştırmalarıyla bildirilmiştir. Ayrıntılı Michaelis–Menten kinetiği, Cu(II)/Cu(I) değerlik analizi ve neokuproin yüzey kaplama yoğunluğu sunulmamıştır.

Antikor immobilizasyonu SEM, EDS, XRD ve FT-IR verileriyle desteklenmiştir. Bununla birlikte antikor yükleme verimi, antikor yönelimi ve bağlanma afinitesi nicel olarak belirlenmemiştir.

Çalışmada kullanılan seçicilik paneli BSA, HRP, GOx ve ALP ile sınırlıdır. Bu sonuçlar bütün serum girişimlerini, heterofil antikorları veya klinik numune çeşitliliğini kapsamamaktadır.

Çalışma Natural Science Foundation of Hebei Province of China ve Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation tarafından desteklenmiştir. Yazarlar çıkar çatışması bulunmadığını bildirmiştir.

Bu Türkçe makale yalnızca yüklenen PDF’deki deney protokolleri, şekiller, sayısal sonuçlar ve yazarların mekanistik yorumlarına dayanarak hazırlanmıştır. PDF’de bulunmayan klinik tanı başarısı, ticari ürün hazır oluşu, hasta güvenliği veya kesin moleküler mekanizma iddiaları eklenmemiştir.