Enzim bağlantılı immünosorbent analizleri, yani ELISA sistemleri, belirli proteinlerin antikorlar aracılığıyla seçici bdaxiliimde tanınmasına və oluşan sinyalin rəng dəyişikliyi üzərinden ölçülmesine dayanır. Bu sistemlerde rəng siqnalınin gücü büyük ölçüde kullanılan enzimin katalitik etkinliğine və kararlılığına bağlıdır. Ancak təbii enzimler sıcaklık, pH və iyonik ortam gibi dəyişkenlerden etkilənebilir.

Dan Li və tədqiqat arkadaşları, təbii enzim yerine süni enzim gibi davranan bir metal-organik karkas nanozimi kullanarak alfa-fetoprotein, yani AFP üçün kolorimetrik bir immunosensor geliştirmiştir. Araşdırmanın mərkəzinde mis iyonları ilə 4,4’-bipiridinden oluşan CuBPY adlı metal-organik karkas və bu yapının yüzeyine bağlanan neokuproin ligandı bulunmaktadır.

CuBPY, 4-aminofenil-β-D-qalaktopiranozid adlı substratın hidrolizini katalizleyen β-D-qalaktosidaza benzeri bir hidrolaza etkinliği göstermiştir. Ancak özgün CuBPY’nin katalitik etkinliği uygulama açısından məhduddır. Araşdırmacılar bu etkinliği artırmak üçün 2,9-dimetil-1,10-fenantrolin, yani neokuproin kullanan bir yüzey liqand mühəndisliyi stratejisi önermiştir.

Neokuproin sistemde iki fərqlı görev üstlenmektedir. İlk olaraq CuBPY üzərindeki mis merkezleriyle koordinasiya kurarak substrat hidrolizini hızlandırmaktadır. İkinci olaraq reaksiya sırasında oluşan Cu(I) iyonlarıyla parlak sarı rəngli bir kompleks meydana getirerek birbaşa kolorimetrik sinyal üretmektedir.

Tədqiqatda neokuproin desteğinin CuBPY’nin PAPG hidrolizine yönelik katalitik kapturşuesini təxminən 1,8 kat artırdığı bildirilmişdir. Bununla belə bu artım ayrıntılı Michaelis–Menten kinetiği, dönüşüm sayısı və ya spesifik aktivlik dəyərleriyle değil, oluşan renkli ürünün absorbansındaki dəyişim üzərinden dəyərlendirilmiştir.

AFP’yi tanıyan antikor, CuBPY sentezi sırasında bir mərhələli biomineralizasiya yoluyla yapıya daxil edilmişdir. Elde edilən anti-AFP@CuBPY biləşiği eyni anda antikor taşıyıcısı, katalitik nanozim, rəng siqnalı üreticisi və siqnal gücləndirici olaraq istifadə edilmişdir.

İmmunosensor, klasik sandvdaxili ELISA’ya benzer bir düzende kurulmuştur. Mikroplaka yüzeyindeki tutucu antikor əvvəl AFP’yi bağlamış, ardından anti-AFP@CuBPY bu antigen kompleksine tutunmuştur. Sistemde ne kadar çox AFP bulunuyorsa plaka üzərinde o kadar çox CuBPY tutulmuş və sonraki renk reaksiyaunda daha güclü sarı sinyal oluşmuştur.

Optimize edilən deney koşullarında PAPG və neokuproin konsentrasiyaleri 20 mM, reaksiya pH’sı 7,0 və renk geliştirme süresi 10 dakika olaraq seçilmiştir. CuBPY’ye yüklenen anti-AFP antikor miktarı 100 µg, mikroplakaya kaplanan tutucu antikor konsentrasiyai 10 µg/mL və bloklayıcı BSA konsentrasiyai yüzde 1 olaraq belirlenmiştir.

Geliştirilən sistemde AFP üçün 5–1000 ng/mL arasında düzgünsal yanıt bildirilmişdir. Kalibrasyon denklemi Y = 0,00005X + 0,02610, determinasiya əmsalı ise R² = 0,994’tür. Sinyal-gürültü nisbətının 3 olduğu ölçüt üzərinden hesaplanan aşkarlama həddi 5 ng/mL olaraq məlumatlmiştir.

Seçicilik deneylerinde AFP’ye qarşı oluşan absorbans sinyali; BSA, xren peroksidazası, qlükoza oksidaza və qələvi fosfatazaın oluşturduğu sinyallerden belirgin bdaxiliimde yüksek aşkar edilmişdir. Bununla belə test edilən girişimci paneli məhduddır və insan serumunda bulunabiləcek bütün proteinleri, antikorları, lipitleri və ya AFP ilə yapısal əlaqəli biyobelirteçleri kapsamamaktadır.

Pratik uygulanabilirlik deneyi üçün insan serumları 50 kat seyreltilmiş və bilinen miktarlarda AFP eklenmiştir. Geri kazanım dəyərleri yüzde 89,1–116,4, nisbi standart sapmalar ise yüzde 15,7’nin altında aşkar edilmişdir. Bu nəticəlar sistemin serum matriksi üçünde AFP sinyali üretebildiğini göstərir; lakin qələviı koşullardaki yüzde 116,4’lük geri qazanım pozitif ölçüm sapmasına işaret etmektedir.

Tədqiqat gerçek pasiyent nümunəlerini, doğal AFP səviyyəlerini, klinik eşik dəyərlerini, tanısal duyarlılığı, tanısal özgüllüğü və ya pasiyentlık ayırma başarısını incelememiştir. Bu səbəbdən geliştirilən sistem klinik olaraq düzgünlanmış bir tanı testi değil, laboratuvar ölçeğinde hazırlanmış deneysel bir kolorimetrik biyosensör platformudur.

Tədqiqatnın temel problemi nədir?

İmmünolojik analizlerde hədəf proteinin antikorla seçici olaraq yakalanması kadar, bu bağlanma olayının ölçülebilir bir sinyale dönüştürülmesi de önemlidir. Klasik ELISA sistemlerinde tanıma antikoruna bağlanan təbii enzim, renksiz bir substratı renkli bir ürüne dönüştürür.

Bu yaklaşım yüksek seçicilik sağlayabilse de təbii enzimler:

• Sıcaklık dəyişimlerinden,
• Aşırı asidik və ya qələvi ortamlardan,
• İyonik gücten,
• Uzun depolama sürelerinden,
• Protein yapısını bozan kimyasal koşullardan etkilənebilir.

Araşdırmanın çözmeye çalıştığı temel problem, təbii enzimlerin yerini alabiləcek sağlam və çok işlevli nanozimlerin çoğunun təbii enzimlerle qarşılaştırıldığında düşük katalitik dönüşüm etkinliğine sahip olmasıdır.

Tədqiqatda bu sualn şu sualyla ele alınmaktadır:

Mis tabanlı bir metal-organik karkasin yüzeyine uygun bir ligand bağlanarak hem hidrolaza benzeri katalitik aktivlik artırılabilir hem de eyni ligand birbaşa rəng siqnalı üretmek üçün kullanılabilir mi?

Nanozim nədir?

Nanozimler, təbii enzimlerin gerçekleştirdiği belirli reaksiyaları taklit edebilən yapay nanomaterialler və ya nano-yapılandırılmış katalitik sistemlerdir. Tek atomlu yapılar, karbon malzemeler, metal oksitler, metal sülfürler və metal-organik karkasler nanozim olaraq kullanılabilir.

Nanozimlerin təbii enzimlere qarşı öne çıkarılan olası avantajları şunlardır:

• Daha yüksek fiziksel və kimyasal sabitlik,
• Daha uzun saklama ömrü,
• Daha düşük üretim maliyeti olasılığı,
• Yüzey özelliklerinin dəyiştiriləbilmesi,
• Birden çox işlevin eyni yapı üçünde birleştiriləbilmesi,
• Katalitik və optik özelliklerin ayarlanabilmesi.

Bununla belə “nanozim” ifadesi bir malzemenin təbii enzime her açıdan eşdəyər olduğunu göstermez. Katalitik hız, substrat özgüllüğü, biyouyğunluk və üretim tekrarlanabilirliği her nanozim üçün ayrı ayrı dəyərlendirilmelidir.

Metal-organik karkasler neden seçildi?

Metal-organik karkasler, İngilizce adıyla metal-organic frameworks və ya MOF-lar, metal iyonları ya da metal kümeleriyle organik bağlayıcıların düzenli bdaxiliimde birleşmesi sonucu oluşan məsaməli kristal quruluşlardır.

MOF-ların biyosensör geliştirme açısından dikkat çekici özellikleri şunlardır:

• Yüksek səth sahəsi,
• Düzenli məsamə quruluşu,
• Ayarlanabilir metal merkezleri,
• Değiştiriləbilir organik bağlayıcılar,
• Biyomolekülleri taşıyabilən daxili və xarici yüzeyler,
• Sentez sonrası yüzey modifikasyonuna uygunluk.

Tədqiqatda kullanılan CuBPY yapısı mis iyonları ilə 4,4’-bipiridin bağlayıcılarından yaradılmışdır. Mis merkezleri yalnız MOF iskeletinin yapısal komponenti deyil; eyni zamanda katalitik və kolorimetrik reaksiyaun mərkəzinde yer alır.

Yüzey liqand mühəndisliyi ne anlama geliyor?

Yüzey liqand mühəndisliyi, bir nanoparçacığın və ya məsaməli malzemenin yüzeyindeki metal merkezlerine belirli organik moleküllerin bağlanarak malzemenin kimyasal davranışının dəyiştirilmesidir.

Bir səth liqandı:

• Substratın katalitik mərkəze yaklaşmasını kolaylaştırabilir,
• Yüzeyin hidrofobik və ya hidrofilik karakterini dəyiştirebilir,
• Metal mərkəzinin elektron yoğunluğunu etkiləyebilir,
• Elektron köçürməını hızlandırabilir,
• Katalitik ara ürünleri kararlı hâle getirebilir,
• Optik və ya kolorimetrik sinyal oluşturabilir.

Bu tədqiqatda səth liqandı olaraq neokuproin seçilmiştir. Neokuproin iki azot atomu üzərinden misla koordinasiya kurabilən çift dişli bir ligandır.

Neokuproin sistemde hangi görevleri üstleniyor?

Neokuproinin en önemli özelliği sistemde tək bir görev yerine iki tamamlayıcı görev üstlenmesidir.

1. Katalitik etkinliği artırma

Neokuproinin azot atomları CuBPY’deki Cu(II) merkezlerine bağlanmaktadır. Araşdırmacılar, neokuproinin fenantrolin halkasının π–π qarşılıqlı təsirləri üçün bir merkez oluşturarak substratın katalitik yüzeye erişimini və hidrolizini kolaylaştırdığını önermektedir.

2. Renk sinyali üretme

Reaksiyonun ilərleyen aşamasında oluşan p-aminofenol, Cu(II)’yi Cu(I)’e indirger. Neokuproin Cu(I) ilə parlak sarı rəngli bir kompleks oluşturur. Şemada bu ürün Cu(I)-(Nc)₂ bdaxiliiminde gösterilmektedir.

Böylece neokuproin hem reaksiyaun hızlanmasına katkıda bulunmakta hem de oluşan Cu(I) miktarını görünür sarı renge dönüştürmektedir.

Katalitik və kolorimetrik reaksiya nasıl ilərliyor?

Tədqiqatnın önerdiği reaksiya zinciri dört temel aşamada açıklanabilir:

1. Neokuproin, CuBPY’deki Cu(II) merkezleriyle koordinasiya kurar.
2. Neokuproinle dəyiştirilmiş CuBPY, PAPG substratının hidrolizini katalizler.
3. PAPG’nin hidrolizi sonucunda p-aminofenol, yani PAP oluşur.
4. PAP, Cu(II)’yi Cu(I)’e indirger və Cu(I) neokuproinle sarı rəngli kompleks meydana getirir.

Reaksiyonun açıklayıcı özeti şu şəkilde gösteriləbilir:

\[ \mathrm{PAPG} \xrightarrow[\mathrm{Nc}]{\mathrm{CuBPY}} \mathrm{PAP} \]

Burada:

• PAPG, 4-aminofenil-β-D-qalaktopiranozid substratını,
• CuBPY, hidrolaza benzeri katalitik MOF yapısını,
• Nc, neokuproini,
• PAP, p-aminofenol ürününü ifade eder.

İndirgenme və renk oluşumu ise tədqiqat mantığına göre şöyle xülasə edilə bilər:

\[ \mathrm{Cu(II)-Nc} + \mathrm{PAP} \rightarrow \mathrm{Cu(I)-(Nc)_2} + \text{sarı renkli sinyal} \]

Bu gösterim reaksiyaun tədqiqatda açıklanan genel yönünü anlatmaktadır. Makalede ayrıntılı stokiyometrik denklem, elektron dengesi və ya bütün yan ürünler məlumatlmemiştir.

Meqanizma birbaşa qanıtlandı mı?

Tədqiqatda oluşan sarı kompleksin UV-Vis absorbansı və neokuproin varlığında katalitik sinyalin artması göstərilmişdir. Ancak önerilən meqanizmanın bütün aşamaları birbaşa spektroskopik və ya kinetik metodlerle düzgünlanmamıştır.

Örneğin tədqiqatda:

• Cu(II)/Cu(I) nisbətını birbaşa gösteren XPS analizi,
• Elektron paramanyetik rezonans ölçümü,
• Ara ürünlerin kütle spektrometrisi,
• Neokuproin yüzey kaplama yoğunluğu,
• Bağlanma sabiti,
• Ayrıntılı reaksiya kinetiği sunulmamıştır.

Bu səbəbdən meqanizma, gözlenen rəng dəyişikliyiyle və literatürde bilinen mis-neokuproin kimyasıyla uyğun bir izahdır; bütün moleküler basamakları deneysel olaraq kəsiknleştirilmiş bir reaksiya modeli deyil.

Şema 1 ne anlatıyor?

Tədqiqatnın beşinci sayfasındaki Şema 1, bütün sensör sistemini tek akış üçünde göstərir.

Şemanın üst sol bölməünde:

• 4,4’-bipiridin,
• Anti-AFP antikoru,
• Cu²⁺ iyonlarının bir mərhələli sentezde bir araya gelerek anti-AFP@CuBPY oluşturduğu gösterilmektedir.

Alt bölməde mikroplaka yüzeyine bağlı tutucu antikor AFP’yi tutmakta, ardından anti-AFP@CuBPY kompleksi AFP’ye bağlanarak sandvdaxili yapı təşkil edir.

Şemanın sağ tarafında PAPG və neokuproin reaksiyaa eklenmekte, sarı rəngli Cu(I)-(Nc)₂ kompleksi oluşmakta və absorbans sinyali AFP konsentrasiyaiyle ilişkiləndirilmektedir.

Şema, sistemdeki dört temel işlevi bir araya getirmektedir:

• Antikorla seçici hədəf tanıma,
• CuBPY ilə kataliz,
• Neokuproinle katalitik güclendirme,
• Cu(I)-neokuproin kompleksiyle renkli siqnal yaranması.

Anti-AFP@CuBPY nasıl sentezlendi?

Anti-AFP antikorunun CuBPY üçüne dahil edilmesi bir mərhələli biomineralizasiya metodiyle gerçekleştirilmiştir.

Sentez adımları şöyledir:

1. 100 µg anti-AFP antikoru, yüzde 50 etanol üçünde hazırlanmış 1 mL 15,6 mM 4,4’-bipiridin məhlulsine eklenmiştir.
2. Karışım homojenlik sağlamak üçün vortekslenmiştir.
3. 1 mL 3,9 mM CuCl₂ məhlulsi mikroinfüzyon pompasıyla 5 mL/dakika hızında karışıma məlumatlmiştir.
4. Süspansiyon 4°C’de sürekli karıştırma altında 12 saat tutulmuştur.
5. Oluşan mavi çökelti 10.000 rpm’de 15 dakika santrifüjlenmiştir.
6. Malzeme yüzde 50 etanolle üç kez yıqanmıştır.
7. Son ürün 2,5 mL ultra saf suda dağıtılmış və 4°C’de saklanmıştır.

Kontrol CuBPY malzemesi eyni işlemle, lakin anti-AFP antikoru eklenmeden hazırlanmıştır.

Biyomineralizasyonun avantajı nədir?

Geleneksel yaklaşımda MOF əvvəl sentezlenebilir, ardından yüzey aktivasyonu və kimyasal bağlama adımlarıyla antikor eklenebilir. Bu süreç çok aşamalı ola bilər və antikorun etkinliğini azaltabiləcek kimyasal koşullar gerektirebilir.

Tədqiqatda kullanılan bir mərhələli biomineralizasiya yaklaşımında antikor MOF oluşurken sisteme dahil edilmektedir. Bu metod üretim adımlarını azaltabilir və antikor taşıyan katalitik malzemenin birbaşa elde edilmesini sağlayabilir.

Bununla belə tədqiqatda:

• Antikor yükleme məlumatmi,
• Malzeme başına antikor miktarı,
• Antikorun yönelimi,
• Bağlanabilir epitop sayısı,
• Biyomineralizasyon sonrasında antikor afinitesi nicel olaraq ölçülmemiştir.

SEM görüntüleri və parçacık boyutu ne gösteriyor?

Şəkil 1’de CuBPY və anti-AFP@CuBPY malzemelerinin skanedici elektron mikroskopiyası görüntüleri təqdim olunur. Her iki malzeme de çubuk və ya kısa prizmatik plaka benzeri yapılar göstermiştir.

Tədqiqatda bildirilən ortalama boyutlar:

• CuBPY üçün təxminən 3140 nm,
• Anti-AFP@CuBPY üçün təxminən 2102 nm’dir.

Anti-AFP ehtiva edən yapının özgün CuBPY’den daha küçük olduğu görülmüşdür. Araşdırmacılar bu boyut fərqının meqanizmasını ayrıntılı olaraq izahmıştır.

Bildirilən təxminən 2,1–3,1 µm büyüklükler mikrometre ölçeğindedir. “Nanozim” terimi burada malzemenin süni enzim benzeri katalitik işlevini tanımlamaktadır; SEM’de gözlenen bütün çubukların klasik anlamda 100 nm’den küçük müstəqil nanoparçacıklar olduğu gösterilmemiştir.

EDS element haritalaması ne gösterdi?

Enerji dağılımlı X-ışını spektroskopisi analizinde CuBPY və anti-AFP@CuBPY üçünde temel olaraq:

• Karbon,
• Azot,
• Oksijen,
• Mis belirlenmiştir.

Anti-AFP@CuBPY örneğinde kükürd və oksigen sinyalinin daha yüksek olduğu bildirilmişdir. Araşdırmacılar kükürdün antikor proteinindeki sistein və ya metiyonin kalıntılarından mənbəlandığını düşünmektedir.

EDS haritalaması karbon, azot, oksigen, mis və kükürdün yapı üzərindeki dağılımını göstermiştir. Artan kükürd və oksigen sinyali antikorun malzemeye dahil edildiğini desteklemektedir; lakin tek başına antikorun biyolojik olaraq aktif yönelimde bulunduğunu qanıtlamaz.

XRD nəticəları ne anlatıyor?

CuBPY və anti-AFP@CuBPY’nin toz X-şüa difraksiyası desenlerinin büyük ölçüde eyni olduğu bildirilmişdir. Bu nəticə, antikorun biomineralizasiya sırasında yapıya dahil edilmesinin CuBPY’nin temel kristal karkasini bozmadığını düşündürmektedir.

Başka bir ifadeyle antikor eklenmesi malzemenin kimliğini tamamen fərqlı, amorf bir yapıya dönüştürmemiştir.

FT-IR nəticəları ne anlatıyor?

İki malzemenin FT-IR spektrumları genel olaraq benzer işlevsel gruplar göstermiştir. Anti-AFP@CuBPY’de iki protein əlaqəli bant güclenmiştir:

• 1636 cm⁻¹: Amide I, əsas C=O gerilmesi,
• 1535 cm⁻¹: Amide II, N-H bükülmesi və C-N gerilmesi.

Bu bantların güclenmesi, protein yapısındaki peptit bağlarının malzemede bulunduğunu desteklemektedir. EDS’deki kükürd sinyaliyle birlikte dəyərlendirildiğinde antikorun CuBPY yapısına immobilize edildiği yorumunu güclendirmektedir.

Şəkil 1’in bütünleşik mesajı

Şəkil 1’de dört ayrı karakterizasyon katmanı birleştirilmiştir:

Neokuproin katalitik etkinliği ne kadar artırdı?

CuBPY, PAPG ilə neokuproin bulunmadan da hidrolaza benzeri aktivite göstermiştir. Ancak PAPG və neokuproin karışımı CuBPY bulunmadığında renksiz kalmıştır.

CuBPY sisteme eklendiğinde 455 nm çevresinde belirgin absorbans dəyişikliği ortaya çıxmışdır. Neokuproinin katalitik reaksiya sırasında bulunması sinyali daha da artırmıştır.

Araşdırmacılar neokuproin destekli CuBPY’nin özgün CuBPY’ye göre 1,8 kat daha yüksek katalitik aktivite gösterdiğini bildirmiştir.

Bu nəticə önemli olmakla birlikte tədqiqatda aşağıdaki kinetik dəyərler məlumatlmemiştir:

• Michaelis sabiti, K_m,
• Maksimum hız, V_max,
• Katalitik dönüşüm sayısı, k_cat,
• Katalitik etkinlik, k_cat/K_m,
• Malzeme kütlesi başına spesifik aktivlik.

Bu səbəbdən 1,8 katlık dəyər, tədqiqatnın belirli PAPG, neokuproin və reaksiya koşullarındaki kolorimetrik absorbans müqayisəsını temsil etmektedir.

Antikor eklenmesi katalitik etkinliği bozdu mu?

Anti-AFP@CuBPY’nin PAPG hidrolizi üçün CuBPY’ye benzer katalitik kapturşue gösterdiği bildirilmişdir. Bu nəticə, antikorun MOF’a dahil edilmesinin katalitik mərkəzleri tamamen kapatmadığını və ya malzemenin hidrolaza benzeri işlevini ortadan kaldırmadığını göstərir.

Anti-AFP@CuBPY 90 gün saklandıktan sonra da neokuproin desteğine yanıt veren katalitik aktivlik göstermiştir. Ancak tədqiqat:

• Başlangıç aktivitesinin yüzde kaçının korunduğunu,
• Depolama süresince ara zaman noktalarını,
• Fərqlı sıcaklıklardaki stabiliteyi,
• Antikorun 90 gün sonraki bağlanma afinitesini ayrı olaraq raporlamamıştır.

Şəkil 2 ne anlatıyor?

Şəkil 2a fərqlı reaksiya karışımlarının UV-Vis spektrumlarını müqayisəktadır. PAPG ilə neokuproin CuBPY olmadığında belirgin sarı sinyal oluşturmamıştır. En yüksek absorbans, CuBPY, PAPG və neokuproinin birlikte bulunduğu koşulda görülmüşdür.

Şəkildeki tüp fotoğrafı neokuproin bulunan reaksiyaun, bulunmayan koşula göre daha belirgin sarı rəng oluşturduğunu görsel olaraq göstərir.

Şəkil 2b CuBPY, yeni hazırlanmış anti-AFP@CuBPY və 90 gün saklanmış anti-AFP@CuBPY’nin neokuproin destekli katalitik sinyallerini müqayisəktadır. Eğrilərin genel bdaxiliimi və təxminən 455 nm civarındaki tepe korunmuştur.

İmmunosensor nasıl kuruldu?

Geliştirilən sistem klasik sandvdaxili immünolojik analiz mantığına dayanmaktadır.

1. Mikroplaqanın antikorla kaplanması

96 quyulu mikroplaqanın her kuyusuna 100 µL, 10 µg/mL yakalama anti-AFP antikoru eklenmiş və plaka 4°C’de bir gece bekletilmiştir.

2. Yıkama və bloklama

Bağlanmayan antikorlar 0,01 M PBST ilə üç kez uzaklaştırılmıştır. Plaqanın boş yüzeyleri 200 µL yüzde 1 BSA məhlulsiyle 37°C’de 40 dakika bloke edilmiştir.

3. AFP’nin yakalanması

Standart AFP məhlulleri və ya test nümunəlerinden 100 µL eklenmiş və 37°C’de 120 dakika inkübe edilmiştir.

4. Anti-AFP@CuBPY’nin bağlanması

Dört yıkama işleminden sonra kuyulara 100 µL anti-AFP@CuBPY eklenmiş və 37°C’de 50 dakika tutulmuştur.

5. Renk reaksiyau

Bağlanmayan nanozim uzaklaştırıldıktan sonra her kuyuya sırasıyla:

• 50 µL 20 mM PAPG,
• 50 µL 20 mM neokuproin,
• 100 µL 0,02 M, pH 7,0 amonyum asetat eklenmiştir.

On dakikalık inkubasiyadan sonra UV-Vis absorbans spektrumu ölçülmüştür.

AFP konsentrasiyai neden renk yoğunluğunu artırıyor?

Mikroplakada daha çox AFP bulunması, tutucu antikorna daha çox AFP bağlanması mənasına gəlir. Daha çox AFP ise daha çox anti-AFP@CuBPY’nin kuyuda tutulmasını sağlar.

Bağlanan CuBPY miktarı arttıkça:

• Daha çox PAPG hidroliz edilir,
• Daha çox PAP oluşur,
• Daha çox Cu(II), Cu(I)’e indirgenir,
• Daha çox sarı Cu(I)-neokuproin kompleksi oluşur,
• Absorbans yüksəlir.

Dolayısıyla ölçülen renk birbaşa AFP’nin kendi rengi deyil. AFP, mikroplakada tutulacak nanozim miktarını belirleyen biyolojik hədəf olaraq görev yapmaktadır.

PAPG konsentrasiyai nasıl optimize edildi?

PAPG konsentrasiyai artırıldıkça absorbans başlanğıcta hızla yüksəlmiş, təxminən 20 mM’den sonra artım büyük ölçüde yavaşlamıştır. Bu səbəbdən 20 mM PAPG seçilmiştir.

Bu plato, tədqiqat koşullarında katalitik mərkəzlerin və ya renk oluşum basamaklarından birinin substrat bakımından doygunluğa yaklaşmasıyla uyğun ola bilər. Ancak ayrıntılı enzim kinetiği yapılmadığı üçün kəsikn doygunluk meqanizması belirlenmemiştir.

Neokuproin konsentrasiyai nasıl optimize edildi?

Neokuproin konsentrasiyai arttıkça absorbans yüksəlmiş və təxminən 20 mM’den sonra daha məhdud dəyişim göstermiştir. Tədqiqatda maliyet, sinyal və kullanım kolaylığı birlikte dəyərlendirilərek 20 mM seçilmiştir.

pH neden 7,0 olaraq seçildi?

CuBPY’nin PAPG hidrolizine yönelik katalitik sinyali pH 3’ten pH 7’ye kadar artmış, daha alkali koşullarda azalmıştır.

Bu nəticə CuBPY’nin asidik ilə nötr aralıkta etkin olduğunu göstərir. İmmünolojik bağlanma koşullarıyla uyğunluk da dikkate alınarak pH 7,0 seçilmiştir.

pH optimizasyon grafiği ek Şəkil S2’ye yönlendirilmiştir. Ana PDF’de bu ek şeklin ayrıntılı sayısal məlumatleri məlumatlmemektedir.

Neden 10 dakikalık reaksiya süresi seçildi?

Reaksiyon süresi uzadıkça absorbans ilk aşamada artmış və təxminən 10–15 dakikadan sonra plato eğilimine girmiştir. On dakikadan sonraki dəyişimin məhdud olduğu belirtilərek optimum süre 10 dakika seçilmiştir.

On dakikalık renk geliştirme süresi, metodin uzun enzim inkubasiyalarına ihtiyaç duymadan sinyal üretmesini sağlayan pratik özelliklerinden biridir.

Antikor və BSA miktarları nasıl seçildi?

CuBPY sentezinde kullanılan etiketli anti-AFP miktarı arttıkça absorbans yüksəlmiştir. İncelenen aralıkta en yüksek sinyal 100 µg ilə elde edilmiş və bu miktar seçilmiştir.

Mikroplakaya kaplanan tutucu antikor konsentrasiyai 10 µg/mL’ye kadar artırıldığında absorbans yüksəlmiş, bu dəyərden sonra plato görülmüşdür.

BSA konsentrasiyai arttıkça özgül olmayan yüzey bağlanması azalmış və en uygun nəticə yüzde 1 BSA ilə elde edilmiştir. Daha yüksek BSA konsentrasiyaleri ek yarar sağlamamıştır.

Şəkil 3 ne anlatıyor?

Şəkil 3, sistemin altı temel optimizasyon dəyişkenini göstərir:

Grafiklerde çoğu parametre üçün sinyalin əvvəl hızla yüksəldiği, ardından plato oluşturduğu görülmektedir. Optimum dəyərler her durumda yalnız mutlak maksimum sinyale göre değil, kullanım kolaylığı və maliyet gerekçeleriyle seçilmiştir.

Kalibrasyon sonucu

Optimize edilmiş sistemde AFP konsentrasiyai yüksəldikçe absorbans spektrumundaki təxminən 455 nm bölgesindeki sinyal artmıştır.

5–1000 ng/mL aralığında bildirilən kalibrasiya denklemi şöyledir:

\[ Y = 0{,}00005X + 0{,}02610 \]

\[ R^2 = 0{,}994 \]

Burada:

• X, AFP konsentrasiyaini ng/mL cinsinden,
• Y, ölçülen absorbans dəyərini,
• 0,00005, kalibrasiya eğrisinin eğimini,
• 0,02610, AFP bulunmadığında və ya sıfıra yaklaşıldığında tahmin edilən başlanğıc sinyalini,
• R², düzgünsal modelin ölçüm dəyişimini izah derecesini ifade eder.

R² = 0,994 güclü bir düzgünsal ilişki göstərir. Ancak tədqiqatda kalibrasiya artıklarının dağılımı, varyans homojenliği və ya fərqlı konsentrasiyalarda ölçüm belirsizliği ayrıntılı olaraq sunulmamıştır.

Algılama sınırı ne anlama geliyor?

Tədqiqatda aşkarlama həddi 5 ng/mL olaraq bildirilmiş və siqnal-küy nisbəti 3 ölçütü istifadə edilmişdir:

[ S/N = 3 ]

Bu ölçüt, analit sinyalinin arka plan gürültüsünden təxminən üç kat yüksek olduğu səviyyəsi ifade eder.

Algılama sınırının 5 ng/mL olması, metodin bu səviyyəde AFP varlığını ayırt edebildiği mənasına gəlir. Ancak miqdar təyini həddi, yani LOQ ayrı olaraq bildirilmemiştir.

Ayrıca 5 ng/mL hem kalibrasiya aralığının alt sınırı hem de LOD olaraq məlumatlmiştir. Daha düşük səviyyəlerde çok sayıda boş nümunə və düşük konsentrasiyalu tekrarlarla yapılacak ek analiz, LOD və LOQ’nun daha sağlam belirlenmesini sağlayabilirdi.

Şəkil 4a və 4b ne gösteriyor?

Şəkil 4a’da 5 ng/mL’den 1000 ng/mL’ye kadar artan AFP konsentrasiyalerinin absorbans spektrumları gösterilmektedir. AFP konsentrasiyai arttıkça təxminən 450–455 nm bölgesindeki absorbans yüksəlmektedir.

Şəkil 4b’de AFP konsentrasiyai ilə absorbans arasındaki kalibrasiya düzgünsu bulunmaktadır. Veri noktaları genel olaraq düzgünsal çizgiye yakın yerleşmiştir.

Seçicilik deneyi

Sistemin seçiciliği şu proteinlere qarşı dəyərlendirilmiştir:

• BSA,
• Yaban turpu peroksidazı, HRP,
• Glikoz oksidaz, GOx,
• Alkalin fosfataz, ALP,
• AFP.

AFP xariciındaki proteinlerin oluşturduğu absorbans dəyişimi düşük kalırken AFP belirgin sinyal oluşturmuştur.

Bu nəticə, sensörün anti-AFP antikoruna dayalı biyolojik tanıma işlevinin çalıştığını desteklemektedir. Seçicilik esas olaraq CuBPY’nin AFP’yi kimyasal olaraq ayırt etmesinden değil, antikorların AFP’ye bağlanmasından mənbəlanmaktadır.

Seçicilik deneyinin sınırları

Test edilən protein paneli metodin ilk seçicilik dəyərlendirmesi üçün yararlıdır. Ancak gerçek insan serumunda yüzlerce fərqlı protein, lipid, metabolit və antikor bulunur.

Tədqiqatda şu olası girişimcilər ayrıntılı olaraq test edilmemiştir:

• Yüksek miktardaki serum immünoglobulinleri,
• Hemoglobin və hemoliz etkisi,
• Bilirubin,
• Trigliserit və lipemiya,
• Heterofil antikorlar,
• Romatoid faktör,
• AFP’ye yapısal və ya immünolojik yakınlık gösterebiləcek proteinler.

Bu səbəbdən Şəkil 4c sistemin məhdud bir protein paneline qarşı seçici olduğunu göstermekte, bütün klinik matriks girişimlerini xaricilamamaktadır.

Serum nümunəleri nasıl analiz edildi?

Pratik uygulanabilirlik tədqiqatsında insan serumları 50 kat seyreltilmiş və standart AFP antigeniyle zenginleştirilmiştir. Ölçüm işlemi tampon üçündeki AFP standartlarıyla eyni immunosensor protokolü kullanılarak yürütülmüştür.

Her ekleme səviyyəsi üç kez analiz edilmiştir. Bildirilən nəticəlar:

• Geri kazanım: yüzde 89,1–116,4,
• RSD: yüzde 15,7’nin altında.

Geri kazanımın açıklayıcı matematiksel anlamı şöyledir:

\[ \text{Geri kazanım (\%)} = \frac{\text{ölçülen AFP miktarı}}{\text{eklenen AFP miktarı}} \times 100 \]

Bu formül makalede açık denklem olaraq məlumatlmemiştir; ekleme deneyinin nasıl yorumlandığını izahk amacıyla göstərilmişdir.

Yüzde 100’e yakın geri qazanım eklenen AFP’nin düzgünya yakın ölçüldüğünü göstərir. Yüzde 116,4 gibi yüzde 100’ün üzərindeki dəyərler ise qələviı nümunəlerde matriks mənbəlı pozitif sapma və ya ölçüm dəyişkenliği bulunabiləceğini düşündürür.

Göreli standart sapmanın temel açıklayıcı formülü şöyledir:

\[ \mathrm{RSD}(\%) = \frac{s}{\bar{x}} \times 100 \]

• s, tekrar ölçümlerin standart sapmasını,
• \bar{x}, tekrar ölçümlerin ortalamasını ifade eder.

Yüzde 15,7’ye yaklaşabilən RSD, tampon üçündeki optimize edilmiş ölçümlere kıyasla serum matriksinde daha yüksek dəyişkənlik bulunduğunu göstərir.

Şəkil 4d ne anlatıyor?

Şəkil 4d iki ayrı serum örneğinde 50, 500 və 1000 ng/mL AFP ekleme səviyyəlerini göstərir.

Grafikte örneğin:

• 50 ng/mL ekleme səviyyəsinde təxminən 44,5 və 56,9 ng/mL,
• 500 ng/mL səviyyəsinde təxminən 477,4 və 536,2 ng/mL,
• 1000 ng/mL səviyyəsinde təxminən 1133,0 və 1163,9 ng/mL ölçümleri gösterilmektedir.

Bu nəticəlar düşük və orta səviyyəde nominal dəyəre yakın ölçüm yapılabildiğini; 1000 ng/mL səviyyəsinde ise iki serumda da pozitif sapma bulunduğunu göstərir.

“Gerçek serum analizi” ifadesi nasıl anlaşılmalıdır?

Tədqiqat insan serumu matriksi kullanmıştır; lakin ölçülen AFP doğal pasiyent nümunəlerindeki bilinsultyen AFP deyil. Serumlar 50 kat seyreltilmiş və bilinen miktarda standart AFP eklenmiştir.

Dolayısıyla tədqiqat:

• Serum matriksi üçünde ölçüm yapılabildiğini göstərir.
• Doğal pasiyent AFP səviyyəlerini düzgünlamamaktadır.
• Sağlıklı və pasiyent bireyleri ayırmamaktadır.
• Referans klinik laboratuvar metodiyle müqayisə yapmamaktadır.
• Tanısal duyarlılık və spesifiklik hesaplamamaktadır.

Diğer nanozim immunosensorlerle müqayisə

Tədqiqatnın Tablo 1’i fərqlı nanozim tabanlı immunosensorleri sentez adımı, katalitik güclendirme yaklaşımı, renk sistemi, reaksiya süresi, hədəf, düzgünsal aralık və aşkarlama həddi açısından müqayisəktadır.

Geliştirilən sistemin bildirilən özellikleri:

• Tek aşamalı sentez,
• Neokuproin yüzey liqand mühəndisliyi,
• Nc/PAPG renk sistemi,
• 10 dakikalık katalitik reaksiya,
• 5–1000 ng/mL düzgünsal aralık,
• 5 ng/mL aşkarlama həddidır.

Tablodaki qələviı başka sensörler daha düşük algılama sınırlarına ulaşmıştır. Örneğin AFP üçün məlumatlen Ps-Pt nanoparçacık sistemi 0,004 ng/mL LOD bildirmiştir. Buna qarşılık bu sistemin düzgünsal aralığı 0,01–0,5 ng/mL ilə daha dardır.

Bu səbəbdən geliştirilən CuBPY sistemi “en hassas AFP sensörü” deyil. Tədqiqatnın öne çıqan yönü geniş ölçüm aralığı, bir mərhələli antikor-MOF sentezi, təbii enzim gerektirmemesi və ligandın hem katalitik hem kolorimetrik işlev üstlenmesidir.

Tablodaki sistemlerin hədəfleri və deney koşulları fərqlı olduğundan metodler arası sayısal müqayisəlar birbaşa performans sıralaması olaraq yorumlanmamalıdır.

Tədqiqatnın gecmiş açısından önemi

MOF nanozimlerinin katalitik etkinliğini artırmak üçün metal düğüm mühendisliği, ikinci metal ekleme, aktif merkez yoğunluğunu artırma və ya başka katalitik malzemelerle kompozit oluşturma gibi yaklaşımlar istifadə edilmişdir.

Bu metodlerin bir bölməü çok aşamalı sentez, kaplama, katkılama və ya karmaşık yüzey kimyası gerektirebilir. Mevcut tədqiqat səth liqandının daha bturşu bir katalitik güclendirme aracı olaraq kullanılabiləceğini göstermeyi amaçlamıştır.

Tədqiqatnın özgün yaklaşımı, neokuproinin yalnız yüzey dəyiştirici və ya renk reaktifi olaraq değil, bu iki görevi eyni anda yerine getiren çift işlevli bir komponent olaraq kullanılmasıdır.

Bugün açısından önemi

Geliştirilən sistem, təbii enzim etiketinin yerine antikor taşıyan katalitik bir MOF kullanmaktadır. Bu yaklaşım immunosensor komponentlerinin eyni malzemede bütünleştirilmesini sağlayabilir.

CuBPY platformunun dört işlevi şunlardır:

• Anti-AFP antikorunun taşınması,
• PAPG hidrolizinin katalizlenmesi,
• Mis dəyərlik dəyişimi üzərinden sinyal oluşturulması,
• Neokuproin koordinasiyauyla sinyalin yüksəltilmesi.

On dakikalık renk geliştirme süresi və mikroplaka formatı, metodin laboratuvar iş akışlarına uyarlanabilmesi açısından avantaj sağlayabilir.

Gündelik həyat və sağlık açısından olası anlamı

Tədqiqatnın ana hədəfi AFP adlı bir proteinin ölçülmesidir. Kolorimetrik sistemin temel avantajı, hədəf konsentrasiyai arttıkça çıplak gözle de fərq ediləbilən sarı rəng yoğunluğunun yüksəlmesidir.

Bu tür sistemler gələcəkte:

• Daha bturşu optik okuyucuların kullanılmasına,
• Doğal enzimlerin saklama sualnlarının azaltılmasına,
• Çok işlevli test reaktiflerinin geliştirilmesine,
• Mikroplaka analizlerinin daha kısa renk geliştirme süresiyle yürütülmesine katkıda bulunabilir.

Ancak mevcut tədqiqat taşınabilir cihaz, telefon kamerasıyla okuma, ev testi, hızlı test şeridi və ya pasiyent başı kullanım dəyərlendirmesi yapmamıştır.

Gelecek araşdırmalarda neler yapılmalıdır?

• Neokuproinin CuBPY yüzeyine bağlanma miktarı nicel olaraq belirlenmelidir.
• Cu(II)’den Cu(I)’e dönüşüm XPS və ya başka dəyərlik duyarlı tekniklerle düzgünlanmalıdır.
• PAPG hidrolizi üçün K_m, V_max və katalitik aktivlik hesaplanmalıdır.
• Anti-AFP antikorunun yükleme məlumatmi və bağlanma afinitesi ölçülmelidir.
• Yakalama və algılama antikorlarının klon və epitop uyğunluğu açıklanmalıdır.
• Partikül boyutu, dağılımı və partiya-partiya tekrarlanabilirliği incelenmelidir.
• LOD və LOQ daha çox düşük konsentrasiya tekrarıyla düzgünlanmalıdır.
• Daha geniş və klinik açıdan əhəmiyyətli girişimci paneli kullanılmalıdır.
• Hemolizli, lipemiyak və ikterik serumların etkisi araştırılmalıdır.
• Doğal AFP ehtiva edən pasiyent serumları analiz edilmelidir.
• Nəticəlar düzgünlanmış bir klinik referans metodiyle qarşılaştırılmalıdır.
• Tanısal duyarlılık, spesifiklik, ROC eğrisi və karar eşikleri dəyərlendirilmelidir.
• Uzun dönem antikor etkinliği və reaktif raf ömrü nicel olaraq belirlenmelidir.

Tədqiqatnın güclü yönleri

• MOF nanozim etkinliğini artırmak üçün bturşu bir yüzey liqand mühəndisliyi yaklaşımı önerilmiştir.
• Neokuproin hem katalitik güclendirici hem renk geliştirici olaraq istifadə edilmişdir.
• Antikor taşıma, kataliz, siqnal yaranması və sinyal yüksəltme eyni malzemede birleştirilmiştir.
• Anti-AFP@CuBPY bir mərhələli biomineralizasiyala hazırlanmıştır.
• Malzeme SEM, EDS, XRD və FT-IR ilə çok yönlü olaraq karakterize edilmiştir.
• Antikor yüklenmesinden sonra CuBPY’nin kristal quruluşsının korunduğu göstərilmişdir.
• Neokuproin desteğiyle 1,8 kat katalitik sinyal artımı bildirilmişdir.
• Anti-AFP@CuBPY’nin katalitik etkinliği 90 günlük depolamadan sonra da gözlenmiştir.
• PAPG, neokuproin, pH və reaksiya süresi sistematik olaraq optimize edilmiştir.
• Yakalama antikoru, etiketli antikor və BSA koşulları ayrı ayrı dəyərlendirilmiştir.
• 5–1000 ng/mL gibi geniş bir AFP ölçüm aralığı elde edilmiştir.
• Serum matriksi üçünde ekleme-geri qazanım deneyi gerçekleştirilmiştir.
• Doğal enzim gerektirmeyen bir kolorimetrik sistem geliştirilmiştir.

Tədqiqatnın məhdudlıkları

• Tədqiqat hakem dəyərlendirmesinden gecmemiş bir preprinttir.
• Pasiyent nümunəleri və ya doğal klinik AFP səviyyəleri dəyərlendirilmemiştir.
• Serumlar 50 kat seyreltilmiş və standart AFP ilə zenginleştirilmiştir.
• Geri kazanım aralığı yüzde 89,1–116,4 gibi geniş bir aralıktadır.
• Serum deneylerinde RSD yüzde 15,7’ye yaklaşabilmektedir.
• Yüksek ekleme səviyyəlerinde pozitif ölçüm sapması görülmüşdür.
• Test edilən girişimci protein sayısı məhduddır.
• Hemoliz, lipemiya, bilirubin və heterofil antikor etkiləri araştırılmamıştır.
• Klinik referans metodle müqayisə yapılmamıştır.
• Tanısal duyarlılık, spesifiklik və ya ROC analizi mövcud deyil.
• AFP’nin klinik karar eşikleri tədqiqat üçünde dəyərlendirilmemiştir.
• LOQ bildirilmemiştir.
• LOD, kalibrasiya aralığının en düşük noktasıyla eynidır.
• Kalibrasyon artık analizi və konsentrasiyaa bağlı ölçüm belirsizliği sunulmamıştır.
• Neokuproinin yüzey kaplama miktarı belirlenmemiştir.
• Cu(II)/Cu(I) dönüşümü birbaşa dəyərlik analiziyle düzgünlanmamıştır.
• Katalitik iyiləşme ayrıntılı enzim kinetiğiyle dəyərlendirilmemiştir.
• Antikor yükleme məlumatmi və antikor yönelimi nicel olaraq belirlenmemiştir.
• Yakalama və algılama antikorlarının klon və ya epitop bilgiləri ana metinde məlumatlmemiştir.
• SEM’de bildirilən yapılar təxminən 2–3 µm ölçeğindedir.
• Parti-parti üretim tekrarlanabilirliği raporlanmamıştır.
• Metod başka bir laboratuvarda müstəqil olaraq düzgünlanmamıştır.
• Malzeme və cihaz ayrıntılarının bir bölməünün ek dosyada bulunduğu belirtilmiş, lakin ilgili ayrıntıların tamamı ana PDF’de sunulmamıştır.

Tədqiqat ne söylüyor?

• CuBPY, PAPG üçün hidrolaza və β-D-qalaktosidaza benzeri katalitik aktivlik göstərir.
• Neokuproin CuBPY’nin oluşturduğu kolorimetrik sinyali təxminən 1,8 kat artırmıştır.
• Neokuproin hem katalitik güclendirici hem Cu(I) üçün renk geliştirici olaraq işlev görməktedir.
• Anti-AFP antikoru CuBPY yapısına bir mərhələli biomineralizasiyala dahil ediləbilmiştir.
• Antikor eklenmesine rağmen CuBPY’nin kristal quruluşsı və katalitik işlevi büyük ölçüde korunmuştur.
• Anti-AFP@CuBPY sandvdaxili immunosensorde enzim işaretli antikor yerine kullanılabilmiştir.
• AFP konsentrasiyai arttıkça sarı rəngli Cu(I)-neokuproin sinyali artmıştır.
• 5–1000 ng/mL aralığında düzgünsal AFP yanıtı elde edilmiştir.
• Algılama sınırı 5 ng/mL olaraq bildirilmişdir.
• Seyreltilmiş və AFP eklenmiş serumlarda ölçüm gerçekleştiriləbilmiştir.

Tədqiqat ne söylemiyor?

• Sistemin klinik olaraq onaylanmış bir AFP testi olduğunu göstermemektedir.
• Pasiyent və sağlıklı bireyleri ayırabildiğini göstermemektedir.
• Belirli bir pasiyentlığın tanısını koyduğunu göstermemektedir.
• Klinik duyarlılık və ya spesifiklik qanıtı sunmamaktadır.
• Doğal pasiyent AFP səviyyəlerini düzgünlanmış referans metodle müqayisəmaktadır.
• Neokuproin-CuBPY meqanizmasının bütün moleküler basamaklarını birbaşa qanıtlamamaktadır.
• Geliştirilən nanozimin təbii enzimlerden genel olaraq daha hızlı olduğunu göstermemektedir.
• Sistemin bütün serum girişimlerine dayanıklı olduğunu göstermemektedir.
• Evde, sahada və ya pasiyent başında kullanılmaya hazır bir ürün sunduğunu göstermemektedir.
• Ticari üretim maliyeti və ya seri üretim başarısı sunmamaktadır.

Tədqiqatnın Metodi və Nəticələrı

Malzeme tasarımının teknik özeti

Anti-AFP@CuBPY sentez koşulları

Malzeme karakterizasyonunun özeti

İmmunosensor uygulama protokolü

Optimize edilən parametreler

Analitik performans nəticəları

Şəkillerin temel mesajları

Teknik nəticəların toplu dəyərlendirmesi

• CuBPY, PAPG üçün hidrolaza benzeri katalitik mərkəz olaraq çalışmıştır.
• Neokuproin mis merkezleriyle koordinasiya kurarak rəng siqnalıni artırmıştır.
• Neokuproin varlığında təxminən 1,8 kat daha yüksek katalitik sinyal bildirilmişdir.
• Anti-AFP antikorunun biomineralizasiyala eklenmesi MOF kristal quruluşsını belirgin bdaxiliimde bozmamıştır.
• Anti-AFP@CuBPY, CuBPY’ye yakın katalitik aktivlik göstermiştir.
• Malzemenin neokuproin destekli katalitik etkinliği 90 günlük depolamadan sonra da gözlenmiştir.
• AFP miktarı arttıkça tutulan nanozim və oluşan sarı Cu(I)-Nc sinyali artmıştır.
• Metod geniş bir kalibrasiya aralığı sağlamış, lakin LOD ilə alt kalibrasiya sınırı eyni dəyərde kalmıştır.
• Serum ekleme nəticəları kullanılabilirlik göstermiş, fakat tampon ölçümlerine göre daha yüksek dəyişkənlik və qələviı pozitif sapmalar ortaya çıkarmıştır.
• Klinik uygulama üçün pasiyent nümunəleri və referans metod müqayisəsı gereklidir.

Mənbə və Metod Notu

Bu daxilierik, Dan Li, Yifan Niu, Yuchen Zhang, Na Li, Siqi Zhang, Jiajia Shi, Yueqi Liu, Xiaoming Chen və Yong Zhao tarafından hazırlanan “Surface ligand engineering of copper-based MOFs with hydrolase-mimetic activity for colorimetric immunosensing of AFP” baş örtüyülı tədqiqatya dayanmaktadır.

Tədqiqat; CuBPY adlı mis əsaslı metal-organik karkasin neokuproin səth liqandı kullanılarak katalitik açıdan güclendirilmesini və AFP ölçümünde kolorimetrik immunosensor olaraq kullanılmasını bildiren deneysel bir preprint araşdırma makalesidir.

Mətnde açıkça “This preprint research paper has not been peer reviewed” ifadesi yer alır. Dolayısıyla tədqiqat hakem dəyərlendirmesinden gecmemiştir. PDF’de dergi kabulü və ya hakemli nihai yayın bilgisi mövcud deyil.

Araşdırma klinik tədqiqat deyil. Pasiyent grubu, tanı düzgünluğu, pasiyentlık sınıflandırması və ya müalicə sonucu incelenmemiştir. Serum deneyleri, 50 kat seyreltilmiş insan serumuna bilinen miktarda standart AFP eklenerek gerçekleştirilmiştir.

Geliştirilən sensörün serum geri qazanımları yüzde 89,1–116,4, nisbi standart sapmaları yüzde 15,7’nin altında aşkar edilmişdir. Bu dəyərler serum matriksi üçünde ölçüm yapılabiləceğini desteklemekle birlikte klinik laboratuvar validasiyau üçün yeterli deyil.

Neokuproinin CuBPY’nin katalitik etkinliğini 1,8 kat artırdığı absorbans müqayisəlarıyla bildirilmişdir. Ayrıntılı Michaelis–Menten kinetiği, Cu(II)/Cu(I) dəyərlik analizi və neokuproin yüzey kaplama yoğunluğu sunulmamıştır.

Antikor immobilizasyonu SEM, EDS, XRD və FT-IR məlumatleriyle desteklenmiştir. Bununla belə antikor yükleme məlumatmi, antikor yönelimi və bağlanma afinitesi nicel olaraq belirlenmemiştir.

Tədqiqatda kullanılan seçicilik paneli BSA, HRP, GOx və ALP ilə məhduddır. Bu nəticəlar bütün serum girişimlerini, heterofil antikorları və ya klinik numune çeşitliliğini kapsamamaktadır.

Tədqiqat Natural Science Foundation of Hebei Province of China və Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation tarafından desteklenmiştir. Yazarlar çıkar çatışması bulunmadığını bildirmiştir.

Bu Türkçe makale yalnız yüklenen PDF’deki deney protokolleri, şəkiller, sayısal nəticəlar və yazarların meqanistik yorumlarına dayanarak hazırlanmıştır. PDF’de bulunmayan klinik tanı başarısı, ticari ürün hazır oluşu, pasiyent güvenliği və ya kəsikn moleküler meqanizma iddiaları eklenmemiştir.