Tatizo kuu la kisayansi katika utafiti huu ni jinsi ambavyo misombo ya neva yenye asili ya mimea, ambayo inaweza kuwa na athari katika hali zinazofanana na msongo wa mawazo na wasiwasi, inaweza kutathminiwa katika viwango vya kitabia na kimetaboliki. Wasiwasi si thamani moja ya kikemia inayoweza kupimwa moja kwa moja; tabia, mizunguko ya neva, mifumo ya nyurotransmita, homoni za msongo na metaboli ya seli hubadilika kwa pamoja. Kwa hiyo, kipimo kimoja tu cha tabia au kipimo kimoja tu cha metaboliti huenda kisitoshe kueleza mwitikio changamano wa msongo.

Kiumbe mfano kilichochaguliwa katika utafiti huu ni zebrafish, yaani Danio rerio. Zebrafish hutumiwa sana katika tafiti za nyurotabia kwa sababu wana mfumo wa neva wa mnyama mwenye uti wa mgongo, miitikio yao ya msongo hujitokeza katika tabia, mapendeleo yao ya eneo ndani ya tanki na mifumo ya kuogelea inaweza kupimwa, na wana thamani ya kulinganisha katika tafiti za magonjwa ya binadamu kwa upande wa jenetiki na fiziolojia. Makala inaeleza kwamba zebrafish wana jeni zinazolingana na takribani %70–80 ya jeni zinazohusishwa na magonjwa ya binadamu. Hata hivyo, ufanano huu haumaanishi kuwa matokeo ya zebrafish yanaweza kuhamishwa moja kwa moja kuwa matibabu ya binadamu; matokeo kutoka kwa viumbe mfano yanapaswa kutathminiwa kama hatua ya kuunda nadharia tete na kuchunguza mifumo.

Heterostemma piperifolium imewasilishwa katika utafiti kama spishi ambayo haijachunguzwa vya kutosha kifamakolojia. Inaelezwa kuwa mizizi ya mmea huu imetumiwa katika tiba ya jadi ya kikabila katika eneo la Orissa, India, kwa menorrhagia na homa. Hata hivyo, kama utafiti unavyosema wazi, hakuna matumizi ya jadi yaliyoripotiwa moja kwa moja kwa hali za nyurokisaikolojia kwa H. piperifolium. Watafiti wamehusisha pengo hili na ukweli kwamba spishi H. tanjorense ya jenasi hiyo hiyo, inayojulikana kwa jina lilelile la kienyeji na katika muktadha uleule wa jadi, imetumiwa kwa matatizo ya nyurokisaikolojia. Hii si ushahidi wa moja kwa moja, bali ni msingi wa kiethnofamakolojia wa kufanya utafiti.

Msingi wa kikemia unatokana na alkaloidi za aina ya purini. Alkaloidi za puriniamu na pirimidini kama heteromine A–K zimeripotiwa hapo awali kutoka jenasi Heterostemma. Kiunzi cha purini cha misombo hii kina ufanano wa kimuundo na vimoduli vya neva vinavyojulikana kama kafeini na theobromine. Kwa kuwa kafeini na viambato vinavyohusiana vya xanthine vinaweza kuonyesha athari za kuchochea na kurekebisha mfumo wa neva, watafiti walidhania kwamba alkaloidi za H. piperifolium zinaweza kuathiri msongo na tabia. Hii pia si ushahidi wa moja kwa moja wa ufanisi, bali ni nadharia tete ya utafiti iliyojengwa juu ya msingi wa kikemia na taksonomia.

Sehemu ya kwanza ya majaribio ya utafiti ilikuwa kuandaa sehemu ya mmea. Majani yalikusanywa Oktoba 2022 kutoka Pulau Tuba, Langkawi, Malaysia; utambuzi wa spishi ulifanywa na Dr. Shamsul Khamis na sampuli ya kumbukumbu ilisajiliwa katika maabara husika ya Universiti Teknologi MARA. Majani yaliyokusanywa yalikaushwa kivulini, yakasagwa kuwa unga na kilo 1,6 za nyenzo za mmea zilifanyiwa masereshini kwa methanoli kwa saa 72. Mwishowe, gramu 98,0 za dondoo ghafi ya methanoli yenye rangi ya kijani iliyokolea zilipatikana.

Dondoo hii ghafi haikutolewa moja kwa moja katika vipimo vya tabia. Kwanza iligawanywa kwa kromatografia ya safu wazi ya Sephadex LH-20. Gramu 6,5 za dondoo zilitenganishwa kwa mfumo wa dichloromethane:methanol 1:1 na sehemu HPMF1–HPMF4 zilipatikana. HPMF2 iligawanywa tena na sehemu ndogo HPMF2F1–HPMF2F4 zikapatikana; HPMF2F3 ilifanyiwa kromatografia ya ziada ya Sephadex LH-20 ili kuondoa klorofili. Sehemu ndogo wakilishi yenye utajiri wa alkaloidi iliyotumiwa katika tathmini za kibayolojia ni HPMF2F3F1.

Mfumo wa UHPLC-MS/MS ulitumiwa kwa wasifu wa kikemia. Utengano ulifanywa kwenye safu ya Accucore Vanquish C18 kwa awamu tembezi za maji yenye 0,1% asidi ya formiki na asetonitrili. Njia chanya na hasi za ESI zilitumiwa, na spektra za MS/MS zikakusanywa kwa nishati tofauti za mgongano. Data ghafi zilichakatwa kwa MZmine; hatua za utambuzi wa misa, uundaji wa kromatogramu, dekonvolusheni na uchujaji wa isotopu zilitumika. Kisha SIRIUS 5, CSI:FingerID na CANOPUS zilitumiwa kutabiri fomula ya molekuli, mgombea wa muundo na darasa la kikemia.

Katika uchambuzi huu jumla ya vipengele 1786 vya misa vilihifadhiwa, na kati yake misombo tisa yenye hitilafu ya misa ≤ 5 ppm iliwekewa utambulisho wa kimakadirio. Neno “kimakadirio” ni muhimu: misombo hii si utambulisho wa Level 1 uliothibitishwa kwa viwango rejea; ni vitambulisho vilivyopendekezwa kutokana na spectrometry ya misa ya azimio la juu, ufanano wa mgawanyiko wa MS/MS, ulinganifu wa hifadhidata na ufaafu wa kitaksonomia. Kwa hiyo sehemu ya kikemia ya utafiti inatoa wasifu wa awali wenye nguvu, lakini uthibitisho kwa misombo iliyosafishwa bado unahitajika.

Jedwali 1 linafupisha tabia ya kikemia ya sehemu yenye utajiri wa alkaloidi. Misombo mingi kati ya tisa ni ya darasa la alkaloidi za purini. Heteromine H iliripotiwa kwa fomula C₈H₁₁O₂N₅ katika dakika 1,58; heteromine G iliripotiwa kwa fomula C₉H₁₅O₂N₅ katika dakika 2,70. Misombo inayohusiana na purini kama 8-aminocaffeine na 2′-deoxyadenosine pia imo kwenye orodha. Total ion chromatogram katika Kielelezo 2 inaonyesha wasifu wa kromatografia wa sehemu hiyo na usambazaji wa vilele vinavyojitokeza. Taswira hii inaonyesha kwamba sehemu hiyo si kiwanja kimoja safi, bali ni mchanganyiko wenye alkaloidi/metaboliti nyingi.

Kabla ya majaribio ya tabia, jaribio la sumu kwa kiinitete cha zebrafish lilifanywa. Hatua hii ilifanywa kwa kufuata mbinu ya OECD Test Guideline 236 ili kuelewa kama sehemu iliyotumiwa ilisababisha sumu ya ukuaji. Katika sehemu yenye utajiri wa alkaloidi ya 10 mg/L, kati ya viinitete 24, 2 vilionyesha kuganda katika saa ya 24; katika saa ya 48 mabuu 22/24 yalikuwa yameanguliwa, katika saa ya 72 hakuna kasoro ya kimofolojia iliyoonekana, na katika saa ya 96 vifo vilikuwa 2/24, yaani %8. Katika udhibiti hasi vifo pia vilikuwa %8, huku katika kikundi cha udhibiti chanya cha 3,4-dichloroaniline vifo vikifikia %32.

Jedwali 2 linaonyesha wazi matokeo haya ya sumu. Hakukuwa na tofauti yenye maana katika vifo vya saa 96 kati ya sehemu ya alkaloidi na udhibiti hasi; p=1,000. Tofauti kati ya sehemu ya alkaloidi na udhibiti chanya iliripotiwa kama p=0,072 na haikufikia kikomo cha umuhimu wa kitakwimu. Katika sehemu ya mjadala, matokeo ya sumu kwa kiinitete yalitafsiriwa kuwa yanaashiria LC₅₀ ya zaidi ya 100 mg/L. Hata hivyo, viwango vilivyotumiwa katika majaribio ya tabia vilikuwa katika masafa ya 25–1250 ng/mL; viwango hivi ni vya chini sana kuliko ngazi za mg/L zilizotumiwa katika jaribio la sumu kwa kiinitete.

Katika modeli ya tabia ya zebrafish waliokomaa, jumla ya samaki 72 walitumiwa. Samaki walikuwa wild-type zebrafish wenye umri wa miezi 4–6 na urefu wa takribani 3–4 cm. Itifaki ya majaribio iliidhinishwa na kamati ya maadili ya Universiti Teknologi MARA. Samaki waligawanywa katika vikundi sita: udhibiti hasi uliowekewa msongo, udhibiti chanya uliowekewa msongo na kutibiwa kwa fluoxetine 10 mg/L, vikundi vitatu vilivyowekewa msongo na kutibiwa kwa sehemu ya alkaloidi ya 25 ng/mL, 250 ng/mL au 1250 ng/mL, na kikundi cha kawaida kisichowekewa msongo. Vipimo vya tabia vilitathminiwa hasa katika vikundi vilivyowekewa msongo na kutibiwa.

Modeli ya msongo imewasilishwa kama mchoro wa mtiririko katika Kielelezo 1. Kielelezo kinaonyesha kwanza vikundi vya matibabu, kisha hatua ya msongo wa kimwili wa dakika mbili, na baada yake vipimo vya tabia. Kichocheo cha msongo kilitolewa kwa swirling katika tanki dogo. Vipimo vya tabia vilikuwa swim test, novel tank test na light-dark test. Kielelezo 1 ni muhimu kwa sababu kinaonyesha uti wa mgongo wa majaribio yote kwa mtazamo mmoja: athari ya sehemu ya mmea haikuhusishwa na matokeo moja tu ya tabia, bali na paradigms kadhaa za tabia na baadaye uchambuzi wa metabolomiki.

Katika swim test, shughuli ya lokomota ilitathminiwa kwa jumla ya mwendo na kasi ya kuogelea. Kulingana na tafsiri ya utafiti, mwendo ulioongezeka au uliovurugika unaweza kuakisi mwitikio wa msongo; reduced movement au immobility pia inaweza kutafsiriwa kama kiashiria cha wasiwasi/msongo. Jambo muhimu hapa ni kwamba vipimo vya tabia havipaswi kusomwa kwa urahisi kama “kuogelea zaidi ni bora” au “kuogelea kidogo ni bora”. Vinapaswa kutafsiriwa pamoja na modeli ya msongo, udhibiti chanya na vipimo vingine vya tabia.

Katika swim test, matokeo ya ANOVA yana maana:

\[ F(4,45) = 200.524,\quad p < 0.001 \]

Kauli hii inaonyesha kwamba kulikuwa na tofauti yenye maana ya kitakwimu katika wastani wa kasi ya kuogelea kati ya vikundi vya matibabu. Thamani ya F inawakilisha uwiano wa utofauti kati ya vikundi dhidi ya utofauti ndani ya vikundi; p<0,001 inaonyesha kuwa uwezekano wa tofauti hii kuelezwa kwa bahati ni mdogo sana. Kulingana na uchambuzi wa Tukey post hoc, kikundi hasi kilionyesha kasi ya kuogelea iliyo juu kwa kiasi kikubwa kuliko udhibiti chanya. Vikundi vya 25 ng/mL na 250 ng/mL pia vilionyesha kasi ya kuogelea iliyo juu kwa kiasi kikubwa kuliko udhibiti chanya; kikundi cha 1250 ng/mL hakikuonekana tofauti na udhibiti chanya.

Kielelezo 3 kinaonyesha matokeo haya kama grafu ya nguzo. Kasi ya kuogelea ni ya juu sana katika kikundi hasi cha msongo na iko chini sana katika udhibiti chanya wa fluoxetine. Katika vikundi vya 25 na 250 ng/mL kasi iko juu kuliko udhibiti chanya lakini chini kuliko udhibiti hasi. Kikundi cha 1250 ng/mL kinaonekana kuwa karibu zaidi na kikundi cha fluoxetine. Grafu hii inaonyesha kwamba sehemu ya alkaloidi iliathiri mwitikio wa lokomota kwa namna tofauti kulingana na dozi.

Novel tank test ni jaribio linalotumiwa mara kwa mara katika tafiti za wasiwasi kwa zebrafish. Samaki anapowekwa katika mazingira mapya ya tanki kwa kawaida hukaa kwanza katika sehemu ya chini; baada ya muda tabia ya kupanda juu na kuchunguza huongezeka. Kukaa muda mrefu katika sehemu ya chini kwa kawaida hutafsiriwa kuwa kiashiria cha tabia inayofanana na wasiwasi. Katika utafiti huu, kipimo kikuu ni muda uliotumika katika sehemu ya chini.

Katika novel tank test, athari ya matibabu ilionekana kuwa na maana:

\[ F(4,45) = 52.984,\quad p < 0.001 \]

Kulingana na uchambuzi wa Tukey, vikundi vyote vya matibabu vilikaa katika sehemu ya chini kwa muda mrefu zaidi ikilinganishwa na kikundi cha udhibiti chanya cha fluoxetine. Hata hivyo, kati ya vikundi vya sehemu ya alkaloidi, dozi ya 250 ng/mL iliripotiwa kuwa na muda mfupi zaidi katika sehemu ya chini ikilinganishwa na udhibiti hasi. Katika Kielelezo 4, muda uliotumika katika sehemu ya chini ni mrefu katika kikundi cha udhibiti hasi, ni mfupi sana katika udhibiti chanya, na ni mrefu kuliko udhibiti chanya katika vikundi vya 25/250/1250 ng/mL lakini kuna mifumo tofauti kati ya dozi. Hali hii inaashiria kwamba sehemu hiyo haikuunda wasifu wa uchunguzi wa sehemu ya juu wenye nguvu kama fluoxetine, lakini hasa katika dozi ya 250 ng/mL inaweza kuonyesha ahueni ya sehemu ikilinganishwa na kikundi chenye msongo.

Katika light-dark test, mapendeleo ya zebrafish kati ya eneo lenye mwanga na lenye giza yalitathminiwa. Kwa kawaida, kuepuka kwa nguvu eneo lenye giza au kukaa kwa muda mrefu gizani kunaweza kuhusishwa na tabia inayofanana na wasiwasi; kuongezeka kwa muda katika eneo lenye mwanga kunaweza, katika baadhi ya hali, kutafsiriwa kama kupungua kwa tabia inayofanana na wasiwasi. Katika utafiti, tanki liligawanywa katika sehemu mbili, samaki wakaruhusiwa kusogea kwa uhuru na muda waliotumia katika eneo lenye mwanga ukapimwa.

Katika light-dark test, matokeo ya ANOVA yalikuwa kama ifuatavyo:

\[ F(4,45) = 3.830,\quad p < 0.05 \]

Hii inaonyesha kwamba kulikuwa na tofauti yenye maana kati ya vikundi katika muda uliotumika katika eneo lenye mwanga; hata hivyo, athari haikuwa na nguvu kama katika swim test na novel tank test. Kulingana na uchambuzi wa Tukey, udhibiti hasi na kikundi cha sehemu ya 25 ng/mL vilikaa katika eneo lenye mwanga kwa muda mrefu kwa kiasi kikubwa kuliko udhibiti chanya. Katika vikundi vya 250 na 1250 ng/mL, wastani wa muda katika eneo lenye mwanga ulikuwa juu kuliko udhibiti chanya lakini haukufikia umuhimu wa kitakwimu. Kielelezo 5 kinaonyesha kwamba tofauti hizi zilikuwa ndogo na zenye mabadiliko zaidi kitabia.

Tafsiri ya jumla ya data ya tabia ni kwamba sehemu ya alkaloidi haikurekebisha kikamilifu mifumo ya tabia iliyovurugwa na msongo katika kila kipimo kwa kiwango sawa na fluoxetine, lakini ilionyesha ahueni ya sehemu iliyo thabiti zaidi hasa katika dozi ya kati, yaani 250 ng/mL. Katika mjadala, watafiti wanatafsiri hali hii kama athari inayofanana na anxiolytic. Hata hivyo, neno “inayofanana na anxiolytic” halimaanishi matibabu ya kliniki ya wasiwasi; linamaanisha kupungua kwa mabadiliko ya tabia yanayohusiana na msongo ndani ya paradigms za tabia za zebrafish.

Uchambuzi wa metabolomiki ni mhimili wa pili mkuu wa utafiti. Baada ya matibabu, ubongo wa samaki ulitolewa, ukagandishwa haraka katika nitrojeni kimiminika, ukachimbwa kwa mfumo wa methanoli-maji-kloroformu na kuingizwa katika uchambuzi wa untargeted metabolomics unaotegemea LC-MS/MS. Sampuli 42 za mtu mmoja mmoja na sampuli 7 za pooled quality control zilitumiwa. Data zilichakatwa kwa MZmine, anoteshini ya metaboliti ikafanywa kwa SIRIUS/CSI:FingerID, na uchambuzi wa pathway enrichment pamoja na taswira ukafanywa kwa MetaboAnalyst.

PCA, yaani principal component analysis, ilitumiwa kuona usambazaji wa jumla wa vikundi katika data ya metabolomiki. Katika utafiti iliripotiwa kwamba katika grafu ya alama za global PCA, vipengele viwili vikuu vya kwanza vilieleza jumla ya %48,6 ya varianse:

\[ PC1 = 25.7\%,\quad PC2 = 22.9\%,\quad PC1+PC2 = 48.6\% \]

Kauli hii inaonyesha kwamba takribani nusu ya utofauti katika data ya metabolomiki inaweza kuonyeshwa kwenye mihimili miwili ya kwanza. PCA haisemi moja kwa moja ni metaboliti ipi iliyobadilika; badala yake inaonyesha kama wasifu wa jumla wa metaboliki wa vikundi unafanana au unatofautiana.

Katika Kielelezo 6, kikundi hasi cha msongo kilijitenga na vikundi vingine hasa katika mwelekeo wa PC1. Kikundi cha udhibiti chanya cha fluoxetine kilionyesha mkengeuko tofauti na kikundi cha msongo kando ya PC2. Vikundi vya sehemu ya alkaloidi vilikusanyika karibu na katikati ya grafu na kuonyesha mwingiliano wa sehemu na vidhibiti hasi/chanya. Hii inaashiria kwamba sehemu hiyo haikurejesha kabisa wasifu wa metaboliki kuwa wa kawaida, lakini iliunda nafasi za kati kati ya wasifu wa msongo na wa fluoxetine.

Kielelezo 7 kinaonyesha kwa undani zaidi ulinganisho wa jozi wa PCA. Kuna utengano dhahiri kati ya kikundi cha kawaida kisichowekewa msongo na kikundi hasi cha msongo; hili linaunga mkono kwamba msongo ulibadilisha wasifu wa metaboliti za ubongo. Pia kuna utengano kati ya kikundi hasi na kikundi cha fluoxetine. Kikundi cha sehemu ya 25 ng/mL kilibaki karibu na udhibiti hasi, huku kikundi cha 250 ng/mL kikijitenga zaidi na udhibiti hasi na kuchukua nafasi ya kati kuelekea udhibiti chanya. Kikundi cha 1250 ng/mL pia kilijitenga na udhibiti hasi na kuonyesha usambazaji wa metaboliki ulio karibu zaidi na udhibiti chanya. Mfano huu unaunga mkono wazo la upangaji upya wa metaboliki unaohusiana na dozi.

Uchambuzi wa heatmap unaonyesha jinsi metaboliti 23 tofauti zilivyobadilika kati ya vikundi. Katika Kielelezo 8 kila mstari unawakilisha metaboliti na kila safu inawakilisha sampuli. Rangi ya chungwa inaonyesha kuongezeka kwa wingi wa metaboliti, na rangi ya buluu inaonyesha kupungua. Wasifu wa metaboliki wa kikundi hasi cha msongo unatofautiana na udhibiti chanya na vikundi vya dozi kubwa ya sehemu. Kikundi cha 25 ng/mL hukusanyika karibu zaidi na udhibiti hasi, huku vikundi vya 250 na 1250 ng/mL vikionyesha mifumo inayofanana zaidi na kikundi cha fluoxetine.

Makundi ya metaboliti yanayojitokeza katika heatmap yanaweza kukusanywa chini ya mada kadhaa za kibayolojia. Ya kwanza ni metaboli ya asidi amino: metaboliti kama tyrosine, threonine, phenylalanine, valine, serine, lysine, glutamine, aspartic acid na proline zilibadilika kati ya vikundi vya msongo na matibabu. Kwa sababu phenylalanine na tyrosine zinahusiana na vitangulizi vya nyurotransmita za catecholamine, mabadiliko haya yana maana katika muktadha wa usanisi wa nyurotransmita na kuzoea msongo. Glutamine na aspartic acid zinaweza kutathminiwa katika muktadha wa excitatory neurotransmission na miunganisho ya kimetaboliki ya neuron–astrocyte.

Mada ya pili muhimu ni njia ya tryptophan–kynurenine. Katika utafiti, viambato vya tryptophan kama kynurenine na picolinic acid ni miongoni mwa metaboliti tofauti. Kwa kuwa metaboli ya tryptophan inahusishwa na biolojia ya serotonin, uanzishaji wa kinga, mwitikio wa msongo na uzalishaji wa metaboliti zenye shughuli za neva, mabadiliko katika njia hii yana umuhimu kwa hali zinazofanana na wasiwasi. Hata hivyo, utafiti haukupima moja kwa moja ni enzimu gani katika njia hii ilibadilika; kwa hiyo matokeo yanapaswa kutafsiriwa katika ngazi ya njia.

Mada ya tatu ni metaboli ya nishati. Mabadiliko katika metaboliti kama fumarate na creatine yanaweza kuhusishwa na mzunguko wa nishati wa mitokondria, uhifadhi wa nishati wa seli na mahitaji ya nishati wakati wa msongo. Katika mjadala, matokeo haya yalitafsiriwa kuhusiana na metaboli ya nishati ya mitokondria na usawa wa redox. Tafsiri hii inaendana na fasihi ya jumla kwamba msongo unaweza kuathiri metaboli ya nishati ya ubongo; hata hivyo, kazi ya mitokondria haikupimwa moja kwa moja katika utafiti huu.

Mada ya nne ni metaboli ya purini/nukleotidi. Mabadiliko ya metaboliti kama uracil, thymine na xanthine yanaweza kutathminiwa katika muktadha wa miitikio ya seli kwa msongo, ubadilishaji wa nukleotidi na ishara za purinergic. Mada hii pia ni ya kuvutia kidhana kutokana na alkaloidi za purini zilizo katika sehemu ya mmea. Hata hivyo, utafiti huu haujathibitisha kwa sababu na matokeo kwamba alkaloidi za purini katika sehemu hiyo zilibadilisha moja kwa moja metaboliti maalum za purini katika ubongo.

Mada ya tano ni metaboli ya fosfolipidi. Metaboliti kama Glycerophosphocholine na 1-octadecanoyl-sn-glycerophosphocholine zinahusishwa na mzunguko wa fosfolipidi na mienendo ya utando wa seli. Katika tishu za neva, metaboli ya lipidi ni muhimu kwa uadilifu wa utando, utendaji wa sinepsi na kuzoea kwa seli wakati wa msongo. Mabadiliko ya metaboliti hizi kati ya vikundi vya matibabu katika Kielelezo 8 yanaashiria kwamba sehemu hiyo inaweza kuhusishwa si tu na vitangulizi vya nyurotransmita bali pia na michakato inayohusiana na utando.

Moja ya tafsiri zinazovutia zaidi katika utafiti ni kwamba athari ya kitabia na ya metabolomiki haikuwa kubwa zaidi katika dozi ileile. Katika mjadala, inaelezwa kwamba kikundi cha 250 ng/mL kilionyesha athari iliyo dhahiri zaidi katika uboreshaji wa tabia, lakini urejeshaji wa metabolomiki ulionekana kuwa na nguvu zaidi katika dozi za juu. Hali hii ilielezwa kwa mahusiano ya dozi–mwitikio yasiyo ya mstari au yenye umbo la U lililogeuzwa yanayoweza kuonekana katika misombo yenye shughuli za neva. Kwa maneno mengine, dozi kubwa zaidi haimaanishi daima matokeo bora ya tabia; katika mfumo wa neva athari bora inaweza kutokea katika masafa fulani ya dozi.

Nguvu ya utafiti huu ni kwamba badala ya kutathmini sehemu ya bidhaa asilia kwa kipimo kimoja cha tabia, imeichunguza kwa pamoja kupitia wasifu wa kikemia, sumu kwa kiinitete, paradigms tatu za tabia na metabolomiki ya ubongo. Mbinu hii ya tabaka nyingi inafaa kwa kuelewa athari za malengo mengi za mchanganyiko tata wa mimea. Pia matumizi ya fluoxetine kama udhibiti chanya yaliwezesha matokeo ya tabia na metabolomiki kulinganishwa na rejea ya kifamakolojia inayojulikana.

Mapungufu ya utafiti pia yanapaswa kuwekwa wazi. Kwanza, utafiti ni preprint ambayo haijapitia tathmini ya wenzao. Pili, utambulisho wa metaboliti ni wa kimakadirio; haujathibitishwa kwa viwango halisi. Tatu, sehemu ya alkaloidi si kiwanja safi; haijulikani ni kiwanja gani kinachochangia kwa kiwango gani katika athari za tabia na metabolomiki. Nne, modeli ya zebrafish si sawa moja kwa moja na wasiwasi wa kliniki kwa binadamu. Tano, sababu na matokeo hazijathibitishwa; mabadiliko ya metaboliti yanaambatana na mabadiliko ya tabia, lakini hayajaonyeshwa kwa uhakika kuwa ndiyo chanzo cha tabia.

Kwa mtazamo wa historia, utafiti huu unaongezeka kwenye mkondo wa tafiti za bidhaa asilia unaohusu uwezo wa alkaloidi zenye shughuli za neva katika familia Apocynaceae na alkaloidi za purini zilizoripotiwa kutoka jenasi Heterostemma. Thamani yake leo ni kwamba kwa mara ya kwanza unachunguza kwa utaratibu spishi H. piperifolium, ambayo hapo awali haijachunguzwa sana kifamakolojia, katika viwango vya tabia na metabolomiki. Kwa siku zijazo, utafiti unaweza kuwa msingi wa kutenga alkaloidi binafsi katika sehemu hiyo, kuthibitisha metaboliti kwa viwango halisi, kufanya targeted metabolomics, kupima mifumo katika kiwango cha vipokezi au enzimu, na kufanya tafiti pana zaidi za dozi na muda.

Athari kwa maisha ya kila siku haipaswi kutafsiriwa moja kwa moja kama “mmea huu unatibu wasiwasi”. Tafsiri sahihi zaidi ni kwamba bidhaa asilia zinaweza kuonyesha athari za kibayolojia zenye malengo mengi zinazohusiana na mfumo wa neva; lakini ili kuelewa athari hizo kwa kuaminika, tabia, kemia na metaboli zinahitaji kuchunguzwa pamoja. Utafiti huu ni wa hatua ya awali, wa kabla ya kliniki na wa kuzalisha nadharia tete, unaochunguza athari zinazowezekana za sehemu za alkaloidi zenye asili ya mimea katika tabia inayohusiana na msongo na metaboli ya ubongo.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Mbinu ya utafiti inajumuisha ukusanyaji na uchimbaji wa nyenzo ya mmea, maandalizi ya sehemu yenye utajiri wa alkaloidi kwa Sephadex LH-20, anoteshini ya kikemia inayotegemea UHPLC-MS/MS na SIRIUS, jaribio la sumu kwa kiinitete cha zebrafish, modeli ya msongo mkali kwa zebrafish waliokomaa, vipimo vitatu vya tabia na uchambuzi wa metabolomiki ya ubongo.

Matokeo ya anoteshini ya kikemia: Katika uchambuzi wa UHPLC-MS/MS, vipengele 1786 vya misa viligunduliwa na misombo tisa iliwekewa anoteshini ya kimakadirio kwa mtiririko wa kazi unaotegemea SIRIUS. Jedwali lifuatalo linafupisha kwa mpangilio misombo mikuu iliyotolewa katika utafiti.

Kwa kuwa utambulisho wa misombo hii haujathibitishwa kwa viwango rejea, unapaswa kutathminiwa kama anoteshini ya kimakadirio, si utambuzi wa mwisho wa misombo.

Matokeo ya sumu kwa kiinitete:

Matokeo haya yanaunga mkono kwamba katika kiwango cha 10 mg/L kilichopimwa, sehemu ya alkaloidi haikuonyesha vifo vya juu kuliko udhibiti hasi. Hata hivyo, hii si ushahidi wa usalama wa muda mrefu au usalama kwa kiumbe aliyekomaa.

Vipimo vya tabia na matokeo ya kitakwimu:

Usomaji wa jumla wa matokeo ya tabia:

• Uwekaji wa msongo ulisababisha mabadiliko dhahiri katika tabia za zebrafish.
• Udhibiti chanya wa fluoxetine, kama ilivyotarajiwa, ulibadilisha wasifu wa tabia unaohusiana na msongo.
• Sehemu ya alkaloidi haikurekebisha kabisa kuvurugika kwa tabia, lakini ilionyesha ahueni ya sehemu katika baadhi ya vigezo.
• Dozi ya 250 ng/mL ilitafsiriwa katika sehemu ya mjadala kuwa kiwango kilichotoa wasifu thabiti zaidi wa uboreshaji wa tabia.
• Ingawa dozi ya 1250 ng/mL ilionekana kuwa karibu zaidi na fluoxetine katika wasifu wa metabolomiki, haikutoa matokeo bora zaidi katika kila kipimo cha tabia.

Matokeo ya PCA na metabolomiki:

Makundi ya metaboliti tofauti yanayojitokeza katika heatmap:

Kauli kuu za kitakwimu zilizotumiwa na zilizoelezwa katika utafiti:

\[ F(4,45) = 200.524,\quad p < 0.001 \]

Kauli hii inaonyesha kwamba katika swim test kulikuwa na tofauti kubwa ya kitakwimu kati ya vikundi katika wastani wa kasi ya kuogelea. Jaribio la F katika ANOVA hutathmini uwiano wa varianse kati ya vikundi na varianse ndani ya vikundi.

\[ F(4,45) = 52.984,\quad p < 0.001 \]

Kauli hii inaonyesha kwamba katika novel tank test kulikuwa na tofauti yenye maana kati ya vikundi vya matibabu katika muda uliotumika kwenye sehemu ya chini.

\[ F(4,45) = 3.830,\quad p < 0.05 \]

Kauli hii inaonyesha kwamba katika light-dark test kulikuwa na tofauti yenye maana kati ya vikundi katika muda uliotumika katika eneo lenye mwanga; hata hivyo, athari ilikuwa ndogo zaidi kuliko katika vipimo vingine.

[ PC1 + PC2 = 25.7\% + 22.9\% = 48.6\% ]

Uhusiano huu unaonyesha kwamba katika grafu ya alama za PCA, vipengele viwili vikuu vya kwanza vilieleza jumla ya %48,6 ya varianse ya metabolomiki. Thamani hii husaidia kuelewa ni kwa kiwango gani wasifu wa metaboliki unaweza kuwakilishwa katika grafu ya vipimo viwili.

Matokeo ya jumla:

• H. piperifolium ilitumiwa kuandaa sehemu yenye utajiri wa alkaloidi kutoka kwenye majani.
• Kwa anoteshini inayotegemea UHPLC-MS/MS na SIRIUS, misombo tisa ya kimakadirio ilitambuliwa, na mingi ikaainishwa kama alkaloidi za aina ya purini.
• Katika jaribio la sumu kwa kiinitete, sehemu ya 10 mg/L ilionyesha kiwango kilekile cha vifo kama udhibiti hasi baada ya saa 96: %8.
• Modeli ya msongo mkali kwa zebrafish waliokomaa ilisababisha mabadiliko dhahiri katika viwango vya tabia na metabolomiki.
• Matokeo ya swim test, novel tank test na light-dark test yalionyesha kwamba sehemu hiyo ilibadilisha kwa kiwango fulani kuvurugika kwa tabia kunakohusiana na msongo.
• Dozi ya 250 ng/mL ilitafsiriwa kuwa na wasifu thabiti zaidi wa uboreshaji wa tabia.
• Katika uchambuzi wa Brain metabolomics, metaboliti 23 tofauti zilitambuliwa.
• Mabadiliko ya metaboliki yanahusishwa na metaboli ya asidi amino, njia ya tryptophan–kynurenine, metaboli ya nishati, metaboli ya purini/nukleotidi na mzunguko wa fosfolipidi.
• Uchambuzi wa Heatmap na PCA ulionyesha kwamba katika vikundi vya dozi kubwa, wasifu wa metaboliki uliovurugwa na msongo unaweza kusogea kuelekea mifumo inayofanana na fluoxetine.
• Utafiti hautoi ushahidi wa matibabu ya wasiwasi au ufanisi wa dawa ya mfadhaiko kwa binadamu; unatoa matokeo ya awali katika modeli ya zebrafish ya kabla ya kliniki.

Maelezo ya Chanzo na Mbinu

Maudhui haya yameandaliwa kwa msingi wa utafiti wenye kichwa “Integrated Neurobehavioral and Brain Metabolomics Analysis of Heterostemma piperifolium Alkaloid-Enriched Fractions in a Zebrafish Acute Stress Model” ulioandaliwa na Dinie Carmila Khairul, Richard Johari James, Salfarina Ramli, Shamsul Khamis, Nur Khaleeda Zulaikha Zolkeflee, Kathleen J. Jalani na Nurulfazlina Edayah Rasol.

Aina ya chanzo ni makala ya utafiti ya preprint. Maandishi yana kauli wazi “This preprint research paper has not been peer reviewed”. Kwa hiyo utafiti haujapitia tathmini ya wenzao. Taarifa inayothibitisha DOI, kukubaliwa kwa mwisho na jarida au kukamilika kwa mchakato wa tathmini ya wenzao haiwezi kuthibitishwa kutokana na maandishi.

Maelezo katika makala hii yameandaliwa kwa msingi wa maandalizi ya nyenzo ya mmea, mchakato wa kugawanya sehemu kwa Sephadex LH-20, anoteshini ya kikemia inayotegemea UHPLC-MS/MS na SIRIUS, jaribio la sumu kwa kiinitete cha zebrafish, modeli ya msongo mkali kwa zebrafish waliokomaa, swim test, novel tank test, light-dark test, PCA, heatmap na matokeo ya metabolomiki ya ubongo yaliyotolewa katika utafiti. Hakuna madai yasiyokuwapo katika PDF kuhusu athari ya kliniki, matibabu ya wasiwasi kwa binadamu, mafanikio ya dawa ya mfadhaiko, dhamana ya usalama, pendekezo la dozi au matumizi ya bidhaa yaliyoongezwa.

Utafiti huu si jaribio la kliniki. Hauhusishi kundi la wagonjwa binadamu, utambuzi wa kliniki, itifaki ya matibabu, pharmacokinetics ya binadamu au utafiti wa usalama. Matokeo yamewekewa mipaka na jaribio la sumu kwa kiinitete cha zebrafish, modeli ya tabia kwa zebrafish waliokomaa na uchambuzi wa metabolomiki ya ubongo. Matokeo ya tabia yanapaswa kutathminiwa katika muktadha wa tabia “zinazofanana na wasiwasi” za zebrafish; hayapaswi kusomwa kama ushahidi wa moja kwa moja wa matibabu ya matatizo ya wasiwasi kwa binadamu.

Utambulisho wa kikemia kwa kiasi kikubwa uko katika kiwango cha kimakadirio. Utambulisho wa metaboliti na alkaloidi ulipendekezwa kutokana na data ya MS/MS ya azimio la juu, utabiri wa SIRIUS/CSI:FingerID, ulinganifu wa hifadhidata na ufaafu wa kitaksonomia; haukuthibitishwa kwa uhakika kwa viwango halisi. Kwa hiyo, targeted metabolomics, utengaji wa misombo safi na ulinganisho na viwango rejea utahitajika siku zijazo.

Moja ya mapungufu muhimu ya utafiti ni kutoweza kuthibitisha uhusiano wa kisababishi kati ya mabadiliko ya tabia na metabolomiki. Imeonyeshwa kwamba metaboliti fulani zinaambatana na mabadiliko ya tabia; lakini haijathibitishwa kwamba metaboliti hizo ndizo chanzo cha moja kwa moja cha mabadiliko ya tabia. Pia kwa kuwa sehemu hiyo ni mchanganyiko, haijulikani ni alkaloidi gani inachangia katika athari gani ya kibayolojia. Kutokana na hadhi ya preprint, inapaswa kuzingatiwa kwamba matokeo yanaweza kubadilika baada ya tathmini ya wenzao au kuhitaji uthibitisho wa ziada.