Tatizo kuu la utafiti huu ni kwamba ufuatiliaji wa matumizi ya opioidi katika kiwango cha jamii unahitaji mbinu za uchanganuzi zilizoaminika, nyeti na zinazoweza kutekelezwa katika maabara nyingi zaidi. Mgogoro wa opioidi, hasa kutokana na kuenea kwa opioidi sintetiki kama fentanyl na vitokanavyo nayo, umegeuka kuwa tatizo kubwa la afya ya umma. Vyanzo vya jadi vya data, kama tafiti za dodoso, rekodi za hospitali, vifo vya overdose, maombi ya tiba, data za vyombo vya sheria na rekodi za dawa zilizokamatwa, mara nyingi ni viashiria visivyo vya moja kwa moja au vinavyochelewa. Ni muhimu, lakini haviwezi daima kuonyesha kwa wakati, kwa kutopendelea na kwa kina mwelekeo halisi wa matumizi katika jamii.

Epidemiolojia inayotegemea maji machafu, yaani wastewater-based epidemiology au WBE, imeibuka ili kujaza pengo hili. Maji machafu yanayoingia katika mfumo wa majitaka wa eneo fulani yanaweza kubeba metaboliti za dawa, kemikali na alama za kibaolojia zinazotolewa kwa mkojo na kinyesi na watu wanaoishi katika eneo hilo. Sampuli hizi zikichambuliwa, lengo si kumtambua mtu mmoja mmoja, bali kuelewa mwelekeo wa jamii kwa ujumla. Kwa hiyo WBE inaweza kuwa nyenzo muhimu kwa onyo la mapema, ufuatiliaji wa kikanda na upangaji wa rasilimali katika masuala nyeti ya afya ya umma kama matumizi ya opioidi.

Hata hivyo uchanganuzi wa opioidi katika maji machafu ni mgumu kiufundi. Michanganyiko inayolengwa mara nyingi hupatikana katika viwango vya ng/L au ppt. Matrix ya maji machafu nayo ni changamani sana: vitu ogani, chumvi, mabaki ya sabuni, chembe za kibaolojia, dawa nyingine na usumbufu wa kikemikali huweza kuwepo katika sampuli ileile. Kutenganisha, kutambua na kupima kwa uhakika kiasi kidogo sana cha metaboliti za opioidi katika mazingira haya kunahitaji unyeti mkubwa na uteuzi mzuri.

Umuhimu wa utafiti huu unaonekana hapa. Katika fasihi, uchanganuzi wa kiwango cha ppt mara nyingi huhusishwa na high-resolution mass spectrometry, yaani HRMS, au mifumo ya triple quadrupole ya kiwango cha juu sana. Vifaa hivi vina nguvu kubwa, lakini ni ghali, vinahitaji utaalamu wa kiufundi na havipatikani katika kila maabara ya afya ya umma au ufuatiliaji wa mazingira. Kwa hiyo watafiti waliuliza swali la vitendo: je, kwa mfumo wa LC-MS/MS triple quadrupole wa daraja la kati, ikiwa maandalizi ya sampuli na hali za upimaji zimeboreshwa vizuri, upimaji wa opioidi katika kiwango cha ppt unaweza kufikiwa?

Jibu la utafiti, chini ya masharti maalumu, ni ndiyo. Waandishi walitumia jukwaa la SCIEX Triple Quad 3500, linaloweza kuchukuliwa kama mfumo wa triple quadrupole wa daraja la kati, na kuunganisha uboreshaji wa SPE, kuyeyusha tena katika maji %100, sindano ya ujazo mkubwa na mkakati wa scheduled MRM ili kupata unyeti mkubwa.

Analiti saba zililengwa: morphine; M3G, yaani morphine-3-glucuronide; M6G, yaani morphine-6-glucuronide; norfentanil; noroxycodone; methadone; na EDDP. Morphine ni opioidi ya kutuliza maumivu na pia kiashiria kinachohusiana na metaboli ya heroin. M3G na M6G ni metaboliti za glucuronide za morphine na zinafanana sana kimuundo. Norfentanil ni metaboliti muhimu ya fentanyl na kiashiria cha mfiduo wa opioidi sintetiki. Noroxycodone inahusiana na metaboli ya oxycodone. Methadone hutumiwa katika udhibiti wa maumivu na tiba ya utegemezi wa opioidi, huku EDDP ikiwa metaboliti kuu ya methadone na kiashiria muhimu katika maji machafu.

Uchaguzi huu wa paneli unaonyesha kwamba utafiti haukuuliza tu “ni misombo gani inaweza kupimwa?”, bali pia “ni metaboliti gani zinaweza kuwa viashiria vyenye maana kwa kiwango cha jamii katika WBE?” Kuingizwa kwa metaboliti za glucuronide ni muhimu hasa kwa sababu ni polar, zinafanana kimuundo na zinaweza kuwepo katika viwango vya chini katika matrix ya maji machafu.

Hatua ya kwanza muhimu ilikuwa maandalizi ya viwango vya kalibresheni na sampuli za udhibiti wa ubora. Suluhisho kuu la akiba liliandaliwa kwa 2.000 ng/mL kwa kila analiti. Kwa dilution mfululizo, mikunjo ya kalibresheni ya pointi 19 iliundwa katika masafa ya 0,008–2.000 ng/mL. Kwa analiti nyingi, masafa ya kazi ya mstari ya 0–250 ng/mL yaliamuliwa kwa sindano ya 50 µL. Sampuli za QC za kiwango cha chini, kati na juu zilitumiwa kutathmini utendaji wa mbinu.

Mazingira ya kuyeyusha tena sampuli yalikuwa muhimu kwa mafanikio ya kromatografia. Uwiano mbalimbali wa methanol/maji ulijaribiwa: %100 methanol, 75:25 methanol/maji, 50:50 methanol/maji, 25:75 methanol/maji na %100 maji. Kwa kuwa mwanzo wa gradient ya LC ulikuwa na maji mengi, sampuli ilipolingana na awamu ya mwanzo, umbo la peak liliboreka. Kuyeyusha tena katika %100 maji kulitoa peaks kali zaidi na ishara kubwa zaidi, hasa kwa morphine, M3G na M6G.

Kielelezo 4 katika ukurasa wa 21 kinaonyesha uboreshaji huu. Wakati methanol ilikuwa nyingi, baadhi ya analiti zilionyesha peak fronting, tailing au ishara dhaifu; katika hali ya %100 maji, morphine na metaboliti za glucuronide zilitoa peaks nadhifu na zenye nguvu. Hii inaonyesha kuwa unyeti wa mbinu hautegemei tu mass spectrometer, bali pia kigezo kinachoonekana rahisi lakini muhimu: sampuli inadungwa ikiwa imeyeyushwa katika nini.

Hatua ya pili muhimu ilikuwa solid phase extraction, yaani SPE. Sampuli za maji machafu zilitiwa asidi hadi pH 2,5 ili kuboresha uthabiti wa analiti na kushikamana kwao na cartridge ya polimeri ya Strata-XC. Cartridge ziliandaliwa kwa methanol na maji yaliyotiwa asidi; sampuli zilipakiwa chini ya vacuum; cartridge zilisafishwa kwa maji, zikaushwa kwa vacuum na analiti zikaondolewa kwa methanol yenye %2 ammonia. Eluate zilikauka chini ya nitrojeni katika 40 °C na kisha ziliyeyushwa tena katika maji ya daraja la HPLC kabla ya uchanganuzi.

Scheme 1 inaonyesha mtiririko wa kazi baada ya SPE: 50 mL ya sampuli hupitishwa kwenye SPE na kubadilishwa kuwa extract ya ujazo mdogo, hukaushwa, huyeyushwa tena na kuandaliwa katika hali mbalimbali za solvent. Mantiki ni kuzingatia analiti kutoka sampuli kubwa ya mazingira na kuongeza unyeti kwa sindano kubwa zaidi katika kifaa.

Kuna mizani muhimu hapa. Utafiti unasema kuwa kuyeyusha tena katika %100 maji kulipunguza recovery kwa baadhi ya analiti. Hata hivyo kuliruhusu sindano ya 50 µL badala ya 5 µL. Hivyo hata kama recovery ya moja kwa moja ilipungua kwa %10–40, ongezeko la mara 10 la ujazo wa sindano lilitoa faida ya jumla katika ishara. Hili ni somo la kawaida katika kemia ya uchanganuzi: mbinu bora si ile inayoongeza kigezo kimoja peke yake, bali ile inayosawazisha unyeti, umbo la peak, recovery, urudiwaji na kustahimili matrix.

Mbinu ya mass spectrometry iliendelezwa katika positive electrospray ionization, yaani ESI positive mode. Kwa kila analiti, multiple reaction monitoring au MRM transitions ziliboresha. MRM katika triple quadrupole hufuata kuvunjika kwa precursor ion maalumu hadi product ions maalumu, hivyo kuongeza uteuzi na unyeti. Kwa kila analiti, transition moja kuu ya quantitation na transition moja au mbili za confirmation zilichaguliwa.

Kwa ufupi mantiki ya MRM inaweza kuonyeshwa hivi:

\[ Q1: ext{ioni mama} ightarrow Q3: ext{ioni bidhaa} \]

Q1 huchagua precursor ion ya mass-to-charge ratio maalumu. Ioni hii huvunjwa katika collision cell. Q3 hufuatilia product ion maalumu. Ikiwa precursor ion, product ion na retention time zote zinaendana, utambuzi wa kiwanja huwa wa kuaminika zaidi.

Kielelezo 1 katika ukurasa wa 19 kinatoa spectra wakilishi za fragmentation kwa EDDP, M6G, M3G, morphine, norfentanil, noroxycodone na methadone. Kielelezo hiki ni ushahidi wa kwa nini MRM transitions hizo zilichaguliwa. Kwa M3G na M6G, ambazo ni isomers karibu sana, mass peke yake haitoshi; retention time na product ion transitions lazima zitumike pamoja.

Scheduled MRM hufuatilia kila analiti tu katika dirisha la muda karibu na retention time yake inayotarajiwa. Katika utafiti huu dirisha la MRM lilikuwa sekunde 40. Njia hii hupunguza idadi ya transitions zinazofuatiliwa kwa wakati mmoja, huongeza ufanisi wa ukusanyaji data kwa kila transition na inaweza kuboresha signal-to-noise. Waandishi walisema scheduled MRM iliongeza signal-to-noise kwa metaboliti za glucuronide kwa takribani %10 ikilinganishwa na unscheduled MRM.

Kwa utenganishaji wa LC, kolamu ya Kinetex Biphenyl ilitumika. Uchaguzi huu ni muhimu kwa kutenganisha metaboliti za opioidi zinazofanana kimuundo. Awamu A ilikuwa maji ya daraja la LC-MS yenye 2 mM ammonium formate; awamu B ilikuwa methanol yenye 2 mM ammonium formate. Gradient ya dakika 11 ilianza na %100 A, ikafika %80 A/%20 B dakika ya 4, %100 B kati ya dakika 7–9,5 na kisha kurudi kwenye hali ya awali. Joto la kolamu liliboreshwa hadi 30 °C.

Kielelezo 2 katika ukurasa wa 20 kinaonyesha extracted ion chromatogram au XIC ya sampuli ya maji machafu iliyoongezewa standards. Norfentanil, noroxycodone, EDDP, methadone, M3G, M6G na morphine zinaonekana kama peaks zilizotenganishwa. Kielelezo 3 kinaonyesha chromatograms za influent na effluent za siku ileile, hivyo kuonyesha kuwa mbinu inafanya kazi si tu katika standards bali pia katika sampuli halisi za uwanjani.

Matokeo ya linearity yaliunga mkono uaminifu wa mbinu. R² ilikuwa 0,9998 kwa morphine, 0,9999 kwa M3G, 0,9999 kwa M6G, 0,999 kwa norfentanil, 0,9992 kwa noroxycodone na 0,9992 kwa EDDP. Thamani zilizo karibu sana na 1 zinaonyesha uhusiano thabiti wa mstari kati ya ishara na mkusanyiko.

Unyeti ulionyeshwa kwa lower limits of quantitation katika kiwango cha sampuli: noroxycodone 0,31 ng/L, EDDP 0,61 ng/L, morphine 4,88 ng/L, M6G 0,61 ng/L, M3G 0,08 ng/L, norfentanil 0,61 ng/L na methadone 9,77 ng/L. Hii inaonyesha kuwa kwa analiti nyingi upimaji wa ng/L au bora zaidi uliwezekana.

Kigezo cha LOQ kilitegemea uwiano wa signal/noise:

[ S/N > 10 ]

Hii ina maana kuwa ishara lazima iwe zaidi ya mara 10 ya kelele ya msingi ili kiwanja kihesabiwe kuwa kinaweza kupimwa kwa kiasi kwa uaminifu unaokubalika.

Accuracy na precision zilitathminiwa kwa sampuli za QC na ziliripotiwa kuwa ndani ya ±%15 ya nominal value. Matrix effect pia ilichunguzwa kwa kulinganisha sampuli zilizoongezewa analiti katika deionized water na katika wastewater; tofauti za ukubwa wa kalibresheni, slope na linearity zilikuwa chini ya %5, zikionyesha matrix effect iliyodhibitiwa.

Jedwali 5 lilionyesha recovery ya deuterated internal standards baada ya kuyeyusha tena katika maji: noroxycodone-d3 %23 ± 4,52; EDDP-d3 %13 ± 3,54; morphine-d3 %80 ± 2,99; M6G-d3 %26 ± 10,33; M3G-d3 %35 ± 6,84; norfentanil-d5 %56 ± 4,06; methadone-d3 %24 ± 4,01. Recovery si ya juu kwa analiti zote, lakini internal standards zenye isotopi zilisaidia kufidia upotevu wa extraction na mabadiliko ya matrix katika quantitation.

Sampuli halisi za maji machafu zilitoka katika wastewater treatment plant ya eneo la Greater Albany, New York. Sampuli sita zilichambuliwa: kwa Jumatatu, Alhamisi na Jumapili, kila siku ikiwa na influent na effluent. Sampuli zilikuwa zimekusanywa kwa utafiti wa awali na kuhifadhiwa katika chupa za plastiki katika -20 °C.

Thamani hizi zinaonyesha kuwa mbinu inaweza kutofautisha metaboliti za opioidi katika ng/L kwenye sampuli halisi za maji machafu. Hata hivyo hazijabadilishwa moja kwa moja kuwa makadirio ya matumizi ya jamii. Kwa makadirio hayo, WBE huhitaji mtiririko wa maji machafu, idadi ya watu, uthabiti wa metaboliti, uharibifu ndani ya sewer, mienendo ya treatment plant na vyanzo vya nje.

Morphine na glucuronides zake hazikugunduliwa katika sampuli halisi. Hili linaweza kumaanisha kwamba hazikuwepo katika viwango vinavyopimika, au kuhifadhiwa, kuharibika, muda wa sampuli, hali ya sewer au matrix effects zilishusha viwango chini ya uwezo wa quantitation.

Jedwali 7 linalinganisha mbinu hii na mbinu za zamani za LC-MS/MS za opioidi katika maji machafu. Jambo kuu ni kwamba, bila HRMS na bila kifaa cha premium, SCIEX Triple Quad 3500 iliweza kutoa unyeti wa ng/L kwa sindano ya 50 µL na kuyeyusha tena katika %100 maji. Muda wa uchanganuzi wa dakika 11 pia unaifanya mbinu iwe ya vitendo kwa uchanganuzi wa kawaida.

Kwa mtazamo wa kihistoria, utafiti huu unalenga kikwazo cha upatikanaji wa vifaa katika WBE. Ikiwa unyeti mkubwa ungewezekana tu kwa vifaa ghali sana, WBE ingebaki kazi ya maabara chache. Utafiti huu unaonyesha kuwa maandalizi mazuri ya sampuli na hali za LC-MS/MS zilizoboreshwa zinaweza kufanya vifaa vinavyopatikana zaidi vitoe matokeo yenye nguvu.

Kwa leo, thamani ya utafiti ni kwamba unaweza kusaidia maabara nyingi zaidi kufanya ufuatiliaji wa mazingira na jamii katika mgogoro wa opioidi. Norfentanil na EDDP ni viashiria muhimu vya kuelewa mwelekeo wa jamii.

Kwa siku zijazo, mbinu inaweza kupanuliwa kwa paneli kubwa zaidi za opioidi, metaboliti mpya za opioidi sintetiki, sampuli kutoka miji tofauti na tafiti za mfululizo wa muda. Ikiunganishwa na mikakati ya sampuli, uthabiti, removal rates na population-normalized loads, inaweza kutoa data zenye nguvu zaidi kwa upangaji wa afya ya umma. Lakini utafiti huu wenyewe haukufanya makadirio hayo ya epidemiolojia; ulilenga utendaji wa uchanganuzi.

Athari yake ya maisha ya kila siku si kipimo cha mtu binafsi wala ufuatiliaji wa kisheria. WBE ikitumika kimaadili inalenga mwelekeo wa jamii usiotambulisha watu, si uthibitisho wa matumizi ya mtu. Inaweza kusaidia kupanga huduma za tiba, programu za kupunguza madhara, kutambua mapema mawimbi mapya ya opioidi sintetiki na kuelekeza rasilimali za afya ya umma.

Nguvu za utafiti ni pamoja na kulenga unyeti wa ppt kwa triple quadrupole ya daraja la kati, SPE yenye preconcentration takribani mara 100, kuyeyusha tena katika maji, sindano ya ujazo mkubwa, scheduled MRM, linearity kubwa, matumizi katika sampuli halisi na kulinganisha na fasihi. Mipaka ni kwamba ni preprint, sampuli halisi ni chache, zilitoka eneo moja na wiki moja, morphine na glucuronides hazikuwa positive katika sampuli za uwanjani, recovery ya baadhi ya analiti ni ndogo, na hakuna hesabu ya matumizi ya jamii iliyofanywa.

Kwa hitimisho, utafiti unaonyesha kuwa uchanganuzi wa opioidi na metaboliti zake katika maji machafu haupaswi kutegemea tu majukwaa ghali zaidi ya mass spectrometry. Mchango wake mkuu ni kuonyesha kuwa SPE, kuyeyusha tena katika maji, sindano ya ujazo mkubwa na scheduled MRM zinaweza kuwezesha ufuatiliaji wa ppt hata katika triple quadrupole ya daraja la kati. Hata hivyo, matokeo ni ya preprint na yanahitaji kuimarishwa kwa sampuli nyingi zaidi, hali tofauti za maji machafu na mapitio ya wenzao.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Mbinu ilijumuisha kuchagua paneli ya opioidi/metaboliti, kuandaa standards na QC, kuzingatia sampuli kwa SPE, kuyeyusha tena katika %100 maji, sindano ya 50 µL HPLC-MS/MS, scheduled MRM, tathmini ya calibration, linearity, LOQ, recovery, matrix effect na uchanganuzi wa sampuli halisi za wastewater.

Kwa ujumla, utafiti unaonyesha kuwa mfumo ulioboreshwa unaweza kufikia unyeti unaofaa kwa WBE katika jukwaa linalopatikana zaidi. Si mbinu ya uchunguzi wa kliniki wa mtu binafsi, bali ni mfumo wa uchanganuzi wa jamii.

Maelezo ya Chanzo na Mbinu

Maudhui haya yanategemea kazi ya Thomas Regan, Ian Riley, Muhit Rana, Pengfei Xie na Avni A. Argun yenye kichwa “Highly sensitive HPLC-MS/MS quantitation of opioids and morphine glucuronides in wastewater using a mid-range triple quadrupole platform”. Chanzo ni preprint na kinaeleza wazi: “This preprint research paper has not been peer reviewed”. Kwa hiyo matokeo yanapaswa kusomwa kama data za awali za mbinu ya uchanganuzi. Hakuna madai ya kliniki, ushahidi wa matumizi ya mtu binafsi, hitimisho la kisheria au hesabu ya moja kwa moja ya matumizi ya jamii iliyoongezwa hapa.