Bu çalışma, Lactobacillus plantarum (Lp) hücrelerini whey protein isolate nanofibrils (WPNFs) ile önceden koruyup W1/O/W2 su-yağ-su çift emülsiyonunun iç su fazına yerleştiren ve bu probiyotik yüklü emülsiyonu koaksiyel 3D gıda baskısında iç çekirdek olarak kullanan bir fonksiyonel peynir üretim yaklaşımını incelemektedir. W1/O/W2 çift emülsiyonu, probiyotiğin bulunduğu W1 iç su fazını bir yağ tabakasıyla çevreleyen ve bu yapıyı ikinci bir dış su fazı W2 içinde dağıtan çok katmanlı bir enkapsülasyon sistemidir. Optimize sistemde %4,0 PGPR, %50 W1, %60 yağ fazı ve dış fazda %5,0 WPI kullanılmış; emülsiyon içinde Lp canlılığı 4 °C'de 14 gün sonunda %90,44 olarak korunmuştur. Koaksiyel baskıda emülsiyon iç çekirdek, WPNF ile modifiye edilmiş F20 işlenmiş peynir ise dış yapı olarak kullanılmış; baskılı örneklerde probiyotik sayısı yaklaşık 6,78–8,06 log10 CFU/g aralığında kalmış ve şekil sapması 14 gün sonunda yalnız −%3,5 ± 1,5 olmuştur. Bulgular, çift emülsiyon ile koaksiyel 3D baskının probiyotik hücreleri mekanik ve çevresel stresten koruyabilecek bir gıda mühendisliği sistemi sağlayabileceğini göstermektedir; ancak çalışma laboratuvar ölçeğindedir ve klinik sağlık etkisini ya da endüstriyel üretim başarısını test etmemektedir.

W1/O/W2 Çift Emülsiyonu Nedir?

W1/O/W2 çift emülsiyonu, küçük iç su damlacıklarının önce yağ fazı içinde kapsüllendiği ve oluşan W1/O damlacıklarının daha sonra ikinci bir dış su fazı W2 içerisinde dağıtıldığı çok bölmeli bir emülsiyon sistemidir; bu çalışmada probiyotik Lactobacillus plantarum hücreleri en içteki W1 fazına yerleştirilerek yağ tabakası ve dış faz aracılığıyla çevresel stresten fiziksel olarak ayrılmıştır.

Bu düzenlemenin temel avantajı, hidrofilik bir biyolojik bileşenin doğrudan dış gıda matrisiyle temasını sınırlandırabilmesidir. Çalışmada bu özellik yalnız depolama için değil, ince koaksiyel nozül içerisindeki mekanik kesme kuvvetinden, sıcaklıktan ve uç pH koşullarından korunma amacıyla da kullanılmıştır.

Probiyotik neden doğrudan peynire karıştırılmamıştır?

Kaynak, Cheddar peynirinin probiyotik taşıyıcısı olarak uygun olabileceğini fakat probiyotiklerin doğrudan peynir matrisiyle temasının protein hidrolizi ve aroma değişiklikleri gibi kalite sorunlarına yol açabileceğini belirtmektedir. Koaksiyel baskı yaklaşımının mantığı, probiyotiği iç çekirdekte tutup peynir kabuğunu koruyucu dış yapı olarak kullanmaktır.

Bu nedenle sistem iki ayrı mühendislik problemini aynı anda çözmeye çalışmaktadır:

• probiyotiği canlı tutabilecek bir iç faz oluşturmak,
• 3D baskı sonrasında şeklini koruyabilecek bir peynir dış fazı geliştirmek.

Whey Protein Nanofibrilleri Probiyotikleri Nasıl Koruyor?

WPNFs, pH 2,0 koşulunda pozitif yüklü hale gelen whey protein nanofibrilleridir ve negatif yüklü Lactobacillus plantarum yüzeyiyle elektrostatik etkileşime girerek bakterinin çevresinde fiziksel bir protein bariyeri oluşturur; TEM görüntüleri bu nanofibrillerin bakteri yüzeyine bağlandığını göstermektedir.

WPNF hazırlanması

%5,0 (w/w) WPI çözeltisi pH 2,0'a ayarlandı ve 30 dakika manyetik olarak karıştırıldı. Çözelti daha sonra 4 °C'de 9000 r/min hızında 15 dakika santrifüjlendi ve 0,45 μm filtreden geçirildi.

Filtrat 80 °C'de, 200 rpm'de 10 saat tutuldu. Bu işlem sonucunda WPI proteinlerinin fibriler yapılar oluşturması sağlandı.

Probiyotiğin WPNF ile kaplanması

Lactobacillus plantarum 1.0665 başlangıç canlı sayısı 9,26 log10 CFU/mL olarak verildi. Hücreler MRS sıvı ortamında 37 °C'de 24 saat aktive edildi; santrifüj, fosfat tamponuyla yıkama ve CaCl2 içinde yeniden süspansiyon adımlarından sonra Lp çözeltisi WPNF çözeltisine 1:49 (v/v) oranında eklendi.

Karışım 15 dakika vortekslenip oda sıcaklığında 1 saat bekletildi. TEM görüntülerinde kontrol bakterisinin yüzeyi düzgünken, WPNF uygulamasından sonra fibrillerin hücre yüzeyi çevresinde belirgin biçimde bulunduğu görülmektedir.

Kaynak, WPNF için +27,68 ± 1,52 mV ve bakteriyel süspansiyon için −0,38 ± 0,09 mV zeta potansiyeli rapor etmektedir. Bu karşıt yükler WPNF–bakteri öz-düzenlenmesini destekleyen elektrostatik mekanizmayla uyumludur.

Çift emülsiyonun yapısı

Probiyotik yüklü iç faza %5,0 (w/v) fruktooligosakkarit (FOS) eklendi. FOS, bakterilerin depolama boyunca desteklenmesi amacıyla prebiyotik bileşen olarak kullanıldı.

İlk emülsifikasyon aşamasında PGPR zeytinyağı içerisinde çözüldü ve Lp-WPNF içeren W1 fazı bu yağ fazına katılarak yüksek kesme homojenizasyonuyla W1/O emülsiyonu oluşturuldu.

İkinci aşamada W1/O emülsiyonu WPI içeren dış su fazı W2 ile yeniden homojenize edilerek W1/O/W2 yapısı üretildi.

Çift Emülsiyon İçin En Uygun Formülasyon Nasıl Belirlendi?

Çalışmada damlacık boyutu, zeta potansiyeli ve depolama kararlılığı birlikte değerlendirilerek W1/O/W2 sistemi için %4,0 PGPR, %50 iç su fazı, %60 yağ fazı ve dış su fazında %5,0 WPI optimum koşul olarak seçilmiştir.

PGPR konsantrasyonu

PGPR %2,0'dan %4,0'a yükseltildiğinde W1/O damlacık boyutu 1353,3 nm'den 139,8 nm'ye kadar düşmüştür. %5,0 PGPR'de ise damlacık boyutu tekrar 545,6 nm'ye yükselmiştir.

%4,0 PGPR kullanılan emülsiyonun zeta potansiyeli −35,25 mV olarak raporlanmış ve sonraki deneyler için bu konsantrasyon seçilmiştir.

İç su fazı oranı

W1 oranı %50 olduğunda W1/O damlacık boyutu minimum değer olan 69,08 nm'ye ulaşmıştır. Daha yüksek su oranlarında mevcut emülgatör miktarının genişleyen ara yüzeyi yeterince kaplayamaması daha büyük damlacık oluşumuyla ilişkilendirilmiştir.

Yağ fazı oranı

W1/O/W2 emülsiyonunda yağ fazı %60 olduğunda damlacık boyutu 553,01 nm'ye düşmüş ve bu koşul sonraki deneyler için seçilmiştir. %60–70 yağ fazında depolama sırasında serum fazı oluşmadığı bildirilmiştir.

WPI konsantrasyonu

Dış fazda %5,0 WPI kullanıldığında damlacık boyutu 579,4 nm ile minimuma ulaşmıştır. Daha düşük protein düzeyi yetersiz ara yüzey kaplanmasıyla, daha yüksek düzey ise protein agregasyonu veya depletion flocculation olasılığıyla ilişkilendirilmiştir.

Mikroskobik doğrulama

CLSM analizinde Lp DAPI ile mavi, WPNFs Nile blue ile yeşil ve zeytinyağı Nile Red ile kırmızı olarak görüntülenmiştir. Birleşik görüntülerde bu sinyallerin emülsiyon damlacıkları içinde üst üste gelmesi ve dış W2 fazında mavi bakteriyel sinyal bulunmaması, probiyotiğin iç faz içerisinde tutulduğunu desteklemektedir.

W1/O/W2 Sistemi Probiyotik Canlılığını Ne Ölçüde Korudu?

W1/O/W2 çift emülsiyonu, korumasız Lp hücrelerine göre depolama, sıcaklık ve uç pH koşullarında belirgin derecede daha yüksek canlılık sağlamış; 4 °C'de 14 günlük depolama sonunda probiyotik canlılık oranı %90,44 olarak korunmuştur.

14 günlük depolamada canlı hücre düzeyi 8,92 log CFU/g'den 8,48 log CFU/g'ye gerilemiştir. Buna karşın korumasız kontrol grubundaki düşüş çok daha belirgin olmuştur.

Çalışma ayrıca çift emülsiyonun orta yağ tabakasının dış su fazındaki asit veya bazın W1 iç fazına ulaşmasını sınırlandırarak pH stresine karşı fiziksel bariyer oluşturduğunu ileri sürmektedir.

Kaynak burada küçük fakat önemli bir raporlama tutarsızlığı içermektedir: yöntem kısmında pH stres testleri pH 2,0 ve 11,0 olarak tanımlanırken Şekil 4 ve sonuç metni pH 2,0 ile 12,0 değerlerini göstermektedir. Bu nedenle hangi alkali koşulun gerçekten kullanıldığı PDF temelinde kesinleştirilememektedir.

Isıl koruma

Metot bölümünde test koşulları 65 °C'de 30 dakika ve 90 °C'de 15 saniye olarak verilmektedir. Sonuç metninde ise bir cümlede kontrol grubunun “60 °C'de 30 dakika” sonrasında %9,87 canlılık gösterdiği yazılmıştır. Bu sıcaklık değeri yöntem ve Şekil 4 ile tutarsızdır; burada veri sessizce düzeltilmemiştir.

Aynı cümle W1/O/W2 emülsiyonunda canlılığın %73,53 olduğunu rapor etmektedir. Genel deneysel eğilim, çift emülsiyonun termal stres altında korumasız hücrelerden daha yüksek canlılık sağladığını desteklemektedir.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

İç çekirdeğin reolojisi

Koaksiyel 3D baskıda iç çekirdeğin 0,4 mm çapındaki ince nozül içerisinden akabilmesi gerektiğinden düşük viskozite ve shear-thinning davranışı önemlidir.

%60 ve %70 yağ fazlı W1/O/W2 emülsiyonlarının görünür viskozitesi artan shear rate ile güçlü biçimde azalmıştır. Bu shear-thinning davranışı, malzemenin nozül altında akışkanlaşabileceğini göstermektedir.

Tüm frekans aralığında depolama modülü \(G'\), kayıp modülü \(G''\)'den yüksek kalmıştır. Bu durum emülsiyonun akışkan olmasına rağmen belirgin elastik/yarı-katı ağ karakteri taşıdığını göstermektedir.

%60 yağ fazlı emülsiyon %70'e göre daha düşük modül ve viskozite gösterdiği için ince koaksiyel nozül açısından daha uygun bulunmuştur.

Dış çekirdek: F20 işlenmiş peynir

Saf Cheddar peynirinin doğrudan baskı için fazla sert olduğu değerlendirilmiştir. Bu nedenle eritilmiş Cheddar'a %5 WPNF çözeltisi farklı oranlarda eklenmiş ve F10, F20, F30 ve F40 örnekleri hazırlanmıştır.

F20, %20 WPNF çözeltisi fraksiyonu kullanılan işlenmiş peynir formülasyonudur. Bu tanım nihai peynirin kuru maddesinde %20 saf WPNF bulunduğu anlamına gelmez.

Dinamik shear recovery testlerinde düşük strain (%1) statik durumu, yüksek strain (%200) ise nozül içindeki akış koşulunu temsil etmiştir. Yüksek strain altında \(G'\) ve \(G''\) hızla düşmüş; strain tekrar %1'e indirildiğinde modüller hızla toparlanmıştır.

F20, araştırmacılar tarafından ekstrüzyon kolaylığı ile baskı sonrasında yapısal toparlanma arasında en uygun dengeyi sağlayan formülasyon olarak seçilmiştir.

Sıcaklığın dış çekirdeğe etkisi

Peynir örnekleri 25–70 °C arasında incelenmiştir. \(G'\) ve \(G''\) önce yükselmiş, yaklaşık 35 °C civarında maksimuma ulaşmış ve daha sonra peynir yağının erimesi ve protein matrisinin yumuşamasıyla düşmüştür.

Baskı için dış çekirdek 45 °C'de ekstrüde edilmiştir.

F20'nin baskı performansı

Şekil 6'da Cheddar ve F10 baskılarında kesintili çizgiler ile pürüzlü yüzey görülürken F20 ve F30 daha sürekli çizgiler üretmiştir. F40 ise aşırı yumuşak olduğu için şeklini yeterince koruyamamıştır.

F20 kullanılarak basılan gül modeli düzgün yüzey, belirgin sınırlar ve üç boyutlu form korunumu göstermiştir. Kaynak bu örneğin boyutlarını 51,41 mm uzunluk, 44,91 mm genişlik ve 39,20 mm yükseklik olarak vermektedir.

Koaksiyel 3D Baskı Hibrit Baskıya Göre Neden Daha Başarılı Oldu?

Koaksiyel 3D baskı, düşük viskoziteli probiyotik emülsiyonu ve şekil taşıyan peynir matrisini birbirine karıştırmak yerine ayrı iç ve dış akışlar halinde aynı anda ekstrüde ettiği için, probiyotik yükünü artırırken dış peynir yapısının mekanik desteğini koruyabilmiştir.

Hibrit baskı

Hibrit yöntemde W1/O/W2 emülsiyonu Cheddar peynirine doğrudan %3, %5 veya %7 oranında karıştırılmıştır.

%3 ve %5 emülsiyon içeren malzemeler ekstrüde edilebilmiş ancak basılan küpler hızla deforme olmuştur. Alt bölgeler genişlemiş ve merkez çökmüştür.

%7 emülsiyon içeren karışım ise üst üste biriken tabakaları destekleyemediğinden başarılı biçimde basılamamıştır.

Koaksiyel baskı

Koaksiyel sistemde iç nozül çapı 0,4 mm, iç emülsiyon akış hızı 0,08 mL/min olarak ayarlanmıştır. Dış nozül çapı 1,05 mm, peynir baskı hızı ise 25 mm/s'dir.

F20 dış malzeme 45 °C'de, W1/O/W2 iç faz ise oda sıcaklığında eş zamanlı olarak ekstrüde edilmiştir.

Kaynakta gıda boyasıyla kırmızı renklendirilen iç emülsiyonun dışarı sızmaması, dış F20 tabakasının iç çekirdeği başarılı biçimde çevrelediğine görsel kanıt olarak sunulmuştur.

Şekil doğruluğu

Koaksiyel örneklerde 14 gün sonunda yalnız hafif kenar küçülmesi gözlenmiş; hibrit örneklerde görülen taban yayılması veya tabaka çökmesi görülmemiştir.

3D Baskı Probiyotik Hücreleri Öldürdü mü?

Korumasız probiyotik hücreler 0,4 mm iç nozül kullanıldığında belirgin canlılık kaybı yaşarken W1/O/W2 emülsiyonuyla kapsüllenmiş hücrelerin hibrit ve koaksiyel baskı sonrasında canlılık oranı %95'in üzerinde kalmıştır; bu sonuç emülsiyonun ekstrüzyon shear stresine karşı önemli bir koruyucu rol oynadığını göstermektedir.

Probiyotik çözeltisinin doğrudan 0,4 mm koaksiyel nozül içerisinden geçirilmesiyle oluşturulan kontrol grubunda canlılık yalnız %55,23 olarak verilmiştir.

Buna karşılık W1/O/W2 ile korunan probiyotiklerde hibrit ve koaksiyel baskının canlılık oranları birbirinden anlamlı derecede farklı bulunmamıştır.

Depolama sonunda baskılı örneklerde canlı bakteri sayısı **6,78–8,06 log10 CFU/g** aralığında kalmıştır.

Kaynak bunu probiyotik gıdalar açısından yeterli düzeylerle karşılaştırmaktadır; ancak bu mikrobiyolojik canlılık sonucu, ürünün insanlar üzerinde klinik sağlık yararı sağladığını doğrudan kanıtlamaz.

Aroma korunumu

Elektronik burun analizinde Cheddar, F20, koaksiyel probiyotik peynir ve W1/O/W2 emülsiyonu karşılaştırılmıştır.

F20 ve koaksiyel basılmış ürünün radar profilleri birbirine yakın bulunmuştur. Buna karşılık iç çekirdek emülsiyonunun aroma profili belirgin biçimde farklıdır.

PCA analizinde PC1 toplam varyansın %76,4'ünü, PC2 ise %13,3'ünü açıklamıştır. Böylece ilk iki bileşen birlikte toplam varyansın %89,7'sini temsil etmektedir.

F20 ve koaksiyel basılmış örneklerin PCA uzayında aynı kümeye yakın yerleşmesi, dış peynir tabakasının iç emülsiyonun aroma etkisini maskeleyebildiği yorumunu desteklemektedir.

Çalışmanın desteklediği sonuçlar

• WPNF, Lp hücre yüzeyinde fiziksel koruyucu yapı oluşturabilir.
• Probiyotik hücreler W1/O/W2 çift emülsiyonun iç su fazında tutulabilir.
• Optimize edilmiş çift emülsiyon 14 gün boyunca yüksek Lp canlılığını koruyabilir.
• W1/O/W2 sistemi sıcaklık, pH ve ekstrüzyon stresine karşı koruma sağlayabilir.
• F20 işlenmiş peynir koaksiyel 3D baskıda uygun dış yapı olarak kullanılabilir.
• Koaksiyel baskı, hibrit baskıya göre daha yüksek geometrik kararlılık sağlamıştır.
• Koaksiyel baskılı ürün 14 gün buzdolabı depolamasında düşük şekil sapması göstermiştir.
• Dış peynir matrisi iç emülsiyonun aroma profilinin nihai ürüne yansımasını azaltmıştır.

Çalışmanın desteklemediği sonuçlar

• Ürünün insanlar üzerinde klinik sağlık yararı gösterilmemiştir.
• Probiyotiklerin bağırsakta kolonizasyonu bu deneyde ölçülmemiştir.
• Uzun dönem raf ömrü 14 günden daha uzun süre doğrulanmamıştır.
• Endüstriyel ölçekli sürekli üretim denenmemiştir.
• Tüketici duyusal paneli yapılmamıştır; aroma değerlendirmesi elektronik buruna dayanmaktadır.
• Ekonomik fizibilite veya ticari üretim maliyeti hesaplanmamıştır.
• Koaksiyel baskının tüm peynir formülasyonları için aynı başarıyı göstereceği kanıtlanmamıştır.

Kaynak içi belirsizlikler

Makalenin pH stres koşullarında 11,0 ve 12,0 arasında, ısıl stres bölümünde ise 60 °C ile 65 °C arasında raporlama uyuşmazlıkları bulunmaktadır. Ayrıca koaksiyel baskı boyutlarının tasarımdan “anlamlı farklı olmadığını” belirten cümlede P<0,05 yazılması istatistiksel ifade açısından kendi içinde çelişkilidir. Verianla metni bu değerleri sessizce düzeltmemekte, kaynak içindeki belirsizliği görünür tutmaktadır.

Kaynak ve Yöntem Notu

Özgün başlık: Encapsulation of probiotics in W1/O/W2 emulsion for coaxial 3D printing probiotic-riched cheese products.

Yazarlar: Yupeng Qi, Yuhe Wang, Jiali Hu, Bo Song, Lei Zhang, Chunhong Liu ve Jing Xu.

Eş birinci yazarlar: Yupeng Qi ve Yuhe Wang.

Sorumlu yazarlar: Chunhong Liu ve Jing Xu.

Kurumlar: Northeast Agricultural University; Key Laboratory of Agricultural Functional Molecule Design and Utilization of Heilongjiang Province; Key Laboratory of Soybean Biology of Ministry of Education China; Heilongjiang Green Food Science Research Institute.

Platform: SSRN.

SSRN Abstract No.: 6889393.

Kaynak türü: Deneysel araştırma preprinti.

Hakemlik durumu: Hakem değerlendirmesinden geçmemiştir.

DOI: Kaynakta belirtilmemiştir.

Finansman: Heilongjiang Provincial Postdoctoral Science Foundation.

Çıkar çatışması: Yazarlar bilinen finansal çıkar çatışması veya araştırmayı etkileyebilecek kişisel ilişki bulunmadığını beyan etmiştir.

Probiyotik:Lactobacillus plantarum 1.0665.

Temel enkapsülasyon sistemi: WPNF kaplı Lp içeren W1/O/W2 su-yağ-su çift emülsiyonu.

Optimize emülsiyon: %4,0 PGPR, %50 W1, %60 yağ fazı ve dış fazda %5,0 WPI.

Koaksiyel baskı: İç nozül 0,4 mm ve 0,08 mL/min; dış nozül 1,05 mm; dış F20 peynir fazı 45 °C'de ve 25 mm/s baskı hızıyla ekstrüde edilmiştir.

Analiz yöntemleri: TEM, CLSM, zeta potansiyeli ve damlacık boyutu ölçümü, reoloji, 3D baskı geometrisi, koloni sayımı, elektronik burun ve PCA.

İstatistik: Deneyler üç ayrı tekrarda yapılmış, sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiş, ANOVA için SPSS V20.0 kullanılmış ve genel anlamlılık seviyesi p<0,05 olarak belirtilmiştir.

Temel sınırlılık: Çalışma laboratuvar ölçekli baskı ve 14 günlük soğuk depolamayla sınırlıdır. Probiyotik hücrelerin canlılığı gösterilmiş olsa da klinik sağlık etkisi, gerçek sindirim sistemi performansı ve endüstriyel ölçek doğrulanmamıştır.