MicrobeMS, mikroorganizmalardan elde edilen MALDI-ToF kütle spektrumlarının işlenmesi, kalite kontrolü, veritabanı oluşturulması ve taksonomik tanımlama amacıyla geliştirilmiş MATLAB tabanlı kapsamlı bir masaüstü yazılımıdır. Sistem yalnız bilinmeyen bir bakteriye ait spektrumun referans veritabanıyla karşılaştırılmasını değil; ham spektrumların içe aktarılması, metadata yönetimi, otomatik spektral kalite testleri, baseline düzeltmesi, smoothing, normalizasyon, peak picking, consensus/database spectrum oluşturulması, pseudo-gel görselleştirmesi, unsupervised hierarchical cluster analysis, spektral uzaklık temelli identifikasyon, biomarker taraması ve belirli yapay sinir ağı uygulamalarına bağlantı gibi araştırma zincirinin çok sayıda basamağını aynı ortamda birleştirmektedir.

Çalışmada yazılımın işlevleri, daha önce Avrupa çapında gerçekleştirilen kör bir external quality assurance exercise kapsamında oluşturulmuş highly pathogenic bacteria test panelinin yeniden analiziyle gösterilmektedir. Test paneli 10 bakteriyel izolat ve toplam 24 teknik replikat spektrum içermektedir. Kalite analizinde bütün spektrumlar için ortalama genel kalite skoru 64,3, gözlenen aralık ise 45,0–75,4 olarak bildirilmiştir. Standart MicrobeMS identifikasyon iş akışında 24 spektrumun 23'ü genus ve species düzeyinde doğru tanımlanmış; tek hatalı otomatik sonuçta bir Yersinia pestis spektrumu Yersinia similis olarak sıralanmıştır. Makaledeki manuel takip incelemesi, ilgili örnekte m/z 3065 civarındaki karakteristik yoğun sinyalin varlığını göstererek söz konusu örneğin Y. pestis ile uyumlu olduğunu desteklemiştir.

Bu sonuçlar MicrobeMS'in akademik MALDI-ToF araştırmalarındaki işlevselliğini göstermektedir; ancak kaynak çalışma yazılımın ve RKI spektral veritabanlarının formal klinik validasyondan geçmediğini açıkça belirtmektedir. Dolayısıyla 23/24 sonucu düzenleyici onaylı tanısal doğruluk oranı olarak yorumlanamaz. Test paneli sınırlı ve özel bir veri kümesidir; tanımlama başarısı spektrum kalitesine, kullanılan referans veritabanının kapsamına, kültür ve ölçüm standardizasyonuna, preprocessing ayarlarına ve analiz yöntemine bağlıdır.

MicrobeMS hangi problemi çözmeye çalışıyor?

MicrobeMS'in temel amacı, MALDI-ToF kütle spektrometrisine dayalı mikrobiyal tanımlamada araştırmacıya ticari bir yazılım ekosistemine tamamen bağımlı olmayan, esnek ve MATLAB tabanlı bir analiz ortamı sağlamaktır.

MALDI-ToF MS'de bilinmeyen bir mikroorganizmanın tanımlanması genel olarak deneysel spektrumun, taksonomik kimliği önceden güvenilir yöntemlerle belirlenmiş referans mikroorganizmalardan oluşturulan spektrum veritabanlarıyla karşılaştırılmasına dayanır. Spektral benzerlik veya uzaklık ölçütleri hesaplanır, referans girişleri sıralanır ve elde edilen skor dağılımı bilinmeyen örneğin genus veya species kimliğinin değerlendirilmesinde kullanılır.

Kaynak çalışmaya göre ticari MALDI-ToF platformları bu süreci rutin laboratuvarlar için çok iyi bütünleştirmiş olmakla birlikte akademik araştırmada farklı algoritmaların denenmesi, kendi spektrum veritabanlarının oluşturulması, metadata üzerinde doğrudan kontrol sağlanması ve verilerin başka araçlarla değiş tokuş edilmesi gibi gereksinimler ortaya çıkmaktadır. MicrobeMS yaklaşık iki on yıllık RKI çalışmaları boyunca bu gereksinimler doğrultusunda geliştirilmiştir.

MATLAB burada yalnız analiz dili mi?

Hayır. MATLAB, MicrobeMS'in yalnız matematiksel hesaplama motoru değil, veri yapısı, grafik kullanıcı arayüzü, spektral işleme, matrissel karşılaştırma, istatistiksel analiz ve raporlama ortamıdır.

Kaynak çalışmanın ele aldığı v0.92 sürümü Windows ve Linux altında MATLAB p-code biçiminde, ayrıca Windows için standalone uygulama olarak kullanılabilmektedir. Programın ana GUI'sinde spektrum grafiği, yüklenen spektrumların listesi, preprocessing ve peak-picking kontrolleri, database yönetimi ve analiz komutları aynı çalışma alanında toplanmıştır.

Şekil 1'deki gerçek arayüz, üst bölümde MALDI-ToF spektrumunu; alt kontrol satırlarında dosya bilgisi, görüntüleme, preprocessing, peak picking, peak database ve analysis işlemlerini göstermektedir. Analysis menüsünde standard ID, MBT-like ID, in silico ID, compare with database, hierarchical clustering, t-test, Wilcoxon rank-sum test, peak-frequency test ve average spectra gibi farklı analiz yolları yer almaktadır.

MicrobeMS'in ana iş akışı nedir?

Kaynağın Şekil 2'sindeki mimari dört büyük sınıfa ayrılmaktadır: veri içe aktarma; kalite testleri ve görselleştirme; preprocessing; analiz ve raporlama. Gerçek standart identification işlemi ise bu yapıyı daha ayrıntılı bir zincir hâline getirir.

Hangi veri formatları destekleniyor?

MicrobeMS'in güçlü yönlerinden biri veri değişimidir. Kaynak çalışma Bruker MALDI-ToF sistemlerinden elde edilen BrukerRaw yapılarını ve bunların fid dosyalarını doğrudan işleyebildiğini belirtmektedir. bioMérieux VITEK MS spektrumları ise mzXML aracılığıyla içe aktarılabilmektedir.

.muf dosyası MATLAB çalışma alanında doğrudan:

spec = load('sample_set.muf','-mat');

biçiminde yüklenebilir. Benzer şekilde .pkf peak-list dosyaları MATLAB structure array olarak erişilebilir. Bu yapı, MicrobeMS'in yalnız GUI içinde kapalı bir analiz sistemi olmasını engelleyerek araştırmacının veriyi MATLAB ortamında ayrıca incelemesine izin vermektedir.

Metadata neden bu kadar önemli?

MALDI-ToF spektrumunun bilimsel anlamı yalnız spektral piklerden oluşmaz. Bakterinin taksonomisi, kültür süresi, sıcaklık, büyütme ortamı, sample-preparation yöntemi, operatör ve cihaz bilgileri gibi metadata alanları sonuçların izlenebilirliği açısından önemlidir.

MicrobeMS, bu metadata'nın spektrumlarla birlikte saklanmasını ve daha sonra GUI üzerinden düzenlenmesini desteklemektedir. Kaynağın Şekil 3'ündeki gerçek metadata ekranında genus, species, strain, spectrum ID, büyüme koşulları, sample treatment, laser power, calibration standard ve preprocessing parametreleri gibi çok sayıda alan birlikte gösterilmektedir.

Bu metadata daha sonra dendrogram veya pseudo-gel görünümündeki spektrumların yorumlanmasında kullanılabilir ve seçilmiş alanlar MATLAB command window ile log dosyasına aktarılabilir.

Kalite testi hangi dört özelliği ölçüyor?

MicrobeMS kalite testi, bir spektrumun sonraki identification veya database oluşturma işlemlerine uygunluğunu dört nesnel ölçüt üzerinden değerlendirmektedir:

1. Spektral noise düzeyi,
2. Spektrum başına bulunan peak sayısı,
3. Baseline yükselmesi,
4. Belirlenen mass peak'lerin ortalama resolving power değeri.

Her ölçüt için 0 ile 100 arasında bir kalite skoru hesaplanır. Sıfır kötü kaliteyi ve başarısız testi, 100 ise çok yüksek kaliteyi temsil eder. Dört skor kullanıcı tarafından ayarlanabilen ağırlıklarla birleştirilerek yine 0–100 aralığında genel QT skoru oluşturulur.

Kaynağın Şekil 4'ünde kalite sonuçları kırmızı-sarı-yeşil trafik ışığı mantığıyla HTML raporunda gösterilmektedir. Bu görsel yalnız estetik bir raporlama değildir; operatörün problemli spektrumları hızlı biçimde görmesini amaçlamaktadır.

HPB panelindeki spektrum kalitesi nasıldı?

HPB test panelinin yeniden analizinde bütün spektrumlar için global ortalama QT skoru 64,3, gözlenen aralık ise 45,0–75,4 olarak bildirilmiştir.

Çalışma özellikle düşük hücre konsantrasyonuna sahip bazı B. anthracis, Y. pestis ve B. thuringiensis örneklerinde daha düşük kalite skorları görüldüğünü vurgulamaktadır. Bu durum yakın akraba türler arasındaki spektral farkların zaten küçük olduğu örneklerde identification hatası riskini artırabilir.

Preprocessing hangi işlemleri içeriyor?

MicrobeMS preprocessing aşaması ham spektrumu daha kararlı ve karşılaştırılabilir bir yapıya dönüştürmek için birden fazla yöntem sunmaktadır:

• Autocalibration,
• Minimum yöntemi veya asymmetric least squares ile baseline subtraction,
• Average smoothing veya Savitzky-Golay smoothing,
• Modified 1-norm ile normalizasyon,
• Spectrum resolution reduction,
• Düşük veya yüksek m/z bölgesinin kesilmesi.

Autocalibration için her spektrumda konumu kesin olarak bilinen en az iki analyte peak'ine ihtiyaç duyulduğu belirtilmektedir.

Peak picking algoritması nasıl çalışıyor?

MicrobeMS, peak detection için m/z boyunca sabit bir intensity threshold kullanmak yerine kütle aralığına göre değişen bir threshold fonksiyonu uygular. Bunun nedeni MALDI-ToF MS analitik duyarlılığının düşük m/z bölgesinde daha yüksek, yüksek m/z bölgesinde ise daha düşük olabilmesidir.

Threshold üç bileşenin birleşimine dayanır:

1. Asymmetric least-squares baseline fonksiyonu,
2. m/z'ye bağlı S-biçimli sigmoid threshold,
3. Ayarlanabilir faktörle ölçeklenmiş noise dağılımı.

Çalışmada sigmoid bileşen:

\[ T(x)=\frac{I_m\,s}{1+e^{k(x-x_c)}} \]

şeklinde verilmektedir ve

\[ k=e^{-l} \]

olarak tanımlanmaktadır.

\(x_c\), maksimum eğimin bulunduğu m/z konumunu; \(l\), eğim kontrolünü; \(s\), yoğunluk ölçekleme faktörünü temsil eder. \(I_m\) ise spektrumdaki en yoğun 13 peak değerlendirilerek, bunların en güçlü üç tanesi dışarıda bırakıldıktan sonra kalan peak'lerden elde edilen ortalama intensity değeridir. Amaç birkaç olağanüstü güçlü peak'in threshold ölçeğini tek başına belirlemesini engellemektir.

MicrobeMS sabit sayıda peak seçimine de izin verir. Varsayılan uygulamalarda spektrum başına sıklıkla 30 peak kullanılmaktadır. Sabit peak sayısı seçildiğinde \(s\) değeri istenen peak sayısına ulaşılana kadar iteratif olarak değiştirilir.

Pseudo-gel görünümü ne işe yarıyor?

Yüzlerce veya binlerce spektrumun ayrı grafikler hâlinde incelenmesi pratik değildir. MicrobeMS bu nedenle spektral intensity değerlerini gri ton veya renk değerlerine dönüştürerek spektrum numarasına karşı m/z ekseninde pseudo-gel görüntüsü oluşturabilir.

Kaynağın Şekil 5'inde 1.400'den fazla Bacillus cereus sensu stricto ve Bacillus anthracis spektrumu preprocessing sonrasında tek bir pseudo-gel görünümünde sunulmuştur. Dikey bantlar belirli m/z konumlarında peak'lerin tekrarlayan varlığını gösterirken, tür veya strain grupları arasında sistematik bant farklılıkları olası biomarker peak'lere işaret edebilir.

MATLAB'ın WindowButtonMotionFcn işlevi MouseOver davranışı için kullanılarak kullanıcının spektrum üzerinde belirli m/z peak'lerini ve ilgili metadata'yı etkileşimli biçimde incelemesine olanak sağlanmaktadır.

Database spectrum nasıl oluşturuluyor?

MicrobeMS'teki database spectrum tek bir ölçümden değil, aynı mikroorganizmayı temsil eden birden fazla spektrumun birleştirilmesinden oluşturulan consensus referanstır.

Kaynağa göre ideal durumda bir database spectrum için yaklaşık 12–20 bireysel spektrum kullanılmalı; bunlar tercihen üç biyolojik replikattan gelmeli ve her biyolojik replikat için en az dört teknik replikat bulunmalıdır.

Database spectrum, ortalama mass spectrum ile ilişkili özel peak table'dan oluşur. Tek spektrum peak tablolarından farklı olarak database peak table'ları ortalama m/z ve normalize/weighted intensity bilgilerinin yanında peak abundance, yani peak'in kaynak spektrumlarda görülme sıklığını da içerir.

MicrobeMS bu referansları etiketlenmiş veri setlerinden, manuel seçilmiş spektrumlardan veya toplu batch modunda oluşturabilir. Kaynak, RKI veritabanındaki 1.700'den fazla database spectrum girişinin bu otomatik özelliğin kullanımıyla oluşturulduğunu belirtmektedir.

RKI'nin deneysel spektrum veritabanı ne kadar büyük?

Çalışmada kullanılan kamuya açık RKI MALDI-ToF veritabanının v4.2 sürümü 11.055 MALDI-ToF spektrumu ve biosafety level 1–3 kapsamındaki 1.601 bakteriyel strain içermektedir.

Bu sayılar “database spectrum” sayısıyla aynı kavram değildir. 11.055 değeri veri koleksiyonundaki bireysel MALDI-ToF spektrumlarını; 1.700'den fazla database spectrum ifadesi ise MicrobeMS tarafından oluşturulan consensus/reference girişlerini belirtmektedir.

In silico veritabanı ne yapıyor?

MicrobeMS deneysel MALDI spektrumlarının yanında genom/protein verisinden oluşturulan pseudo-MALDI veritabanlarını da sorgulayabilmektedir.

Çalışmada 2024 sürümündeki RKI in silico database'in 17.850 pseudo-MALDI spektrumu içerdiği ve her in silico spektrumda 80 pseudo-peak bulunduğu bildirilmektedir. Bu veriler UniProtKB'den türetilmektedir.

Yazar bu veritabanını açık biçimde deneysel olarak nitelendirmekte ve gerçek mass-spectrometry ölçümlerinden oluşturulan veritabanların identification doğruluğuna henüz ulaşmadığını belirtmektedir. Bu nedenle in silico database tanısal kullanım için değil, araştırma ve test amacıyla sunulmaktadır.

UHCA bakteriler arasındaki benzerliği nasıl gösteriyor?

Unsupervised hierarchical cluster analysis (UHCA), önceden sınıf etiketi kullanmadan spektrumları aralarındaki ölçülebilir benzerliğe göre kümeler.

MicrobeMS'in varsayılan uzaklık yaklaşımı Pearson product-moment correlation coefficient'ten türetilen D-values değeridir. Alternatif olarak Euclidean, standardized Euclidean ve City Block uzaklıkları kullanılabilir. Clustering tarafında Ward's method varsayılandır; single, average, complete ve centroid linkage seçenekleri de bulunmaktadır.

HPB test panelindeki örnek UHCA için kaynakta şu preprocessing/analiz koşulları verilmiştir:

Kaynağın Şekil 6'sındaki dendrogramda teknik replikatlar strain düzeyinde ayrı kümeler oluşturmaktadır. Yakın akraba türlerin strain kümeleri daha üst düzey clade'lerde birleşmektedir. Bacillus anthracis ile B. thuringiensis, Burkholderia pseudomallei kompleksi üyeleri ve Yersinia pestis ile Y. pseudotuberculosis bu davranışın örnekleridir.

Düşük konsantrasyonlu ve daha düşük kaliteli spektrumlara ait bazı strain kümeleri ise daha yüksek iç heterojenlik göstermektedir. Bu nedenle çalışma UHCA sonuçlarının da kaliteli ve standartlaştırılmış spektrum üretimine bağımlı olduğunu vurgulamaktadır.

Spektral tanımlama skoru nasıl hesaplanıyor?

MicrobeMS'in varsayılan identification yaklaşımında deneysel ve referans peak tabloları önce düşük çözünürlüklü, discretized spektral vektörlere dönüştürülür. Ardından iki spektrum arasındaki Pearson correlation coefficient hesaplanır:

\[ r(x,y)=\frac{\operatorname{cov}(x,y)}{\sigma_x\sigma_y} \]

Bu korelasyon değeri D-value'a dönüştürülür:

\[ D(x,y)=1000[1-r(x,y)] \]

\(D=0\) mükemmel korelasyonu, teorik olarak \(D=2000\) ise tam anti-korelasyonu temsil eder.

Daha sonra similarity değeri:

\[ S=1000-D \]

olarak hesaplanır. \(S<1\) olduğunda değer 1'e eşitlenir ve logaritmik identification skoru:

\[ S_{ld}=\log_{10}(S) \]

şeklinde elde edilir. Buna göre \(S_{ld}=3\), peak tablolarının aynı olduğu üst sınıra karşılık gelir; değer sıfıra yaklaştıkça pozitif korelasyon zayıflar.

MicrobeMS skoru ticari skorlarla aynı mı?

Hayır. Çalışma MicrobeMS \(S_{ld}\) skorlarının ticari MALDI Biotyper skorlarıyla doğrudan karşılaştırılamayacağını özellikle belirtmektedir çünkü preprocessing ve skor hesaplama yöntemleri farklıdır.

Aynı verilerin standart workflow ve varsayılan parametrelerle işlendiği gözlemlerde MicrobeMS \(S_{ld}\) değerlerinin ticari karşılıklarından ortalama yaklaşık 0,3 skor birimi daha yüksek olduğu belirtilmiştir. Yazar bu nedenle genus veya species tanımlaması için evrensel bir \(S_{ld}\) cut-off önermemektedir.

MATLAB vectorization neden önemli?

MicrobeMS'in büyük spektral veritabanlarında hızlı çalışmasının önemli nedenlerinden biri MATLAB vectorization yaklaşımıdır. Tek tek scalar döngüler yerine matris ve vektör işlemleriyle çok sayıda korelasyon eşzamanlı hesaplanmaktadır.

Kaynakta verilen performans örneğine göre 2.000 database peak table ile 400 deneysel spektrum arasındaki 800.000 correlation coefficient, standart 2026 PC donanımında bir saniyeden kısa sürede hesaplanabilmektedir.

Bu performans bir bütün yazılım benchmark'ı değildir ve her bilgisayar için garanti edilen süre olarak yorumlanmamalıdır. Kaynak yalnız söz konusu correlation hesaplama aşaması için bu örneği vermektedir.

Kalibrasyon hatalarına karşı brute-force yaklaşımı nedir?

MicrobeMS, kaçınılmaz mass-calibration farklılıklarının identification skorunu düşürmesini azaltmak için deneysel spektrumun calibration constants değerlerini kullanıcı tarafından belirlenen aralıkta sistematik olarak değiştirebilir.

Her kalibrasyon varyasyonu database peak tablolarıyla toplu olarak karşılaştırılır ve elde edilen \(S_{ld}\) değerleri arasından en yüksek veya en yüksek n sonucun ortalaması seçilebilir. Kaynak, bu hesaplama yoğun yöntemin MATLAB vectorization sayesinde uzun çalışma sürelerine yol açmadan uygulanabildiğini belirtmektedir.

Rank-list analizi neden ayrıca gerekiyor?

Tek bir en yüksek skor her zaman açık taxonomic karar vermeye yetmeyebilir. Özellikle yakın akraba türler database ranking'in üst sıralarında karışık biçimde yer aldığında yalnız ilk sonucu değerlendirmek yanıltıcı olabilir.

MicrobeMS bu nedenle bir türün database'deki temsilcilerinin sıralamadaki yerlerini ve skorlarını birlikte değerlendirerek species-specific rank-list score hesaplayabilmektedir.

Normalize edilmiş skorun temel biçimi:

\[ S_{rl,j}=1000\frac{F_j}{F_{j,\max}} \]

ve bunun logaritmik karşılığı:

\[ S_{ldrl,j}=\log_{10}(S_{rl,j}) \]

olarak verilmektedir. \(S_{ldrl,j}\) 0 ile 3 arasında değişebilir.

Kaynak, rank-list analizinin ilgili species için database'de en az beş strain, tercihen sekizden fazla strain bulunduğunda daha güvenilir olduğunu; az sayıda referans varsa sonucun dikkatli yorumlanması gerektiğini belirtmektedir.

Artificial neural network işlevinin rolü nedir?

MicrobeMS yalnız correlation/distance tabanlı identification ile sınırlı değildir. NeuroDeveloper yazılımına ANN arayüzü de içermektedir.

Bu işlevin geliştirilmesindeki motivasyonlardan biri, Bacillus anthracis ile yakın akrabaları veya Yersinia pestis ile Y. pseudotuberculosis gibi spektral olarak birbirine son derece benzeyen organizmaların standart mesafe yöntemleriyle ayrılmasının zor olabilmesidir.

Ancak kaynak ANN işlevinin MicrobeMS'in erken dönemlerinde başarıyla kullanıldığını, son yıllarda ise aktif olarak geliştirilmediğini açıkça belirtmektedir. Dolayısıyla ANN modülü mevcut çalışmanın ana doğrulama sonucu değildir.

Türkiye açısından ne ifade ediyor?

Bu çalışma Almanya'daki Robert Koch Institute ortamında geliştirilmiş bir yazılımı ve RKI spektral koleksiyonlarını tanımlamaktadır; Türkiye'deki klinik laboratuvarlardan toplanmış doğrulama verisi içermemektedir.

MicrobeMS'in araştırma amaçlı vendor-neutral veri işleme yapısı, Türkiye'deki MALDI-ToF araştırma laboratuvarları açısından yöntemsel olarak ilgi çekici olabilir. Ancak yerel kullanım için cihaz formatı uyumluluğu, laboratuvar preprocessing protokolü, yerel strain çeşitliliği, referans database kapsamı, kalite güvence süreçleri ve klinik/regülasyon gereklilikleri ayrıca değerlendirilmelidir.

Özellikle bu çalışmadaki 23/24 identification sonucu Türkiye'deki rutin mikrobiyolojik tanıya aktarılabilecek bir performans oranı değildir. Kaynak yazılımı formal olarak valide edilmiş klinik tanı ürünü şeklinde sunmamaktadır.

Çalışmanın desteklediği sonuçlar

• MicrobeMS, MATLAB tabanlı kapsamlı bir MALDI-ToF mikroorganizma spektrum analiz ortamıdır.
• Ham veri importundan preprocessing, quality control, peak picking ve identification'a kadar birden fazla işlem aynı yazılım içinde gerçekleştirilebilir.
• Metadata ve spektral database yönetimi desteklenmektedir.
• BrukerRaw ve mzXML tabanlı farklı veri kaynaklarının işlenmesine yönelik araçlar bulunmaktadır.
• Quality test dört ölçüt üzerinden 0–100 arası bireysel ve genel skor üretmektedir.
• Pseudo-gel görünümü yüzlerce veya binlerce spektrumun birlikte incelenmesini desteklemektedir.
• UHCA ile peak-table tabanlı unsupervised clustering yapılabilmektedir.
• Correlation/distance tabanlı identification için MATLAB vectorization büyük karşılaştırma matrislerinin hızlı hesaplanmasını sağlamaktadır.
• HPB test panelindeki standart identification örneğinde 24 vakanın 23'ü genus ve species düzeyinde doğru tanımlanmıştır.
• Program RKI'de database oluşturma ve özel/nadir patojen spektrumlarının araştırma amaçlı analizlerinde kullanılmıştır.

Çalışmanın desteklemediği veya kanıtlamadığı sonuçlar

• MicrobeMS'in formal olarak valide edilmiş klinik tanı yazılımı olduğu gösterilmemektedir.
• RKI spektral database'lerinin düzenleyici amaçlı formal validasyonu bu çalışmada sunulmamaktadır.
• 23/24 sonucu bütün bakteriler, cihazlar, laboratuvarlar veya örnek türleri için genel doğruluk oranı değildir.
• MicrobeMS'in ticari MALDI-ToF platformlarından genel olarak daha doğru olduğu gösterilmemektedir.
• MicrobeMS \(S_{ld}\) skorları ticari MALDI Biotyper skorlarıyla bire bir eşdeğer değildir.
• In silico database deneysel spektrum database'iyle aynı identification performansına sahip değildir.
• ANN işlevi çalışmanın güncel ana performans değerlendirmesi değildir.
• Yazılımın mevcut kullanımı klinik karar veya tedavi seçimi için otomatik olarak yeterli değildir.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

HPB test paneli nasıl oluşturulmuş?

Çalışmanın yazılım örneklerinde kullanılan HPB test paneli, 2014 yılında Avrupa Birliği destekli external quality assurance exercise kapsamında oluşturulmuş kör bir laboratuvar karşılaştırma çalışmasından gelmektedir.

Panel 10 farklı bakteriyel izolat içermektedir; bunların beşi highly pathogenic bacteria, beşi ise non-HPB olarak tanımlanmıştır. Avrupa'dan 11 laboratuvar ring trial'a katılmış ve RKI'nin ZBS6 birimi test örneklerini taxonomic kimlikleri kendisine açıklanmadan analiz etmiştir.

Bu yazılım çalışmasındaki analiz yeni bir prospektif laboratuvar deneyi değil; daha önce yayımlanan test panelinin MicrobeMS'in güncel özellikleri kullanılarak yeniden analizidir.

Test panelinin temel sayıları

Standart identification workflow nasıl yürütülmüş?

MicrobeMS iki identification yaklaşımı sunmaktadır. Deneyimli kullanıcı bütün preprocessing, peak detection ve identification parametrelerini elle belirleyebilir. Alternatif standart iş akışında ise program adımları büyük ölçüde otomatik yürütür.

Standard ID seçildiğinde:

1. Quality test uygulanır.
2. microbems.opt dosyasındaki parametrelere göre preprocessing yapılır.
3. Peak'ler çıkarılır.
4. Identification analysis dialog açılır.
5. Önceden tanımlanan .pkf database otomatik yüklenir.
6. Experimental peak list ile database girişleri karşılaştırılır.
7. Skor ranking ve taxonomic sonuçlar oluşturulur.
8. Sonuçlar HTML, text veya Excel raporuna aktarılabilir.

Kaynakta experimental database'ler için 30 peak'li referans girişlerinin avantajlı bulunduğu; in silico database'de ise 78 peak'li girişlerin daha etkili olduğu belirtilmektedir. RKI database'lerinin 30, 45 veya 78 peak içeren farklı .pkf sürümleri bulunabilmektedir.

23 doğru sonucun içinde neler var?

Standart identification analizinde 24 teknik spektrumun 23'ü genus ve species düzeyinde doğru sınıflandırılmıştır. Francisella tularensis örneği ayrıca subsp. holarctica alt türü düzeyinde doğru tanımlanmıştır.

Tek otomatik hatada spectrum no. 21 için Yersinia pestis yerine Yersinia similis sonucu elde edilmiştir. Kaynak, Y. similis'in Y. pseudotuberculosis kompleksinin genetik olarak yakın bir üyesi olduğunu vurgulamaktadır.

İlgili örneğin spektrumunun manuel incelenmesinde m/z 3065 civarında yoğun bir peak görülmüş ve kaynak bunu pPCP1 plasmid taşıyan Y. pestis strain'leriyle ilişkili tipik MALDI özelliği olarak değerlendirmiştir. Böylece manuel takip, test örneğinin doğru kimliği olan Y. pestis yorumunu desteklemiştir.

Bu örnek aynı zamanda otomatik skor ranking'in uzman değerlendirmesinin tamamen yerine geçmediğini göstermektedir.

Şekil 7 ne gösteriyor?

Çalışmanın son sayfasındaki Şekil 7, MicrobeMS identification sisteminin üç katmanını birlikte gösterir. A panelinde inter-spectral distance analysis dialog bulunur; burada peak-table karşılaştırması, m/z aralığı, bin genişliği, distance method ve calibration variation parametreleri kontrol edilebilir.

B panelindeki HTML report'ta test spectrum kimliği, quality-test sonuçları, rank-list özeti ve en yüksek database eşleşmeleri kırmızı/yeşil trafik ışığı mantığıyla sunulmaktadır. C paneli ise deneysel ve database peak list'lerinin görsel karşılaştırmasını sağlar.

Bu nedenle MicrobeMS sonucu yalnız tek bir numerik skor olarak üretmez; kalite bilgisi, ranking yapısı ve spektral peak eşleşmelerini birlikte inceleme olanağı verir.

Bağımsız yazılım testlerinde ne bulunmuş?

Kaynak iki dış kullanıcının MicrobeMS v0.92 üzerindeki test deneyimini ayrı olarak raporlamaktadır.

Matthias Mailänder, GUI üzerinden erişilebilen işlevleri NeuroDeveloper entegrasyonu ve LC-MS in silico spectra dışında sistematik olarak test ettiğini; vendor MALDI-ToF verilerinin yüklendiğini, preprocessing zincirinin çalıştığını ve kalite kontrollü identification/classification işlevlerinin güçlü olduğunu bildirmektedir.

Jörg Rau ise yazılımı Windows 10 üzerinde gerçek laboratuvar ortamında ticari MALDI yazılımlarıyla paralel çalıştırmıştır. Kaynakta arayüzün sade olduğu, text/Excel/HTML raporların kolay yorumlandığı ve karmaşık cluster analizlerinde hesaplamaların hızlı gerçekleştiği belirtilmektedir.

Bunlar önemli operasyonel testlerdir ancak kontrollü, çok merkezli formal software validation çalışmasıyla aynı şey değildir. Nitekim makalenin kendisi MicrobeMS ve RKI database'lerinin formal validation'dan geçmediğini açıkça belirtmektedir.

MicrobeMS'in güçlü yönleri

• MATLAB'ın matrix/vector hesaplama avantajını büyük spektral karşılaştırmalarda doğrudan kullanması,
• Preprocessing ile identification arasındaki tüm zincirin tek ortamda bulunması,
• Farklı veri formatları için import/export seçenekleri,
• Spektrum metadata'sına ayrıntılı erişim,
• Nesnel quality-test mekanizması,
• Deneysel database oluşturma ve yönetme araçları,
• Pseudo-gel ve dendrogram gibi araştırma odaklı görselleştirmeler,
• Parametrelerin microbems.opt üzerinden değiştirilebilir olması,
• Standart ve ileri seviye identification workflow seçenekleri,
• Spektrum verilerinin yerel ve kısıtlı ortamda analiz edilebilmesi.

Temel sınırlılıklar

• Yazılım ve RKI database'leri formal klinik validation sürecinden geçirilmemiştir.
• Identification başarısı kullanılan reference database'in tür ve strain kapsamına güçlü biçimde bağlıdır.
• Düşük kaliteli spektrumlar yakın akraba türlerin ayrımını zorlaştırabilir.
• Preprocessing ve peak-picking parametreleri sonuçları etkileyebilir.
• In silico database henüz deneysel database'lerin doğruluk seviyesine ulaşmamıştır.
• ANN modülü son yıllarda aktif biçimde geliştirilmemiştir.
• Yazılımın akademik esnekliği, düzenleyici klinik ürünlerde beklenen standardizasyon ve formal traceability ile aynı şey değildir.

Kaynak ve Yöntem Notu

Tam özgün çalışma adı: MicrobeMS - A MATLAB Toolbox for Microbial Identification Based on Mass Spectrometry

Yazar: Peter Lasch.

Sorumlu yazar: Peter Lasch.

Eş katkı: Çalışma tek yazarlıdır; eş birinci/eş katkı beyanı bulunmamaktadır.

Kurum: Robert Koch Institute, ZBS 6 – Proteomics and Spectroscopy (ZBS 6), Seestraße 10, Berlin, Almanya.

Kaynak türü: MATLAB tabanlı bilimsel yazılım tanımlama, metodoloji ve örnek veri yeniden analizi çalışması.

Yayın durumu: Yüklenen çalışma bir preprinttir ve hakem değerlendirmesinden geçmemiştir. Sonuçlar bu yayın aşaması dikkate alınarak değerlendirilmelidir.

Yüklenen platform: SSRN.

SSRN abstract numarası: 7231327.

Doğrulanmış preprint DOI: 10.64898/2026.05.08.723807.

DOI platformu: Aynı başlık ve yazarla yayımlanan bioRxiv preprint kaydı.

BioRxiv yayın tarihi: 12 Mayıs 2026.

Hakemli dergi sürümü: 24 Ağustos 2026 itibarıyla bibliyografik kontrolde doğrulanmış ayrı bir hakemli dergi sürümü tespit edilmemiştir.

Makalede incelenen yazılım sürümü: MicrobeMS v0.92, Ocak 2026.

Güncel sürüm ayrımı: MicrobeMS'in resmî Wiki'si Mayıs 2026 itibarıyla v0.93 sürümünü güncel sürüm olarak listelemektedir. Bu Verianla makalesinin bilimsel açıklaması kaynak çalışmada incelenen v0.92 sürümüne dayanır; v0.93'e sonradan eklenen değişiklikler geriye dönük olarak çalışma bulgusu kabul edilmemiştir.

Programlama ortamı: MATLAB.

Kaynakta dağıtım biçimi: Windows ve Linux için MATLAB p-code; Windows için standalone uygulama.

Güncel dağıtım notu: Projenin resmî sitesi MicrobeMS'i açık kaynak yazılım olarak tanımlamamaktadır; yazılım test ve ticari olmayan kullanım amacıyla ücretsiz dağıtılmaktadır. Bu nedenle MicrobeMS bu makalede “açık kaynak” olarak nitelendirilmemiştir.

Kaynak-içi dağıtım ifadesi notu: Yazılım açıklamasının bir bölümünde standalone ile MATLAB m-/p-code ifadeleri birlikte geçerken Code Availability bölümü yalnız p-code Windows/Linux ve standalone Windows dağıtımını belirtmektedir. Güncel Wiki de kaynak kodu değil p-code/standalone paketleri sunmaktadır. Bu ifadeler sessizce tek bir dağıtım biçimine dönüştürülmemiştir.

Temel yazılım konfigürasyonu: Otomatik QT, preprocessing, peak detection ve identification parametrelerinin önemli bölümü düzenlenebilir microbems.opt metin dosyasında tutulmaktadır.

Test veri seti: 2014 QUANDHIP External Quality Assurance Exercise kapsamında oluşturulan HPB paneli; 10 izolat ve 24 teknik replikat spektrum.

Kamuya açık deneysel database: Kaynakta RKI MALDI-ToF database v4.2 için 11.055 spektrum ve 1.601 bacterial strain bildirilmektedir.

Database DOI: Çalışmanın abstract bölümünde RKI database koleksiyonu için 10.5281/zenodo.7702374 bağlantısı verilmektedir.

In silico database: Çalışmada 17.850 pseudo-MALDI spektrumu ve spektrum başına 80 pseudo-peak içeren 2024 deneysel in silico database tanımlanmaktadır; yazar bunu tanısal kullanım için önermemektedir.

Formal validation sınırı: Kaynak yazar açık biçimde ne MicrobeMS yazılımının ne de RKI database'lerinin formal validation'dan geçtiğini belirtmektedir. Bu nokta ticari, düzenleyici amaçlı MALDI-ToF tanı sistemleriyle temel ayrımdır.

Bağımsız test: Çalışmada Matthias Mailänder ve Jörg Rau tarafından v0.92 üzerinde gerçekleştirilen ayrı operasyonel yazılım testleri raporlanmıştır. Bunlar formal klinik validation olarak değerlendirilmemiştir.

Kaynak-içi editoryal not: “Independent Testing” bölümünde Matthias Mailänder ve Jörg Rau alt bölümlerinin ikisi de “8.1” olarak numaralandırılmıştır. Bu numaralandırma hatası bilimsel içeriği etkilemediğinden sessizce kaynak metne atfedilmemiş, yalnız burada kayıt altına alınmıştır.

Çıkar çatışması: Yazar herhangi bir çıkar çatışması bildirmemiştir.

Üretken yapay zekâ beyanı: Yazar, makale metninin yalnız dilsel revizyonu için DeepL'in ticari sürümü ile Gemini'nin ücretsiz sürümünün kullanıldığını ve başka yapay zekâ yöntem veya araçlarının kullanılmadığını belirtmektedir.

Acknowledgements: Yazar; Nico Fischer, Elke Westhäuser, Charlyn John, Jeremias Meiß, Maren Stämmler ve Andy Schneider'a mikrobiyal örnek hazırlama ve MALDI-ToF MS ölçümleri için; ayrıca Joerg Doellinger, Alejandra Bosch, Marcel Erhardt ve Thomas Maier'e bilimsel tartışma ve destekleri için teşekkür etmektedir.

CRediT: Yüklenen tek yazarlı çalışmada ayrı bir CRediT authorship contribution statement bulunmamaktadır.

Bilimsel güvenlik ve yorum sınırı: Bu çalışma mikrobiyal spektrumların hesaplamalı analizi ve yazılım iş akışını tanımlamaktadır. Verianla metni, yüksek patojeniteli organizmaların yetiştirilmesi veya laboratuvar üretimi için operasyonel protokol oluşturmaz; kaynak çalışmanın spektral analiz ve yazılım sonuçlarıyla sınırlıdır.

Bilimsel içerik sınırı: Bu Verianla makalesindeki MicrobeMS mimarisi, denklemler, kalite testleri, preprocessing yöntemleri, veritabanları, UHCA parametreleri, HPB test paneli ve identification bulguları yüklenen çalışmaya dayanmaktadır. Dış kaynak yalnız preprint DOI'si, tarih, güncel yayın durumu ve güncel yazılım sürümü/dağıtım durumunun bibliyografik doğrulanması amacıyla kullanılmıştır; kaynakta bulunmayan yeni biyolojik veya tanısal sonuç eklenmemiştir.