5-FU/хитозан/β-циклодекстрин үч компоненттүү наноташуучусу — 5-фторурацилдин (5-FU) β-циклодекстрин менен инклюзиясын жана хитозан негизиндеги псевдополиротаксан матрицасын бирге колдонгон, pHга сезгич дары бөлүп чыгаруу үчүн иштелип чыккан физикалык бириктирилген дары жеткирүү системасы. Изилдөөдө система рентген нурларынын дифракциясы (XRD), Фурье өзгөртүүсү менен инфракызыл спектроскопия (FTIR), динамикалык жарык чачыроосу (DLS), зета-потенциал жана сканерлөөчү электрондук микроскопия (SEM) менен мүнөздөлгөн; 5-FU бөлүнүп чыгышы pH 5,5 жана 7,4 шарттарында өлчөнгөн; HCT-116 колоректалдык рак клеткаларында цитотоксикалуулук жана ген экспрессиясы бааланган. Мындан тышкары, эркин 5-FUга тиешелүү көз карандысыз ачык транскриптом маалымат топтому колдонулуп in silico белок–белок өз ара аракеттенүү тармагы түзүлгөн.

Үч компоненттүү формуланын орточо гидродинамикалык диаметри 187,3 ± 12,6 nm, полидисперстүүлүк индекси 0,214 ± 0,031 жана зета-потенциалы +32,5 ± 4,2 mV деп өлчөнгөн. Дары жүктөө мазмуну булакта %18,6 ± 1,2, капсулалоо натыйжалуулугу %74,3 ± 3,5 деп билдирилген. 72 сааттын аягында 5-FU бөлүнүп чыгышы pH 7,4 шартында %67,37, pH 5,5 шартында %87,35 болгон. HCT-116 клеткаларында эркин 5-FU үчүн IC₅₀ 42,5 µM, 5-FU/β-CD эки компоненттүү комплекси үчүн натыйжа текстинде 27,75 µM жана үч компоненттүү 5-FU/Chs/β-CD формуласы үчүн 16,5 µM деп билдирилген.

RT-qPCR жыйынтыктарында үч компоненттүү формула тобунда Caspase-3 экспрессиясы көзөмөлдүн 3,72 эсесине, P53 экспрессиясы 3,63 эсесине чейин жогоруласа, BCL2 0,48 эсеге жана VEGF 0,32 эсеге чейин төмөндөгөн. Бирок бул топтор бирдей 5-FU концентрацияларында эмес, ар бир формуланын өзүнүн IC₅₀ эквиваленттүү концентрациясында текшерилген. Ошондуктан ген экспрессиясын салыштыруу ташуучунун таасирин дары дозасынан толук көз карандысыз ажыраткан эксперимент эмес.

Изилдөөнүн жыйынтыктары in vitro клетка культурасынын деңгээлинде. Наноташуучу адамдарда кыйла натыйжалуу же коопсуз колоректалдык рак дарылоосу экени көрсөтүлгөн эмес. Жаныбарлардагы фармакокинетика, шишикте топтолуу, биотаралуу, системалык уулуулук, чыныгы шишикти бутага алуу, узак мөөнөттүү химиялык туруктуулук жана клиникалык натыйжалуулук бул изилдөөдө текшерилген эмес.

Хитозан/β-Циклодекстрин Үч Компоненттүү Наноташуучусу Деген Эмне?

Хитозан/β-циклодекстрин үч компоненттүү наноташуучусу β-циклодекстриндин 5-FU менен түзгөн инклюзиялык өз ара аракеттенүүсүн хитозандын полимердик матрицасы менен бириктирип, 5-FUну физикалык кармап туруу аркылуу эригичтикти, бөлүкчө туруктуулугун жана pHга көз каранды бөлүнүп чыгуу жүрүм-турумун өзгөртүүгө багытталган 5-FU/Chs/β-CD формуласы.

5-Фторурацил деген эмне?

5-Фторурацил (5-FU) — пиримидин аналогу болгон антиметаболиттик химиотерапиялык дары. Изилдөөнүн биологиялык контекстинде 5-FUнун негизги таасирлеринин бири тимидилат-синтазаны басаңдатып DNA синтезин бузуу болуп саналат. Булак 5-FUнун тез метаболизм, плазмадагы кыска жарым ажыроо мезгили, системалык уулуулук жана химиорезистенттүүлүк сыяктуу клиникалык чектөөлөрү көзөмөлдөнгөн дары жеткирүү системаларына кызыгууну күчөткөнүн белгилейт.

Бул изилдөө 5-FUнун жаңы ракка каршы механизмин ачпайт. Изилдөөнүн негизги суроосу — белгилүү дарынын физикалык ташылуу жана бөлүнүп чыгуу касиеттерин хитозан жана β-циклодекстрин колдонуу аркылуу өзгөртүүгө болобу деген маселе.

β-Циклодекстрин деген эмне?

β-Циклодекстрин (β-CD) — жети глюкопираноза бирдигинен турган шакек сымал олигосахарид. Молекуланын сырткы бөлүгү гидрофилдүү мүнөздө болсо, ички көңдөйү салыштырмалуу гидрофобдук микро-чөйрө түзөт. Ылайыктуу молекулалар бул көңдөйгө жарым-жартылай жайгашып инклюзиялык комплекс түзө алат.

Инклюзиялык комплексте конок молекула менен β-CD ортосунда жаңы коваленттик байланыш түзүлүшү милдеттүү эмес. Бул изилдөөдөгү FTIR өзгөрүүлөрү да суутек байланышы, van der Waals өз ара аракеттенүүлөрү жана гидрофобдук инклюзия сыяктуу коваленттик эмес өз ара аракеттенүүлөргө ылайык деп чечмеленген.

Хитозан деген эмне?

Хитозан — хитинди деацетилдөөдөн алынган катиондук полисахарид. Бул изилдөөдө колдонулган хитозан орточо молекулалык массалуу; булак молекулалык массасын 190–310 kDa, деацетилдөө даражасын %75–85 жана илешкектүүлүгүн 200–800 cP деп берет.

Хитозандын амин топтору протондолушу мүмкүн болгондуктан, полимердин электр заряды жана чынжырлар аралык өз ара аракеттенүүлөрү pHга жараша өзгөрүшү мүмкүн. Булак кислоталуу чөйрөдө протондолуунун жогорулашын полимер матрицасынын шишиши жана 5-FUнун тезирээк диффузиясы менен байланыштырат.

Псевдополиротаксан эмнени билдирет?

Псевдополиротаксан — шакек сымал молекулалар полимер чынжырынын боюна физикалык түрдө тизиле алган супрамолекулалык түзүлүштү билдирет. Бул жердеги “псевдо” түшүнүгү классикалык полиротаксандарда шакектердин чынжырдан чыгып кетишине тоскоол болгон чоң акыркы топтордун милдеттүү эместигин түшүндүрөт.

Изилдөөдө β-CD жана хитозан физикалык аралаштыруу аркылуу псевдополиротаксан комплексин түзүү үчүн колдонулган. Андан кийин изилдөөчүлөр 5-FUну алдын ала түзүлгөн Chs/β-CD түзүлүшүнө эриткичти буулантуу/чөгөрүү ыкмасы менен жүктөшкөн.

Эмне үчүн үч башка формула салыштырылды?

Изилдөөнүн материалдык жана клеткалык эксперименттеринде үч негизги абал салыштырылган:

• Эркин 5-FU: ташуучусу жок дары.
• 5-FU/β-CD: 5-FUнун β-циклодекстрин менен түзгөн эки компоненттүү инклюзиялык комплекси.
• 5-FU/Chs/β-CD: β-CD жана хитозанды бирге камтыган үч компоненттүү формула.

Бул ирет β-CD өзү берген өзгөрүүнү жана ага хитозан кошулганда пайда болгон кошумча өзгөрүүнү ажыратып көрүү үчүн колдонулган.

Үч компоненттүү формула кантип даярдалды?

Алдын ала даярдалган Chs/β-CD псевдополиротаксан комплексинен 0,8 g алынып, 30 mL суусуз N,N-диметилформамид (DMF) ичинде 60 °Cде, 600 rpm магниттик аралаштыруу астында эки саат диспергирленген.

Өзүнчө 0,5 g 5-FU 10 mL суусуз DMF ичинде беш мүнөттүк кыска соникация менен эритилген. 5-FU эритмеси бөлмө температурасында Chs/β-CD дисперсиясына 1 mL/мүн ылдамдыкта тамчылатып кошулган.

Аралашма андан кийин 60 °Cде 20 саат аралаштырылып, майда ак чөкмө пайда болгон. Чөкмө вакуумдук чыпкалоо менен чогултулуп, үч жолу 50 mL дистилденген суу менен жуулган, бөлмө температурасында 24 саат абада кургатылган жана андан кийин силикагель үстүндө вакуумдук десикатордо дагы 48 саат кургатылган. Акыркы порошок жабык янтарь түстөгү айнек бөтөлкөлөрдө 4 °Cде сакталган.

Гидродинамикалык диаметр эмнени өлчөйт?

Динамикалык жарык чачыроосу менен алынган гидродинамикалык диаметр бөлүкчө суюктуктун ичинде кыймылдаганда көрсөткөн натыйжалуу өлчөмдү билдирет. Бул маани кургак SEM сүрөтүнөн сызгыч менен өлчөнгөн геометриялык диаметр менен бирдей физикалык чоңдук эмес; бөлүкчөнүн айланасындагы эриткичтин өз ара аракеттенүүлөрү жана агрегация абалы DLS натыйжасына таасир этиши мүмкүн.

PDI деген эмне?

Полидисперстүүлүк индекси (PDI) — DLS өлчөөсүндө бөлүкчө өлчөмүнүн бөлүштүрүүсүнүн кеңдиги жөнүндө маалымат берген өлчөмсүз көрсөткүч. Маани азайган сайын бөлүштүрүү тарыраак жана бөлүкчө популяциясы өлчөмү боюнча бир тектүүрөөк деп эсептелет. Бул изилдөөдө PDI эркин 5-FUдагы 0,416 мааниден үч компоненттүү формулада 0,214 маанисине төмөндөгөн.

Зета-потенциал эмнени билдирет?

Зета-потенциал — суюктуктун ичиндеги бөлүкчөлөрдүн электрокинетикалык беттик жүрүм-турумун сүрөттөгөн электр потенциалынын өлчөмү жана mV менен берилет. Булак үч компоненттүү формуладагы +32,5 mV маанини хитозандын протондолгон амин топтору менен байланыштырып, жогорку электростатикалык турукташууга ылайык деп чечмелеген.

Зета-потенциалдын абсолюттук маанисинин жогору болушу коллоиддик туруктуулук жөнүндө пайдалуу маалымат берет; бирок өз алдынча узак мөөнөттүү химиялык туруктуулукту, биологиялык коопсуздукту же in vivo жүрүм-турумду далилдебейт.

14 күндүк коллоиддик туруктуулук сыноосу

Булак 14 күндө өлчөмдүн өсүшү %8 көрсөткүчүнөн төмөн, зета-потенциалдын азайышы %13 көрсөткүчүнөн төмөн жана PDI 0,3 маанисинен төмөн калышын практикалык кыска мөөнөттүү коллоиддик туруктуулукка ылайык деп эсептейт. Бул сыноо 4 °Cде болгону 14 күн сактоону камтыйт; узак мөөнөттүү сактоо мөөнөтүнүн далили эмес.

XRD жыйынтыктары эмнени көрсөттү?

Таза 5-FUнун XRD үлгүсүндөгү курч жана күчтүү дифракциялык чокулардын болушу кристаллдык катуу түзүлүшкө ылайык келет. 5-FU/β-CD комплексинде 5-FUга мүнөздүү чокулардын интенсивдүүлүгү азайып, чокулар кеңейген. Булак муну β-CD көңдөйүнүн ичинде инклюзия түзүлүшү жана кристаллдык тартиптин азайышы менен байланыштырат.

Үч компоненттүү системада 5-FUнун кристаллдык чокулары дагы да басаңдатылган. Хитозанга тиешелүү деп эсептелген болжол менен 10,8° жана 20° тегерегиндеги XRD өзгөчөлүктөрүнүн үч компоненттүү формулада болжол менен 12,5° жана 20,2°ге жылганы билдирилген. Изилдөөчүлөр бул өзгөрүүлөрдү 5-FU, β-CD жана хитозан ортосундагы молекулалык өз ара аракеттенүүлөр жана 5-FUнун полимердик матрицада көбүрөөк таралган/аморфтук мүнөзгө ээ болушу менен шайкеш деп эсептешет.

XRDде чокулардын басаңдашы молекула ташуучунун кайсы жеринде жайгашканын түздөн-түз көрсөтпөйт. Изилдөөнүн түзүмдүк түшүндүрмөсү XRD, FTIR жана башка мүнөздөө жыйынтыктарын чогуу баалоого негизделет.

FTIR жыйынтыктары эмнени көрсөттү?

FTIR молекулалардагы байланыштардын термелүүлөрүнө туура келген инфракызыл сиңирүү тилкелерин өлчөйт. Таза 5-FU үчүн булак N–H созулушун 3567,66 cm⁻¹, алифаттык C–H созулушун 2935,12 cm⁻¹ жана карбонил C=O созулушун 1715,37 cm⁻¹ деп билдирген.

Булак бул жылыштарды жаңы коваленттик байланыш түзүлүшүнүн далили катары эмес, суутек байланыштары жана башка коваленттик эмес молекулалар аралык өз ара аракеттенүүлөргө ылайык спектрдик өзгөрүүлөр катары чечмелейт.

SEM эмнени көрсөттү?

Таза 5-FUнун SEM сүрөттөрүндө чоң жана иретсиз кристаллдык бөлүкчөлөр көрүнгөн. 5-FU/β-CD эки компоненттүү комплексинде бети жылмакайыраак, пластинка сымал жана узун түзүлүштөр билдирилген. Үч компоненттүү формулада болсо орой, иретсиз жана агрегатка окшош наноскопиялык морфология байкалган.

Булактагы SEM микрографиялары чыныгы эксперименттик байкоо болгондуктан Verianla ичинде жасалма SEM сүрөтү түзүлгөн эмес. DLS жана SEM да бирдей физикалык өлчөөнү аткарбай турганын унутпоо керек: DLS суюктуктагы гидродинамикалык жүрүм-турумду, SEM болсо кургатылган жана алтын менен капталган үлгүнүн беттик морфологиясын баалайт.

Фазалык эригичтик эмнени өлчөдү?

Фазалык эригичтик эксперименти β-CD жана Chs/β-CD системалары суу чөйрөсүндө 5-FU эригичтигин канчалык өзгөрткөнүн изилдеген. Таза 5-FU үчүн булак болжол менен 1,12 mg/mL суудагы эригичтикти берет.

β-CD концентрациясы жогорулаган сайын 5-FU эригичтиги сызыктуу жогорулаганы жана бул Higuchi классификациясы боюнча A₁-типтүү жүрүм-турумга ылайык экени айтылган. Булак муну болжол менен 1:1 5-FU:β-CD инклюзиялык стехиометрия менен байланыштырат.

Булак β-CD үчүн көрүнгөн байланышуу/туруктуулук константасын:

\[ K_s=\frac{\mathrm{Slope}}{S_0(1-\mathrm{Slope})} \]

теңдемеси менен эсептегенин билдирет.

Бул жерде Slope фазалык эригичтик түз сызыгынын эңкейишин; S₀ комплекс түзүүчү зат жок кездеги 5-FUнун баштапкы эригичтигин; K_s болсо көрүнгөн туруктуулук константасын билдирет.

Булак төмөнкү сандык туюнтманы берет:

\[ K_s=\frac{0.1315}{1.1124(1-0.1315)}=136.2\ \mathrm{M^{-1}} \]

Булак ичиндеги шайкештик эскертүүсү: Теңдемеде басылган 0,1315 жана 1,1124 сандары бирдикти өзгөртүү түшүндүрүлбөстөн түз арифметикалык колдонулганда оң жактагы 136,2 M⁻¹ мааниси алынбайт. Булак S₀ бул эсепте кайсы молярдык бирдикке айландырылганын көрүнүктүү түрдө түшүндүрбөйт. Ошондуктан Verianla 136,2 M⁻¹ маанисин булакта билдирилген жыйынтык катары сактайт; жетишпеген бирдик/нормалдаштыруу кадамын божомолдоп жаңы эсеп чыгарбайт.

Булак 136,2 M⁻¹ маанисин 5-FU менен β-CD ортосунда салыштырмалуу алсыз комплекстешүү аффинитети катары чечмелейт.

pH 5,5 шартында Тезирээк 5-FU Бөлүнүп Чыгышы Эмнени Билдирет?

pH 5,5 шартында тезирээк бөлүнүп чыгуу үч компоненттүү хитозан/β-циклодекстрин матрицасы кислоталуу чөйрөдө көбүрөөк 5-FU бошоторун көрсөтөт; бул изилдөөнүн алкагында pH 5,5 жоон ичегинин люменин эмес, кислоталуу шишик микро-чөйрөсүн жана клеткага киргенден кийинки эндосомалык/лизосомалык чөйрөнү чагылдырган in vitro шарт.

Бөлүнүп чыгуу эксперименти кантип жүргүзүлдү?

Үч компоненттүү формуладан 10 mg, болжол менен 2,5 mg 5-FU эквивалентине туура келгидей болуп 2 mL бөлүнүп чыгуу чөйрөсүндө диспергирленип, 12–14 kDa молекулалык масса кесүү чегине ээ диализ баштыгына жайгаштырылган.

Диализ баштыгы 37 °Cде 50 mL бөлүнүп чыгуу чөйрөсүнө салынган жана 100 rpmде үзгүлтүксүз чайкалган. Эки чөйрө салыштырылган:

• pH 5,5 ацетат буфери,
• pH 7,4 фосфат-буферленген туздуу эритме.

0,5; 1; 2; 4; 8; 12; 24; 48 жана 72 саатта 1 mL үлгү алынып, ошол эле көлөмдө жаңы чөйрө кошулган. Бөлүнүп чыккан 5-FU UV–Vis спектрофотометри менен 266 nmде өлчөнгөн.

Булак эки pH шартынын ортосундагы айырма бардык өлчөө убакыттарында p < 0,001 болгонун билдирет.

Хитозан эмне үчүн pHга сезгич?

Булактын механизмди түшүндүрүүсүндө хитозандын амин топтору кислоталуу чөйрөдө көбүрөөк протондолуп –NH₃⁺ формасына өтөт. Бирдей оң заряддардын ортосундагы электростатикалык түртүлүү полимер чынжырларын бири-биринен алыстата алат; матрица шишигенде 5-FUнун тышкы чөйрөгө диффузиясы жеңилдеши мүмкүн.

Булак хитозандын pK_a маанисин болжол менен 6,5 деп берет жана pH 7,4 шартында амин топторунун болжол менен %50–60 бөлүгү протондолгон бойдон каларын билдирет. Бирок бул пайыз үчүн өзүнчө эксперимент же эсептөө теңдемеси берилбегендиктен, Verianla бул катышты кайра чыгарылган өлчөө катары эмес, булак авторлорунун механизм түшүндүрмөсүнүн бир бөлүгү катары берет.

pH 5,5 жоон ичегинин ичиндеги pHбы?

Жок. Булак муну атайын түшүндүрөт. pH 5,5 шарты жоон ичегинин люменин чагылдыруу үчүн тандалган эмес; кислоталуу шишик микро-чөйрөсү жана клеткага алынгандан кийинки эндосомалык/лизосомалык бөлүктөр менен байланышкан.

Бул айырмачылык маанилүү; жыйынтык “дары жоон ичегиге жеткенде pH 5,5 болгондуктан автоматтык түрдө бөлүнүп чыгат” деп чечмеленбеши керек.

IC₅₀ Маанисинин 42,5 µMден 16,5 µMге Төмөндөшү Эмнени Билдирет?

IC₅₀нин 42,5 µMден 16,5 µMге төмөндөшү HCT-116 клеткаларында жана бул изилдөөнүн 72 сааттык SRB эксперимент шарттарында үч компоненттүү формула клетканын жашоого жөндөмдүүлүгүн %50 деңгээлге түшүрүү үчүн эркин 5-FUга караганда төмөн 5-FU эквиваленттүү концентрацияны талап кыларын көрсөтөт; бул жыйынтык адамдарда төмөн клиникалык дозаны же жогорку дарылоо ийгилигин түздөн-түз далилдебейт.

SRB тести эмнени өлчөйт?

Sulforhodamine B (SRB) тести фиксацияланган клеткалардагы клеткалык белоктун көлөмүнө көз каранды боёк сигналын колдонуп клетка биомассасы/жашоо жөндөмдүүлүгү үчүн кыйыр өлчөм берет. Изилдөөдө 540 nm абсорбанс өлчөнгөн.

Булак клетканын жашоо жөндөмдүүлүгүн:

\[ \mathrm{Cell\ viability}(\%)= \frac{A_{\mathrm{sample}}-A_{\mathrm{blank}}} {A_{\mathrm{control}}-A_{\mathrm{blank}}}\times100 \]

түрүндө эсептеген.

Бул жерде:

• A_sample: дарылоо колдонулган кудуктун абсорбансы,
• A_control: дарылоо колдонулбаган көзөмөл кудугунун абсорбансы,
• A_blank: клеткасыз чөйрөнүн фондук абсорбансы.

Blank сигналын алып салуу аппарат/чөйрө фонун азайтат; калган дарылоо сигналы көзөмөл тобуна салыштырылып пайыздык жашоо жөндөмдүүлүк алынат.

HCT-116 цитотоксикалуулук жыйынтыктары

42,5 / 16,5 ≈ 2,58 болгондуктан булак муну болжол менен 2,6 эсе жогорулаган in vitro цитотоксикалык потенциал деп билдирет.

Бул катыш клиникалык натыйжалуулук катышы эмес. IC₅₀ белгилүү клетка линиясы, убакыт, культура шарттары жана өлчөө ыкмасы алдындагы клеткалык жоопту гана билдирет.

Цитотоксикалуулук экспериментиндеги булак ичиндеги бирдик айырмасы

Ыкма бөлүмү клеткалар 0,05–500 µg/mL эквиваленттүү 5-FU аралыгында дарыланганын билдирет. Бирок клетка микроскопиясы сүрөтүнүн түшүндүрмөсүндө 0,05 жана 500 µM деп жазылган жана доза–жооп жыйынтыктарында да IC₅₀ µM менен берилген.

Булак бул µg/mL–µM айырмасын түшүндүрбөйт. Ошондуктан Verianla бул эки бирдикти бири-бирине айландырып, кайсынысы “туура” экенин чечкен эмес.

RT-qPCR эмне үчүн жасалды?

RT-qPCR менен клеткалардын дарылоодон кийинки төрт ген боюнча mRNA экспрессиясы өлчөнгөн:

• P53: клеткалык стресс, DNA бузулушу, клетка цикли жана апоптозду жөнгө салууда борбордук ролу бар шишик басуучу жолдун компоненти.
• Caspase-3: апоптоздук клетка өлүмүнүн аткаруучу каспаздарынын бири.
• BCL2: апоптозго каршы клетканын жашап калуу белоктору үй-бүлөсүнүн мүчөсү.
• VEGF: ангиогенез менен байланышкан сигнал молекуласы.

RT-qPCR бул жерде mRNA экспрессиясын өлчөйт. P53 же Caspase-3 mRNAсынын жогорулашы өзүнчө тиешелүү белоктун көлөмүн, белоктун активдешүү абалын же чыныгы апоптоздук клеткалардын санын түздөн-түз өлчөбөйт. Булак бул ген өзгөрүүлөрүн апоптозго шайкеш молекулалык белгилер катары чечмелейт.

2^−ΔΔCt ыкмасы эмнени эсептейт?

Изилдөөдө салыштырмалуу ген экспрессиясы салыштырмалуу Ct ыкмасы менен эсептелген:

\[ \mathrm{Relative\ expression}=2^{-\Delta\Delta C_t} \]

Стандарттуу салыштырмалуу Ct логикасында алгач максаттуу гендин Ct мааниси GAPDH же β-Actin сыяктуу референстик гендерге карата нормалдаштырылат:

\[ \Delta C_t=C_{t,\mathrm{hedef}}-C_{t,\mathrm{referans}} \]

Андан кийин дарылоо тобунун нормалдаштырылган мааниси көзөмөл тобу менен салыштырылат:

\[ \Delta\Delta C_t= \Delta C_{t,\mathrm{tedavi}}-\Delta C_{t,\mathrm{kontrol}} \]

Акыркы кадамда \(2^{-\Delta\Delta C_t}\) туюнтмасы көзөмөл тобуна салыштырмалуу экспрессия өзгөрүшүн берет. Натыйжа 1 маанисинен жогору болсо салыштырмалуу жогорулашты, 1 маанисинен төмөн болсо салыштырмалуу азайышты билдирет.

RT-qPCR топтору бирдей 5-FU дозасын алдыбы?

Жок. Булак ар бир формуланы өзүнүн IC₅₀ эквиваленттүү концентрациясында колдонгон:

• эркин 5-FU: 42,5 µM,
• 5-FU/β-CD: 27,5 µM,
• 5-FU/Chs/β-CD: 16,5 µM.

Бул эксперименттик дизайн ар бир формуланын болжол менен эквиваленттүү цитотоксикалык деңгээлдеги молекулалык жообун салыштырат. Бирок топтордогу 5-FU молярдык концентрациясы бирдей эмес. Ошондуктан ген экспрессиясындагы айырмачылыктарды “ташуучунун таасири” деп гана чечмелөөгө болбойт; формула жана колдонулган IC₅₀ эквиваленттүү концентрация бирге өзгөрөт.

Булак Caspase-3 жана P53 үчүн үч компоненттүү формуланын эркин 5-FU жана эки компоненттүү комплекске караганда жогорулашын; BCL2 жана VEGF үчүн болсо күчтүүрөөк төмөндөшүн статистикалык маанилүү айырмачылыктар менен байланыштырат (p < 0,05).

In Silico PPI Тармагы Наноташуучунун Механизмин Түздөн-Түз Далилдейби?

Жок. Изилдөөнүн in silico PPI анализи GSE183977 маалымат топтомундагы HT29 клеткаларынын эркин 5-FUга транскрипциялык жообун изилдейт; хитозан, β-циклодекстрин же үч компоненттүү наноташуучу үчүн транскриптом маалыматтары колдонулбагандыктан, тармактык анализ наноташуучуга мүнөздүү механизмдин түз далили эмес.

In silico маалымат топтому лабораториялык эксперименттен эмнеси менен айырмаланат?

Бул айырмачылыктарга байланыштуу эки маалымат бөлүгүн бири-бирин толуктоочу түрдө чечмелөөгө болот, бирок алар бири-биринин түз репликациясы эмес.

Дифференциалдык ген экспрессиясы кантип аныкталды?

GEO2R менен көзөмөл жана 5-FU колдонулган HT29 үлгүлөрү салыштырылган. Булак маанилүү дифференциалдык экспрессия үчүн:

\[ |\log_2(\mathrm{Fold\ Change})| > 1.5 \]

жана:

\[ p_{\mathrm{adj}} < 0.05 \]

чектерин колдонгон.

log₂ fold-change ген экспрессиясындагы өзгөрүүнү эки негиздүү логарифмдик масштабда билдирет. Оң маани жогорулашты, терс маани төмөндөөнү көрсөтөт. Түзөтүлгөн p мааниси болсо көп сандагы гендер бир убакта текшерилгенде жалган оң натыйжаларды көзөмөлдөө үчүн колдонулган түзөтүлгөн статистикалык маанилүүлүк көрсөткүчү.

Булак жалпысынан 33 жогору жөнгө салынган жана 217 төмөн жөнгө салынган ген, башкача айтканда 250 дифференциалдык ген аныктаган.

PPI тармагы кантип түзүлдү?

250 дифференциалдык ген STRING маалымат базасына өткөрүлүп, өз ара аракеттенүү ишеним көрсөткүчү >0,4 болгон белок–белок өз ара аракеттенүүлөрү колдонулган.

Натыйжада:

• 112 түйүн,
• 170 кыр,
• PPI enrichment p < 1,0 × 10⁻¹⁶

камтыган тармак алынган. Түйүн белокту/ген продуктусун, кыр болсо STRING аныктаган белок–белок байланышы тууралуу маалыматты билдирет.

PPI байытуу p маанисинин өтө кичине болушу бул белоктор тармакта туш келди тандалган ошол эле өлчөмдөгү ген тобунан күтүлгөндөн көбүрөөк байланыштуу экенин көрсөтөт. Бул маани ар бир өз ара аракеттенүүнүн биологиялык себептүүлүгүнүн далили эмес.

Hub ген кантип аныкталды?

PPI тармагы Cytoscapeке өткөрүлүп, CytoHubba кошумчасынын degree көрсөткүчү колдонулган. Degree — түйүн түз байланышкан тармак байланыштарынын саны.

IL6нын degree упайы 30 менен эң жогору табылган. Бул IL6 колдонулган PPI тармагында эң көп байланышка ээ борбордук түйүн экенин билдирет; бул IL6 наноташуучунун эксперимент аркылуу далилденген бутагы дегенди билдирбейт.

Функционалдык байытуу эмнени көрсөттү?

Булакта эң күчтүү байытылган биологиялык процесс цитокин аркылуу сигнал берүү жолу деп берилген:

\[ FDR=8.77\times10^{-5} \]

Бул термин EGR1, IFNL2, IL19, CXCL1, IL6, IFNL3 жана MYC болгон жети hub генди камтыган.

Клетканын органикалык затка жообу, химиялык затка жообу, клетка өлүмүнүн оң жөнгө салынышы, апоптоздук процесстин оң жөнгө салынышы, MAPK каскадынын жөнгө салынышы, иммундук жооп жана JAK–STAT рецептордук сигнал жолу сыяктуу процесстер да байытылган.

FDR көп гипотезалуу тесттерде күтүлгөн жалган ачылыш үлүшүн көзөмөлдөгөн түзөтүлгөн статистикалык көрсөткүч. Кичирээк FDR байкалган ген тизмесинин тиешелүү функционалдык термин менен байланышын кокустук менен түшүндүрүүгө каршы күчтүү статистикалык колдоо берет.

Изилдөөнүн Ыкмасы жана Жыйынтыктары

Материалдар

5-FU кеминде %99 HPLC тазалыгында, β-CD кеминде %98 тазалыгында колдонулган. β-CDнин молекулалык массасы булакта 1135 g/mol деп берилген. Хитозан орточо молекулалык массалуу, 190–310 kDa; деацетилдөө даражасы %75–85; илешкектүүлүгү 200–800 cP деп көрсөтүлгөн.

HCT-116 адамдын колоректалдык рак клетка линиясы Nawah Scientific Inc. компаниясынан алынган. Клетка культурасында RPMI-1640, fetal bovine serum, пенициллин–стрептомицин жана трипсин-EDTA колдонулган.

5-FU/β-CD физикалык аралашмасы

Көзөмөл үчүн физикалык аралашма инклюзиялык комплекстегидей эле 1:50 салмак катышында 5-FU жана β-CD колдонуу менен даярдалып, компоненттер комплекс түзүлүшүн мажбурлабастан бир тектүү аралашма алуу үчүн хаванда 10 мүнөт жеңил майдаланган.

5-FU/β-CD инклюзиялык комплексин даярдоо

0,04 g 5-FU 30 mL DMF ичинде эритилип, 2 g β-CD акырындап кошулган жана суспензия 80 °Cде үзгүлтүксүз магниттик аралаштыруу астында сегиз саат кармалган.

Эритме стерилдүү Petri идиштерине өткөрүлүп, бөлмө температурасында жети күн кургатылган. Кургак катуу зат кырып алынган, жеңил майдаланган жана бөлмө температурасында аба кирбеген идиштерде сакталган.

Chs/β-CD псевдополиротаксанын даярдоо

1,1 g β-CD 50 mL дистилденген сууда 50 °Cде 600 rpm аралаштыруу менен эритилип, бөлмө температурасына чейин муздатылган.

Өзүнчө 0,25 g хитозан 50 mL %1 v/v суудагы уксус кислотасында эритилип, 12 саат аралаштырылган. Хитозан эритмеси бөлмө температурасындагы β-CD эритмесине 1 mL/мүн ылдамдыкта кошулган.

Аралашма дагы 24 саат 600 rpmде аралаштырылган. Пайда болгон сүттөй ак чөкмө 12.000 × gде 20 мүнөт центрифугаланып, үч жолу дистилденген суу жана бир жолу 0,1 M аммоний гидроксиди менен жуулган, 48 саат лиофилизацияланган жана десикатордо сакталган.

DLS өлчөө шарттары

Үч компоненттүү формула 1 mg/mL концентрацияда деиондоштурулган сууда диспергирленип, 10 мүнөт соникацияланган жана Zetasizer Nano ZS аппаратында 25 °Cде, 173° чачыроо бурчунда үч кайталоо менен өлчөнгөн.

FTIR шарттары

FTIR өлчөөлөрү Jasco Model 4100 спектрометри менен 4000–400 cm⁻¹ толкун саны диапазонунда жана 4 cm⁻¹ ажыратуу жөндөмүндө жүргүзүлгөн. Үлгүлөр KBr пеллеттери катары даярдалган.

XRD шарттары

Bruker D8 Advance дифрактометри, Cu Kα нурлануусу жана λ=1,5406 Å колдонулган. Аппарат 40 kV жана 40 mAда иштетилип; скан 2θ=5–80° диапазонунда, 0,02° кадам жана 2°/мүн скан ылдамдыгы менен жүргүзүлгөн.

SEM шарттары

Zeiss Sigma 500 VP FESEM колдонулган. Үлгүлөр 0,1 mg/mL болуп деиондоштурулган сууда диспергирленип, алюминий stub үстүнө тамызылып, вакуумда кургатылган жана өткөрүмдүүлүктү жогорулатуу үчүн жука алтын катмар менен капталган. Сүрөттөр 5 kV ылдамдатуучу чыңалууда 10.000× жана 50.000× чоңойтууда алынган.

Дары жүктөө мазмуну жана капсулалоо натыйжалуулугу

Булак эки негизги формуланы колдонгон:

\[ DLC(\%)= \frac{\text{Formülasyondaki ilaç ağırlığı}} {\text{Formülasyon ağırlığı}}\times100 \]

DLC (drug loading content) алынган формуланын жалпы массасынын канча пайызы дары экенин билдирет.

\[ EE(\%)= \frac{\text{Formülasyondaki ilaç ağırlığı}} {\text{Başlangıçta eklenen ilaç ağırlığı}}\times100 \]

EE (encapsulation efficiency) башында колдонулган дарынын кайсы үлүшү акыркы ташуучу системанын ичинде кармалып калганын билдирүүчү көрсөткүч.

Булак орточо:

• DLC = %18,6 ± 1,2,
• EE = %74,3 ± 3,5

деп билдирген.

5-таблицадагы EE эсептөөнүн булак ичиндеги белгисиздиги

Булак 5-таблицада орточо формула массасын 5,12 mg, “Drug Added” маанисин 500 mg жана ушул 5,12 mg үлгүдөгү өлчөнгөн дарыны 0,95 mg деп берет.

DLC жагынан:

\[ \frac{0.95}{5.12}\times100\approx18.6\% \]

болгондуктан, басылган DLC мааниси таблица менен арифметикалык жактан шайкеш.

Бирок 0,95 mg өлчөнгөн дары жана таблицада басылган 500 mg баштапкы дары ошол эле формулада түз колдонулса, булакта берилген %74,3 EE алынбайт. Бул жердеги мүмкүн болгон үлгү-масштаб/batch-масштаб нормалдаштыруу кадамы же мамыча аныктамасы макалада түшүндүрүлгөн эмес.

Ошондуктан %74,3 булак жыйынтыгы өзгөртүлбөй сакталган; бирок таблица маанилеринен көз карандысыз кайра тастыкталган EE эсеби катары берилген эмес.

Фазалык эригичтик ыкмасындагы концентрация айырмасы

Материал жана ыкма бөлүмү Chs/β-CD псевдополиротаксаны үчүн 0–10 mg/mL диапазонун көрсөтөт. Жыйынтык бөлүмү болсо эң жогорку сыноо деңгээлин 20 mg/mL Chs/β-CD деп аныктап, бул жерде 5-FU эригичтигин 6,84 ± 0,20 mg/mL деп берет.

Булак бул эки концентрация диапазонунун ортосундагы айырманы түшүндүргөн эмес. Verianla жыйынтыктарды 20 mg/mLден 10 mg/mLге түшүргөн эмес же ыкма бөлүмүн унчукпай 20 mg/mL кылып өзгөрткөн эмес.

Эригичтик жыйынтыктары

Таблицанын аталышы бул маалыматтарды “эквиваленттүү β-CD концентрацияларында” салыштыруу катары берет. Бирок текстте 20 mg/mL Chs/β-CD системасы болжол менен 4,4 mM β-CD камтууга туура келет деген өзүнчө билдирүү болгондуктан, концентрация октору кантип шайкеш келтирилгени булакта толук ачык эмес. Ошондуктан таблица булак маанилери менен өзгөртүлбөй сакталган, жаңы концентрация конверсиясы түзүлгөн эмес.

Статистикалык анализ

Эксперименттик жыйынтыктар үч кайталоо менен жүргүзүлүп, орточо ± стандарттык четтөө түрүндө берилген. Статистикалык анализ GraphPad Prism колдонулуп жүргүзүлгөн.

Топтордун ортосундагы айырмачылыктар үчүн бир факторлуу дисперсиялык анализ (one-way ANOVA), андан кийин Tukey post hoc тести колдонулган. Статистикалык маанилүүлүк чеги:

\[ p<0.05 \]

деп белгиленген.

ANOVA бир нече топтун орточо маанилеринин ортосунда жалпы айырма бар-жогун текшерет. Tukey post hoc тести болсо ANOVAдан кийин кайсы топ жуптары бири-биринен айырмаланарын баалоо үчүн колдонулат.

In silico анализ кадамдары

1. NCBI Gene Expression Omnibus ичинде 5-FU жана колоректалдык рак менен байланышкан маалымат топтомдору изделген.
2. GSE183977 ичинен эки көзөмөл жана эки 100 µM 5-FU колдонулган HT29 үлгүсү тандалган.
3. GEO2R менен дифференциалдык экспрессия анализи жүргүзүлгөн.
4. |log₂FC| >1,5 жана adjusted p<0,05 чектери колдонулган.
5. 250 дифференциалдык ген STRINGге өткөрүлгөн.
6. STRING өз ара аракеттенүүлөрүндө confidence score >0,4 колдонулган.
7. Тармак Cytoscapeке өткөрүлгөн.
8. CytoHubba degree ыкмасы менен биринчи 10 hub ген тандалган.
9. ShinyGO менен функционалдык байытуу жүргүзүлгөн.

Изилдөө түздөн-түз колдогон жыйынтыктар

• 5-FU, β-CD жана хитозан физикалык ыкмалар менен үч компоненттүү катуу формулада бириктирилген.
• Үч компоненттүү формула DLSде 187,3 ± 12,6 nm орточо гидродинамикалык диаметр жана +32,5 ± 4,2 mV зета-потенциал көрсөткөн.
• XRD жана FTIR маалыматтары 5-FUнун кристаллдык тартибинин азайышына жана компоненттер аралык коваленттик эмес өз ара аракеттенүүлөргө ылайык өзгөрүүлөрдү көрсөткөн.
• 5-FU бөлүнүп чыгышы pH 5,5 шартында pH 7,4 шартына салыштырмалуу тезирээк болгон.
• HCT-116 клеткаларында үч компоненттүү формула эркин 5-FUга салыштырмалуу төмөн IC₅₀ көрсөткөн.
• Үч компоненттүү формуланын өзүнүн IC₅₀ эквиваленттүү концентрациясындагы RT-qPCR экспериментинде P53 жана Caspase-3 экспрессиясы жогору, BCL2 жана VEGF экспрессиясы төмөн билдирилген.
• Эркин 5-FUнун көз карандысыз HT29 транскриптом маалыматтарында IL6, MYC, EGR1, BMP4 жана ATF3 камтыган борбордук тармак түйүндөрү аныкталган.

Изилдөө түздөн-түз колдобогон жыйынтыктар

• Наноташуучунун адам бейтаптарында натыйжалуураак экени көрсөтүлгөн эмес.
• Наноташуучунун адамдарда 5-FU уулуулугун азайтканы көрсөтүлгөн эмес.
• 187 nm бөлүкчө өлчөмүнүн чыныгы адам шишигине тандалма түрдө жетери көрсөтүлгөн эмес.
• EPR таасирине ылайык өлчөм диапазонунда болуу чыныгы in vivo шишикти бутага алуунун далили эмес.
• Фармакокинетика, биотаралуу же шишик ичиндеги дары концентрациясы өлчөнгөн эмес.
• Жаныбар модели колдонулган эмес.
• Клиникалык үлгү же бейтап колдонулган эмес.
• 14 күндүк 4 °C коллоиддик өлчөө узак мөөнөттүү сактоо мөөнөтүнүн далили эмес.
• RT-qPCR жыйынтыктары белок деңгээлин же белок активдүүлүгүн түздөн-түз өлчөбөйт.
• In silico IL6, MYC, EGR1 жана ATF3 жыйынтыктары хитозан/β-CD ташуучусуна мүнөздүү түз механисттик далил эмес.

Изилдөөнүн негизги ыкмалык чектөөлөрү

Эң маанилүү чектөө — in vitro жана in silico эксперименттер ар башка клетка линияларын, ар башка дарылоо убакыттарын жана ар башка 5-FU шарттарын колдонушу. HCT-116 клеткалары формулалар менен 72 саат текшерилсе, GSE183977 анализи HT29 клеткаларында 100 µM эркин 5-FUнун болгону эки сааттык жообуна негизделет.

Ошондуктан булак in silico анализди наноташуучу механизмдин түз далили катары эмес, 5-FU фармакологиясына корреляциялык системалык деңгээлдеги контекст катары мүнөздөйт.

Экинчи маанилүү чектөө — ген экспрессиясы топтору бирдей 5-FU дозасында салыштырылган эмес. Ар бир формула өзүнүн IC₅₀ концентрациясында колдонулган. Ошондуктан ташуучунун түзүлүшүнүн таасири менен ар башка 5-FU концентрацияларынын таасири бул эксперименттик дизайнда толук ажыратылган эмес.

Үчүнчү чектөө — жыйынтыктар клетка культурасына жана эсептөө тармактык анализине гана негизделген. Булак жыйынтык бөлүмүндө in vivo фармакокинетика жана натыйжалуулук изилдөөлөрүн, узак мөөнөттүү туруктуулук сыноолорун жана сунушталган молекулалык жолдорду максаттуу генди басаңдатуу же ингибиция эксперименттери менен тастыктоону келечектеги иштердин катарында көрсөтөт.

Булак жана Ыкма Жөнүндө Эскертүү

Түпнуска изилдөө: Chitosan/β-cyclodextrin nanocarriers enhance 5-fluorouracil efficacy against colorectal cancer via pH-responsive release and apoptosis modulation

Авторлор: Amr M. A. Mohamed; Hemat M. Dardeer; Ali M. A. Ahmed; M. Yasser Alsedfy; Amr E. Abd Elhadi; Abdelmoniem M. A. Elsanosy; Abdelhakam Esmaeil Mohamed Ahmed; Alaa Hassan Said.

Жооптуу автор: Alaa Hassan Said.

Жооптуу автордун электрондук почтасы: alaa.elkareem@sci.svu.edu.eg

Мекеме 1: Department of Zoology, Faculty of Science, Qena University, Qena 83523, Egypt.

Мекеме 2: Department of Chemistry, Faculty of Science, Qena University, Qena 83523, Egypt.

Мекеме 3: Molecular Biotechnology Program, Faculty of Science, Qena University, Qena 83523, Egypt.

Мекеме 4: Electronics and Nano Devices Lab, Faculty of Science, Qena University, Qena 83523, Egypt.

Мекеме 5: Radiology Department, Applied Health Sciences Faculty, Sphinx University, New Assiut, Egypt.

Мекеме 6: Faculty of Agriculture, Food Sciences and Environmental Management, Institute of Food Science, University of Debrecen, Debrecen, Hungary.

Мекеме 7: Faculty of Forestry, University of Khartoum, Khartoum North, Sudan.

Журнал: Scientific Reports.

Басмакана/платформа: Nature Portfolio / Springer Nature.

Том: 16.

Макала номери: 20981.

ISSN: 2045-2322.

DOI: 10.1038/s41598-026-60468-z.

Макала келип түшкөн: 12-май 2026.

Кабыл алынган күнү: 29-июнь 2026.

Жарыяланган күнү: 7-июль 2026.

Булак түрү: Эксперименттик in vitro дары жеткирүү/наноматериал изилдөөсүн толуктоочу in silico тармактык фармакология жана функционалдык байытуу анализи менен бириктирген түпнуска изилдөө макаласы.

Рецензия: Scientific Reports журналында жарыяланган рецензияланган макала.

Лицензия: Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).

Этикалык уруксат: Qena University Faculty of Science Ethics Committee, Permit Number 005/07/25. Булак адам же жаныбар субъекттери колдонулбаганын билдирет.

Маалыматтын жеткиликтүүлүгү: Изилдөөнү колдогон маалыматтар макаланын ичинде экени; кошумча маалыматтарды жооптуу автордон сураса болору билдирилген.

Кызыкчылыктардын кагылышы: Авторлор кызыкчылыктардын кагылышы жок экенин билдиришкен.

Каржылоо: Булак ачык жеткиликтүүлүк каржылоосу Science, Technology & Innovation Funding Authority (STDF) жана Egyptian Knowledge Bank (EKB) кызматташтыгы менен камсыз болгонун билдирет жана ошол эле бөлүмдө “No funding” сөз айкашын колдонот. Ошондуктан ачык жеткиликтүүлүк басылмасынын чыгымдарын колдоо менен изилдөө долбоорун каржылоону аралаштырбоо керек.

Ыраазычылык: Авторлор Qena University Faculty of Science курамындагы Genetic & Molecular Biology жана Organic Chemistry лабораторияларына кызматташтык жана колдоо үчүн ыраазычылык билдиришет.

Авторлордун салымы: Amr M. A. Mohamed: концептуалдаштыруу, ыкма, формалдык анализ жана алгачкы кол жазма. Hemat M. Dardeer: концептуалдаштыруу жана ыкма. Ali M. A. Ahmed: ыкма, формалдык анализ жана алгачкы кол жазма. M. Yasser Alsedfy: программалык камсыздоо, формалдык анализ жана алгачкы кол жазма. Amr E. Abd Elhadi: ыкма. Abdelmoniem M. A. Elsanosy: ыкма. Abdelhakam Esmaeil Mohamed Ahmed: карап чыгуу жана түзөтүү. Alaa Hassan Said: формалдык анализ, визуалдаштыруу, алгачкы кол жазма, карап чыгуу жана түзөтүү. Бардык авторлор акыркы текстти окуп, жактырганы билдирилет.

Тең салым: Булакта тең салым же тең биринчи авторлук жөнүндө билдирүү жок.

Булак ичиндеги шайкештик эскертүүсү 1: Фазалык эригичтик ыкмасында Chs/β-CD үчүн 0–10 mg/mL деп жазылган, ал эми жыйынтык бөлүмүндө 20 mg/mL шарты билдирилген.

Булак ичиндеги шайкештик эскертүүсү 2: Фазалык эригичтик константасынын теңдемесинде басылган сандык коюу менен билдирилген 136,2 M⁻¹ жыйынтыгынын ортосундагы бирдик/нормалдаштыруу кадамы көрүнүктүү түрдө түшүндүрүлгөн эмес.

Булак ичиндеги шайкештик эскертүүсү 3: 5-таблицада 0,95 mg өлчөнгөн дары, 500 mg “Drug Added” жана %74,3 EE бирге берилген; таблицадагы эки масса EE формуласында түз колдонулганда басылган EE жыйынтыгы алынбагандыктан, үлгү-batch нормалдаштыруусу ачык эмес.

Булак ичиндеги шайкештик эскертүүсү 4: Цитотоксикалуулук ыкмасында концентрация диапазону µg/mL деп жазылган, ал эми клетка микроскопиясынын сүрөт түшүндүрмөсүндө µM бирдиги колдонулган.

Булак ичиндеги шайкештик эскертүүсү 5: Эки компоненттүү 5-FU/β-CD комплексинин IC₅₀ мааниси кыскача мазмунда 27,5 µM, жыйынтык текстинде 27,75 µM деп берилген. Бул айырма булак ичинде сакталган.

Негизги түшүндүрмө чеги: Бул изилдөө клиникалык изилдөө эмес. HCT-116 жыйынтыктары клетка культурасынын деңгээлинде. Наноташуучунун адамдарда шишикти бутага алуусу, фармакокинетикасы, коопсуздугу, дозаны азайтуу таасири же дарылоо ийгилиги көрсөтүлгөн эмес.

In silico түшүндүрмө чеги: GSE183977 анализи HT29 клеткаларында эркин 5-FUга тиешелүү 2 сааттык транскрипциялык жоопту колдонот. Хитозан, β-CD же үч компоненттүү формулага мүнөздүү транскриптом маалыматы жок болгондуктан, hub ген тармагы наноташуучуга мүнөздүү түз молекулалык далил эмес.