Bacillus thuringiensis kökenli Cry1Ca proteini, duyarlı böcek larvalarında temel olarak orta bağırsak epitelini hedefleyen insektisidal bir proteindir. Bu çalışma, Cry1Ca'nın Spodoptera littoralis larvalarındaki etkisini yalnız mortalite üzerinden değil; büyüme, bağırsak epitel organizasyonu, mikrovilluslar, peritrofik matriks ve bağırsak bakterilerinin uzamsal dağılımı üzerinden incelemiştir. Çalışmanın önemli yöntemsel özelliği, larvaların orta bağırsaklarının önceden disseke edilmemesi ve bütün larvaların kriyoprezervasyonla hazırlanarak taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile incelenmesidir.

Kısa süreli subletal Cry1Ca uygulaması 24 saat içinde larva büyümesini güçlü biçimde baskılamıştır. Kontrol grubunda 10 larvalık grupların ortalama ağırlığı 90,3 ± 0,7 mg iken 20, 100 ve 300 ng/µl Cry1Ca alan gruplarda sırasıyla 61 ± 1 mg, 44 ± 1 mg ve 34,7 ± 0,3 mg ölçülmüştür. Buna rağmen kısa maruziyet deneyinde mortalite görülmemiştir. SEM ve TEM görüntüleri, en düşük subletal konsantrasyonda bile mikrovillus kaybı, kolumnar hücre lizisi ve peritrofik matriks bozulması ortaya koymuştur.

Geçici maruziyetten 48 saat sonra epitel organizasyonunun kısmen toparlandığı, mikrovillusların yeniden daha belirgin hale geldiği ve peritrofik matriksin kontrol yapısına yaklaştığı gözlenmiştir. Buna karşılık sürekli ve yüksek Cry1Ca maruziyeti geri dönüşsüz epitel yıkımı, yoğun bakteriyel yayılım ve larva ölümüyle sonuçlanmıştır. Bulgular, toksinin doğrudan epitel hasarı oluşturmasının yanı sıra bağırsak bariyerinin bozulmasının bakterilerin normalde erişemediği bölgelere geçmesini kolaylaştırabileceğini göstermektedir.

Cry proteinleri böcek bağırsağını nasıl etkiler?

Bacillus thuringiensis, biyolojik zararlı mücadelesinde uzun süredir kullanılan bir bakteridir. Bu bakterinin ürettiği kristal Cry proteinleri, duyarlı böcek larvaları tarafından ağız yoluyla alındığında alkalin orta bağırsak ortamında çözünür. Protoxin biçimindeki proteinler proteolitik enzimlerle işlenerek yaklaşık 60 kDa'lık aktif monomerlere dönüştürülür.

Aktif Cry proteinleri orta bağırsak epitel hücrelerinin fırçamsı kenar membranındaki aminopeptidazlar, kadherinler veya ABC taşıyıcıları gibi reseptörlerle etkileşebilir. Bu süreç oligomerleşme, membranda por oluşumu, ozmotik dengenin bozulması ve nihayet hücre lizisiyle ilişkilidir.

Ancak çalışmanın vurguladığı üzere toksisite yalnız reseptör bağlanmasından ibaret değildir. Epitelin yenilenme kapasitesi, peritrofik matriksin bütünlüğü ve bağırsak mikrobiyotası da larvanın toksine vereceği son yanıtı etkileyebilir.

Peritrofik Matriks Neden Önemlidir?

Peritrofik matriks, bağırsak lümenindeki içerikle epitel hücreleri arasında yarı geçirgen bir bariyer oluşturan yapıdır. Normal durumda bu yapı hem sindirim ortamının düzenlenmesine hem de bağırsak bakterilerinin epitel yüzeyine doğrudan ulaşmasının sınırlandırılmasına yardımcı olur. Cry1Ca maruziyetinden sonra bu bariyerin parçalanması, yalnız epitelin daha fazla toksine maruz kalmasını değil, bakterilerin normalde korunmuş endoperitrofik alanlara ve epitel bölgelerine geçmesini de kolaylaştırabilir.

Neden bütün larva görüntülendi?

Elektron mikroskobisiyle yapılan klasik bağırsak çalışmalarında orta bağırsak genellikle hayvandan disseke edilir ve ardından sabitlenir. Ancak mekanik disseksiyon; bağırsak lümeninin biçimini değiştirebilir, peritrofik matriksi parçalayabilir, bakterilerin konumunu değiştirebilir ve kırılgan hücresel yapıların bozulmasına neden olabilir.

Bu çalışmada araştırmacılar mümkün olduğunca az örnek manipülasyonu uygulamayı amaçlamıştır. Özellikle cryo-SEM aşamasında larvalar agar içinde hızla immobilize edilmiş, sıvı azot slush içinde dondurulmuş ve kriyo-kırma sonrasında −90 °C'de dört dakika freeze-etching uygulanmıştır. Numuneler platinle kaplanmış ve görüntüleme sırasında −140 °C'de tutulmuştur.

Bu yöntem, orta bağırsağı yalnız izole bir doku olarak değil; kütikula, kaslar, trakeal yapılar, bağırsak epiteli, peritrofik matriks ve lümenle birlikte bütün anatomik bağlamı içinde inceleme olanağı sağlamıştır.

Deney hayvanları

Spodoptera littoralis laboratuvar kolonisi Universitat de València'da 100'den fazla nesildir sürdürülmektedir. Larvalar yapay diyetle, erişkinler ise ad libitum %10 sakkaroz çözeltisiyle beslenmiştir.

Koloni koşulları:

• Sıcaklık: 25 ± 3 °C
• Bağıl nem: %70 ± 10
• Fotoperiyot: 16 saat aydınlık / 8 saat karanlık

Cry1Ca hazırlanması

Cry1Ca, Escherichia coli XL1-Blue suşunda eksprese edilmiştir. Bakteriyel hücrelerden protoxin içeren inklüzyon cisimcikleri ayrılmış; alkalin karbonat ortamında çözündürülmüş ve tripsinle aktive edilmiştir.

Protoxin aktivasyonu, tripsinin enzim:protoxin oranı 1:10 olacak şekilde eklenmesi ve 37 °C'de iki saat inkübasyonla gerçekleştirilmiştir. Son aktif Cry1Ca preparatı 50 mM sodyum karbonat/bikarbonat tamponu, pH 10,5 ve 150 mM NaCl içeren çözeltiye karşı gece boyunca diyaliz edilmiştir.

Kısa süreli subletal maruziyet

Yeni deri değiştirmiş üçüncü dönem larvalar yaklaşık üç saat aç bırakılmıştır. Daha sonra Cry1Ca içeren 4 µl'lik damlacıklar Petri kabına dairesel biçimde yerleştirilmiştir.

Damlacıklar:

• Cry1Ca,
• %0,05 fenol kırmızısı,
• %10 sakkaroz,
• 10 mM DTT,
• 50 mM karbonat/bikarbonat tamponu, pH 10,5

içermiştir. Fenol kırmızısı larvaların damlayı gerçekten tükettiğini göstermek amacıyla kullanılmıştır.

Damlacık alımı doğrulandıktan sonra toksin ortamdan kaldırılmış ve larvalar toksinsiz taze diyete aktarılmıştır. Böylece araştırmacılar sürekli zehirlenmeden farklı olarak geçici bir maruziyetten sonra bağırsak hasarının devam edip etmediğini veya toparlanıp toparlanmadığını inceleyebilmiştir.

Analiz zamanları 24 ve 48 saat olarak belirlenmiştir.

Sürekli ve ölümcül maruziyet

İkinci deney düzeninde Cry1Ca yapay diyetin yüzeyine uygulanmıştır. 2 ml diyete 50 µl Cry1Ca çözeltisi yayılmış ve kaynakta nihai yüzey konsantrasyonu 10.250 ng/cm² olarak verilmiştir.

Larvalar bu diyet üzerinde sürekli tutulmuş ve 24 ile 48 saat sonra mikroskobik inceleme için örneklenmiştir. Bu deney, toksinin geçici değil kesintisiz biçimde alınması durumunda bağırsak dokusunun ne ölçüde bozulduğunu değerlendirmiştir.

SEM koşulları

TEM koşulları

TEM analizinde larvalar %2 Karnovsky fiksatifiyle sabitlenmiş, vakum infiltrasyonu uygulanmış ve 4 °C'de 12 saat fikse edilmiştir. Ardından %2 osmiyum tetroksit ile post-fiksasyon yapılmış ve örnekler dereceli etanol serisinde dehidrate edilmiştir.

Ultraince kesitler 90 nm kalınlığında hazırlanmış ve uranil asetat ile kurşun sitrat kullanılarak kontrastlandırılmıştır.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Cry1Ca larva büyümesini ne kadar etkiledi?

Kısa süreli maruziyet sonrasında larvalar toksin içermeyen normal diyete aktarılmıştır. Buna rağmen 24 saat sonra açık bir doz-bağımlı büyüme baskılanması görülmüştür.

Gruplar arasındaki fark:

F(3,8)=651,5; P<0,0001

olarak raporlanmıştır.

Dolayısıyla bu deneyde Cry1Ca'nın ilk belirgin fizyolojik etkisi ölümden önce ortaya çıkan güçlü büyüme baskılanmasıdır.

SEM sağlıklı orta bağırsakta ne gösterdi?

Kontrol larvalarının enine kesitlerinde bağırsak dokusunun genel mimarisi korunmuştur. Kolumnar hücreler, goblet hücreleri, fırçamsı kenar, bazal membran, peritrofik matriks, endoperitrofik ve ektoperitrofik alanlar ayırt edilebilmiştir.

Kaynak PDF'nin 30. ve 31. sayfalarındaki SEM görüntüleri, sağlam larva orta bağırsağının enine organizasyonunu ve epitelin lümene bakan yüzeyindeki yapıları göstermektedir.

20 ng/µl Cry1Ca bile belirgin hasar oluşturdu

Subletal deneyin en düşük Cry1Ca konsantrasyonu olan 20 ng/µl'de bile 24 saat sonra ciddi bağırsak hasarı görülmüştür:

• fırçamsı kenar artık belirgin değildir,
• peritrofik matriks kaybolmuştur,
• kolumnar hücrelerde yaygın lizis görülmüştür,
• ancak bazal membranda belirgin hasar saptanmamıştır.

İstatistiksel sonuç:

t=10,96; P<0,0001

olarak verilmiştir. Böylece epitel kalınlığı yaklaşık yarıya düşmüştür.

20 ve 300 ng/µl Arasında Neden Belirgin Ultrastrüktürel Fark Görülmedi?

Kaynakta 20 ve 300 ng/µl kısa maruziyet gruplarının SEM görüntüleri arasında hasarın niteliği açısından belirgin bir farklılık saptanmamıştır. Her iki konsantrasyonda da peritrofik matriks ve fırçamsı kenar kaybı ile kolumnar hücre lizisi görülmüştür. Yazarlar bu bulguyu, belirli bir toksin-reseptör etkileşim eşiği aşıldığında aşağı akış hücresel hasarın daha çok eşik veya doygunluk benzeri bir davranış gösterebileceği şeklinde yorumlamaktadır.

Bu sonuç “dozun önemsiz olduğu” anlamına gelmemektedir. Nitekim larva ağırlıklarında 20, 100 ve 300 ng/µl arasında belirgin doz-bağımlı fizyolojik fark vardır. Bulgular yalnız incelenen SEM görüntülerindeki nitel epitel hasar örüntüsünün 20 ve 300 ng/µl arasında açık biçimde ayrışmadığını göstermektedir.

TEM: mikrovilluslar ve peritrofik matriks

Kontrol larvalarında TEM, epitel hücrelerinin apikal yüzeyinde yoğun mikrovilluslar ve devamlı bir peritrofik matriks göstermiştir. Endoperitrofik alan görece temiz görünmekte ve bakteriler normalde bu koruyucu bariyerin diğer tarafında kalmaktadır.

Kaynak PDF'nin 34. sayfasındaki TEM görüntüsünde sağlıklı kolumnar hücrelerin apikal yüzeyindeki düzenli mikrovillus dizileri açık biçimde görülmektedir.

24 saatlik subletal hasar

20 ng/µl Cry1Ca maruziyetinden 24 saat sonra TEM bulguları homojen değildir. Bazı alanlarda epitel tabakasının genel organizasyonu büyük ölçüde korunmuşken başka alanlarda hücre lizisine bağlı açık süreksizlikler görülmüştür.

Bununla birlikte daha yaygın olan temel bulgular:

• mikrovillus yoğunluğunun ciddi biçimde azalması veya tamamen kaybolması,
• peritrofik matriksin kesintili ve kıvrımlı hale gelmesi,
• endoperitrofik ve ektoperitrofik alanlarda bakterilerin ortaya çıkmasıdır.

PDF'nin 36. ve 37. sayfalarındaki TEM görüntülerinde bakteriler “b”, mikrovilluslar “mv”, peritrofik matriks “pm”, kolumnar hücreler “cc” ve goblet hücreleri “gc” olarak işaretlenmiştir. Özellikle bakterilerin bozulan peritrofik bariyerin yakınında görülmesi çalışmanın merkezi görsel kanıtlarından biridir.

Bağırsak 48 Saat Sonra İyileşebildi mi?

Geçici ve subletal maruziyette kısmen evet. Cry1Ca yalnız kısa süre verildikten sonra toksinsiz diyete aktarılan larvaların 48 saatlik TEM görüntülerinde, 24 saatlik örneklere göre belirgin toparlanma görülmüştür. Epitel monolayeri yeniden daha düzenli hale gelmiş, açık hücre lizisi alanları saptanmamış, mikrovillus yoğunluğu artmış ve peritrofik matriks kontrol larvalarındaki yapıya daha çok benzemeye başlamıştır.

Ancak kaynak bu durumu tam doku restorasyonu olarak göstermemektedir. Bazı bölgelerde mikrovillus yoğunluğu hâlâ düşük olduğundan en doğru ifade kısmi ultrastrüktürel iyileşmedir.

Sürekli yüksek maruziyet tamamen farklı bir sonuç verdi

Uzun deneyde larvalar Cry1Ca içeren diyet üzerinde tutulmaya devam etmiştir. Kaynak yönteminde yüzey konsantrasyonu 10.250 ng/cm² olarak belirtilmektedir.

24 saatte:

• büyüme son derece sınırlıdır,
• hareket belirgin biçimde azalmıştır,
• epitel monolayerinde yaygın bozulma vardır,
• mikrovillus yoğunluğu ciddi ölçüde düşmüştür,
• peritrofik matriks kaybolmaya başlamıştır.

48 saatte ise larvaların büyük bir bölümü ölmüş, kalanlar büyük ölçüde hareketsiz hale gelmiş ve bağırsak dokusunun geniş alanlarında epitel tamamen parçalanmıştır.

Bakteriler nereye geçti?

Kontrol larvalarında bakteriler esas olarak bağırsak lümeninde kalmış ve peritrofik matriks bunların korunmuş bağırsak bölgelerine geçmesini sınırlamıştır.

Cry1Ca uygulanmış larvalarda ise bakteriler:

• peritrofik matriksi geçerken,
• mikrovillus bölgesine yaklaşırken,
• epitel hücreleriyle ilişkili alanlarda ve
• ileri hasarda bağırsak dokusunun geniş kısımlarına yayılmış halde

gözlenmiştir.

Kaynak PDF'nin 28. ve 37. sayfalarındaki TEM görüntülerinde çok sayıda elektron yoğun bakteriyel yapı, bozulan bağırsak bariyerinin yanında görülmektedir.

Bakteriyel Geçiş Cry1Ca Toksisitesinde Ne Anlama Geliyor?

Çalışma, Cry1Ca'nın doğrudan epitel hasarı ile bağırsak bariyerinin bozulması arasında açık bir ultrastrüktürel ilişki göstermektedir. Peritrofik matriks ve epitel bütünlüğü kaybedildiğinde bakteriler normalde bulunmadıkları bölgelere ulaşabilmektedir. Yazarlar bu gözlemlerin, bakteriyel translokasyonun ileri toksisitede sistemik enfeksiyona ve olası septisemiye katkıda bulunabileceği modelini desteklediğini belirtmektedir.

Bununla birlikte TEM görüntülerinde bakterilerin bariyeri aşması doğrudan gözlenmiş olsa da çalışma bakteriyemi veya hemolimfte kültür temelli sistemik enfeksiyon ölçümü yapmamıştır. Bu nedenle “septisemi doğrulandı” yerine “gözlemler septisemi hipoteziyle uyumludur” ifadesi bilimsel olarak daha doğrudur.

Maruziyet süresi neden kritik?

Bu karşılaştırma, Cry1Ca etkisinin yalnız uygulanan konsantrasyonla değil toksinle temasın devam edip etmemesiyle de güçlü biçimde ilişkili olduğunu göstermektedir.

Çalışmanın desteklediği sonuçlar

• Cry1Ca subletal kısa maruziyette bile larva büyümesini ciddi biçimde baskılamıştır.
• Bu kısa deneyde toksin uygulanmış larvalarda mortalite görülmemiştir.
• 20 ng/µl Cry1Ca bile 24 saatte güçlü epitel hasarı oluşturmuştur.
• Epitel kalınlığı 128 ± 4 µm'den 67 ± 4 µm'ye düşmüştür.
• Mikrovilluslar, kolumnar hücreler ve peritrofik matriks Cry1Ca'dan etkilenmiştir.
• Bakteriler toksin uygulamasından sonra normalde korunmuş bağırsak bölgelerinde gözlenmiştir.
• Kısa maruziyetten 48 saat sonra bağırsak organizasyonunda kısmi iyileşme görülmüştür.
• Sürekli yüksek Cry1Ca maruziyeti ileri ve geri dönüşsüz bağırsak yıkımıyla ilişkilidir.
• Bütün-larva kriyo-SEM yaklaşımı, bağırsak yapılarının uzamsal ilişkilerinin korunmasını desteklemiştir.

Çalışmanın desteklemediği sonuçlar

• 20–300 ng/µl arasındaki bütün biyolojik etkilerin birbirine eşit olduğu gösterilmemiştir.
• Subletal maruziyet sonrası bütün larvaların tamamen iyileştiği gösterilmemiştir.
• Bakteriyel translokasyon görülmesine rağmen çalışma kültür veya moleküler yöntemle sistemik septisemiyi doğrudan doğrulamamıştır.
• Sonuçlar bütün Lepidoptera türlerine otomatik olarak genellenemez.
• Laboratuvar kolonisi sonuçları doğrudan tarla koşullarındaki toksin maruziyet düzeylerini temsil etmez.
• Çalışma direnç gelişimini doğrudan ölçmemiştir; toparlanmanın direnç evrimi açısından önemi tartışma düzeyinde değerlendirilmiştir.

Yöntemin daha geniş kullanım alanı

Yazarlar bütün-larva SEM/TEM yaklaşımının Cry proteinleriyle sınırlı olmadığını belirtmektedir. Benzer yöntem:

• Vip proteinleri,
• Cyt toksinleri,
• bitki kökenli proteazlar,
• lektinler,
• RNAi tabanlı bağırsak hedefli teknolojiler

gibi farklı biyolojik moleküllerin bağırsak üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir.

Kaynak ve Yöntem Notu

Kaynakta belirtilen başlık: Title suggestion: Assessing the impact of Cry insecticidal proteins from Bacillus thuringiensis on the midgut of Spodoptera littoralis (Boisduval)

Yazarlar: Giovambattista Depietra; Rosa María González Martínez; María Teresa Mínguez; Enrique Navarro Raga; Joel González Cabrera.

Sorumlu yazar: Joel González-Cabrera.

Kurumlar: Syngenta Jealott’s Hill International Research Centre, Bracknell, United Kingdom; Institute of Biotechnology and Biomedicine – BIOTECMED, Department of Genetics, Universitat de València, Spain; Microscopy Section, Central Service for Experimental Research – SCSIE, Universitat de València, Spain.

Kaynak türü: SSRN preprint.

SSRN kayıt numarası: Abstract 6880462.

Hakemlik durumu: Yüklenen PDF açık biçimde “This preprint research paper has not been peer reviewed” ve “Preprint not peer reviewed” ifadelerini taşımaktadır.

Ana deney organizması: Spodoptera littoralis (Boisduval), üçüncü dönem larvalar.

İncelenen toksin: Bacillus thuringiensis Cry1Ca.

Ana yöntemler: fizyolojik larva ağırlığı ölçümü, bütün-larva cryo-SEM, transmisyon elektron mikroskopisi (TEM), kısa subletal maruziyet ve sürekli ölümcül maruziyet.

Kısa maruziyet: 4 µl oral damlacık, Cry1Ca konsantrasyonları 20, 100 ve 300 ng/µl; analiz 24 ve 48 saat.

Sürekli maruziyet: yöntem bölümünde yapay diyet yüzeyinde 10.250 ng/cm² Cry1Ca konsantrasyonu bildirilmiştir.

Kaynak içi tutarsızlık: Figure 13 ve Figure 14 açıklamalarında uzun maruziyet için “20 ng/µl” ifadesi yer almakta, ancak Materials and Methods bölümünde uzun maruziyet açık biçimde 10.250 ng/cm² yüzey dozu olarak tanımlanmaktadır. Bunların farklı birimler olması nedeniyle bu Verianla metni yöntemdeki 10.250 ng/cm² değerini ana sürekli maruziyet koşulu olarak korumakta ve şekil açıklamalarındaki farklı ifadeyi olası raporlama tutarsızlığı olarak kaydetmektedir.

Finansman: European Union MSCA-RISE-2020 programı, CypTox, Grant 101007917.

Çıkar çatışması bildirimi: Giovambattista Depietra, Syngenta Jealott’s Hill International Research Centre çalışanıdır ve maaş desteği almaktadır. Makalede şirketin çalışmanın kavramsallaştırılması veya yürütülmesinde rolü olmadığı belirtilmektedir. Yazarlar başka çıkar çatışması bildirmemiştir.

Teşekkür: Cry1Ca toksinini sağlayan Sandy Nicole Valdiviezo'ya ve önceki makale sürümünün değerlendirilmesine katkı sağlayan Dr. Patricia Hernández-Martínez'e teşekkür edilmektedir.

Temel sınırlamalar: Deney laboratuvar ortamındaki uzun süreli S. littoralis kolonisi üzerinde yürütülmüştür. Başlangıçta larvalar tek tek tartılmamış, randomizasyon görünür sağlık ve benzer gelişim durumu üzerinden yapılmıştır. 48 saatlik makroskopik toparlanma için ağırlık verileri metinde “data not shown” olarak belirtilmiştir. Septisemi doğrudan sistemik mikrobiyolojik testle doğrulanmamıştır. Çalışma preprinttir ve hakem değerlendirmesi tamamlanmamıştır.

Görsel kullanım notu: PDF'deki SEM/TEM mikrografları kaynak veriyi temsil eder. Verianla için en uygun yaklaşım doğrudan mikrograf kopyalamak yerine sağlıklı epitel → Cry1Ca por/hasar süreci → mikrovillus kaybı → peritrofik matriks parçalanması → bakteri geçişi → 48 saatlik kısmi toparlanma zincirini özgün bilimsel bir şema olarak yeniden oluşturmaktır.