Протеини Cry1Ca, ки аз Bacillus thuringiensis сарчашма мегирад, протеини инсектицидиест, ки дар ларваҳои ҳашароти ҳассос пеш аз ҳама эпителияи рӯдаи миёнаро ҳадаф мегирад. Ин таҳқиқот таъсири Cry1Ca-ро ба ларваҳои Spodoptera littoralis на танҳо аз рӯи фавт, балки аз рӯи афзоиш, ташкили эпителияи рӯда, микровиллҳо, матрицаи перитрофӣ ва тақсимоти фазоии бактерияҳои рӯда баррасӣ кардааст. Хусусияти муҳими методии кор дар он аст, ки рӯдаи миёнаи ларваҳо пешакӣ диссексия нашуда, тамоми ларваҳо бо криоконсерватсия омода гардида, бо микроскопияи электронии сканерӣ (SEM) ва микроскопияи электронии трансмиссионӣ (TEM) таҳқиқ шудаанд.

Истифодаи кӯтоҳмуддати сублеталии Cry1Ca дар давоми 24 соат афзоиши ларваҳоро шадидан боздошт. Дар гурӯҳи назоратӣ вазни миёнаи гурӯҳҳои иборат аз 10 ларва 90,3 ± 0,7 mg буд, дар ҳоле ки дар гурӯҳҳои гирифтаи 20, 100 ва 300 ng/µl Cry1Ca вазнҳо мутаносибан 61 ± 1 mg, 44 ± 1 mg ва 34,7 ± 0,3 mg чен карда шуданд. Бо вуҷуди ин, дар таҷрибаи таъсири кӯтоҳмуддат фавт мушоҳида нашуд. Тасвирҳои SEM ва TEM ҳатто дар пасттарин консентратсияи сублеталӣ аз даст рафтани микровиллҳо, лизиси ҳуҷайраҳои сутуншакл ва вайроншавии матрицаи перитрофиро нишон доданд.

Пас аз 48 соат аз таъсири муваққатӣ мушоҳида шуд, ки ташкили эпителия қисман барқарор гардидааст, микровиллҳо боз равшантар шудаанд ва матрицаи перитрофӣ ба сохтори назоратӣ наздик шудааст. Баръакс, таъсири пайваста ва баланди Cry1Ca бо вайроншавии бебозгашти эпителия, паҳншавии шадиди бактериявӣ ва марги ларваҳо анҷомид. Натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки ғайр аз осеби мустақими эпителия аз ҷониби токсин, вайрон шудани монеаи рӯда метавонад гузариши бактерияҳоро ба минтақаҳое, ки одатан ба онҳо дастрасӣ надоранд, осон кунад.

Протеинҳои Cry ба рӯдаи ҳашарот чӣ гуна таъсир мекунанд?

Bacillus thuringiensis бактерияест, ки муддати дароз дар муборизаи биологӣ бо зараррасонҳо истифода мешавад. Протеинҳои кристаллии Cry, ки ин бактерия ҳосил мекунад, ҳангоми аз роҳи даҳон ворид шудан ба ларваҳои ҳассос дар муҳити ишқории рӯдаи миёна ҳал мешаванд. Протеинҳои шакли протоксин бо ферментҳои протеолитикӣ коркард шуда, ба мономерҳои фаъоли тақрибан 60 kDa табдил меёбанд.

Протеинҳои фаъоли Cry метавонанд бо ретсепторҳо, аз қабили аминопептидазаҳо, кадгеринҳо ё интиқолдиҳандаҳои ABC дар мембранаи канори хасмонанди ҳуҷайраҳои эпителияи рӯдаи миёна ҳамкорӣ кунанд. Ин раванд бо олигомеризатсия, пайдоиши пораҳо дар мембрана, вайрон шудани тавозуни осмотикӣ ва ниҳоят лизиси ҳуҷайра алоқаманд аст.

Аммо тавре ки таҳқиқот таъкид мекунад, токсикӣ танҳо аз пайвастшавӣ ба ретсептор иборат нест. Қобилияти таҷдиди эпителия, якпорчагии матрицаи перитрофӣ ва микробиотаи рӯда низ метавонанд ба посухи ниҳоии ларва ба токсин таъсир расонанд.

Чаро матрицаи перитрофӣ муҳим аст?

Матрицаи перитрофӣ сохторест, ки байни мундариҷаи люмени рӯда ва ҳуҷайраҳои эпителӣ монеаи нимгузарон ташкил медиҳад. Дар ҳолати муқаррарӣ ин сохтор ҳам ба танзими муҳити ҳозима ва ҳам ба маҳдуд кардани дастрасии мустақими бактерияҳои рӯда ба сатҳи эпителия кумак мекунад. Пас аз таъсири Cry1Ca вайрон шудани ин монеа метавонад на танҳо таъсири бештари токсинро ба эпителия афзоиш диҳад, балки гузариши бактерияҳоро ба фазоҳои эндоперитрофӣ ва минтақаҳои эпителие, ки одатан муҳофизат шудаанд, низ осон намояд.

Чаро тамоми ларва тасвирбардорӣ карда шуд?

Дар таҳқиқоти классикии рӯда бо микроскопияи электронӣ рӯдаи миёна одатан аз ҳайвон ҷудо карда шуда, сипас фиксатсия мешавад. Аммо диссексияи механикӣ метавонад шакли люмени рӯдаро тағйир диҳад, матрицаи перитрофиро пора кунад, ҷойгиршавии бактерияҳоро дигар намояд ва ба вайрон шудани сохторҳои нозуки ҳуҷайравӣ оварда расонад.

Дар ин таҳқиқот муҳаққиқон кӯшиш карданд манипулятсияи намунаҳоро то ҳадди имкон кам кунанд. Махсусан дар марҳилаи cryo-SEM ларваҳо дар агар зуд беҳаракат карда шуданд, дар slush-и нитрогени моеъ ях кунонда шуданд ва пас аз криошикаст дар −90 °C барои чор дақиқа freeze-etching гузаронида шуд. Намунаҳо бо платина пӯшонида шуда, ҳангоми тасвирбардорӣ дар −140 °C нигоҳ дошта шуданд.

Ин усул имкон дод, ки рӯдаи миёна на танҳо ҳамчун бофтаи ҷудошуда, балки дар заминаи пурраи анатомӣ — ҳамроҳ бо кутикула, мушакҳо, сохторҳои трахеалӣ, эпителияи рӯда, матрицаи перитрофӣ ва люмен — таҳқиқ карда шавад.

Ҳайвоноти таҷрибавӣ

Колонияи лаборатории Spodoptera littoralis дар Universitat de València зиёда аз 100 насл нигоҳ дошта мешавад. Ларваҳо бо ғизои сунъӣ ва ҳашароти болиғ ad libitum бо маҳлули %10 сахароза ғизо дода шуданд.

Шароити колония:

• Ҳарорат: 25 ± 3 °C
• Намии нисбӣ: %70 ± 10
• Фотопериод: 16 соат рӯшноӣ / 8 соат торикӣ

Омодасозии Cry1Ca

Cry1Ca дар штамми Escherichia coli XL1-Blue экспрессия карда шуд. Аз ҳуҷайраҳои бактериявӣ ҷисмчаҳои инклюзионии дорои протоксин ҷудо гардида, дар муҳити ишқории карбонат ҳал ва бо трипсин фаъол карда шуданд.

Фаъолсозии протоксин бо илова кардани трипсин ба таносуби фермент:протоксин 1:10 ва инкубатсия дар 37 °C барои ду соат анҷом дода шуд. Препарати ниҳоии фаъоли Cry1Ca дар тӯли шаб бар зидди маҳлули дорои 50 mM буфери карбонат/бикарбонати натрий, pH 10,5 ва 150 mM NaCl диализ карда шуд.

Таъсири кӯтоҳмуддати сублеталӣ

Ларваҳои навпӯстшудаи марҳилаи сеюм тақрибан се соат бе ғизо нигоҳ дошта шуданд. Сипас қатраҳои 4 µl-и дорои Cry1Ca ба таври даврашакл дар табақчаи Petri ҷойгир карда шуданд.

Қатраҳо дорои инҳо буданд:

• Cry1Ca,
• %0,05 фенол сурх,
• %10 сахароза,
• 10 mM DTT,
• 50 mM буфери карбонат/бикарбонат, pH 10,5

буданд. Фенол сурх барои тасдиқ кардани он истифода шуд, ки ларваҳо воқеан қатраро истеъмол кардаанд.

Пас аз тасдиқи истеъмоли қатра токсин аз муҳит хориҷ карда шуд ва ларваҳо ба ғизои тозаи бе токсин гузаронида шуданд. Бо ин роҳ муҳаққиқон тавонистанд, бар хилофи заҳролудшавии пайваста, муайян кунанд, ки пас аз таъсири муваққатӣ осеби рӯда идома меёбад ё барқарор мешавад.

Вақтҳои таҳлил 24 ва 48 соат муқаррар карда шуданд.

Таъсири пайваста ва марговар

Дар тарҳи дуюми таҷриба Cry1Ca ба рӯи ғизои сунъӣ татбиқ карда шуд. Ба 2 ml ғизо 50 µl маҳлули Cry1Ca паҳн карда шуд ва дар манбаъ консентратсияи ниҳоии рӯизаминӣ 10.250 ng/cm² нишон дода шудааст.

Ларваҳо пайваста дар ин ғизо нигоҳ дошта шуда, пас аз 24 ва 48 соат барои таҳқиқи микроскопӣ намуна гирифта шуданд. Ин таҷриба арзёбӣ кард, ки ҳангоми на муваққатан, балки пайваста қабул шудани токсин бофтаи рӯда то чӣ андоза вайрон мешавад.

Шароити SEM

Шароити TEM

Дар таҳлили TEM ларваҳо бо фиксатори %2 Karnovsky фиксатсия шуда, инфилтратсияи вакуумӣ анҷом дода шуд ва дар 4 °C барои 12 соат фиксатсия гардиданд. Сипас бо %2 тетраоксиди осмий постфиксатсия гузаронида шуда, намунаҳо дар силсилаи этаноли дараҷабандӣ дегидрататсия карда шуданд.

Буришҳои ултратунук бо ғафсии 90 nm омода шуда, бо уранил ацетат ва цитрати сурб контраст дода шуданд.

Усул ва натиҷаҳои таҳқиқот

Cry1Ca ба афзоиши ларваҳо то чӣ андоза таъсир расонд?

Пас аз таъсири кӯтоҳмуддат ларваҳо ба ғизои муқаррарии бе токсин гузаронида шуданд. Бо вуҷуди ин, пас аз 24 соат боздории равшани вобаста ба доза дар афзоиш мушоҳида гардид.

Фарқи байни гурӯҳҳо:

F(3,8)=651,5; P<0,0001

гузориш шудааст.

Аз ин рӯ, дар ин таҷриба аввалин таъсири равшани физиологии Cry1Ca боздории шадиди афзоиш буд, ки пеш аз марг пайдо шуд.

SEM дар рӯдаи миёнаи солим чӣ нишон дод?

Дар буришҳои арзии ларваҳои назоратӣ меъмории умумии бофтаи рӯда нигоҳ дошта шудааст. Ҳуҷайраҳои сутуншакл, ҳуҷайраҳои бокалшакл, канори хасмонанд, мембранаи базалӣ, матрицаи перитрофӣ, фазоҳои эндоперитрофӣ ва эктоперитрофӣ фарқ карда шуданд.

Тасвирҳои SEM дар саҳифаҳои 30 ва 31-и PDF-и манбаъ ташкили арзии рӯдаи миёнаи солими ларва ва сохторҳои сатҳи эпителияро, ки ба люмен нигаронда шудаанд, нишон медиҳанд.

Ҳатто 20 ng/µl Cry1Ca осеби равшан ба вуҷуд овард

Ҳатто дар пасттарин консентратсияи Cry1Ca-и таҷрибаи сублеталӣ — 20 ng/µl — пас аз 24 соат осеби ҷиддии рӯда мушоҳида шуд:

• канори хасмонанд дигар равшан нест,
• матрицаи перитрофӣ аз байн рафтааст,
• дар ҳуҷайраҳои сутуншакл лизиси васеъ мушоҳида шудааст,
• аммо дар мембранаи базалӣ осеби равшан муайян нашудааст.

Натиҷаи оморӣ:

t=10,96; P<0,0001

оварда шудааст. Ҳамин тавр, ғафсии эпителия тақрибан ба нисф коҳиш ёфтааст.

Чаро байни 20 ва 300 ng/µl фарқи равшани ултрасохторӣ дида нашуд?

Дар манбаъ байни тасвирҳои SEM-и гурӯҳҳои таъсири кӯтоҳмуддати 20 ва 300 ng/µl аз нигоҳи хусусияти осеб фарқи равшан муайян нашудааст. Дар ҳар ду консентратсия аз даст рафтани матрицаи перитрофӣ ва канори хасмонанд, инчунин лизиси ҳуҷайраҳои сутуншакл мушоҳида шуд. Муаллифон ин натиҷаро чунин шарҳ медиҳанд, ки пас аз гузаштани ҳадди муайяни ҳамкории токсин–ретсептор, осеби поёндасти ҳуҷайравӣ метавонад бештар рафтори монанд ба ҳадди ангезиш ё сершавиро нишон диҳад.

Ин натиҷа маънои онро надорад, ки «доза аҳамият надорад». Дар ҳақиқат, байни 20, 100 ва 300 ng/µl дар вазни ларваҳо фарқи равшани физиологии вобаста ба доза мавҷуд аст. Натиҷаҳо танҳо нишон медиҳанд, ки дар тасвирҳои SEM-и баррасишуда намунаи сифатии осеби эпителия байни 20 ва 300 ng/µl ба таври равшан фарқ накардааст.

TEM: микровиллҳо ва матрицаи перитрофӣ

Дар ларваҳои назоратӣ TEM дар сатҳи апикалии ҳуҷайраҳои эпителӣ микровиллҳои зич ва матрицаи перитрофии пайвастаро нишон дод. Фазои эндоперитрофӣ нисбатан тоза менамуд ва бактерияҳо одатан дар тарафи дигари ин монеаи муҳофизатӣ мемонданд.

Дар тасвири TEM-и саҳифаи 34-и PDF-и манбаъ қаторҳои мунтазами микровиллҳо дар сатҳи апикалии ҳуҷайраҳои сутуншакли солим ба таври равшан дида мешаванд.

Осеби сублеталии 24-соата

Пас аз 24 соати таъсири 20 ng/µl Cry1Ca натиҷаҳои TEM яксон нестанд. Дар баъзе минтақаҳо ташкили умумии қабати эпителӣ асосан нигоҳ дошта шуда бошад ҳам, дар дигар ҷойҳо танаффусҳои ошкор вобаста ба лизиси ҳуҷайраҳо мушоҳида шуданд.

Бо вуҷуди ин, натиҷаҳои асосии бештар паҳншуда инҳо буданд:

• шадидан кам шудани зичии микровиллҳо ё тамоман аз байн рафтани онҳо,
• қатъ-қатъ ва печида шудани матрицаи перитрофӣ,
• пайдо шудани бактерияҳо дар фазоҳои эндоперитрофӣ ва эктоперитрофӣ.

Дар тасвирҳои TEM-и саҳифаҳои 36 ва 37-и PDF бактерияҳо бо «b», микровиллҳо бо «mv», матрицаи перитрофӣ бо «pm», ҳуҷайраҳои сутуншакл бо «cc» ва ҳуҷайраҳои бокалшакл бо «gc» ишора шудаанд. Махсусан мушоҳидаи бактерияҳо дар наздикии монеаи вайроншудаи перитрофӣ яке аз далелҳои асосии визуалии таҳқиқот аст.

Оё рӯда пас аз 48 соат тавонист барқарор шавад?

Дар таъсири муваққатӣ ва сублеталӣ — қисман ҳа. Дар тасвирҳои TEM-и 48-соатаи ларваҳое, ки пас аз додани кӯтоҳмуддати Cry1Ca ба ғизои бе токсин гузаронида шуданд, нисбат ба намунаҳои 24-соата барқароршавии равшан мушоҳида гардид. Монолайери эпителӣ боз муназзамтар шуд, минтақаҳои ошкори лизиси ҳуҷайраҳо муайян нашуданд, зичии микровиллҳо зиёд шуд ва матрицаи перитрофӣ бештар ба сохтори ларваҳои назоратӣ монанд гардид.

Аммо манбаъ ин ҳолатро ҳамчун барқароршавии пурраи бофта нишон намедиҳад. Азбаски дар баъзе минтақаҳо зичии микровиллҳо ҳанӯз паст буд, дақиқтарин ифода барқароршавии қисмии ултрасохторӣ мебошад.

Таъсири пайвастаи баланд натиҷаи тамоман дигар дод

Дар таҷрибаи дарозмуддат ларваҳо дар ғизои дорои Cry1Ca нигоҳ дошта шуданд. Дар қисми усулҳои манбаъ консентратсияи рӯизаминӣ 10.250 ng/cm² зикр шудааст.

Дар 24 соат:

• афзоиш ниҳоят маҳдуд аст,
• ҳаракат ба таври равшан кам шудааст,
• дар монолайери эпителӣ вайроншавии васеъ вуҷуд дорад,
• зичии микровиллҳо хеле коҳиш ёфтааст,
• матрицаи перитрофӣ ба аз байн рафтан оғоз кардааст.

Дар 48 соат қисми зиёди ларваҳо мурдаанд, боқимондаҳо асосан беҳаракат шудаанд ва дар минтақаҳои васеи бофтаи рӯда эпителия пурра пора шудааст.

Бактерияҳо ба куҷо гузаштанд?

Дар ларваҳои назоратӣ бактерияҳо асосан дар люмени рӯда монданд ва матрицаи перитрофӣ гузариши онҳоро ба минтақаҳои муҳофизатшудаи рӯда маҳдуд мекард.

Дар ларваҳои гирифтаи Cry1Ca бошад, бактерияҳо чунин мушоҳида шуданд:

• ҳангоми гузаштан аз матрицаи перитрофӣ,
• ҳангоми наздик шудан ба минтақаи микровиллҳо,
• дар минтақаҳои вобаста ба ҳуҷайраҳои эпителӣ ва
• дар осеби пешрафта — ба қисмҳои васеи бофтаи рӯда паҳншуда

мушоҳида шуданд.

Дар тасвирҳои TEM-и саҳифаҳои 28 ва 37-и PDF-и манбаъ шумораи зиёди сохторҳои бактериявии электронзич дар паҳлӯи монеаи вайроншудаи рӯда дида мешаванд.

Гузариши бактериявӣ дар токсикияти Cry1Ca чӣ маъно дорад?

Таҳқиқот байни осеби мустақими эпителия аз ҷониби Cry1Ca ва вайроншавии монеаи рӯда робитаи равшани ултрасохторӣ нишон медиҳад. Вақте матрицаи перитрофӣ ва якпорчагии эпителия аз даст мераванд, бактерияҳо метавонанд ба минтақаҳое расанд, ки одатан дар онҳо мавҷуд нестанд. Муаллифон мегӯянд, ки ин мушоҳидаҳо модели саҳм гузоштани транслокатсияи бактериявӣ ба сирояти системавӣ ва септисемияи эҳтимолӣ дар токсикияти пешрафтаро дастгирӣ мекунанд.

Бо вуҷуди он ки дар тасвирҳои TEM гузаштани бактерияҳо аз монеа мустақим мушоҳида шудааст, таҳқиқот бактериемия ё сирояти системавиро дар гемолимфа бо усули фарҳангӣ чен накардааст. Аз ин рӯ, аз ҷиҳати илмӣ дурусттар аст, ки ба ҷойи «септисемия тасдиқ шуд» гуфта шавад: «мушоҳидаҳо бо гипотезаи септисемия мувофиқанд».

Чаро давомнокии таъсир муҳим аст?

Ин муқоиса нишон медиҳад, ки таъсири Cry1Ca на танҳо бо консентратсияи истифодашуда, балки бо идома ё қатъ шудани тамос бо токсин низ сахт вобаста аст.

Натиҷаҳое, ки таҳқиқот дастгирӣ мекунад

• Cry1Ca ҳатто дар таъсири кӯтоҳмуддати сублеталӣ афзоиши ларваҳоро шадидан боздошт.
• Дар ин таҷрибаи кӯтоҳ дар ларваҳои гирифтаи токсин фавт мушоҳида нашуд.
• Ҳатто 20 ng/µl Cry1Ca дар 24 соат осеби шадиди эпителӣ ба вуҷуд овард.
• Ғафсии эпителия аз 128 ± 4 µm то 67 ± 4 µm коҳиш ёфт.
• Микровиллҳо, ҳуҷайраҳои сутуншакл ва матрицаи перитрофӣ аз Cry1Ca таъсир гирифтанд.
• Пас аз истифодаи токсин бактерияҳо дар минтақаҳои рӯдае мушоҳида шуданд, ки одатан муҳофизат мешаванд.
• Пас аз 48 соат аз таъсири кӯтоҳмуддат дар ташкили рӯда барқароршавии қисмӣ мушоҳида гардид.
• Таъсири пайваста ва баланди Cry1Ca бо вайроншавии пешрафта ва бебозгашти рӯда алоқаманд аст.
• Равиши cryo-SEM-и тамоми ларва ба нигоҳ доштани муносибатҳои фазоии сохторҳои рӯда мусоидат кард.

Натиҷаҳое, ки таҳқиқот дастгирӣ намекунад

• Нишон дода нашудааст, ки ҳамаи таъсирҳои биологӣ байни 20–300 ng/µl якхелаанд.
• Нишон дода нашудааст, ки ҳамаи ларваҳо пас аз таъсири сублеталӣ пурра барқарор шудаанд.
• Бо вуҷуди мушоҳидаи транслокатсияи бактериявӣ, таҳқиқот септисемияи системавиро бо усули фарҳангӣ ё молекулавӣ мустақим тасдиқ накардааст.
• Натиҷаҳоро ба ҳамаи намудҳои Lepidoptera ба таври автоматӣ умумӣ кардан мумкин нест.
• Натиҷаҳои колонияи лабораторӣ сатҳҳои таъсири токсинро дар шароити саҳро мустақим намояндагӣ намекунанд.
• Таҳқиқот рушди муқовиматро мустақим чен накардааст; аҳамияти барқароршавӣ барои эволютсияи муқовимат дар сатҳи муҳокима арзёбӣ шудааст.

Соҳаи васеътари истифодаи усул

Муаллифон мегӯянд, ки равиши SEM/TEM-и тамоми ларва танҳо бо протеинҳои Cry маҳдуд намешавад. Усули монанд метавонад барои инҳо истифода шавад:

• протеинҳои Vip,
• токсинҳои Cyt,
• протеазаҳои растанипайдо,
• лектинҳо,
• технологияҳои рӯда-ҳадафи асосёфта ба RNAi

барои таҳқиқи таъсири молекулаҳои гуногуни биологӣ ба рӯда истифода шавад.

Ёддошти манбаъ ва усул

Сарлавҳаи дар манбаъ зикршуда: Title suggestion: Assessing the impact of Cry insecticidal proteins from Bacillus thuringiensis on the midgut of Spodoptera littoralis (Boisduval)

Муаллифон: Giovambattista Depietra; Rosa María González Martínez; María Teresa Mínguez; Enrique Navarro Raga; Joel González Cabrera.

Муаллифи масъул: Joel González-Cabrera.

Муассисаҳо: Syngenta Jealott’s Hill International Research Centre, Bracknell, United Kingdom; Institute of Biotechnology and Biomedicine – BIOTECMED, Department of Genetics, Universitat de València, Spain; Microscopy Section, Central Service for Experimental Research – SCSIE, Universitat de València, Spain.

Навъи манбаъ: SSRN preprint.

Рақами сабти SSRN: Abstract 6880462.

Ҳолати баррасии ҳамтоён: PDF-и боршуда ба таври ошкор ибораҳои «This preprint research paper has not been peer reviewed» ва «Preprint not peer reviewed»-ро дар бар мегирад.

Организми асосии таҷрибавӣ: Spodoptera littoralis (Boisduval), ларваҳои марҳилаи сеюм.

Токсини таҳқиқшуда: Bacillus thuringiensis Cry1Ca.

Усулҳои асосӣ: ченкунии физиологии вазни ларва, cryo-SEM-и тамоми ларва, микроскопияи электронии трансмиссионӣ (TEM), таъсири кӯтоҳмуддати сублеталӣ ва таъсири пайвастаи марговар.

Таъсири кӯтоҳмуддат: 4 µl қатраи даҳонӣ, консентратсияҳои Cry1Ca — 20, 100 ва 300 ng/µl; таҳлил дар 24 ва 48 соат.

Таъсири пайваста: дар қисми усулҳо консентратсияи Cry1Ca дар рӯи ғизои сунъӣ 10.250 ng/cm² гузориш шудааст.

Номувофиқатии дохилии манбаъ: Дар шарҳҳои Figure 13 ва Figure 14 барои таъсири дарозмуддат ифодаи «20 ng/µl» омадааст, аммо дар қисми Materials and Methods таъсири дарозмуддат ба таври равшан ҳамчун дозае бо консентратсияи рӯизаминии 10.250 ng/cm² муайян шудааст. Азбаски инҳо воҳидҳои гуногунанд, ин матни Verianla арзиши 10.250 ng/cm²-и қисми усулҳоро ҳамчун шарти асосии таъсири пайваста нигоҳ медорад ва ифодаи фарқкунандаи шарҳҳои расмҳоро ҳамчун номувофиқати эҳтимолии гузориш қайд мекунад.

Маблағгузорӣ: Барномаи European Union MSCA-RISE-2020, CypTox, Grant 101007917.

Изҳороти бархӯрди манфиатҳо: Giovambattista Depietra корманди Syngenta Jealott’s Hill International Research Centre аст ва дастгирии маошӣ мегирад. Дар мақола гуфта мешавад, ки ширкат дар консептуализатсия ё иҷрои таҳқиқот нақш надошт. Муаллифон бархӯрди дигари манфиатҳоро гузориш надодаанд.

Сипосгузорӣ: Ба Sandy Nicole Valdiviezo барои пешниҳоди токсини Cry1Ca ва ба Dr. Patricia Hernández-Martínez барои саҳм дар арзёбии версияи қаблии мақола сипосгузорӣ шудааст.

Маҳдудиятҳои асосӣ: Таҷриба дар колонияи дарозмуддати S. littoralis дар шароити лабораторӣ гузаронида шуд. Дар оғоз ларваҳо алоҳида вазн карда нашуданд ва тасодуфисозӣ бар асоси саломатии намоён ва ҳолати монанди рушд анҷом ёфт. Маълумоти вазн барои барқароршавии макроскопии 48-соата дар матн ҳамчун «data not shown» зикр шудааст. Септисемия бо санҷиши мустақими микробиологии системавӣ тасдиқ нашудааст. Таҳқиқот preprint аст ва баррасии ҳамтоён анҷом наёфтааст.

Ёддошти истифодаи визуалӣ: Микрографҳои SEM/TEM дар PDF додаҳои манбаъро намояндагӣ мекунанд. Барои Verianla муносибтарин равиш нусхабардории мустақими микрограф нест, балки бозсозии занҷири эпителияи солим → раванди пора/осеби Cry1Ca → аз даст рафтани микровиллҳо → пора шудани матрицаи перитрофӣ → гузариши бактерияҳо → барқароршавии қисмии 48-соата дар шакли як схемаи аслии илмӣ мебошад.