Isı stresi, sığırların yalnız genel metabolizmasını değil, üremenin ilk aşamalarında görev yapan hücresel ortamı da etkileyebilir. Bu çalışmada araştırmacılar, Kore yerli sığırı Hanwoo'nun oviduktundan — yani yumurtalık ile rahim arasındaki üreme kanalından — epitel hücreleri izole etmiş ve bu hücreleri laboratuvarda uzun süre kullanılabilecek immortalize bir hücre hattına dönüştürmüştür.

Primer ovidukt epitel hücrelerine piggyBac transpozon sistemi aracılığıyla SV40 large T antigen (SV40T) aktarılmış, puromisin seçimi uygulanmış ve epitel hücre belirteci CDH1/E-cadherin pozitif hücreler FACS ile zenginleştirilmiştir. Elde edilen hücre popülasyonunda CDH1 pozitifliği %98,2 düzeyinde bildirilmiştir.

Hücreler daha sonra 41,5 °C'de 4, 12 veya 24 saat ısı stresine maruz bırakılmış ve karşılık gelen 37 °C recovery dönemleri incelenmiştir. Hücre içi reaktif oksijen türleri (ROS) yalnız 4 saat içinde artarken, SOD1, CAT ve GPX1 gibi antioksidan genlerin belirgin yükselişi daha geç ortaya çıkmış ve 24 saatlik stres döneminde en güçlü düzeye ulaşmıştır.

HSP70 ve endoplazmik retikulum şaperonu BiP/GRP78 ise daha erken yanıt vermiştir. HSP70 4 saatlik ısı stresinde yaklaşık 10,85 kat, 12 saatte yaklaşık 17,24 kat artmıştır. Bu proteinlerin recovery döneminde de yüksek kalması, sıcaklık normale döndüğünde hücresel stres yanıtının hemen sona ermediğini göstermektedir.

24 saatlik ısı stresi transkriptomik ve proteomik analiz için seçilmiş; 510 farklı ifade edilen gen ve 258 farklı ifade edilen protein belirlenmiştir. Zenginleşme analizleri oksidatif stres, protein katlanması, ER stresi, bağışıklık yanıtı, hücresel yaşlanma, besin kıtlığına yanıt, metabolizma ve hücre dışı matriksle ilişkili süreçlerde değişiklikler göstermiştir.

Bununla birlikte çalışma gerçek fertilizasyon veya gebelik başarısını doğrudan ölçmemektedir. Sonuçlar, ısı stresinin Hanwoo ovidukt epitel hücrelerinin moleküler işlevlerini değiştirdiğini gösteren bir laboratuvar modeline aittir.

Ovidukt epitel hücreleri üreme açısından neden önemli?

Ovidukt, yumurtalık ile rahim arasındaki basit bir taşıma borusu değildir. İç yüzeyindeki epitel hücreleri sperm, oosit ve erken embriyoyla hem fiziksel hem de kimyasal olarak etkileşir.

Bu hücrelerin oluşturduğu mikroçevre; sperm hareketliliği ve kapasitasyonu, cumulus-oosit kompleksinin taşınması, erken embriyonun hareketi, besin sağlanması, redoks dengesi ve bağışıklık düzenlenmesi gibi süreçlere katkıda bulunabilir.

OEC'ler ayrıca SOD, GPX ve CAT gibi antioksidan savunma sistemlerini ifade ederek oosit ve erken embriyonun aşırı ROS maruziyetini sınırlandırmaya yardımcı olabilir.

Bu nedenle ovidukt epitelinin yüksek sıcaklıkta nasıl değiştiğini anlamak, sığır üreme biyolojisinde ısı stresinin erken mekanizmalarını araştırmak açısından önemlidir.

Hanwoo Ovidukt Hücre Hattı Nasıl Oluşturuldu?

Taze Hanwoo ovidukt dokuları mezbahadan alınmış ve buz üzerinde laboratuvara taşınmıştır. Ampulla bölgesindeki iç epitel tabakası fiziksel ve enzimatik yöntemlerle ayrıştırılmıştır.

Primer hücreler yüksek glukozlu DMEM, %10 FBS ve antibiyotik-antimikotik içeren kültür ortamında çoğaltılmıştır.

İlk pasajın ardından hücrelere piggyBac transpozon sistemiyle SV40T geni aktarılmıştır. SV40T entegrasyonu PCR ile doğrulanmış, ardından puromisin kullanılarak stabil hücreler seçilmiştir.

Epitel hücre kimliği açısından CDH1/E-cadherin belirteci kullanılmıştır. CDH1 pozitif hücreler FACS ile ayrılmış ve immortalize hücre hattının homojenliği artırılmıştır.

Hücrelerin passage 23'e kadar aktif çoğalması, hattın tekrarlanabilir ısı stresi deneyleri için kullanılabilecek stabil bir in vitro model olduğunu desteklemiştir.

Isı Stresine İlk Yanıt ROS mu, Antioksidan Genler mi?

Çalışmanın zaman serisi, bu iki yanıtın aynı anda başlamadığını göstermektedir.

41,5 °C'de 4 saatlik ısı stresinden sonra hücre içinde DCF floresansı artmış ve ROS birikimi belirginleşmiştir. Buna rağmen aynı zaman noktasında SOD1, CAT ve GPX1 genleri anlamlı biçimde yükselmemiştir.

12 saatlik stres döneminde antioksidan yanıt ortaya çıkmıştır:

Bu zamanlama, hücre içi oksidatif yükteki artışın ölçülebilir antioksidan gen yanıtından önce ortaya çıkabildiğini göstermektedir.

Recovery döneminde SOD1 ve CAT büyük ölçüde başlangıç düzeyine dönerken GPX1 bazı koşullarda yüksek kalmıştır. Bu durum farklı antioksidan bileşenlerin recovery kinetiklerinin aynı olmadığını göstermektedir.

HSP70 ve BiP Neden Bu Kadar Hızlı Yükseldi?

Yüksek sıcaklık proteinlerin doğal üç boyutlu yapısını bozabilir ve yanlış katlanmış protein yükünü artırabilir. Hücreler bu durumda şaperon adı verilen proteinleri aktive ederek proteinlerin yeniden katlanmasını ve agregasyonun sınırlandırılmasını destekler.

Bu çalışmada HSP70 yanıtı antioksidan genlerin belirgin yükselişinden daha erken ortaya çıkmıştır.

BiP'nin 4 saatlik ısı stresinden sonraki recovery döneminde yaklaşık 4,31 kat düzeyine çıkması özellikle dikkat çekicidir. Protein homeostazının onarımı, sıcaklık tekrar 37 °C'ye dönse bile devam ediyor olabilir.

Bu sonuçlar hücrelerin yalnız oksidatif strese değil, sitoplazmik ve endoplazmik retikulum düzeyindeki protein katlanma sorunlarına da yanıt verdiğini göstermektedir.

Neden 24 Saatlik Isı Stresi Multi-Omics Analizi İçin Seçildi?

24 saatlik dönemde SOD1, CAT ve GPX1 antioksidan genlerinin güçlü biçimde yükselmesi; HSP70 ve BiP'nin de hâlâ belirgin düzeyde bulunması, araştırmacıların bu zaman noktasını daha geniş moleküler analiz için seçmesine yol açmıştır.

24 saatlik ısı stresi ile kontrol karşılaştırmasında:

DEG tanımı için ≥|2| fold-change, DEP için ≥|1,5| fold-change eşiği kullanılmıştır.

Recovery grubunda da çok sayıda gen ve protein değişikliğinin devam etmesi, ısı stresinin moleküler etkilerinin yalnız sıcaklık maruziyet süresiyle sınırlı olmadığını göstermektedir.

Transkriptom ve Proteom Aynı Şeyi mi Gösterdi?

Tam olarak değil. mRNA ve protein düzeyinde uyumlu değişim gösteren yalnız 28 ortak gen/protein belirlenmiştir.

Bunların dokuzu doğrudan ısı stresi/kontrol karşılaştırmasında, 19'u ise recovery/kontrol karşılaştırmasında bulunmuştur.

Bu sınırlı örtüşme biyolojik olarak mümkündür; çünkü mRNA'nın proteine çevrilmesi, protein yarı ömrü, degradasyon, translasyon hızı ve post-translasyonel kontrol gibi süreçler iki moleküler katman arasında fark oluşturabilir.

Ancak çalışmanın tasarımındaki önemli bir sınırlama da dikkate alınmalıdır: transkriptom ve proteom analizi öncesinde üç biyolojik tekrar birleştirilerek tek pooled örnek oluşturulmuştur.

Bu nedenle geniş DEG/DEP veri setleri güçlü bir keşif kaynağı olmakla birlikte klasik anlamda üç bağımsız omics replikasyonundan türetilmiş değildir. Araştırmacılar bu sınırlamayı kabul etmiş ve seçilmiş sonuçları bağımsız biyolojik tekrarlarla qRT-PCR ve Western blot kullanarak doğrulamıştır.

Hangi Hücresel Yolaklar Etkilendi?

GO, KEGG ve Reactome analizleri ısı stresi ve recovery dönemlerinde birbirine bağlı çok sayıda süreçte değişiklik göstermiştir.

Yukarı düzenlenen kümelerde özellikle protein katlanması, HSP bağlanması, oksidatif stres, endoplazmik retikulum stresi ve protein yeniden katlanması öne çıkmıştır.

“Response to starvation” teriminin de güçlü biçimde zenginleşmesi hücrenin enerji ve besin metabolizmasında stres koşullarına uyum sağlayan değişiklikler geliştirdiğini düşündürmektedir.

Amino asit, lipid, karbonhidrat ve nükleotid metabolizmasıyla ilişkili gen ve proteinlerde değişiklikler görülmüş; bazı SLC taşıyıcılarıyla bağlantılı molekül taşıma fonksiyonları da etkilenmiştir.

Bağışıklık sistemiyle ilişkili interlökin ve sitokin yolları ile hücre dışı matriks organizasyonu da değişmiştir. Bu bulgular OEC'nin sperm, oosit ve erken embriyo için oluşturduğu mikroçevrenin ısı stresinden etkilenebileceğini düşündürmektedir.

Ancak yolak zenginleşmesi gerçek fertilite azalmasının doğrudan ölçümü değildir.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Hücre kaynağı

Hanwoo dişi sığırlarından alınan taze ovidukt dokusunun ampulla bölgesinden primer epitel hücreleri izole edilmiştir.

Immortalizasyon

SV40 large T antigen, piggyBac transpozon sistemi aracılığıyla hücrelere aktarılmıştır. Stabil entegrasyon PCR ile doğrulanmış ve puromisin seçimi uygulanmıştır.

Epitel karakterizasyonu

CDH1/E-cadherin immünfloresan boyama ve FACS ile değerlendirilmiştir. Çalışmanın özetinde hücre hattı için %98,2 CDH1 pozitifliği bildirilmektedir.

Isı stresi modeli

Kontrol hücreleri 37 °C'de tutulmuş, deney hücreleri 41,5 °C'de 4, 12 veya 24 saat ısı stresine maruz bırakılmıştır. Ardından hücreler 37 °C'de eşdeğer recovery dönemlerine alınmıştır.

ROS

CM-H2-DCFDA floresan probu kullanılmış ve 4 saatlik ısı stresinden sonra hücre içi ROS artışı gözlenmiştir.

qRT-PCR

SOD1, CAT ve GPX1 antioksidan genleri GAPDH'ye normalize edilerek 2^−ΔΔCt yöntemiyle değerlendirilmiştir. Multi-omics sonuçlarının doğrulanması için BAG3, HSPB1, FOXO3 ve CHAC1 genleri ayrıca test edilmiştir.

Western blot

HSP70, BiP/HSPA5, BAG3, COL1A1 ve ACTB proteinleri değerlendirilmiştir.

Transkriptomik

Affymetrix GeneChip Bovine Gene 1.0 ST Array kullanılmıştır. Üç biyolojik RNA örneği analizden önce birleştirilmiştir.

Proteomik

Proteinler S-Trap ile hazırlanmış, TMT10 etiketlenmiş ve Q Exactive HF-X LC/MS sistemiyle analiz edilmiştir. Proteome Discoverer 3.0 ve CHIMERYS kullanılmış; en az iki özgün peptit ve %1 FDR koşulu uygulanmıştır.

Fonksiyonel analiz

GO analizi clusterProfiler, KEGG ve Reactome analizi Metascape ile gerçekleştirilmiştir. Protein-protein etkileşim ağları STRING kullanılarak oluşturulmuştur.

Çalışmanın desteklediği sonuçlar

Çalışma, Hanwoo kökenli stabil bir immortalize OEC hattının oluşturulabildiğini; ısı stresinin bu hücrelerde erken ROS artışı, güçlü HSP70/BiP cevabı, gecikmeli antioksidan gen aktivasyonu ve geniş transkriptomik/proteomik değişiklikler oluşturduğunu desteklemektedir.

Çalışmanın desteklemediği sonuçlar

Bu deney, canlı Hanwoo sığırlarında gebelik oranının ne kadar düştüğünü ölçmemiştir. Yeni hücre hattında embriyo gelişimi veya fertilizasyon başarısı doğrudan test edilmemiştir. Belirlenen zenginleşmiş yolakların her biri için nedensel moleküler mekanizma ayrı deneylerle doğrulanmamıştır. Ayrıca immortalize hücrelerin primer ovidukt hücrelerinin bütün biyolojik davranışlarını eksiksiz biçimde temsil ettiği gösterilmiş değildir.

SV40T sınırlılığı

SV40T hücre proliferasyonunu sürdürmek için kullanılmıştır ancak p53 gibi hücresel kontrol mekanizmalarıyla etkileşebilir. Yazarlar bu nedenle geliştirilen hattın p53 modülasyonunu incelemek için uygun olmadığını özellikle belirtmiştir.

Multi-omics sınırlılığı

Microarray ve LC/MS analizlerinde üç biyolojik tekrar tek pooled örneğe dönüştürülmüştür. Bu yaklaşım biyolojik varyasyonun doğrudan istatistiksel tahminini sınırlar. Temsilî gen ve proteinlerin n=3 doğrulamalarla ayrıca test edilmesi bu riski azaltmaktadır ancak bütün DEG/DEP listesini bağımsız olarak doğrulamaz.

Türler arası anotasyon sınırı

GO ve yolak analizlerinde insan referans veri tabanları kullanılmıştır. Sığır homologları üzerinden yapılan bu işlevsel anotasyon geniş biyolojik yorum sağlar ancak insan ve sığır biyolojisinin her gen-yolak ilişkisinde tamamen özdeş olduğu varsayılmamalıdır.

Kaynak ve Yöntem Notu

Özgün çalışma:Development and characterization of Hanwoo oviduct epithelial cell line for heat stress study

Yazarlar: Ismail Shaleh; Sung Woo Kim; Tae Sub Park; Joonghoon Park.

Sorumlu yazar: Joonghoon Park.

Kurumlar: Seoul National University; IPB University; Hanwoo Research Institute, National Institute of Animal Science, Rural Development Administration.

Dergi: Animal Bioscience.

DOI: 10.5713/ab.250962

Güncel yayın durumu: PubMed kayıtlarında 1 Eylül 2026 itibarıyla ahead-of-print.

Finansman: Rural Development Administration, Republic of Korea — Cooperative Research Program for Agriculture Science and Technology Development, proje RS-2024-00399381. Ismail Shaleh'in doktora çalışması ayrıca KOICA burs desteği almıştır.

Çıkar çatışması: Yazarlar çıkar çatışması bildirmemiştir.

Veri erişimi: Çalışma verilerinin makul talep üzerine sorumlu yazardan sağlanabileceği belirtilmiştir.

Etik onay: Makalede “Not applicable” olarak bildirilmiştir. Ovidukt örnekleri mezbaha kaynaklıdır.

Yapay zekâ kullanım bildirimi: Yazarlar yöntem bölümünün İngilizce yazım etkinliğini geliştirmek amacıyla OpenAI ChatGPT kullandıklarını, daha sonra içeriği gözden geçirip düzenlediklerini ve yayının sorumluluğunu üstlendiklerini bildirmiştir.

Temel sınırlılıklar: Model SV40T ile immortalize edilmiş hücrelere dayanmaktadır; özellikle p53 modülasyonu için uygun değildir. Transkriptomik ve proteomik örnekler biyolojik tekrarlar üzerinden ayrı ayrı analiz edilmek yerine pooling yoluyla tek örneğe dönüştürülmüştür. GO/yolak anotasyonlarında insan referans veri tabanları kullanılmıştır. Fertilizasyon, embriyo gelişimi ve canlı hayvan üreme performansı yeni hücre hattıyla doğrudan test edilmemiştir.

Verianla anlatım ilkesi: Bu içerik kaynak makalenin tam metin çevirisi değildir. Hücre hattı geliştirme yöntemi, sıcaklık ve zaman koşulları, biyobelirteç sonuçları, DEG/DEP sayıları, multi-omics yaklaşımı ve yöntemsel sınırlılıklar kaynağa sadık tutularak bağımsız bir bilimsel öğretici yapıda yeniden anlatılmıştır. Özgün mikroskopi görüntüleri, Western blotlar ve omics ağları için DOI üzerinden kaynak çalışma incelenmelidir.