İstilik stresi mal-qaranın yalnız ümumi metabolizminə deyil, çoxalmanın ilkin mərhələlərində fəaliyyət göstərən hüceyrə mühitinə də təsir göstərə bilər. Bu tədqiqatda araşdırmaçılar Koreyanın yerli mal-qara cinsi Hanwoo-nun oviduktundan — yəni yumurtalıqla uşaqlıq arasındakı reproduktiv kanaldan — epitel hüceyrələrini təcrid etmiş və bu hüceyrələri laboratoriyada uzun müddət istifadə oluna bilən immortalizə edilmiş hüceyrə xəttinə çevirmişlər.

Birincili ovidukt epitel hüceyrələrinə piggyBac transpozon sistemi vasitəsilə SV40 large T antigen (SV40T) köçürülmüş, puromisin seçimi tətbiq edilmiş və epitel hüceyrə markeri CDH1/E-cadherin müsbət hüceyrələr FACS ilə zənginləşdirilmişdir. Əldə edilən hüceyrə populyasiyasında CDH1 müsbətliyi %98,2 səviyyəsində bildirilmişdir.

Hüceyrələr daha sonra 41,5 °C-də 4, 12 və ya 24 saat istilik stresinə məruz qoyulmuş və müvafiq 37 °C bərpa dövrləri araşdırılmışdır. Hüceyrədaxili reaktiv oksigen növləri (ROS) yalnız 4 saat ərzində artdığı halda, SOD1, CAT və GPX1 kimi antioksidant genlərin nəzərəçarpacaq yüksəlişi daha gec meydana çıxmış və 24 saatlıq stres dövründə ən güclü səviyyəyə çatmışdır.

HSP70 və endoplazmatik retikulum şaperonu BiP/GRP78 isə daha erkən cavab vermişdir. HSP70 4 saatlıq istilik stresində təxminən 10,85 dəfə, 12 saatda isə təxminən 17,24 dəfə artmışdır. Bu zülalların bərpa dövründə də yüksək qalması, temperatur normaya qayıtdıqda hüceyrə stres cavabının dərhal başa çatmadığını göstərir.

24 saatlıq istilik stresi transkriptomik və proteomik analiz üçün seçilmiş; 510 diferensial ifadə olunan gen və 258 diferensial ifadə olunan zülal müəyyən edilmişdir. Zənginləşmə analizləri oksidativ stres, zülal qatlanması, ER stresi, immun cavab, hüceyrə qocalması, qida çatışmazlığına cavab, metabolizm və hüceyrədənkənar matrikslə əlaqəli proseslərdə dəyişikliklər göstərmişdir.

Bununla belə, tədqiqat real mayalanma və ya hamiləlik uğurunu birbaşa ölçmür. Nəticələr istilik stresinin Hanwoo ovidukt epitel hüceyrələrinin molekulyar funksiyalarını dəyişdirdiyini göstərən laboratoriya modelinə aiddir.

Ovidukt epitel hüceyrələri çoxalma baxımından niyə vacibdir?

Ovidukt yumurtalıqla uşaqlıq arasında sadə bir daşıma borusu deyil. Onun daxili səthindəki epitel hüceyrələri spermatozoid, oosit və erkən embrionla həm fiziki, həm də kimyəvi şəkildə qarşılıqlı təsir göstərir.

Bu hüceyrələrin yaratdığı mikromühit spermatozoid hərəkətliliyi və kapasitasiya, kumulus-oosit kompleksinin daşınması, erkən embrionun hərəkəti, qida maddələrinin təmin edilməsi, redoks tarazlığı və immun tənzimlənmə kimi proseslərə töhfə verə bilər.

OEC-lər həmçinin SOD, GPX və CAT kimi antioksidant müdafiə sistemlərini ifadə etməklə oositin və erkən embrionun həddindən artıq ROS təsirinə məruz qalmasını məhdudlaşdırmağa kömək edə bilər.

Buna görə də ovidukt epitelinin yüksək temperaturda necə dəyişdiyini anlamaq mal-qara reproduktiv biologiyasında istilik stresinin erkən mexanizmlərini araşdırmaq baxımından vacibdir.

Hanwoo Ovidukt Hüceyrə Xətti Necə Yaradıldı?

Təzə Hanwoo ovidukt toxumaları kəsimxanadan götürülmüş və buz üzərində laboratoriyaya daşınmışdır. Ampulla nahiyəsindəki daxili epitel təbəqəsi fiziki və enzimatik üsullarla ayrılmışdır.

Birincili hüceyrələr yüksək qlükoza tərkibli DMEM, %10 FBS və antibiotik-antimikotik ehtiva edən kultura mühitində çoxaldılmışdır.

İlk pasajdan sonra hüceyrələrə piggyBac transpozon sistemi ilə SV40T geni köçürülmüşdür. SV40T inteqrasiyası PCR ilə təsdiqlənmiş, daha sonra puromisin istifadə edilərək stabil hüceyrələr seçilmişdir.

Epitel hüceyrə kimliyini müəyyən etmək üçün CDH1/E-cadherin markeri istifadə edilmişdir. CDH1 müsbət hüceyrələr FACS ilə ayrılmış və immortalizə edilmiş hüceyrə xəttinin homogenliyi artırılmışdır.

Hüceyrələrin passage 23-ə qədər aktiv şəkildə çoxalması xəttin təkrarlana bilən istilik stresi təcrübələrində istifadə oluna biləcək stabil in vitro model olduğunu dəstəkləmişdir.

İstilik Stresinə İlk Cavab ROS-dur, yoxsa Antioksidant Genlər?

Tədqiqatın zaman sırası bu iki cavabın eyni anda başlamadığını göstərir.

41,5 °C-də 4 saatlıq istilik stresindən sonra hüceyrə daxilində DCF flüoressensiyası artmış və ROS toplanması aydınlaşmışdır. Buna baxmayaraq, eyni zaman nöqtəsində SOD1, CAT və GPX1 genləri əhəmiyyətli dərəcədə yüksəlməmişdir.

12 saatlıq stres dövründə antioksidant cavab ortaya çıxmışdır:

Bu zamanlama hüceyrədaxili oksidativ yükün artmasının ölçülə bilən antioksidant gen cavabından əvvəl ortaya çıxa bildiyini göstərir.

Bərpa dövründə SOD1 və CAT böyük ölçüdə başlanğıc səviyyəsinə qayıtdığı halda, GPX1 bəzi şəraitlərdə yüksək qalmışdır. Bu, müxtəlif antioksidant komponentlərin bərpa kinetikasının eyni olmadığını göstərir.

HSP70 və BiP Niyə Bu Qədər Sürətlə Yüksəldi?

Yüksək temperatur zülalların təbii üçölçülü quruluşunu poza və səhv qatlanmış zülal yükünü artıra bilər. Hüceyrələr bu halda şaperon adlanan zülalları aktivləşdirərək zülalların yenidən qatlanmasını və aqreqasiyanın məhdudlaşdırılmasını dəstəkləyir.

Bu tədqiqatda HSP70 cavabı antioksidant genlərin nəzərəçarpacaq yüksəlişindən daha əvvəl ortaya çıxmışdır.

BiP-nin 4 saatlıq istilik stresindən sonrakı bərpa dövründə təxminən 4,31 dəfə səviyyəsinə yüksəlməsi xüsusilə diqqətəlayiqdir. Zülal homeostazının bərpası temperatur yenidən 37 °C-yə qayıtsa belə davam edə bilər.

Bu nəticələr hüceyrələrin yalnız oksidativ stresə deyil, sitoplazmatik və endoplazmatik retikulum səviyyəsindəki zülal qatlanması problemlərinə də cavab verdiyini göstərir.

Niyə 24 Saatlıq İstilik Stresi Multi-Omics Analizi Üçün Seçildi?

24 saatlıq dövrdə SOD1, CAT və GPX1 antioksidant genlərinin güclü şəkildə yüksəlməsi, HSP70 və BiP-nin də hələ nəzərəçarpacaq səviyyədə qalması araşdırmaçıların bu zaman nöqtəsini daha geniş molekulyar analiz üçün seçməsinə səbəb olmuşdur.

24 saatlıq istilik stresi ilə nəzarətin müqayisəsində:

DEG tərifi üçün ≥|2| fold-change, DEP üçün isə ≥|1,5| fold-change həddi istifadə edilmişdir.

Bərpa qrupunda da çox sayda gen və zülal dəyişikliyinin davam etməsi istilik stresinin molekulyar təsirlərinin yalnız temperatura məruz qalma müddəti ilə məhdudlaşmadığını göstərir.

Transkriptom və Proteom Eyni Şeyi Göstərdimi?

Tam olaraq yox. mRNA və zülal səviyyəsində uyğun dəyişiklik göstərən yalnız 28 ortaq gen/zülal müəyyən edilmişdir.

Bunların doqquzu birbaşa istilik stresi/nəzarət müqayisəsində, 19-u isə bərpa/nəzarət müqayisəsində aşkar edilmişdir.

Bu məhdud üst-üstə düşmə bioloji baxımdan mümkündür; çünki mRNA-nın zülala çevrilməsi, zülalın yarımparçalanma müddəti, deqradasiya, translyasiya sürəti və post-translyasion nəzarət kimi proseslər iki molekulyar təbəqə arasında fərq yarada bilər.

Lakin tədqiqat dizaynındakı mühüm bir məhdudiyyət də nəzərə alınmalıdır: transkriptom və proteom analizindən əvvəl üç bioloji təkrar birləşdirilərək bir pooled nümunə yaradılmışdır.

Buna görə geniş DEG/DEP məlumat dəstləri güclü kəşf mənbəyi olsa da, klassik mənada üç müstəqil omics replikasiyasından əldə edilməmişdir. Araşdırmaçılar bu məhdudiyyəti qəbul etmiş və seçilmiş nəticələri müstəqil bioloji təkrarlarla qRT-PCR və Western blot istifadə edərək təsdiqləmişlər.

Hansı Hüceyrə Yolları Təsirləndi?

GO, KEGG və Reactome analizləri istilik stresi və bərpa dövrlərində bir-biri ilə əlaqəli çoxsaylı proseslərdə dəyişikliklər göstərmişdir.

Yuxarı tənzimlənən qruplarda xüsusilə zülal qatlanması, HSP bağlanması, oksidativ stres, endoplazmatik retikulum stresi və zülalın yenidən qatlanması ön plana çıxmışdır.

“Response to starvation” termininin də güclü şəkildə zənginləşməsi hüceyrənin enerji və qida maddələri metabolizmində stres şəraitinə uyğunlaşan dəyişikliklər inkişaf etdirdiyini düşündürür.

Amin turşusu, lipid, karbohidrat və nukleotid metabolizmi ilə əlaqəli gen və zülallarda dəyişikliklər müşahidə edilmiş; bəzi SLC daşıyıcıları ilə əlaqəli molekul daşıma funksiyaları da təsirlənmişdir.

İmmun sistemi ilə əlaqəli interleykin və sitokin yolları ilə hüceyrədənkənar matriksin təşkili də dəyişmişdir. Bu tapıntılar OEC-nin spermatozoid, oosit və erkən embrion üçün yaratdığı mikromühitin istilik stresindən təsirlənə biləcəyini düşündürür.

Lakin yol zənginləşməsi real fertilitenin azalmasının birbaşa ölçümü deyil.

Tədqiqatın Metodu və Nəticələri

Hüceyrə mənbəyi

Hanwoo dişi mal-qarasından götürülmüş təzə ovidukt toxumasının ampulla nahiyəsindən birincili epitel hüceyrələri təcrid edilmişdir.

İmmortalizasiya

SV40 large T antigen piggyBac transpozon sistemi vasitəsilə hüceyrələrə köçürülmüşdür. Stabil inteqrasiya PCR ilə təsdiqlənmiş və puromisin seçimi tətbiq edilmişdir.

Epitel xarakterizasiyası

CDH1/E-cadherin immunflüoressent boyama və FACS ilə qiymətləndirilmişdir. Tədqiqatın xülasəsində hüceyrə xətti üçün %98,2 CDH1 müsbətliyi bildirilir.

İstilik stresi modeli

Nəzarət hüceyrələri 37 °C-də saxlanmış, təcrübə hüceyrələri 41,5 °C-də 4, 12 və ya 24 saat istilik stresinə məruz qoyulmuşdur. Daha sonra hüceyrələr 37 °C-də ekvivalent bərpa dövrlərinə alınmışdır.

ROS

CM-H2-DCFDA flüoressent zondu istifadə edilmiş və 4 saatlıq istilik stresindən sonra hüceyrədaxili ROS artımı müşahidə edilmişdir.

qRT-PCR

SOD1, CAT və GPX1 antioksidant genləri GAPDH-yə normallaşdırılaraq 2^−ΔΔCt üsulu ilə qiymətləndirilmişdir. Multi-omics nəticələrinin təsdiqlənməsi üçün BAG3, HSPB1, FOXO3 və CHAC1 genləri də ayrıca sınaqdan keçirilmişdir.

Western blot

HSP70, BiP/HSPA5, BAG3, COL1A1 və ACTB zülalları qiymətləndirilmişdir.

Transkriptomika

Affymetrix GeneChip Bovine Gene 1.0 ST Array istifadə edilmişdir. Üç bioloji RNA nümunəsi analizdən əvvəl birləşdirilmişdir.

Proteomika

Zülallar S-Trap ilə hazırlanmış, TMT10 ilə işarələnmiş və Q Exactive HF-X LC/MS sistemi ilə analiz edilmişdir. Proteome Discoverer 3.0 və CHIMERYS istifadə edilmiş; ən azı iki unikal peptid və %1 FDR şərti tətbiq edilmişdir.

Funksional analiz

GO analizi clusterProfiler, KEGG və Reactome analizi isə Metascape ilə həyata keçirilmişdir. Zülal-zülal qarşılıqlı təsir şəbəkələri STRING istifadə edilərək yaradılmışdır.

Tədqiqatın dəstəklədiyi nəticələr

Tədqiqat Hanwoo mənşəli stabil immortalizə edilmiş OEC xəttinin yaradıla bildiyini; istilik stresinin bu hüceyrələrdə erkən ROS artımı, güclü HSP70/BiP cavabı, gecikmiş antioksidant gen aktivləşməsi və geniş transkriptomik/proteomik dəyişikliklər yaratdığını dəstəkləyir.

Tədqiqatın dəstəkləmədiyi nəticələr

Bu təcrübə canlı Hanwoo mal-qarasında hamiləlik nisbətinin nə qədər azaldığını ölçməmişdir. Yeni hüceyrə xəttində embrion inkişafı və ya mayalanma uğuru birbaşa sınaqdan keçirilməmişdir. Müəyyən edilmiş zənginləşmiş yolların hər biri üçün səbəb-nəticəli molekulyar mexanizm ayrıca təcrübələrlə təsdiqlənməmişdir. Həmçinin immortalizə edilmiş hüceyrələrin birincili ovidukt hüceyrələrinin bütün bioloji davranışlarını tam şəkildə təmsil etdiyi göstərilməmişdir.

SV40T məhdudiyyəti

SV40T hüceyrə proliferasiyasını davam etdirmək üçün istifadə edilmişdir, lakin p53 kimi hüceyrə nəzarət mexanizmləri ilə qarşılıqlı təsir göstərə bilər. Müəlliflər buna görə yaradılmış xəttin p53 modulyasiyasını araşdırmaq üçün uyğun olmadığını xüsusilə qeyd etmişlər.

Multi-omics məhdudiyyəti

Microarray və LC/MS analizlərində üç bioloji təkrar bir pooled nümunəyə çevrilmişdir. Bu yanaşma bioloji variasiyanın birbaşa statistik qiymətləndirilməsini məhdudlaşdırır. Təmsilçi gen və zülalların n=3 təsdiqləmələrlə ayrıca sınaqdan keçirilməsi bu riski azaldır, lakin bütün DEG/DEP siyahısını müstəqil şəkildə təsdiqləmir.

Növlərarası annotasiya məhdudiyyəti

GO və yol analizlərində insan referans məlumat bazalarından istifadə edilmişdir. Mal-qara homologları üzərindən aparılan bu funksional annotasiya geniş bioloji şərh imkanı verir, lakin insan və mal-qara biologiyasının hər gen-yol əlaqəsində tamamilə eyni olduğu fərz edilməməlidir.

Mənbə və Metod Qeydi

Orijinal tədqiqat:Development and characterization of Hanwoo oviduct epithelial cell line for heat stress study

Müəlliflər: Ismail Shaleh; Sung Woo Kim; Tae Sub Park; Joonghoon Park.

Məsul müəllif: Joonghoon Park.

Qurumlar: Seoul National University; IPB University; Hanwoo Research Institute, National Institute of Animal Science, Rural Development Administration.

Jurnal: Animal Bioscience.

DOI: 10.5713/ab.250962

Cari nəşr statusu: PubMed qeydlərinə görə 1 Sentyabr 2026 tarixinə ahead-of-print.

Maliyyələşdirmə: Rural Development Administration, Republic of Korea — Cooperative Research Program for Agriculture Science and Technology Development, layihə RS-2024-00399381. Ismail Shaleh-in doktorantura işi əlavə olaraq KOICA təqaüd dəstəyi almışdır.

Maraqlar toqquşması: Müəlliflər maraqlar toqquşması bildirməmişlər.

Məlumatlara çıxış: Tədqiqat məlumatlarının əsaslandırılmış sorğu əsasında məsul müəllifdən əldə edilə biləcəyi bildirilmişdir.

Etik təsdiq: Məqalədə “Not applicable” kimi bildirilmişdir. Ovidukt nümunələri kəsimxana mənşəlidir.

Süni intellektdən istifadə bəyanatı: Müəlliflər metod bölməsinin ingiliscə yazı keyfiyyətini yaxşılaşdırmaq məqsədilə OpenAI ChatGPT-dən istifadə etdiklərini, daha sonra məzmunu nəzərdən keçirib redaktə etdiklərini və nəşrin məsuliyyətini öz üzərlərinə götürdüklərini bildirmişlər.

Əsas məhdudiyyətlər: Model SV40T ilə immortalizə edilmiş hüceyrələrə əsaslanır; xüsusilə p53 modulyasiyasının araşdırılması üçün uyğun deyil. Transkriptomik və proteomik nümunələr bioloji təkrarlar üzrə ayrıca analiz edilmək əvəzinə pooling yolu ilə bir nümunəyə çevrilmişdir. GO/yol annotasiyalarında insan referans məlumat bazalarından istifadə edilmişdir. Mayalanma, embrion inkişafı və canlı heyvanlarda reproduktiv göstəricilər yeni hüceyrə xətti ilə birbaşa sınaqdan keçirilməmişdir.

Verianla təqdimat prinsipi: Bu məzmun mənbə məqalənin tam mətn tərcüməsi deyil. Hüceyrə xəttinin yaradılması üsulu, temperatur və zaman şəraiti, biomarker nəticələri, DEG/DEP sayları, multi-omics yanaşması və metodoloji məhdudiyyətlər mənbəyə sadiq saxlanılaraq müstəqil elmi-maarifləndirici quruluşda yenidən izah edilmişdir. Orijinal mikroskopiya görüntüləri, Western blotlar və omics şəbəkələri üçün mənbə tədqiqat DOI vasitəsilə nəzərdən keçirilməlidir.