Bu preprint çalışma, et/kas dokusu ve süt örneklerinde çok sayıda veteriner ilaç kalıntısını aynı analiz yöntemiyle taramayı hedefliyor. Araştırmacılar, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi kullanan LC-Q-Orbitrap tabanlı bir yöntem geliştirmiş ve 196 farmakolojik aktif maddeyi kapsayan geniş bir tarama paneli oluşturmuş.

Çalışmada önce dört farklı numune hazırlama yöntemi karşılaştırılmış. En uygun yaklaşım olarak, asetonitril/su karışımı ve ardından saf asetonitril ile yapılan çift ekstraksiyon seçilmiş. Daha sonra yöntem, Avrupa Birliği’nin 2021/808 sayılı analitik yöntem validasyon kriterlerine göre kas ve süt matrislerinde değerlendirilmiş.

Sonuçlara göre yöntem, birçok veteriner ilaç kalıntısını hem nitel olarak tarayabiliyor hem de önemli bir kısmını nicel olarak ölçebiliyor. Ancak bazı madde grupları — özellikle avermektinler, bazı beta-laktamlar, makrolidler ve iyonofor antikoksidiyaller — düşük seviyelerde hâlâ zorlayıcı analitler olarak kalıyor.

Veteriner ilaçları, hayvancılıkta hastalıkların tedavisi, önlenmesi ve bazı üretim süreçlerinin yönetimi için kullanılır. Ancak bu maddelerin yanlış, aşırı veya uygunsuz kullanımı, et, süt, yumurta gibi hayvansal gıdalarda kalıntı bırakabilir.

Gıda güvenliği açısından temel sorun şudur: Laboratuvarlar, çok farklı kimyasal özelliklere sahip yüzlerce maddeyi aynı anda güvenilir şekilde nasıl tarayabilir?

Bu kolay bir problem değildir. Çünkü veteriner ilaçları tek tip değildir. Antibiyotikler, antiparaziterler, sakinleştiriciler, ağrı kesiciler, antikoksidiyaller ve başka birçok grup farklı çözünürlük, polarite, kararlılık ve iyonlaşma davranışı gösterir. Bir ekstraksiyon yöntemi bazı maddeleri çok iyi çıkarırken, bazılarını kaybettirebilir.

Ayrıca gıda matrisi de karmaşıktır. Süt yağ, protein, mineral ve şeker içerir. Et/kas dokusu protein ve lipit bakımından yoğundur. Bu bileşenler analiz sırasında sinyalleri baskılayabilir, yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir veya bazı kalıntıların tespitini zorlaştırabilir.

Bu çalışmanın temel problemi şudur:

Et ve süt gibi karmaşık gıda matrislerinde, çok sayıda veteriner ilaç kalıntısını aynı yöntemle hem geniş kapsamlı hem de güvenilir biçimde tespit etmek mümkün mü?

Yöntem Ne Öneriyor?

Çalışma, LC-Q-Orbitrap HRMS adlı yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi yaklaşımını kullanıyor.

Bu ifadeyi sadeleştirelim:

• LC, sıvı kromatografisidir. Numunedeki bileşenleri zamana yayarak ayırır.
• Q-Orbitrap, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresidir. Molekülleri çok hassas kütle ölçümüyle tanır.
• HRMS, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi anlamına gelir. Benzer kütleye sahip bileşikleri ayırt etmekte klasik düşük çözünürlüklü yaklaşımlara göre avantaj sağlayabilir.

Araştırmacılar 196 hedef analit için bir tarama yöntemi kurmuş. Bu analitler arasında antibakteriyeller, sülfonamidler, tetrasiklinler, kinolonlar, makrolidler, benzimidazoller, avermektinler, sakinleştiriciler, antikoksidiyaller ve bazı antiinflamatuvar ilaçlar bulunuyor.

Numune hazırlamada dört farklı yöntem karşılaştırılmış. Amaç, mümkün olduğunca çok maddeyi yeterli geri kazanımla ekstrakte etmek. Karşılaştırma sonunda pratiklik, maliyet, kapsam ve hazırlık basamakları dikkate alınarak çift ekstraksiyon yaklaşımı seçilmiş.

Seçilen yöntemin genel mantığı şöyle:

1. Numune hazırlanıyor.
2. İç standartlar ve hedef madde karışımlarıyla test ediliyor.
3. Asetonitril/su karışımıyla ilk ekstraksiyon yapılıyor.
4. Saf asetonitril ile ikinci ekstraksiyon yapılıyor.
5. Ekstrakt yoğunlaştırılıyor ve uygun çözücüyle yeniden çözülüyor.
6. LC-Q-Orbitrap cihazında analiz ediliyor.
7. Molekül iyonu, alıkonma zamanı ve en az bir parça iyon bilgisi birlikte değerlendirilerek tarama yapılıyor.

Formüller Ne Anlatıyor?

Bu çalışma yoğun matematiksel formül yerine analitik performans ölçütleri üzerine kurulu. En önemli kavramlar şunlar:

1. Yanlış pozitif oranı

Yanlış pozitif, aslında kalıntı içermeyen bir numunenin şüpheli gibi işaretlenmesidir. Çalışmada özgüllük değerlendirilirken boş numunelerde sinyal oluşup oluşmadığına bakılmış.

Basitçe:

Yanlış pozitif oranı = Şüpheli sinyal veren boş numune sayısı / Toplam boş numune sayısı

Bu oran ne kadar düşükse, yöntem o kadar seçici kabul edilir.

2. Yanlış negatif oranı

Yanlış negatif, aslında kalıntı içeren bir numunenin yöntem tarafından kaçırılmasıdır. Gıda kontrolünde yanlış negatif daha kritik olabilir çünkü gerçek bir kalıntı gözden kaçabilir.

Basitçe:

Yanlış negatif oranı = Tespit edilemeyen katkılı numune sayısı / Toplam katkılı numune sayısı

Çalışmada tespit kapasitesi belirlenirken yanlış negatif oranının %5 veya altında olduğu en düşük konsantrasyon düzeyi dikkate alınmış.

3. CCβ

CCβ, yöntemin belirli bir maddeyi güvenilir şekilde tespit edebildiği konsantrasyon düzeyini anlatır. Gıda kalıntı analizinde bu kavram önemlidir çünkü yöntem yalnızca “görüyorum” demekle kalmaz; hangi seviyede güvenilir tarama yapabildiğini de göstermelidir.

4. Geri kazanım ve kesinlik

Geri kazanım, numuneye eklenen maddenin analiz sonunda ne kadarının ölçülebildiğini gösterir. Çok düşük geri kazanım, maddenin ekstraksiyon sırasında kaybolduğunu düşündürebilir. Çok yüksek değerler ise matris etkisi veya sinyal bozulmasına işaret edebilir.

Kesinlik ise tekrarlı ölçümlerin birbirine ne kadar yakın olduğunu anlatır. Bu çalışmada laboratuvar içi tekrarlanabilirlik, CVR değeriyle değerlendirilmiştir.

Grafik / Tablo / Şema Ana Mesajı

Makaledeki görsellerin ana mesajı şöyle özetlenebilir:

İlk grafik, dört farklı ekstraksiyon yönteminin kaç analiti kabul edilebilir geri kazanım aralığında yakaladığını gösteriyor. Ana mesaj şu: Saf asetonitrile dayalı daha basit yöntem, geniş kapsamlı çoklu kalıntı analizi için yeterli değil. Asetonitril/su karışımı ve EDTA içeren çift ekstraksiyon yaklaşımı daha geniş analit kapsamı sunuyor. Bazı temizleme adımları teorik olarak matrisi azaltabilir; fakat bazı analitlerin kaybına da neden olabilir.

Yanlış pozitifleri gösteren grafik, yalnızca molekül iyonu ve alıkonma zamanına bakmanın yeterli olmadığını anlatıyor. En az bir tanısal parça iyonun eklenmesi, yanlış pozitif riskini belirgin şekilde azaltıyor. Bu, yüksek çözünürlüklü cihazlarda bile tek sinyale güvenmenin yeterli olmayabileceğini gösteriyor.

CCβ grafiği, yöntemin hangi maddeleri hangi konsantrasyon düzeyinde güvenilir tespit edebildiğini özetliyor. Ana mesaj: Maddelerin büyük bölümü 5–10 µg/kg aralığında yakalanabiliyor; fakat bazı zorlu analitlerde tespit kapasitesi 50–100 µg/kg düzeyine çıkabiliyor.

Validasyon özet grafikleri, geri kazanım ve kesinlik açısından yöntemin birçok analitte kabul edilebilir performans verdiğini gösteriyor. Ancak tüm 196 madde aynı başarıyla ölçülemiyor. Bazıları nicel ölçüme uygunken, bazıları yalnızca nitel tarama kapsamında değerlendiriliyor.

Gerçek numune uygulamasını gösteren grafik, analiz edilen örneklerin büyük bölümünde veteriner ilaç kalıntısı şüphesi oluşmadığını; şüpheli sinyallerin ise daha çok kas/et örneklerinde ve özellikle kanatlı kasında görüldüğünü anlatıyor. Süt örneklerinde bu çalışma kapsamında VMP kalıntısı tespit edilmemiştir. Ancak bu sonuç yalnızca incelenen örnek seti için geçerlidir.

Deneyler Nasıl Yapılmış?

Çalışma birkaç ana aşamadan oluşuyor.

İlk aşamada standart maddeler ve iç standartlar hazırlanmış. Hedef panel 196 farmakolojik aktif maddeyi kapsayacak şekilde kurulmuş.

İkinci aşamada dört farklı ekstraksiyon yöntemi domuz kas dokusunda karşılaştırılmış. Numuneler belirli düzeyde hedef analitlerle zenginleştirilmiş ve her yöntemin maddeleri ne kadar iyi çıkardığı ölçülmüş.

Üçüncü aşamada seçilen ekstraksiyon yöntemi LC-Q-Orbitrap cihazıyla birleştirilmiş. Analizde tam tarama ve veri bağımsız parçalanma yaklaşımı kullanılmış. Böylece hem hedef molekülün doğru kütlesi hem de parçalanma bilgisi toplanmış.

Dördüncü aşamada yöntem validasyonu yapılmış. Kas ve süt için farklı boş numuneler kullanılmış, farklı katkı seviyeleri test edilmiş, yanlış pozitif, yanlış negatif, tespit kapasitesi, geri kazanım ve kesinlik değerlendirilmiş.

Beşinci aşamada yöntem yeterlilik testlerinde sınanmış. Yeterlilik testleri, laboratuvarın yöntem performansını dış örneklerle değerlendirmesine olanak verir. Bu çalışmada farklı yıllarda ve farklı organizatörler tarafından sağlanan test numuneleri kullanılmış.

Son aşamada yöntem gerçek örneklere uygulanmış. Fransa’daki resmi kontrol ve gözetim planı kapsamında 144 kas/et ve 50 süt örneği analiz edilmiştir.

Sonuçlar Ne Gösteriyor?

Çalışmanın sonuçları birkaç başlıkta özetlenebilir.

Birincisi, yüksek çözünürlüklü LC-Q-Orbitrap yöntemi geniş kapsamlı veteriner ilaç kalıntısı taraması için güçlü bir araçtır. Tek bir analiz yaklaşımıyla farklı ilaç ailelerinden çok sayıda madde izlenebilmiştir.

İkincisi, numune hazırlama yöntemi sonuçlar üzerinde belirleyicidir. Dört yöntem arasında en uygun yaklaşım, asetonitril/su karışımı ve ardından saf asetonitril kullanan çift ekstraksiyon yöntemi olmuştur. Bu yöntem, geniş analit kapsamı ve pratik laboratuvar kullanımı açısından daha dengeli görünmektedir.

Üçüncüsü, yüksek çözünürlüklü kütle ölçümü tek başına yeterli değildir. Yanlış pozitifleri azaltmak için alıkonma zamanı ve molekül iyonuna ek olarak parça iyon bilgisinin kullanılması önemlidir. Çalışma, bu ek bilginin özgüllüğü artırdığını göstermektedir.

Dördüncüsü, yöntem tüm analitlerde aynı performansı vermemektedir. Bazı avermektinler, bazı makrolidler, beta-laktamlar ve antikoksidiyaller düşük düzeylerde daha zor tespit edilmiştir. Bu, çok geniş kapsamlı yöntemlerin doğal bir sınırlılığıdır: Kapsam büyüdükçe her madde için ideal koşulu yakalamak zorlaşır.

Beşincisi, yöntem birçok madde için nicel ölçüm yapabilecek performansa ulaşmıştır. Çalışmada 106 analit kas dokusunda, 115 analit ise süt matrisinde nicel olarak değerlendirilebilir bulunmuştur. Diğerleri için yöntem daha çok nitel tarama amaçlı kullanılabilir.

Altıncısı, yeterlilik testleri yöntemin dış değerlendirmede genel olarak tatmin edici sonuç verdiğini göstermiştir. Bu, yöntemin yalnızca laboratuvar içi validasyonla değil, gerçek kontrol sistemlerine benzeyen dış sınamalarla da test edildiğini gösterir.

Yedincisi, gerçek numune uygulamasında analiz edilen 194 örneğin büyük çoğunluğunda veteriner ilaç kalıntısı tespit edilmemiştir. Şüpheli örnekler daha çok kas/et numunelerinde görülmüş; süt örneklerinde bu çalışma kapsamında kalıntı bulunmamıştır. Ancak bu veri, sadece incelenen örneklerin sonucu olarak yorumlanmalıdır.

Bu Neden Önemli?

Gıda güvenliği laboratuvarları için en kritik ihtiyaçlardan biri, çok sayıda kalıntıyı hızlı, güvenilir ve geniş kapsamlı biçimde tarayabilmektir. Her madde için ayrı yöntem kullanmak hem zaman hem maliyet hem de iş yükü açısından zordur.

Bu çalışma, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisinin bu alandaki avantajını gösteriyor. Q-Orbitrap gibi sistemler, yalnızca önceden tanımlanmış birkaç maddeyi değil, geniş bir hedef listesini yüksek kütle doğruluğuyla tarayabilir. Ayrıca veri kaydı uygun yapılırsa, gelecekte yeni ortaya çıkan maddeler için geriye dönük analiz imkânı da doğabilir.

Bu yaklaşım, resmi gıda kontrol planlarında önemli olabilir. Çünkü hayvansal gıdalarda kalıntı izleme yalnızca “bir madde var mı?” sorusundan ibaret değildir. Analitik yöntem; yanlış pozitifleri azaltmalı, yanlış negatifleri sınırlamalı, mevzuat eşikleriyle uyumlu tespit kapasitesi sunmalı ve gerçek numunelerde uygulanabilir olmalıdır.

Verianla okuyucusu için bu makalenin önemi şurada: Bir gıdanın güvenliği yalnızca üretim aşamasındaki kurallara değil, bu kuralları izleyebilen analitik teknolojilerin gücüne de bağlıdır. Modern gıda kontrolü, kimyasal izleri çok düşük düzeylerde ve çok karmaşık matrislerde okuyabilen cihazlara dayanır.

Dikkat Noktaları

Bu makale hakem değerlendirmesinden geçmemiş bir preprinttir. Bulgular bağımsız bilimsel değerlendirme süreci sonrasında değişebilir.

Çalışma bir sağlık tavsiyesi veya tüketici risk değerlendirmesi değildir. Amaç, et ve süt örneklerinde veteriner ilaç kalıntılarını taramak için kullanılan bir laboratuvar yönteminin performansını göstermektir.

Yöntem 196 maddeyi kapsasa da tüm maddelerde eşit performans göstermemiştir. Bazı maddeler düşük konsantrasyonlarda zor tespit edilmiş veya yalnızca nitel tarama kapsamında değerlendirilebilmiştir.

Gerçek örnek uygulaması 194 numuneyle sınırlıdır. Bu sonuçlar, genel gıda piyasası hakkında geniş ve kesin bir oran olarak okunmamalıdır.

Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi güçlüdür; ancak uzman veri işleme, uygun numune hazırlama, doğru validasyon ve gerektiğinde doğrulayıcı analiz gerektirir.

Sonuç

Bu preprint çalışma, et ve süt gibi hayvansal gıdalarda veteriner ilaç kalıntılarının geniş kapsamlı taranması için LC-Q-Orbitrap tabanlı bir yöntemin geliştirildiğini ve doğrulandığını gösteriyor.

Yöntem, 196 hedef maddeyi kapsıyor. Bunların önemli bir bölümünü düşük µg/kg düzeylerinde tespit edebiliyor; 106 analiti kas dokusunda, 115 analiti süt matrisinde nicel olarak ölçebilecek performans sunuyor. Bununla birlikte, bazı zorlu madde grupları hâlâ optimizasyon gerektiriyor.

Çalışmanın en güçlü mesajı şu: Modern gıda kontrolünde tek bir cihaz sinyaliyle karar vermek yerine, molekül iyonu, alıkonma zamanı, parça iyon bilgisi, validasyon kriterleri ve dış yeterlilik testleri birlikte değerlendirilmelidir. Geniş kapsamlı tarama yöntemleri, gıda güvenliği gözetiminde güçlü araçlar olabilir; ancak her analit ve her matris için dikkatli validasyon şarttır.

Kaynak ve Yöntem Notu

Bu yazı, et/kas dokusu ve süt örneklerinde 196 veteriner ilaç kalıntısının LC-Q-Orbitrap HRMS ile taranmasını anlatan hakem değerlendirmesinden geçmemiş preprint çalışmanın sadeleştirilmiş Türkçe yorumudur. Metin birebir çeviri değildir; çalışmanın amacı, yöntemi, validasyon mantığı, grafik ve tabloların ana mesajı Verianla okuyucusu için yeniden anlatılmıştır.

Çalışma; dört farklı ekstraksiyon yönteminin karşılaştırılması, seçilen çift ekstraksiyon yaklaşımının LC-Q-Orbitrap sistemiyle birleştirilmesi, EU 2021/808 kriterlerine göre validasyon, yeterlilik testleri ve 194 gerçek numune uygulaması üzerine kuruludur. Bulgular laboratuvar yöntemi performansını gösterir; doğrudan tüketici sağlığı riski veya piyasa geneli kalıntı oranı olarak yorumlanmamalıdır.