Issiqlik stressi qoramollarning nafaqat umumiy metabolizmiga, balki koʻpayishning dastlabki bosqichlarida faoliyat yuritadigan hujayraviy muhitga ham ta’sir qilishi mumkin. Ushbu tadqiqotda olimlar Koreyaning mahalliy qoramol zoti Hanwoo oviduktidan — ya’ni tuxumdon bilan bachadon orasidagi reproduktiv yoʻldan — epitel hujayralarini ajratib olib, ularni laboratoriyada uzoq muddat foydalanish mumkin boʻlgan immortalizatsiya qilingan hujayra liniyasiga aylantirgan.

Birlamchi ovidukt epitel hujayralariga piggyBac transpozon tizimi orqali SV40 large T antigen (SV40T) kiritilgan, puromitsin seleksiyasi qoʻllangan va epitel hujayra markeri CDH1/E-cadherin musbat hujayralar FACS yordamida boyitilgan. Olingan hujayra populyatsiyasida CDH1 musbatligi %98,2 darajasida qayd etilgan.

Hujayralar keyin 41,5 °C da 4, 12 yoki 24 soat issiqlik stressiga duchor qilingan va ularga mos 37 °C tiklanish davrlari oʻrganilgan. Hujayra ichidagi reaktiv kislorod turlari (ROS) atigi 4 soat ichida ortgan boʻlsa, SOD1, CAT va GPX1 kabi antioksidant genlarning sezilarli oshishi kechroq yuzaga kelib, 24 soatlik stress davrida eng yuqori darajaga yetgan.

HSP70 va endoplazmatik retikulum shaperoni BiP/GRP78 esa ertaroq javob bergan. HSP70 4 soatlik issiqlik stressida taxminan 10,85 marta, 12 soatda taxminan 17,24 marta oshgan. Ushbu oqsillarning tiklanish davrida ham yuqori boʻlib qolishi harorat me’yorga qaytganda hujayraviy stress javobi darhol tugamasligini koʻrsatadi.

24 soatlik issiqlik stressi transkriptomik va proteomik tahlil uchun tanlangan; 510 ta differensial ifodalangan gen va 258 ta differensial ifodalangan oqsil aniqlangan. Boyitish tahlillari oksidativ stress, oqsil qatlanishi, ER stressi, immun javob, hujayra qarishi, oziqa tanqisligiga javob, metabolizm va hujayradan tashqari matriks bilan bogʻliq jarayonlarda oʻzgarishlarni koʻrsatgan.

Shu bilan birga, tadqiqot haqiqiy urugʻlanish yoki homiladorlik muvaffaqiyatini bevosita oʻlchamaydi. Natijalar issiqlik stressi Hanwoo ovidukt epitel hujayralarining molekulyar funksiyalarini oʻzgartirishini koʻrsatuvchi laboratoriya modeliga tegishli.

Ovidukt epitel hujayralari koʻpayish nuqtai nazaridan nega muhim?

Ovidukt tuxumdon bilan bachadon orasidagi oddiy tashish naychasi emas. Uning ichki yuzasidagi epitel hujayralari spermatozoid, oosit va erta embrion bilan ham fizik, ham kimyoviy tarzda oʻzaro ta’sirlashadi.

Ushbu hujayralar hosil qiladigan mikromuhit spermatozoid harakatchanligi va kapatsitatsiyasi, kumulus-oosit kompleksining tashilishi, erta embrionning harakati, oziqa bilan ta’minlash, redoks muvozanati va immun boshqaruv kabi jarayonlarga hissa qoʻshishi mumkin.

OEC lar, shuningdek, SOD, GPX va CAT kabi antioksidant himoya tizimlarini ifodalab, oosit va erta embrionning ortiqcha ROS ta’siriga duch kelishini cheklashga yordam berishi mumkin.

Shuning uchun ovidukt epitelining yuqori haroratda qanday oʻzgarishini tushunish qoramollar reproduktiv biologiyasida issiqlik stressining dastlabki mexanizmlarini oʻrganish uchun muhimdir.

Hanwoo Ovidukt Hujayra Liniyasi Qanday Yaratildi?

Yangi olingan Hanwoo ovidukt toʻqimalari soʻyishxonadan olinib, muz ustida laboratoriyaga yetkazilgan. Ampulla hududidagi ichki epitel qavati fizik va fermentativ usullar bilan ajratilgan.

Birlamchi hujayralar yuqori glyukozali DMEM, %10 FBS va antibiotik-antimikotik tutuvchi kultura muhitida koʻpaytirilgan.

Birinchi passajdan soʻng hujayralarga piggyBac transpozon tizimi yordamida SV40T geni kiritilgan. SV40T integratsiyasi PCR bilan tasdiqlangan, soʻng puromitsin yordamida barqaror hujayralar tanlab olingan.

Epitel hujayra identifikatsiyasi uchun CDH1/E-cadherin markeri qoʻllangan. CDH1 musbat hujayralar FACS yordamida ajratilib, immortalizatsiya qilingan hujayra liniyasining bir xilligi oshirilgan.

Hujayralarning passage 23 gacha faol koʻpayishi ushbu liniya takrorlanuvchi issiqlik stressi tajribalari uchun foydalanish mumkin boʻlgan barqaror in vitro model ekanini qoʻllab-quvvatlagan.

Issiqlik Stressiga Birinchi Javob ROSmi yoki Antioksidant Genlarmi?

Tadqiqotning vaqt qatori bu ikki javob bir vaqtda boshlanmasligini koʻrsatadi.

41,5 °C da 4 soatlik issiqlik stressidan soʻng hujayra ichida DCF fluoressensiyasi oshgan va ROS toʻplanishi aniq koʻringan. Shunga qaramay, ayni vaqt nuqtasida SOD1, CAT va GPX1 genlari sezilarli darajada oshmagan.

12 soatlik stress davrida antioksidant javob yuzaga kelgan:

Bu vaqtlanish hujayra ichidagi oksidativ yukning ortishi oʻlchanadigan antioksidant gen javobidan oldin yuzaga kelishi mumkinligini koʻrsatadi.

Tiklanish davrida SOD1 va CAT koʻp jihatdan boshlangʻich darajaga qaytgan, GPX1 esa ayrim sharoitlarda yuqori boʻlib qolgan. Bu turli antioksidant komponentlarning tiklanish kinetikasi bir xil emasligini koʻrsatadi.

HSP70 va BiP Nega Shunchalik Tez Oshdi?

Yuqori harorat oqsillarning tabiiy uch oʻlchamli tuzilishini buzishi va notoʻgʻri qatlangan oqsillar yukini oshirishi mumkin. Hujayralar bunday holatda shaperon deb ataladigan oqsillarni faollashtirib, oqsillarning qayta qatlanishi va agregatsiyaning cheklanishini qoʻllab-quvvatlaydi.

Ushbu tadqiqotda HSP70 javobi antioksidant genlarning sezilarli oshishidan oldin paydo boʻlgan.

BiP ning 4 soatlik issiqlik stressidan keyingi tiklanish davrida taxminan 4,31 marta darajasiga koʻtarilishi ayniqsa e’tiborlidir. Harorat yana 37 °C ga qaytsa ham oqsil homeostazini tiklash davom etishi mumkin.

Bu natijalar hujayralar nafaqat oksidativ stressga, balki sitoplazmatik va endoplazmatik retikulum darajasidagi oqsil qatlanishi muammolariga ham javob berishini koʻrsatadi.

Nega 24 Soatlik Issiqlik Stressi Multi-Omics Tahlili Uchun Tanlandi?

24 soatlik davrda SOD1, CAT va GPX1 antioksidant genlarining kuchli oshishi hamda HSP70 va BiP ning hamon sezilarli darajada boʻlishi tadqiqotchilarni ushbu vaqt nuqtasini kengroq molekulyar tahlil uchun tanlashga olib kelgan.

24 soatlik issiqlik stressi va nazoratni taqqoslashda:

DEG ta’rifi uchun ≥|2| fold-change, DEP uchun ≥|1,5| fold-change chegarasi qoʻllangan.

Tiklanish guruhida ham koʻplab gen va oqsil oʻzgarishlarining davom etishi issiqlik stressining molekulyar ta’sirlari faqat harorat ta’sirida boʻlish davomiyligi bilan cheklanmasligini koʻrsatadi.

Transkriptom va Proteom Bir Xil Narsani Koʻrsatdimi?

Toʻliq emas. mRNA va oqsil darajasida mos oʻzgarish koʻrsatgan atigi 28 ta umumiy gen/oqsil aniqlangan.

Ulardan toʻqqiztasi bevosita issiqlik stressi/nazorat taqqoslashida, 19 tasi esa tiklanish/nazorat taqqoslashida aniqlangan.

Bu cheklangan ustma-ust tushish biologik jihatdan mumkin; chunki mRNA ning oqsilga tarjima qilinishi, oqsilning yarim parchalanish davri, degradatsiya, translyatsiya tezligi va post-translyatsion nazorat kabi jarayonlar ikki molekulyar qatlam oʻrtasida farq yuzaga keltirishi mumkin.

Biroq tadqiqot dizaynidagi muhim cheklovni ham hisobga olish kerak: transkriptom va proteom tahlilidan oldin uchta biologik takror birlashtirilib, bitta pooled namuna hosil qilingan.

Shu sababli keng DEG/DEP ma’lumot toʻplamlari kuchli kashfiyot manbai boʻlsa-da, klassik ma’noda uchta mustaqil omics replikatsiyasidan olingan emas. Tadqiqotchilar ushbu cheklovni tan olgan va tanlangan natijalarni mustaqil biologik takrorlar bilan qRT-PCR va Western blot yordamida tasdiqlagan.

Qaysi Hujayraviy Yoʻllar Ta’sirlandi?

GO, KEGG va Reactome tahlillari issiqlik stressi va tiklanish davrlarida oʻzaro bogʻlangan koʻplab jarayonlarda oʻzgarishlarni koʻrsatgan.

Yuqori boshqarilgan toʻplamlarda ayniqsa oqsil qatlanishi, HSP bogʻlanishi, oksidativ stress, endoplazmatik retikulum stressi va oqsilning qayta qatlanishi ajralib turgan.

“Response to starvation” terminining ham kuchli boyitilgani hujayraning energiya va oziqa moddalar almashinuvida stress sharoitlariga moslashuvchi oʻzgarishlar rivojlantirganini koʻrsatishi mumkin.

Aminokislota, lipid, uglevod va nukleotid metabolizmi bilan bogʻliq gen va oqsillarda oʻzgarishlar kuzatilgan; ayrim SLC tashuvchilari bilan bogʻliq molekula tashish funksiyalari ham ta’sirlangan.

Immun tizimi bilan bogʻliq interleykin va sitokin yoʻllari hamda hujayradan tashqari matriks tashkiloti ham oʻzgargan. Ushbu topilmalar OEC spermatozoid, oosit va erta embrion uchun yaratadigan mikromuhit issiqlik stressidan ta’sirlanishi mumkinligini koʻrsatadi.

Biroq yoʻl boyitilishi haqiqiy fertilitet pasayishining bevosita oʻlchovi emas.

Tadqiqot Usuli va Natijalari

Hujayra manbai

Hanwoo urgʻochi qoramollaridan olingan yangi ovidukt toʻqimasining ampulla hududidan birlamchi epitel hujayralari ajratib olingan.

Immortalizatsiya

SV40 large T antigen piggyBac transpozon tizimi orqali hujayralarga kiritilgan. Barqaror integratsiya PCR bilan tasdiqlangan va puromitsin seleksiyasi qoʻllangan.

Epitel xarakterizatsiyasi

CDH1/E-cadherin immunofluoressent boʻyash va FACS yordamida baholangan. Tadqiqot xulosasida hujayra liniyasi uchun %98,2 CDH1 musbatligi qayd etilgan.

Issiqlik stressi modeli

Nazorat hujayralari 37 °C da saqlangan, tajriba hujayralari 41,5 °C da 4, 12 yoki 24 soat issiqlik stressiga duchor qilingan. Shundan soʻng hujayralar 37 °C da mos tiklanish davrlariga oʻtkazilgan.

ROS

CM-H2-DCFDA fluoressent zondi qoʻllangan va 4 soatlik issiqlik stressidan soʻng hujayra ichidagi ROS ortishi kuzatilgan.

qRT-PCR

SOD1, CAT va GPX1 antioksidant genlari GAPDH ga normallashtirilib 2^−ΔΔCt usuli bilan baholangan. Multi-omics natijalarini tasdiqlash uchun BAG3, HSPB1, FOXO3 va CHAC1 genlari ham alohida sinovdan oʻtkazilgan.

Western blot

HSP70, BiP/HSPA5, BAG3, COL1A1 va ACTB oqsillari baholangan.

Transkriptomika

Affymetrix GeneChip Bovine Gene 1.0 ST Array qoʻllangan. Uchta biologik RNA namunasi tahlildan oldin birlashtirilgan.

Proteomika

Oqsillar S-Trap yordamida tayyorlangan, TMT10 bilan belgilangan va Q Exactive HF-X LC/MS tizimi bilan tahlil qilingan. Proteome Discoverer 3.0 va CHIMERYS qoʻllangan; kamida ikkita oʻziga xos peptid va %1 FDR sharti tatbiq etilgan.

Funksional tahlil

GO tahlili clusterProfiler, KEGG va Reactome tahlili Metascape yordamida amalga oshirilgan. Oqsil-oqsil oʻzaro ta’sir tarmoqlari STRING yordamida tuzilgan.

Tadqiqot qoʻllab-quvvatlaydigan natijalar

Tadqiqot Hanwoo kelib chiqishli barqaror immortalizatsiya qilingan OEC liniyasini yaratish mumkinligini; issiqlik stressi bu hujayralarda erta ROS ortishi, kuchli HSP70/BiP javobi, kechikkan antioksidant gen faollashuvi va keng transkriptomik/proteomik oʻzgarishlarni yuzaga keltirishini qoʻllab-quvvatlaydi.

Tadqiqot qoʻllab-quvvatlamaydigan natijalar

Ushbu tajriba tirik Hanwoo qoramollarida homiladorlik darajasi qanchalik pasayganini oʻlchamagan. Yangi hujayra liniyasida embrion rivojlanishi yoki urugʻlanish muvaffaqiyati bevosita sinovdan oʻtkazilmagan. Aniqlangan boyitilgan yoʻllarning har biri uchun sababiy molekulyar mexanizm alohida tajribalar bilan tasdiqlanmagan. Shuningdek, immortalizatsiya qilingan hujayralar birlamchi ovidukt hujayralarining barcha biologik xatti-harakatlarini toʻliq ifodalashi koʻrsatilmagan.

SV40T cheklovi

SV40T hujayra proliferatsiyasini davom ettirish uchun qoʻllangan, biroq p53 kabi hujayraviy nazorat mexanizmlari bilan oʻzaro ta’sirlashishi mumkin. Mualliflar shu sababli ishlab chiqilgan liniya p53 modulyatsiyasini oʻrganish uchun mos emasligini alohida ta’kidlagan.

Multi-omics cheklovi

Microarray va LC/MS tahlillarida uchta biologik takror bitta pooled namunaga aylantirilgan. Ushbu yondashuv biologik variatsiyani bevosita statistik baholashni cheklaydi. Vakillik qiluvchi gen va oqsillarning n=3 tasdiqlashlar bilan alohida sinovdan oʻtkazilishi bu xavfni kamaytiradi, biroq butun DEG/DEP roʻyxatini mustaqil ravishda tasdiqlamaydi.

Turlararo annotatsiya cheklovi

GO va yoʻl tahlillarida inson referens ma’lumotlar bazalari qoʻllangan. Qoramol homologlari asosida bajarilgan ushbu funksional annotatsiya keng biologik talqin beradi, biroq inson va qoramol biologiyasi har bir gen-yoʻl munosabatida toʻliq bir xil deb faraz qilinmasligi kerak.

Manba va Usul Haqida Izoh

Asl tadqiqot:Development and characterization of Hanwoo oviduct epithelial cell line for heat stress study

Mualliflar: Ismail Shaleh; Sung Woo Kim; Tae Sub Park; Joonghoon Park.

Mas’ul muallif: Joonghoon Park.

Tashkilotlar: Seoul National University; IPB University; Hanwoo Research Institute, National Institute of Animal Science, Rural Development Administration.

Jurnal: Animal Bioscience.

DOI: 10.5713/ab.250962

Joriy nashr holati: PubMed qaydlariga koʻra 1 Sentabr 2026 holatiga ahead-of-print.

Moliyalashtirish: Rural Development Administration, Republic of Korea — Cooperative Research Program for Agriculture Science and Technology Development, loyiha RS-2024-00399381. Ismail Shalehning doktorlik ishi, shuningdek, KOICA stipendiyasi koʻmagini olgan.

Manfaatlar toʻqnashuvi: Mualliflar manfaatlar toʻqnashuvi haqida xabar bermagan.

Ma’lumotlardan foydalanish: Tadqiqot ma’lumotlari asosli soʻrov boʻyicha mas’ul muallifdan olinishi mumkinligi bildirilgan.

Etik tasdiq: Maqolada “Not applicable” deb koʻrsatilgan. Ovidukt namunalari soʻyishxonadan olingan.

Sun’iy intellektdan foydalanish bayonoti: Mualliflar usullar boʻlimining inglizcha yozuv samaradorligini yaxshilash maqsadida OpenAI ChatGPT dan foydalanganliklarini, keyin mazmunni koʻrib chiqib tahrir qilganliklarini va nashr uchun javobgarlikni oʻz zimmalariga olganliklarini bildirgan.

Asosiy cheklovlar: Model SV40T bilan immortalizatsiya qilingan hujayralarga asoslangan; ayniqsa p53 modulyatsiyasini oʻrganish uchun mos emas. Transkriptomik va proteomik namunalar biologik takrorlar boʻyicha alohida tahlil qilinish oʻrniga pooling orqali bitta namunaga aylantirilgan. GO/yoʻl annotatsiyalarida inson referens ma’lumotlar bazalari qoʻllangan. Urugʻlanish, embrion rivojlanishi va tirik hayvonlarning reproduktiv koʻrsatkichlari yangi hujayra liniyasi bilan bevosita sinovdan oʻtkazilmagan.

Verianla bayon qilish tamoyili: Ushbu mazmun manba maqolaning toʻliq matn tarjimasi emas. Hujayra liniyasini ishlab chiqish usuli, harorat va vaqt sharoitlari, biomarker natijalari, DEG/DEP sonlari, multi-omics yondashuvi va metodologik cheklovlar manbaga sodiq holda mustaqil ilmiy-oʻquv tuzilmasida qayta bayon qilingan. Asl mikroskopiya tasvirlari, Western blotlar va omics tarmoqlari uchun manba tadqiqot DOI orqali koʻrib chiqilishi kerak.