Дар ин таҳқиқот барои муайянкунии зуд ва миқдории кислотаи 4-хлорофеноксиасетикӣ (4-CPA) дар об як иммуносанҷиши якхелаи поляризатсияи флуоресенсӣ (FPIA) таҳия карда шуд. Муҳаққиқон антителаи моноклоналии M1-ро бо ду пайгиркунандаи гуногуни флуоресентии 4-CPA муқоиса карданд; бо пайгиркунандаи 4-CPA-EDF, ки пайвандгари кӯтоҳ дошт, дар таҳлили 15-дақиқаӣ ҳадди ошкорсозии 1,2 ng/mL ва диапазони таҳлилии тақрибан 2,3–300 ng/mL ба даст омад. Дар намунаҳои воқеии оби кушода, ки ба онҳо 4-CPA илова шуда буд, мувофиқи Ҷадвали 4 барқароршавӣ дар ҳудуди %98–110 қарор дошт. Маҳдудияти асосии усул реактивияти салибии %48 нисбат ба 2,4-D-и аз ҷиҳати сохтор монанд буд; муҳаққиқон ин масъаларо бо ду роҳ — таҳлили математикии ду-FPIA ва пешакӣ хориҷ кардани 2,4-D бо сутуни аффинӣ — баррасӣ карданд. Ислоҳи ду-FPIA дар омехтаҳои санҷидашуда бо барқароршавии %116–151 аз ҳад зиёд ҳисобкунии равшан ба вуҷуд овард, дар ҳоле ки равиши дорои сутуни аффинӣ дар шароити санҷидашуда барои 4-CPA тақрибан %103,6–110 барқароршавӣ фароҳам овард.

4-CPA ҳосилаи синтетикии кислотаи феноксиасетикӣ мебошад, ки метавонад дар растаниҳо таъсири монанд ба ауксин нишон диҳад. Дар истифодаҳои кишоварзӣ он метавонад ҳамчун танзимкунандаи рушди растанӣ истифода шавад ва дар вояҳои баланд таъсири гербисидӣ низ нишон диҳад. Аз ин рӯ, назорати зуди боқимондаи он дар об ва намунаҳои кишоварзӣ аз ҷиҳати таҳлилӣ аҳамият дорад. Ҳадафи таҳқиқот таҳияи усули универсалии истинодӣ барои иваз кардани усулҳои хроматографие, ки таҷҳизоти сатҳи баланд талаб мекунанд, нест; балки эҷоди як равиши скрининги иммунокимиёвии зуд, якхела ва барои ченкунии сайёр мувофиқ мебошад.

Яке аз навгониҳои муҳими таҳқиқот танҳо сохтани FPIA барои 4-CPA нест, балки ҷустуҷӯи мустақими роҳи ҳалли мушкили шабоҳати сохторӣ мебошад, ки дар иммуносанҷишҳо зуд-зуд дида мешавад. Антителаи M1 4-CPA-ро қавӣ шинохт, вале нисбат ба 2,4-D низ ҷавоби назаррас дод. Баръакс, антителаи ҷудогонаи anti-2,4-D дар шароити санҷиши муҳаққиқон нисбат ба 4-CPA ҷавоби салибии назаррас нишон надод. Ин асимметрия ҳам барои ҷудокунии математикии натиҷаҳои ду санҷиш ва ҳам барои ба таври физикӣ нигоҳ доштану хориҷ кардани 2,4-D аз намуна истифода шуд.

Мушкилоти асосии таҳқиқот чист?

Дар муайянкунии моддаҳои кишоварзии дорои массаи молекулавии паст, ба монанди 4-CPA, мушкили асосии таҳлилӣ танҳо чен кардани консентратсияҳои паст нест. Ҳамзамон бояд молекулаи ҳадаф аз пайвастагиҳои дигаре, ки сохтори кимиёвии хеле монанд доранд, фарқ карда шавад. Хусусан, шабоҳати сохторӣ байни 4-CPA ва гербисиди маъмули феноксии 2,4-D метавонад дар таҳлилҳои ба антитела асосёфта реактивияти салибӣ ба вуҷуд оварад.

Дар таҳқиқот ин мушкилот дар ду марҳила баррасӣ шуд. Ҳадафи аввал сохтани FPIA-и ба қадри кофӣ ҳассос ва зуд барои 4-CPA буд. Ҳадафи дуюм таҳияи стратегияҳои таҳлилӣ буд, ки тавонанд ҷавоби салибии FPIA ба 2,4-D-ро идора кунанд.

Иммуносанҷиши поляризатсияи флуоресенсӣ чӣ гуна кор мекунад?

Иммуносанҷиши поляризатсияи флуоресенсӣ тағйироти ҳаракати гардишии молекулаҳои хурди бо флуоресенсия нишонгузоришударо дар маҳлул чен мекунад. Пайгиркунандаи хурди флуоресентӣ дар ҳолати озод зуд мегардад ва поляризатсияи нури барангехтаро бештар аз даст медиҳад. Вақте ҳамон пайгиркунанда ба антителаи калон мепайвандад, тамоми комплекс сусттар мегардад; аз ин рӯ поляризатсияи флуоресенсияи хориҷшаванда баландтар боқӣ мемонад.

Ҳангоми мавҷуд будани молекулаи хурди ҳадаф, ба мисли 4-CPA, дар намуна, он бо пайгиркунандаи флуоресентии 4-CPA барои ҷойи пайвастшавии антитела рақобат мекунад. Бо зиёд шудани 4-CPA-и озод дар намуна, миқдори пайгиркунандаи флуоресентии ба антитела пайвастшуда кам мешавад ва сигнали поляризатсияи ченшуда паст мегардад. Ҳамин тавр, байни консентратсияи 4-CPA ва поляризатсияи флуоресенсӣ робитаи миқдорие, ки ба калибровка асос ёфтааст, сохта мешавад.

Ҷанбаи муҳими ин равиш барои таҳқиқот он аст, ки он бе ниёз ба марҳилаҳои сершумори шустан ва ҷудокунии иммуносанҷишҳои гетерогении анъанавӣ бо мантиқи «омехта кун, инкубатсия кун ва чен кун» кор карда метавонад.

Чаро пайдоиши антителаи M1 ҷолиб аст?

Дар манбаъ як номувофиқии муҳими библиографӣ/методӣ мавҷуд аст. Дар қисми хулоса антителаи M1 ҳамчун антителае тавсиф мешавад, ки зидди 4-CPA тавлид шудааст. Аммо дар қисми усулҳо ба таври возеҳ гуфта мешавад, ки ҳангоми омода кардани иммуноген 2,4-D истифода шудааст ва дар натиҷаҳо шарҳ дода мешавад, ки M1 ҳангоми скрининги клонҳои гибридома, ки зидди 2,4-D омода шуда буданд, пайдо шудааст.

Мувофиқи қисми натиҷаҳо, хусусияти ғайричашмдошти M1 он аст, ки нисбат ба 2,4-D-и аслан ҳадафшуда барои пайвастшавӣ ба 4-CPA аффинитети баландтар нишон медиҳад. Дар муқоисаи ба ELISA асосёфта, барои M1 қимати IC50 бо 4-CPA 0,71 µg/mL ва бо 2,4-D 2,22 µg/mL гузориш шуд. Барои антителаи ҷудогонаи anti-2,4-D қимати IC50-и 2,4-D 0,70 µg/mL буд, дар ҳоле ки реактивияти салибӣ ба 4-CPA дар ҳудуди ошкорсозии таҷриба мушоҳида нашуд.

Аз ин рӯ, тавсиф кардани M1 ҳамчун «антителаи хеле махсусе, ки аз аввал барои 4-CPA тарҳрезӣ шудааст» бо манбаъ пурра мувофиқ нест. Ифодаи дақиқтар ин аст, ки он клоне мебошад, ки дар таҳқиқоти гибридомаи ба 2,4-D нигаронидашуда пайдо шуда, ба 4-CPA аффинитети ғайричашмдошти баланд нишон додааст.

Чаро ду пайгиркунандаи флуоресентӣ синтез шуданд?

Ҳассосияти FPIA на танҳо ба аффинитети антитела, балки ба сохтори аналоги антигени бо флуоресенсия нишонгузоришуда низ вобаста аст. Аз ин рӯ, муҳаққиқон 4-CPA-ро ба ду ҳосилаи гуногуни флуоресентӣ пайваст карданд:

• 4-CPA-EDF: пайвандгари кӯтоҳтар бо ду гурӯҳи CH2 байни 4-CPA ва сохтори флуоресентӣ.
• 4-CPA-6-AHF: пайвандгари дарозтар бо шаш гурӯҳи CH2.

Гурӯҳи карбоксилии 4-CPA бо химияи карбодиимидии ба DCC/NHS асосёфта фаъол карда шуд ва бо гурӯҳҳои аминӣ дар ҳосилаҳои флуоресентӣ пайванди амидӣ ба вуҷуд оварда шуд. Пайгиркунандаҳо бо хроматографияи қабати тунук тоза карда шуданд. Дар таҳқиқот гузориш шуд, ки ҳосили синтез нисбат ба флуоресенти ибтидоӣ маъмулан тақрибан %30–40 буд.

Чӣ гуна тасдиқ шуд, ки пайгиркунандаҳо воқеан синтез шудаанд?

Танҳо гирифтани сигнали флуоресентӣ барои исботи дурустии сохтор кофӣ дониста нашуд. Муҳаққиқон маҳсулоти 4-CPA-EDF ва 4-CPA-6-AHF-ро бо хроматографияи моеъи баландсамар-спектрометрияи массаи баландҳалкунанда (HPLC-HRMS) таҳлил карданд.

Барои 4-CPA-EDF иони молекулавии депротоншуда [M−H]⁻ дар m/z 616,0942; барои 4-CPA-6-AHF бошад дар m/z 641,1696 чен карда шуд. Хатоҳои массаи гузоришшуда мутаносибан −1,6 ppm ва 0,01 ppm буданд. Тақсимоти изотопии таҷрибавӣ бо формулаҳои молекулавии ҳисобшуда мувофиқ омад.

Дар таҳлили пора-порашавии MS/MS дар ҳар ду пайгиркунанда фрагменти хоси тақрибан m/z 126,994, ки боқимондаи 4-CPA-ро дастгирӣ мекунад, мушоҳида шуд. Мавҷудияти фрагментҳои иловагӣ, ки ядрои флуоресентӣ ва минтақаҳои пайвандгарро намояндагӣ мекунанд, низ хулосаи муҳаққиқонро дастгирӣ кард, ки 4-CPA ба интиқолдиҳандаи флуоресентӣ ба таври ковалентӣ пайваст шудааст.

Консентратсияи пайгиркунанда чӣ гуна оптимизатсия шуд?

Шиддати флуоресенсия ва поляризатсияи ду пайгиркунанда дар консентратсияҳои гуногун чен карда шуд. Дар консентратсияҳои паст таносуби сигнал/садо заиф мешуд, дар ҳоле ки дар ҳудуди тақрибан 1–10 nM шиддати флуоресенсия ба сатҳи истифодашаванда баланд шуда, поляризатсия нисбатан устувор мемонд. Дар консентратсияҳои аз 10 nM боло вайрон шудани рафтори хаттӣ ва тағйири поляризатсия гузориш шуд.

Аз ин рӯ, барои таҳқиқот маҳлули кории 5 nM интихоб шуд; пас аз омехтакунӣ консентратсияи ниҳоии пайгиркунанда дар таҷрибаҳои калибровка тақрибан 2,5 nM гузориш шуд.

Пайвастшавии антитела-пайгиркунанда чӣ нишон дод?

Пайвастшавии антителаи M1 ба ду пайгиркунанда бо антителаи моноклоналии ғайримахсуси M2 муқоиса шуд. Ҳангоми илова кардани M1 аз консентратсияҳои пасти антитела болоравии босуръати фраксияи пайвастшуда ва поляризатсияи флуоресенсӣ мушоҳида шуд, дар ҳоле ки M2 тағйири назарраси сигнал ба вуҷуд наовард.

Барои M1 консентратсияҳои ниҳоие, ки ба тақрибан %50 фраксияи пайвастшуда мувофиқ буданд, бо 4-CPA-EDF 2,2 ± 0,1 nM ва бо 4-CPA-6-AHF 3,2 ± 0,3 nM муайян шуданд.

Кадом пайгиркунанда иҷрои беҳтари таҳлилӣ дод?

Ҳангоми муқоисаи мустақими иҷрои таҳлилии ду пайгиркунанда дар муайянкунии 4-CPA, 4-CPA-EDF бо пайвандгари кӯтоҳ ҳадди пасттари ошкорсозӣ дод.

Ин натиҷа нишон медиҳад, ки байни дарозии пайвандгар ва ҳассосият робитаи оддии «пайвандгари дарозтар беҳтар аст» вуҷуд надорад. Муҳаққиқон фарқро бо якчанд омил, аз ҷумла ҳаракатпазирии маҳаллии флуорофор, дастрасӣ ба антитела, таъсирҳои стерикӣ ва дараҷаи маҳдуд шудани ҳаракати гардишӣ пас аз пайвастшавӣ муҳокима мекунанд.

Мувофиқи маълумоти худи манбаъ, ҳассостарин комбинатсия 4-CPA-EDF/M1 буд. Бо вуҷуди ин, номуайянӣ дар қимати LOD-и 1,2 ± 1,2 ng/mL, ки ба андозаи қимати марказӣ калон аст, бояд ҳангоми тафсири иҷрои таҳлилӣ низ ба назар гирифта шавад.

Чаро таҳлил 15 дақиқа тӯл мекашад?

Ҳангоми омӯхтани кинетикаи пайвастшавии антитела ва пайгиркунандаи флуоресентӣ гузориш шуд, ки мувозинат тақрибан дар 15 дақиқа ба даст меояд ва баъдан сигнали поляризатсияи флуоресенсӣ тақрибан 60 дақиқа нигоҳ дошта мешавад. Аз ин рӯ, вақти ченкунии рутинӣ 15 дақиқа интихоб шуд.

Дар ченкуниҳо флуориметри сайёри Sentry 200 истифода шуд. Дар таҳқиқот дарозии мавҷи барангезиш 485 nm ва дарозии мавҷи эмиссия 535 nm дода шудааст. Таҷрибаҳо дар 25 °C ва буфери боратии pH 8,5 гузаронида шуданд.

Иҷрои асосии бадастомада барои 4-CPA чӣ буд?

Барои FPIA, ки бо комбинатсияи 4-CPA-EDF/M1 таҳия шудааст, ҳадди ошкорсозии гузоришшуда 1,2 ng/mL, диапазони муайянкунӣ бар асоси IC20–IC80 тақрибан 2,3–300 ng/mL ва вақти ченкунӣ 15 дақиқа мебошад. Барои намоиши хаттии нимлогарифмии графики калибровка таҳқиқот Y = (0,91 ± 0,02) − (0,24 ± 0,01) × X ва R² = 0,98-ро гузориш мекунад.

Мушкилоти асосии интихобият: 2,4-D

Интихобияти FPIA нисбат ба пайвастагиҳои феноксии аз ҷиҳати сохтор монанд, инчунин глифосат, атразин ва хлорпирифос санҷида шуд. Вақте 4-CPA ҳамчун референси %100 қабул шуд, барои 2,4-D реактивияти салибии %48 ёфт шуд. Барои 2,4,5-T %25, барои MCPA %6 ва барои 3,4-D %0,2 гузориш шуд. Барои глифосат, атразин ва хлорпирифос реактивияти салибӣ аз %0,1 поён монд.

Ин маълумот як нуктаи муҳимро барои усул нишон медиҳад: гарчанде FPIA 4-CPA-ро бо ҳассосият муайян мекунад, агар 2,4-D дар намуна мавҷуд бошад, наметавон фарз кард, ки сигнали ченшуда танҳо аз 4-CPA сарчашма мегирад.

Таҷрибаи матритсаи воқеии об чӣ нишон дод?

Муҳаққиқон ба намунаҳои оби кушода, ки аз нигоҳи кислотаҳои хлорофеноксиасетикӣ пешакӣ бо HPLC санҷида шуда буданд, миқдори маълум 4-CPA илова карда, санҷиши recovery гузарониданд. Дар ҷадвали натиҷаҳо чор консентратсия гузориш шуд:

Мувофиқи ҷадвал, диапазони барқароршавии мушоҳидашуда дар матритсаи воқеии оби кушода %98–110 мебошад. Азбаски дар қисмҳои хулоса ва натиҷа ибораи %98–112 истифода шудааст, дар манбаъ номувофиқии хурди рақамӣ вуҷуд дорад; дар матни Verianla қиматҳои мустақими ҷадвали таҷрибавӣ асос гирифта шудаанд.

Ҳалли аввал барои дахолати 2,4-D: истифодаи ду FPIA якҷоя

Дар ҳалли аввал ҳамон намуна ҳам бо FPIA-и 4-CPA ва ҳам бо FPIA-и қаблан таҳияшудаи 2,4-D чен карда шуд. Мантиқ ба фарзияе асос ёфт, ки системаи 4-CPA ба 2,4-D %48 ҷавоб медиҳад, дар ҳоле ки системаи 2,4-D-и истифодашуда амалан ба 4-CPA ҷавоби салибӣ намедиҳад.

Дар манбаъ ин робита бо системаи зерини муодилаҳо ифода шудааст:

\[ C_1 = X \times A + Y \times 0.48 \times A \]

\[ C_2 = X \times 0 \times B + Y \times B \]

Дар ин ҷо X консентратсияи воқеии 4-CPA, Y консентратсияи воқеии 2,4-D, A ҷавоби системаи санҷиши 4-CPA ба як воҳиди 4-CPA, B ҷавоби системаи санҷиши 2,4-D ба як воҳиди 2,4-D, C1 ҷавоби умумии ченшуда бо системаи 4-CPA ва C2 ҷавоби умумии ченшуда бо системаи 2,4-D-ро ифода мекунад.

Пас аз нормализатсия, таҳқиқот робитаро чунин содда мекунад:

\[ D_1 = X + 0.48Y \]

\[ D_2 \approx Y \]

дар шакли боло содда мекунад.

Аммо натиҷаҳои таҷрибавӣ нишон медиҳанд, ки равиши математикӣ дар омехтаҳои санҷидашуда тамоюли мусбати назаррас ба вуҷуд овард:

Аз ин рӯ, гарчанде нишон дода шудааст, ки равиши ду-FPIA аз ҷиҳати консептуалӣ метавонад ду аналитро ҷудо кунад, натиҷаҳои Ҷадвали 5 нишон медиҳанд, ки махсусан дар консентратсияҳои баландтар 4-CPA ба таври назаррас аз ҳад зиёд ҳисоб шудааст. Арзёбии «муайянкунии дуруст» дар матни манбаъ бояд бо дарназардошти ин рақамҳо бо эҳтиёт хонда шавад.

Ҳалли дуюм: хориҷ кардани 2,4-D ба таври физикӣ пеш аз ченкунӣ

Дар стратегия дуюм, муҳаққиқон антителаҳои махсуси 2,4-D-ро дар Sepharose 4B-и бо BrCN фаъолшуда иммобилизатсия карда, сутуни аффинӣ сохтанд. Ҳангоми гузаронидани намуна аз ин сутун ҳадаф он буд, ки 2,4-D дар сутун нигоҳ дошта шавад ва 4-CPA барои FPIA-и минбаъда дар маҳлул бимонад.

Пас аз гузаронидани намунаҳое, ки танҳо 2,4-D доштанд, аз сутун, дар сигнали FPIA-и 4-CPA фарқи равшане, ки ба дахолати 2,4-D ишора кунад, дида нашуд. Муҳаққиқон инро бо адсорбсияи 2,4-D дар сутун дар шароити санҷидашуда шарҳ доданд.

Сипас намунаҳое, ки ҳам 2,4-D ва ҳам 4-CPA доштанд, санҷида шуданд. Пас аз сутун ва тунуккунии намуна, дар Ҷадвали 6 дар ҳузури 30 ng/mL 2,4-D натиҷаҳои зерин дода шуданд:

Дар ин силсилаи таҷрибаҳо равиши сутуни аффинӣ нисбат ба ислоҳи математикии ду-FPIA қиматҳои мутавозинтари барқароршавӣ дод. Аммо ин натиҷа ба шароити мушаххаси лабораторӣ, сутуни антителаи истифодашуда ва консентратсияҳои санҷидашуда дахл дорад; нишон дода нашудааст, ки ҳамон иҷро дар матритсаҳои гуногуни об ё профилҳои васеътари интерферентҳо худкор нигоҳ дошта мешавад.

Ҷиҳатҳои қавии таҳқиқот кадомҳоянд?

• FPIA-и нав танҳо бо калибровка маҳдуд нашудааст; сохтори пайгиркунандаҳои флуоресентӣ бо HPLC-HRMS ва MS/MS тасдиқ шудааст.
• Ду дарозии гуногуни пайвандгар ба таври таҷрибавӣ муқоиса шудаанд.
• Таъсири мутақобилаи антитела-пайгиркунанда, кинетика ва консентратсияҳои корӣ бо таҷрибаҳои ҷудогона оптимизатсия шудаанд.
• Интихобият на танҳо бо аналити ҳадаф, балки бо чанд аналоги сохторӣ ва пестисидҳои ғайримарбут санҷида шудааст.
• Дар матритсаи воқеии оби кушода санҷиши spike/recovery гузаронида шудааст.
• Реактивияти муҳими салибии 2,4-D пинҳон карда нашудааст; ду роҳи гуногуни ҳалли он таҷрибавӣ санҷида шудаанд.

Маҳдудиятҳои таҳқиқот кадомҳоянд?

• FPIA-и асосии 4-CPA нисбат ба 2,4-D реактивияти салибии %48 дорад; агар дар намуна 2,4-D бошад, ченкунии мустақимро ҳамчун муайянкунии махсуси 4-CPA қабул кардан мумкин нест.
• Барқароршавии %116–151, ки дар равиши математикии ду-FPIA гузориш шудааст, ба тамоюли мусбати назаррас ишора мекунад.
• Гарчанде ҳалли сутуни аффинӣ умедбахш аст, он дар шумораи маҳдуди консентратсияҳо ва танҳо дар як контексти таҷрибавии об нишон дода шудааст.
• Таҳқиқот маҷмӯи калони валидацияро аз намудҳои гуногуни оби табиӣ, матритсаҳои ғизоӣ ё намунаҳои воқеии саҳроӣ аз минтақаҳои васеи ҷуғрофӣ пешниҳод намекунад.
• Қимати 1,2 ± 1,2 ng/mL, ки барои LOD гузориш шудааст, номуайянии нисбии баланд дорад.
• Гузориши таҷрибаҳо дар баъзе ҷойҳои қисми усулҳо ҳамчун ду такрор ва дар шаклу ҷадвалҳо ҳамчун n = 3 масъалаи равшаниро дар сохтори такрорҳо ба вуҷуд меорад.
• Дар манбаъ вобаста ба пайдоиши антитела, баъзе рақамҳои ҷадвал/муодила, диапазонҳои recovery ва манбаъҳои муқоисаи усулҳо номувофиқиҳои таҳрирӣ мавҷуданд.

Ин натиҷа барои Туркия чӣ маъно дорад?

Таҳқиқот мониторинги экологие нест, ки дар обҳои рӯизаминии Туркия гузаронида шуда бошад ва дар бораи басомади истифодаи 4-CPA, консентратсияҳои обӣ ё ҳадҳои меъёрии хоси Туркия маълумот намедиҳад. Аз ин рӯ, иҷрои таҳлилии бадастомадаро мустақиман ба намунаҳои воқеии саҳроии Туркия умумӣ кардан мумкин нест.

Бо вуҷуди ин, равиши FPIA-и зуд, сайёр ва дорои қадамҳои кам метавонад барои скрининги пешакии экологӣ омӯхта шавад, ба шарте ки он бо матритсаҳои обии маҳаллӣ, профили ҳамзамони пестисидҳо ва усулҳои истинодии зарурӣ алоҳида валидация карда шавад. Хусусан дар ҳолате, ки аналогҳои сохтории монанд ба 2,4-D метавонанд дар ҳамон намуна мавҷуд бошанд, ҳалли интихобият бояд дар маркази валидация қарор гирад.

Таҳқиқот чиро дастгирӣ мекунад?

• Бо комбинатсияи 4-CPA-EDF ва M1 барои 4-CPA сигнали зуди FPIA тавлид кардан мумкин аст.
• Дар шароити таҷрибавии таҳқиқот LOD бо қимати марказии 1,2 ng/mL ва диапазони муайянкунии тақрибан 2,3–300 ng/mL ба даст омадааст.
• Дар намунаҳои оби кушода, ки 4-CPA илова шудааст, мувофиқи Ҷадвали 4 барқароршавии %98–110 ба даст омадааст.
• 2,4-D барои FPIA-и 4-CPA интерференти муҳим аст.
• Пешакӣ хориҷ кардани 2,4-D бо сутуни аффинии anti-2,4-D метавонад ченкунии 4-CPA-ро дар омехтаҳои санҷидашуда беҳтар кунад.

Таҳқиқот чиро исбот намекунад?

• Он исбот намекунад, ки FPIA ба таври универсалӣ аз ҳамаи усулҳои хроматографӣ ё иммунокимиёвӣ беҳтар аст.
• Он нишон намедиҳад, ки усул дар ҳамаи матритсаҳои оби табиӣ, ғизо ё маҳсулоти кишоварзӣ ҳамон дақиқиро таъмин мекунад.
• Он нишон намедиҳад, ки ислоҳи математикии ду-FPIA бо дақиқии баланд кор мекунад; натиҷаҳои recovery-и пешниҳодшуда аз ҳад зиёд ҳисобкунии равшан доранд.
• Он нишон намедиҳад, ки сутуни аффинӣ ҳамаи интерферентҳои эҳтимолиро дар намунаҳои воқеии экологӣ хориҷ мекунад.
• Он танҳо вақти таҳлили 15 дақиқаро ҳамчун валидацияи саҳроии кофӣ барои иваз кардани усули рутинӣ ва меъёрии истинодӣ нишон намедиҳад.

Усул ва Натиҷаҳои Таҳқиқот

Истеҳсоли антителаи моноклоналӣ

Дар қисми усулҳои манбаъ гузориш шудааст, ки ҳангоми омода кардани иммуноген 2,4-D бо BSA ва антигени пӯшишӣ бо OVA тавассути химияи EDC/NHS конъюгатсия шудаанд. Мушҳои BALB/c бо як иммунизатсияи аввалия ва чор иммунизатсияи тақвиятӣ иммунизатсия шуданд. Пас аз интихоби ҳайвоне, ки баландтарин титри антителаи хуноба ва дараҷаи ингибитсияро дошт, спленоцитҳо бо ҳуҷайраҳои миеломаи SP2/0 тавассути fusion бо миёнаравии PEG пайваст карда шуданд. Антителаи моноклоналии M1 бо технологияи классикии hybridoma ба даст оварда шуд ва тозакунии аффинии Protein G истифода гардид.

Ин ҷузъиёти методӣ бо ибораи «M1, ки зидди 4-CPA тавлид шудааст» дар хулоса пурра мувофиқ нест. Қисми натиҷаҳо шарҳ медиҳад, ки M1 аз скрининги hybridoma-и ба 2,4-D нигаронидашуда пайдо шуда, ба 4-CPA аффинитети ғайричашмдошти баланд нишон додааст.

Омода кардани пайгиркунандаҳои флуоресентӣ

Гурӯҳи карбоксилии 4-CPA бо DCC ва NHS фаъол карда шуд. Пас аз фаъолсозӣ ба ду қисми омехтаи реаксия мутаносибан EDF ва 6-AHF илова шуданд. Маҳсулот бо истифода аз TLC бо mobile phase-и CHCl3:CH3OH 4:1 ҷудо ва бо метанол элюсия карда шуданд.

4-CPA-EDF пайвандгари кӯтоҳ бо ду гурӯҳи CH2 дошт, дар ҳоле ки 4-CPA-6-AHF пайвандгари дарозтар бо шаш гурӯҳи CH2 дошт.

Шароити HPLC-HRMS

Барои тасдиқи сохтор хроматографи моеъи Dionex Ultimate 3000 ва спектрометри массаи гибридии баландҳалкунандаи Q Exactive истифода шуданд. Сутуни таҳлилӣ HypersilGold aQ, 2,1 × 100 mm ва 3 µm гузориш шуд. Суръати ҷараён 0,50 mL/дақиқа, ҳарорати сутун 40 °C ва ҳаҷми тазриқ 1 µL буд.

Mobile phase A аз %5 acetonitrile/об бо %0,1 formic acid; mobile phase B аз %0,1 formic acid дар acetonitrile иборат буд. Маълумоти MS дар режимҳои 100–1000 m/z Full MS ва 90–900 m/z AIF бо ионизатсияи мусбат ва манфӣ ҷамъоварӣ шуд; ионизатсияи манфӣ барои тафсири сохторӣ иттилоотноктар дониста шуд.

Шароити ченкунии FPIA

Модели калибровкаи чорпараметрӣ

Робитаи байни поляризатсияи флуоресенсӣ ва консентратсияи аналит дар манбаъ бо функсияи логистикии чорпараметрӣ модел шудааст:

\[ Y = B + \frac{A-B}{1+\left(\frac{x}{C}\right)^D} \]

Дар ин ҷо x консентратсияи аналит, Y қимати ченшудаи поляризатсияи флуоресенсӣ, A қимати болоии асимптотикии FP, B қимати поёнии асимптотикӣ ё фонӣ, C нуқтаи гардиши каҷи нимлогарифмӣ ва консентратсияи мувофиқ ба ингибитсияи %50, ва D нишебии каҷро дар нуқтаи гардиш муайян мекунад.

Ҳисоби реактивияти салибӣ

Реактивияти салибӣ дар манбаъ бо робитаи зерин ҳисоб шудааст:

\[ CR = \frac{IC50_{4-CPA}}{IC50_{cr}}\times100\% \]

IC50_4-CPA консентратсияи 4-CPA мебошад, ки пайвастшавии антитела-пайгиркунандаро %50 ингибитсия мекунад; IC50_cr консентратсияи пайвастагии салиб-реактивии санҷидашаванда мебошад, ки ҳамон сатҳи ингибитсияро ба вуҷуд меорад. Қимати баланди CR нишон медиҳад, ки пайвастагии ғайриҳадаф ба санҷиш бештар дахолат мекунад.

Ҳисоби барқароршавӣ

Дар валидацияи spike/recovery:

\[ Recovery(\%)=\frac{C_{found}}{C_{added}}\times100\% \]

истифода шудааст. C_found консентратсияи бо FPIA ёфтшуда ва C_added консентратсияи 4-CPA мебошад, ки ба намуна бо миқдори маълум илова шудааст.

Ҳисоби фраксияи пайвастшуда

Ҳангоми оптимизатсияи антитела фраксияи пайвастшудаи пайгиркунандаи флуоресентӣ бо:

\[ F_b=\frac{mP-mP_{free}}{mP_{max}-mP_{free}} \]

ҳисоб шудааст. Дар ин ҷо mP поляризатсияи ченшуда, mP_free поляризатсияи пайгиркунандаи озод ва mP_max поляризатсия ҳангоми пайвастшавии максималии антитела-пайгиркунанда мебошад.

Хулосаи натиҷаҳои асосии миқдорӣ

Ёддошт оид ба Манбаъ ва Усул

Номи пурраи аслии таҳқиқот: Fluorescence Polarization Immunoassay with Modulated Selectivity for Effective Detection of the Agrochemical 4-Chlorophenoxyacetic Acid

Муаллифон: Marya K. Kolokolova; Liliya I. Mukhametova; Boris S. Tupertsev; Anatoly V. Zherdev; Xinxin Xu; Chuanlai Xu; Sergei A. Eremin.

Тартиби муаллифон: Дар манбаъ бо тартиби боло оварда шудаанд. Изҳороти равшани муаллифи якуми баробар/саҳми баробар муайян нашудааст.

Муаллифи масъул: Sergei A. Eremin.

Муассисаҳо: Faculty of Chemistry, M. V. Lomonosov Moscow State University, Москва, Русия; A. N. Bach Institute of Biochemistry, Research Center of Biotechnology of the Russian Academy of Sciences, Москва, Русия; N. N. Semenov Federal Research Center for Chemical Physics, Russian Academy of Sciences, Москва, Русия; State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi, Чин.

Навъи манбаъ: Мақолаи аслии таҳқиқотии аз баррасии ҳамтоён гузашта (Article).

Маҷалла: Biosensors.

Ношир: MDPI, Basel, Switzerland.

Ҷилд / шумора / рақами мақола: 16 / 6 / 343.

DOI: 10.3390/bios16060343.

Пайванди расмӣ:https://doi.org/10.3390/bios16060343

Санаҳо: Қабул шуд 29 апрели 2026; бозбинӣ шуд 8 июни 2026; пазируфта шуд 13 июни 2026; нашр шуд 18 июни 2026.

Вазъи баррасии ҳамтоён: Мувофиқи маълумоти расмии ношир, таҳқиқот мақолаи таҳқиқотии дар маҷаллаи аз баррасии ҳамтоён гузарандаи Biosensors нашршуда мебошад.

Иҷозатнома: Creative Commons Attribution (CC BY); дастрасии кушода.

Маблағгузорӣ: Russian Science Foundation, грант 24-43-00196.

Кумитаи ахлоқ: Гузориш шудааст, ки таҷрибаҳои ҳайвонот мувофиқи қоидаҳои ҳайвоноти лабораторӣ дар Чин гузаронида шуда, аз ҷониби Jiangnan University Animal Ethics Committee тасдиқ шудаанд.

Ризоияти огоҳона: Татбиқ намешавад.

Дастрасии маълумот: Гуфта шудааст, ки маълумотро метавон аз муаллифон бо дархост гирифт.

Бархӯрди манфиатҳо: Муаллифон изҳор кардаанд, ки бархӯрди манфиатҳо вуҷуд надорад.

Саҳми муаллифон: Консептуализатсия A.V.Z. ва S.A.E.; методология L.I.M.; валидация M.K.K., B.S.T. ва L.I.M.; таҳлили формалӣ B.S.T.; таҳқиқот M.K.K., B.S.T., C.X., X.X. ва L.I.M.; куратсияи маълумот M.K.K. ва A.V.Z.; тарҳи аввал L.I.M. ва M.K.K.; баррасӣ/таҳрир A.V.Z. ва S.A.E.; визуализатсия C.X.; роҳбарӣ A.V.Z. ва S.A.E.; идоракунии лоиҳа A.V.Z. ва C.X.; дарёфти маблағгузорӣ S.A.E.

Номувофиқиҳои дохили манбаъ

Пайдоиши антителаи M1: Хулоса M1-ро ҳамчун антителаи зидди 4-CPA тавлидшуда тавсиф мекунад, дар ҳоле ки қисмҳои усул ва натиҷаҳо мегӯянд, ки M1 аз таҳқиқоти гибридомаи ба 2,4-D нигаронидашуда пайдо шуда, ба 4-CPA аффинитети ғайричашмдошти баланд нишон додааст. Мақолаи Verianla шарҳи усул/натиҷаро асос гирифта, ин зиддиятро намоён нигоҳ доштааст.

Диапазони recovery: Гарчанде дар хулоса ва қисми натиҷа ибораи %98–112 вуҷуд дорад, Ҷадвали таҷрибавии 4 чор қимати %98, %102, %103 ва %110 дорад. Дар матни асосии илмӣ диапазони %98–110 аз Ҷадвали 4 истифода шудааст.

Recovery-и ду-FPIA: Ҷадвали 5 қиматҳои %116, %138 ва %151-ро медиҳад, дар ҳоле ки матни баъдӣ диапазонро %99–151 ифода мекунад. Дар матни Verianla қиматҳои воқеии ҷадвал асос гирифта шудаанд.

Шумора/консентратсияи намунаҳо: Дар қисми усулҳо гуфта мешавад, ки намунаҳои оби кушода дар сатҳҳои 2,5; 5; 10; 50; 200 ва 500 ng/mL spike шудаанд, аммо дар қисми натиҷаҳо ибораи «ҳафт» намуна истифода мешавад ва Ҷадвали 4 танҳо сатҳҳои 5, 10, 50 ва 200 ng/mL-ро гузориш мекунад. Барои сатҳҳои гумшуда маълумот сохта нашудааст.

Истинодҳои салибии муодила ва ҷадвал: Дар баъзе ҷойҳои матн ба реактивияти салибӣ ё муодилаҳои ду-аналит бо рақамҳои қаблӣ истинод шудааст. Муодилаҳо дар ин мақола аз рӯйи мазмуни математикиашон оварда шудаанд ва хатои рақамгузории манбаъ хомӯшона ба тағйири маълумоти илмӣ табдил дода нашудааст.

Қисми ихтисорот: Номи пурраи 2,4-D дар рӯйхати ихтисорот ба шакле навишта шудааст, ки бо номи “2,4-dichlorophenoxyacetic acid” дар матни асосӣ мувофиқ нест. Ба ҳамин монанд, дар номгузории 2,4,5-T низ бо матни асосӣ фарқи истилоҳӣ мавҷуд аст.

Ҷадвали муқоисавии усулҳо: Баъзе мувофиқатҳои усул–истинод дар Ҷадвали 7-и манбаъ бо библиография пурра мувофиқ нестанд. Илова бар ин, гарчанде дар муқаддимаи мақола баъзе мисолҳои хроматографӣ бо LOD-и хеле пасттар зикр мешаванд, дар қисми натиҷаҳо арзёбии васеътаре оварда шудааст, ки FPIA аз бисёр усулҳои асбобӣ беҳтар аст. Аз ин рӯ, мақолаи Verianla хулосаи «FPIA аз ҳамаи усулҳои асбобӣ беҳтар аст»-ро қабул намекунад.

Ҳудуди илмӣ: Таҳқиқот таҳияи FPIA-и зуд барои 4-CPA ва тасдиқи онро дар баъзе намунаҳои об дастгирӣ мекунад. Аммо валидацияи саҳроии васеъмиқёс дар шабакаҳои воқеии мониторинги муҳити зист, такроршавандагии бисёрмарказӣ ё иҷрои универсалӣ дар матритсаҳои гуногуни об/ғизо нишон дода нашудааст.

Ёддошти манбаи Verianla: Мазмуни илмӣ бо баррасии қисмҳои усул, формула, ҷадвал, график, спектрҳои HPLC-HRMS/MS, маълумоти калибровка, санҷишҳои recovery, таҷрибаҳои реактивияти салибӣ, таҳқиқоти сутуни аффинӣ, натиҷа, маблағгузорӣ, ахлоқ, дастрасии маълумот ва саҳми муаллифон дар таҳқиқоти 22-саҳифаи боршуда омода шудааст. Манбаъҳои беруна танҳо барои тасдиқи ҳувияти библиографӣ ва вазъи нашр истифода шудаанд; ба баёни асосии илмӣ аз берун натиҷаи нави таҷрибавӣ илова нашудааст.