Aspirin, digoksin, amiodaron ve furosemid; trombosit işlevi, kalbin kasılma gücü, kalp ritmi ve vücuttaki sıvı yükü gibi birbirinden farklı kardiyovasküler süreçlerde kullanılan dört etkin maddedir. Kimyasal yapıları ve kromatografik davranışları birbirinden önemli ölçüde farklı olan bu moleküllerin tek bir analiz koşulunda birbirlerinden ayrılarak ölçülmesi, analitik yöntem geliştirme açısından kolay bir görev değildir.

P. Sankar ve çalışma arkadaşları, söz konusu dört etkin maddenin tek bir kromatografik çalışmada eş zamanlı olarak belirlenmesi için izokratik ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi, yani RP-HPLC yöntemi geliştirmiştir. Araştırmacılar, yöntemin yalnızca ilaçların ölçülmesini değil; asidik, bazik, oksidatif, termal ve fotolitik stres altında oluşan bozunma ürünlerinden ayrılmalarını da sağlamasını amaçlamıştır.

Ayırma, koruyucu kolonla birlikte kullanılan 250 × 4,6 mm boyutlarında ve 5 µm parçacık büyüklüğünde ACE C18 kolon üzerinde gerçekleştirilmiştir. Mobil faz bileşenleri olarak asetonitril, metanol ve yüzde 0,05 trifluoroasetik asit kullanılmıştır. Akış hızı 1,0 mL/dakika, enjeksiyon hacmi 20 µL, UV algılama dalga boyu 234 nm ve toplam analiz süresi 20 dakika olarak bildirilmiştir.

Geliştirilen koşullarda digoksin 3,918 dakikada, aspirin 4,482 dakikada, furosemid 4,852 dakikada ve amiodaron 14,282 dakikada elüe olmuştur. Böylece üç etkin madde kromatogramın ilk yaklaşık beş dakikalık bölümünde, amiodaron ise belirgin biçimde daha geç bir bölgede saptanmıştır.

Çalışmada 25–75 µg/mL aralığında doğrusal yanıt elde edildiği bildirilmiştir. Belirleme katsayıları digoksin için 1,0000, aspirin ve amiodaron için 0,9999, furosemid için 0,9993 olarak verilmiştir. Bu değerler, incelenen konsantrasyon aralığında pik alanı ile analit konsantrasyonu arasında güçlü bir doğrusal ilişki bulunduğunu göstermektedir.

Doğruluk çalışmalarında yüzde 80, 100 ve 120 ekleme düzeyleri kullanılmıştır. Tabloda bildirilen ortalama geri kazanımlar aspirin için yüzde 100,59–100,99, digoksin için yüzde 100,24–101,27, amiodaron için yüzde 100,57–101,15 ve furosemid için yüzde 100,22–101,34 aralığındadır. İlgili göreli standart sapma değerlerinin tamamı yüzde 2’nin altında kalmıştır.

Gün içi ve günler arası kesinlik çalışmalarında da yüzde RSD değerleri yüzde 2’nin altında bulunmuştur. Yöntemin kolon sıcaklığındaki ve algılama dalga boyundaki küçük değişikliklere karşı dayanıklılığının değerlendirildiği sağlamlık deneylerinde RSD değerleri yüzde 0,10–0,91, ölçüm sonuçları ise yaklaşık yüzde 98,00–101,75 aralığında kalmıştır.

Zorlanmış bozunma deneylerinin en belirgin sonucu bazik koşullarda görülmüştür. 0,1 M NaOH uygulamasından sonra bildirilen kalan miktarlar aspirin için yüzde 85,74, digoksin için yüzde 80,36, amiodaron için yüzde 95,82 ve furosemid için yüzde 90,53’tür. Bu sonuçlar içinde bazik stres altında en büyük kayıp digoksinde, ardından aspirinde görülmüştür.

Asit, oksidasyon, ısı, ortam koşulları ve UV ışığı altında bildirilen kayıplar bazik koşula göre daha sınırlı kalmıştır. Standart ve örnek çözeltilerinin 24 saatlik analizinde başlangıca göre değişim aspirin için yüzde 1,10, digoksin için yüzde 0,84, amiodaron için yüzde 0,37 ve furosemid için yüzde 0,80 olarak bildirilmiştir.

Çalışma, yöntemin dört etkin maddeyi aynı analizde ayırabildiğini ve temel validasyon parametrelerinde düşük değişkenlik gösterdiğini savunmaktadır. Bununla birlikte mobil faz bileşenlerinin hangi hacimsel oranlarda karıştırıldığı açıkça belirtilmemiştir. Kolon sıcaklığı yöntem bölümünde 40°C, koşullar tablosunda ise “ortam sıcaklığı” olarak verilmiştir. Kalibrasyon düzeyi ve tekrar sayıları konusunda da metnin farklı bölümleri arasında tutarsızlıklar bulunmaktadır.

Ayrıca bozunma ürünlerinin ayrı pikler olarak ayrıldığı belirtilmesine rağmen çözünürlük katsayıları, zorlanmış bozunma kromatogramları, sayısal pik saflığı sonuçları ve bozunma ürünlerinin kimlikleri sunulmamıştır. Bu nedenle yöntem umut verici bir analitik yaklaşım ortaya koysa da laboratuvarlar arası doğrudan uygulanmadan önce eksik deney ayrıntılarının açıklığa kavuşturulması ve bağımsız doğrulama yapılması gerekir.

Çalışmanın çözmeye çalıştığı analitik problem

Farmasötik kalite kontrolünde bir etkin maddenin yalnızca mevcut olduğunun gösterilmesi yeterli değildir. Etkin maddenin doğru miktarda bulunması, başka bileşenlerle karışmadan ölçülebilmesi ve zaman içinde oluşabilecek bozunma ürünlerinden ayrılabilmesi gerekir.

Bu gereklilik, aynı formülasyon veya analiz programında birden fazla etkin madde bulunduğunda daha karmaşık hâle gelir. Her molekül:

• Farklı polariteye,
• Farklı moleküler büyüklüğe,
• Farklı asit-baz davranışına,
• Farklı çözünürlüğe,
• Kolon yüzeyiyle farklı etkileşim gücüne sahip olabilir.

Bu nedenle bir molekülü iyi ayıran mobil faz koşulu başka bir molekülün çok erken çıkmasına, piklerinin üst üste binmesine veya aşırı uzun süre kolonda tutulmasına neden olabilir.

Çalışmanın temel problemi, aspirin, digoksin, amiodaron ve furosemidin tek bir izokratik RP-HPLC çalışmasında ölçülmesini sağlayacak ortak koşulun belirlenmesidir.

Dört etkin madde neden aynı yöntem içinde ele alındı?

Çalışmanın girişinde bu ilaçların kardiyovasküler hastalıklarda farklı amaçlarla kullanılabildiği belirtilmektedir:

• Aspirin: Siklooksijenazı geri dönüşümsüz olarak baskılayan ve trombosit karşıtı amaçla kullanılan asetilsalisilik asit.
• Digoksin: Na⁺/K⁺-ATPazı baskılayarak miyokard kasılma gücünü etkileyen kardiyak glikozit.
• Amiodaron: Geniş etkili sınıf III antiaritmik ilaç.
• Furosemid: Kalp yetersizliği ve hipertansiyonla ilişkili sıvı tutulmasında kullanılan güçlü kıvrım diüretiği.

Şekil 1’de dört molekülün kimyasal yapıları birlikte gösterilmektedir. Aspirin görece küçük aromatik bir yapı taşırken digoksin büyük steroidal çekirdek ve şeker birimleri içermektedir. Amiodaron iyot içeren geniş aromatik yapısıyla, furosemid ise klor, sülfonamid ve karboksilik asit işlevleriyle ayrılmaktadır.

Çalışma bu moleküler farklılıkları nicel bir yapı-kromatografi modeliyle analiz etmemiştir. Bununla birlikte yapıların çeşitliliği, dört bileşiğin ortak bir kolon ve mobil faz koşulunda ayrılmasının neden yöntem optimizasyonu gerektirdiğini görsel olarak ortaya koymaktadır.

Literatürdeki boşluk nasıl tanımlandı?

Araştırmacılar aspirinin klopidogrel, rosuvastatin, prasugrel veya başka etkin maddelerle; furosemidin başka diüretiklerle eş zamanlı analizi için çeşitli HPLC yöntemleri bulunduğunu belirtmiştir. Digoksin ve amiodaron için de plazma, farmasötik formülasyon ve çözünme örneklerinde HPLC veya LC-MS/MS yöntemleri bildirilmiştir.

Buna karşılık dört ilacın tamamını tek bir RP-HPLC analizinde birlikte belirlemeyi amaçlayan doğrulanmış bir yöntem bulunmadığı ileri sürülmüştür. Araştırmanın özgünlük iddiası bu noktaya dayanmaktadır.

Geliştirilen yöntemle laboratuvarın:

• Dört ayrı analiz yerine tek çalışma yapması,
• Analiz süresini azaltması,
• Çözücü kullanımını düşürmesi,
• Çok bileşenli örneklerin kalite kontrolünü kolaylaştırması amaçlanmıştır.

Ancak çalışmada gerçek bir laboratuvar maliyet karşılaştırması veya yöntem başına çözücü tüketim hesabı sunulmamıştır. Maliyet ve verimlilik avantajları, yöntemin tek analizde dört bileşeni ölçebilmesine dayanan uygulama çıkarımlarıdır.

RP-HPLC ne anlama geliyor?

Yüksek performanslı sıvı kromatografisinde örnek sıvı bir mobil faz yardımıyla ince parçacıklarla doldurulmuş kolondan geçirilir. Örnekteki moleküller, kolonun sabit fazı ile mobil faz arasında farklı ölçüde dağıldıkları için kolondan farklı zamanlarda çıkar.

Ters fazlı HPLC’de kolon yüzeyi görece hidrofobik, mobil faz ise su ve organik çözücü bileşenlerinden oluşur. Molekül kolon yüzeyiyle ne kadar güçlü etkileşirse kolonda o kadar uzun süre kalabilir. Bununla birlikte alıkonma süresi yalnızca hidrofobikliğe bağlı değildir; iyonlaşma durumu, mobil faz bileşimi, sıcaklık ve moleküler yapı da sonucu etkileyebilir.

Çalışmada C18 bağlı faz taşıyan ACE kolon kullanılmıştır. C18 ifadesi, silika yüzeyine uzun karbon zincirlerinin bağlandığı ters fazlı kolon yapısını belirtir.

İzokratik elüsyon ne demektir?

İzokratik yöntemde mobil fazın bileşimi analiz boyunca sabit tutulur. Gradyan yöntemde ise organik çözücü veya başka mobil faz bileşenlerinin oranı zamanla değiştirilir.

İzokratik yöntemlerin uygulaması ve cihazlar arasında aktarılması görece kolay olabilir. Ancak çok farklı alıkonma özelliklerine sahip bileşenler aynı analizde bulunduğunda, erken çıkan bileşiklerin birbirinden ayrılması ile geç çıkan bileşiğin makul sürede elüe edilmesi arasında denge kurulması gerekir.

Bu çalışmada digoksin, aspirin ve furosemid ilk beş dakika içinde birbirine yakın zamanlarda çıkarken amiodaron 14,282 dakikada elüe olmuştur. İzokratik koşulun hem erken üçlü grubu ayırması hem de amiodaronu 20 dakikalık çalışma içinde çıkarması hedeflenmiştir.

Kullanılan cihaz ve kolon sistemi

Analizler Shimadzu LC-40 serisi HPLC sistemiyle gerçekleştirilmiştir. Sistem şu bileşenlerden oluşmaktadır:

• Dörtlü pompa,
• DGU-40 çevrim içi gaz giderici,
• SPD-M40 fotodiyot dizisi dedektörü,
• SIL-40C otomatik örnekleyici,
• LabSolutions 7.1 veri toplama ve işleme yazılımı.

Ayırma için koruyucu kolonla birlikte ACE C18 kolon kullanılmıştır:

• Kolon uzunluğu: 250 mm,
• İç çap: 4,6 mm,
• Parçacık büyüklüğü: 5 µm.

Mobil faz ve seyrelticiler

Çalışmada mobil faz bileşenleri şu şekilde bildirilmiştir:

• Yüzde 0,05 trifluoroasetik asit,
• Asetonitril,
• Metanol.

Elüsyon izokratik olarak gerçekleştirilmiştir. Ancak PDF’de bu üç bileşenin nihai mobil faz içindeki hacimsel oranları verilmemektedir. “Yüzde 100 asetonitril”, “yüzde 100 metanol” ve “yüzde 0,05 TFA” ifadeleri ayrı çözücü kanallarını tanımlamakta; analitik çalışma sırasında pompalanan karışımın oranını göstermemektedir.

İki ayrı seyreltici bildirilmiştir:

• Seyreltici A: Metanol:asetonitril, 50:50 hacim/hacim.
• Seyreltici B: Su:asetonitril, 50:50 hacim/hacim.

Mobil fazın kullanım öncesinde sonikasyonla gazdan arındırıldığı ve 0,45 µm membran filtreden geçirildiği belirtilmiştir.

Kromatografik koşullar

Yöntem bölümünde bildirilen temel koşullar şunlardır:

• Akış hızı: 1,0 mL/dakika,
• Enjeksiyon hacmi: 20 µL,
• Algılama dalga boyu: 234 nm,
• Toplam çalışma süresi: 20 dakika,
• Kolon sıcaklığı: yöntem metninde 40°C.

Koşullar tablosunda kolon sıcaklığı “ambient”, yani ortam sıcaklığı olarak yazılmıştır. Sağlamlık deneylerinde 38 ve 42°C kullanılması ise nominal sıcaklığın 40°C olduğuna işaret etmektedir. Bu raporlama farklılığı, yöntemin başka bir laboratuvarda aynen uygulanabilmesi için açıklığa kavuşturulmalıdır.

Standart çözeltiler nasıl hazırlandı?

Çalışmada aspirin, digoksin, amiodaron ve furosemidden ayrı ayrı 25 mg tartıldığı ve seyreltici A ile çözüldüğü belirtilmiştir. Metin, 50 mL seyreltici kullanıldığını ve çözeltinin 0,5 mg/mL olduğunu yazarken aynı cümlede 100 mL’lik balonjojelerden söz etmektedir.

25 mg maddenin 50 mL’ye tamamlanması durumunda:

\[ C=\frac{25\ \mathrm{mg}}{50\ \mathrm{mL}}=0{,}5\ \mathrm{mg/mL} \]

Burada:

• C, stok çözeltinin derişimini,
• 25 mg, tartılan etkin madde miktarını,
• 50 mL, varsayılan son hacmi ifade eder.

Metindeki 0,5 mg/mL değeri 50 mL son hacimle uyumludur. Eğer son hacim 100 mL olsaydı derişim 0,25 mg/mL olurdu. Bu nedenle balonjoje hacmi ile bildirilen stok konsantrasyonu arasında raporlama belirsizliği bulunmaktadır.

Stok çözeltiden 2,5 mL alınarak 50 mL’ye seyreltildiği belirtilmiştir. Başlangıç stokunun 0,5 mg/mL olduğu kabul edilirse çalışma çözeltisinin derişimi şu olur:

\[ C_2=\frac{C_1V_1}{V_2} =\frac{0{,}5\ \mathrm{mg/mL}\times2{,}5\ \mathrm{mL}} {50\ \mathrm{mL}} =0{,}025\ \mathrm{mg/mL} \]

\[ 0{,}025\ \mathrm{mg/mL}=25\ \mu\mathrm{g/mL} \]

Bu değer sistem uygunluğu çalışmalarında bildirilen 0,025 mg/mL standart konsantrasyonuyla uyumludur.

Yöntem optimizasyonunda hangi koşullar denendi?

Şekil 2’de üç kromatografik deneme karşılaştırılmıştır.

İlk deneme: Fosfat tamponu ve asetonitril

20 mM potasyum dihidrojen ortofosfat tamponu, pH 3,0 ve asetonitril kullanılan ilk koşulda:

• Baz çizgisinin bozulduğu,
• Teorik plaka sayısının düşük olduğu,
• Pik kuyruklanmasının kabul edilebilir olmadığı bildirilmiştir.

İkinci deneme: Yüzde 0,1 TFA

Asetonitril, metanol ve yüzde 0,1 trifluoroasetik asit kullanılan koşulda bileşiklerin erken elüe olduğu ve pik şekillerinin uygun olmadığı ifade edilmiştir.

Seçilen koşul: Yüzde 0,05 TFA

Asetonitril, metanol ve yüzde 0,05 trifluoroasetik asit kullanılan üçüncü koşulda:

• Daha simetrik pikler,
• Daha uygun alıkonma süreleri,
• Yüksek teorik plaka değerleri,
• Kabul edilebilir kuyruklanma,
• Baz çizgisinde ayrılmış pikler elde edildiği bildirilmiştir.

Şekil 2c’de digoksin, aspirin ve furosemid pikleri kromatogramın yaklaşık 4–5 dakikalık dar bölümünde yer alırken amiodaron yaklaşık 14 dakikada görülmektedir.

Alıkonma süreleri ne anlatıyor?

Aspirin ile furosemid arasındaki alıkonma süresi farkı yalnızca:

\[ 4{,}852-4{,}482=0{,}370\ \mathrm{dakika} \]

Digoksin ile aspirin arasındaki fark ise:

\[ 4{,}482-3{,}918=0{,}564\ \mathrm{dakika} \]

olmuştur. Araştırmacılar piklerin baz çizgisinde ayrıldığını bildirmektedir. Bununla birlikte çalışma, komşu pikler arasındaki sayısal çözünürlük katsayılarını vermemektedir. Özellikle aspirin ve furosemid arasındaki yakınlık nedeniyle çözünürlük değerlerinin raporlanması yöntemin ayırma gücünü daha açık gösterebilirdi.

Sistem uygunluğu neden değerlendirilir?

Sistem uygunluğu, analitik örnekler çalışılmadan önce cihazın, kolonun ve yöntemin beklenen performansı gösterip göstermediğini kontrol eder. Çalışmada şu parametreler değerlendirilmiştir:

• Alıkonma süresi,
• Pik alanı,
• Kuyruklanma faktörü,
• Teorik plaka sayısı.

Metinde alıkonma süresi ve pik alanı için yüzde RSD’nin 2’nin altında, kuyruklanma faktörünün 2’den küçük ve teorik plaka sayısının 500’den büyük olduğu belirtilmiştir.

Tablo 2’de ise kuyruklanma faktörü ve teorik plaka sayısının mutlak değerleri yerine bunlara ait olduğu anlaşılan yüzde RSD değerleri verilmiştir. Bu nedenle metindeki uygunluk iddiası ile mutlak sistem uygunluğu sonuçları tablodan tam olarak doğrulanamamaktadır.

Özgüllük nasıl değerlendirildi?

Özgüllük deneyinde:

• Boş çözücü,
• Plasebo,
• Standart,
• Örnek kromatogramları karşılaştırılmıştır.

Şekil 3’te boş ve plasebo kromatogramlarının dört etkin maddenin alıkonma zamanlarında belirgin girişim piki göstermediği; standart ve örnek kromatogramlarında ise hedef piklerin oluştuğu görülmektedir.

Fotodiyot dizisi dedektörüyle pik saflığının değerlendirildiği belirtilmiştir. Ancak sayısal pik saflığı indeksi, saflık eşiği veya spektral karşılaştırma sonucu verilmemiştir.

Doğrusallık nasıl değerlendirildi?

Doğrusallık, konsantrasyon arttıkça cihaz yanıtının öngörülebilir ve orantılı biçimde artıp artmadığını gösterir. Çalışmada kalibrasyon eğrileri, konsantrasyona karşı ortalama pik alanı grafiğe geçirilerek oluşturulmuştur.

Temel doğrusal kalibrasyon denklemi:

\[ y=mx+b \]

şeklindedir.

• y, kromatografik pik alanını,
• x, analit konsantrasyonunu,
• m, eğimi,
• b, y ekseni kesişimini ifade eder.

Çalışmada bildirilen denklemler şunlardır:

Digoksin:

\[ y=38\,752{,}7697x+15\,272{,}2000 \]

\[ R^2=1{,}0000 \]

Aspirin:

\[ y=14\,066{,}7087x-17\,834{,}8000 \]

\[ R^2=0{,}9999 \]

Furosemid:

\[ y=108\,966{,}1435x+664\,621{,}6000 \]

\[ R^2=0{,}9993 \]

Amiodaron:

\[ y=29\,556{,}5918x-18\,371{,}2000 \]

\[ R^2=0{,}9999 \]

Belirleme katsayılarının tamamı 0,999’un üzerindedir. Bu değerler, çalışmada incelenen konsantrasyon aralığında pik alanının konsantrasyonla güçlü doğrusal ilişki gösterdiğini desteklemektedir.

Bununla birlikte yöntem bölümünde 50–150 düzeylerini kapsayan 10 kalibrasyon seviyesinden, sonuç bölümünde ise 25–75 µg/mL aralığında altı seyreltiden söz edilmektedir. Kalibrasyon düzeylerinin sayısı ve tam konsantrasyonları metin boyunca tutarlı biçimde verilmemiştir.

Doğruluk ve geri kazanım neyi ölçüyor?

Doğruluk, yöntemle bulunan miktarın bilinen veya teorik değere ne kadar yakın olduğunu gösterir. Çalışmada yüzde 80, yüzde 100 ve yüzde 120 ekleme düzeyleri kullanılmış ve her düzey üç kez analiz edilmiştir.

Geri kazanımın temel matematiksel anlamı açıklama amacıyla şu şekilde gösterilebilir:

\[ \text{Geri kazanım (\%)}= \frac{\text{ölçülen miktar}} {\text{eklenen teorik miktar}} \times100 \]

Yüzde 100’e yakın sonuç, yöntemin eklenen etkin madde miktarını büyük ölçüde geri ölçebildiğini gösterir.

Tablo 2’de bildirilen sonuçlar:

Sonuç metninde verilen geri kazanım aralıkları bu tablodaki değerlerden daha geniştir. Örneğin aspirin için metinde yüzde 99,81–101,84 aralığı yazılırken tabloda yüzde 100,59–100,99 görülmektedir. Ham ölçüm verileri sunulmadığı için bu farkın başka tekrarları mı temsil ettiği yoksa raporlama tutarsızlığı mı olduğu belirlenememektedir.

Kesinlik ve yüzde RSD

Kesinlik, aynı veya benzer koşullarda tekrarlanan ölçümlerin birbirine ne kadar yakın olduğunu değerlendirir. Çalışmada gün içi tekrar edilebilirlik ve günler arası ara kesinlik incelenmiştir.

Çalışmada açıkça verilen yüzde RSD formülü şöyledir:

\[ \%RSD= \frac{s}{\bar{x}} \times100 \]

Burada:

• s, ölçümlerin standart sapmasını,
• \bar{x}, ölçümlerin ortalamasını,
• RSD, göreli standart sapmayı ifade eder.

RSD küçüldükçe tekrar ölçümleri arasındaki dağılımın ortalamaya göre daha dar olduğu anlaşılır.

Sonuç metninde furosemidin gün içi RSD değeri yüzde 0,94 olarak yazılırken Tablo 2’de yüzde 0,79 verilmiştir. Her iki değer de çalışmanın kullandığı yüzde 2 sınırının altındadır; ancak kesin raporlanacak değer açısından metin ve tablo birbiriyle uyumlu değildir.

Sağlamlık deneyi neyi gösteriyor?

Sağlamlık, yöntem koşullarında kasıtlı olarak yapılan küçük değişikliklerin sonucu önemli ölçüde değiştirip değiştirmediğini değerlendirir.

Çalışmada:

• Kolon sıcaklığı 38 ve 42°C’ye değiştirilmiş,
• Algılama dalga boyu 233 ve 237 nm olarak uygulanmıştır.

Nominal sıcaklık 40°C kabul edildiğinde 38 ve 42°C değişiklikleri ±2°C’ye karşılık gelir. Nominal dalga boyu 234 nm olduğu hâlde 233 ve 237 nm değerleri eşit bir ±2 nm değişikliği oluşturmamaktadır. Metindeki “±2 nm” açıklamasıyla tabloda verilen dalga boyları bu nedenle tutarlı değildir.

Bütün sağlamlık koşullarında:

• RSD değerleri yüzde 0,10–0,91,
• Ölçüm sonuçları yüzde 98,00–101,75 aralığında kalmıştır.

En düşük bildirilen ölçüm sonucu, digoksinin 233 nm koşulunda yüzde 98,00’e kadar inen aralığıdır. En yüksek değer ise aspirinin 237 nm koşulunda yüzde 101,75’e ulaşan aralığıdır.

Zorlanmış bozunma çalışması neden yapıldı?

Stabiliteyi gösterebilen bir analitik yöntem, ana etkin madde pikini bozunma sırasında oluşan başka bileşenlerden ayırabilmelidir. Bu nedenle etkin maddeler normal depolama dışındaki daha ağır koşullara maruz bırakılır.

Çalışmada kullanılan stresler:

• Asidik stres: 0,1 N HCl,
• Bazik stres: 0,1 M NaOH,
• Oksidatif stres: Yüzde 0,1 H₂O₂,
• Termal stres: 105°C’de iki saat,
• Ortam koşulu: Oda sıcaklığında iki gün,
• Fotolitik stres: 254 nm’de yedi gün,
• Fotolitik stres: 366 nm’de yedi gün.

Bozunma tablosu nasıl okunmalıdır?

Tablo 4’teki değerler bozunan yüzdeyi değil, stres sonrasında ölçülen kalan ilaç yüzdesini göstermektedir. Yaklaşık kayıp oranı şu ilişkiyle hesaplanabilir:

\[ \text{Yaklaşık kayıp (\%)}= 100-\text{kalan miktar (\%)} \]

Bazik stres neden öne çıkıyor?

Bazik koşulda hesaplanan yaklaşık kayıplar:

• Digoksin: yüzde 19,64,
• Aspirin: yüzde 14,26,
• Furosemid: yüzde 9,47,
• Amiodaron: yüzde 4,18’dir.

Böylece dört ilaç için de tabloda en belirgin kayıp bazik stres altında görülmektedir. Digoksin ve aspirin özellikle yüksek kayıp göstermiştir.

Çalışma bu kayıpların kimyasal bozunma ürünlerini tanımlamamış ve bozunma mekanizmalarını çözmemiştir. Dolayısıyla sonuçlar hangi ilaçların hangi stres altında daha fazla azaldığını gösterir; ortaya çıkan moleküllerin yapısını açıklamaz.

Stabiliteyi gösteren yöntem iddiasının sınırı

Araştırmacılar, ana bileşiklerin bozunma ürünlerinden ayrıldığını belirtmektedir. Ancak PDF’de:

• Zorlanmış bozunmaya ait ayrı kromatogramlar,
• Ana pik ile en yakın bozunma piki arasındaki çözünürlük değerleri,
• Sayısal fotodiyot dizisi pik saflığı sonuçları,
• Kütle dengesi,
• Bozunma ürünlerinin kimlikleri verilmemiştir.

Bu nedenle sunulan veriler ilaç miktarının stres altında değiştiğini göstermektedir. Yöntemin bozunma ürünlerinden ayrımı konusundaki kanıt ise çalışmada özet düzeyinde kalmıştır.

Çözelti stabilitesi

Standart ve örnek çözeltileri 0, 6, 12, 18 ve 24 saatlik aralıklarla değerlendirilmiştir. Tablo başlığında bir sütun “8. saat” biçiminde görünse de karşılaştırma sütununda “0–18. saat” yazılması bu noktanın 18. saat olduğunu düşündürmektedir.

Çalışmanın kabul ölçütü ± yüzde 2’dir ve bütün sonuçların bu sınırın içinde kaldığı belirtilmiştir. En büyük 24 saatlik değişim aspirinde yüzde 1,10’dur.

Yöntem hangi kullanım için geliştirilmiştir?

Araştırmacılar yöntemin farmasötik formülasyonların rutin kalite kontrolü ve stabilite değerlendirmesi için kullanılabileceğini belirtmektedir.

Çalışma aşağıdaki amaçlara yönelik değildir:

• Hasta kanında digoksin veya amiodaron düzeyinin ölçülmesi,
• Terapötik ilaç izlemi,
• Farmakokinetik analiz,
• Biyoeşdeğerlik araştırması,
• İlaçların klinik etkinliğinin karşılaştırılması,
• Hastaya özel doz belirlenmesi.

Plazma, serum, idrar veya başka biyolojik matris analiz edilmediğinden yöntemin biyolojik örneklerde kullanılabileceği sonucu çıkarılamaz.

Çalışmanın geçmiş açısından önemi

Önceki kromatografik çalışmalar çoğunlukla bu ilaçlardan birini veya ikili-üçlü sınırlı kombinasyonları ele almıştır. Bu çalışma, dört farklı kardiyovasküler etkin maddenin ortak bir C18 kolon ve tek izokratik çalışmayla ölçülmesi yönünde bir yöntem tasarımı sunmaktadır.

Bugün açısından önemi

Tek analizde birden fazla etkin maddenin belirlenmesi, kalite kontrol laboratuvarlarında cihaz zamanının ve analiz adımlarının azaltılmasına yardımcı olabilir. Yirmi dakikalık bir çalışmada dört pik elde edilmesi, ayrı yöntemler yerine ortak bir analitik platform kurulması açısından pratik bir başlangıç sunmaktadır.

Bununla birlikte yöntem aktarılabilirliğinin temel koşulu, mobil faz oranlarının ve örnek hazırlama ayrıntılarının açık biçimde tanımlanmasıdır. Mevcut preprintte bu ayrıntıların bazıları eksik veya tutarsızdır.

Gelecek açısından yapılması gerekenler

• Mobil fazdaki TFA, asetonitril ve metanol oranları kesin olarak verilmelidir.
• Kolon sıcaklığının ortam sıcaklığı mı yoksa 40°C mi olduğu açıklanmalıdır.
• Kalibrasyon seviyelerinin sayısı ve tam konsantrasyonları düzeltilmelidir.
• Stok çözeltinin son hacmi ve gerçek derişimi açıkça yazılmalıdır.
• Sistem uygunluğu için mutlak plaka sayıları ve kuyruklanma faktörleri verilmelidir.
• Komşu piklerin çözünürlük katsayıları raporlanmalıdır.
• LOD ve LOQ değerleri belirlenmeli veya sunulmalıdır.
• Zorlanmış bozunma kromatogramları ve sayısal pik saflığı sonuçları eklenmelidir.
• Bozunma kütle dengesi değerlendirilmelidir.
• Bağımsız laboratuvar veya farklı kolon partileriyle yöntem aktarımı sınanmalıdır.
• Gerçek farmasötik ürünlerde örnek hazırlama ve matris etkisi ayrıntılı olarak doğrulanmalıdır.

Çalışmanın güçlü yönleri

• Kimyasal yapıları farklı dört etkin madde tek analizde ele alınmıştır.
• Farklı mobil faz ve akış koşulları karşılaştırılarak yöntem optimizasyonu yapılmıştır.
• Fotodiyot dizisi dedektörlü HPLC sistemi kullanılmıştır.
• Boş, plasebo, standart ve örnek kromatogramları karşılaştırılmıştır.
• Doğrusallık, doğruluk, kesinlik ve sağlamlık deneyleri uygulanmıştır.
• Asit, baz, oksidasyon, sıcaklık, ortam ve iki UV dalga boyunu içeren çoklu stres koşulları değerlendirilmiştir.
• 24 saatlik çözelti stabilitesi incelenmiştir.
• Kalibrasyon belirleme katsayılarının tamamı 0,999’un üzerindedir.
• Geri kazanım ve kesinlik deneylerindeki RSD değerleri yüzde 2’nin altında kalmıştır.
• Yöntem 20 dakikalık izokratik bir analiz sunmaktadır.

Çalışmanın sınırlılıkları

• Çalışma hakem değerlendirmesinden geçmemiş bir preprinttir.
• Mobil faz bileşenlerinin nihai karışım oranları verilmemiştir.
• Kolon sıcaklığı yöntem bölümünde 40°C, tabloda ortam sıcaklığı olarak yazılmıştır.
• Stok çözelti için 50 mL ve 100 mL ifadeleri aynı hazırlama açıklamasında yer almaktadır.
• Doğrusallık bölümünde 10 seviye ile altı seyreltiden ayrı ayrı söz edilmiştir.
• Kalibrasyon standartlarının tam konsantrasyon dizisi verilmemiştir.
• Sistem uygunluğu için yöntem bölümünde beş, tablolarda altı tekrar belirtilmiştir.
• Mutlak teorik plaka sayıları ve kuyruklanma faktörleri açıkça raporlanmamıştır.
• Pikler arasında sayısal çözünürlük değerleri sunulmamıştır.
• Sayısal pik saflığı sonuçları verilmemiştir.
• Duyarlılıkten söz edilmesine rağmen LOD ve LOQ sonuçları bulunmamaktadır.
• Doğruluk bölümündeki metinsel aralıklar ile Tablo 2’deki değerler aynı değildir.
• Furosemid gün içi kesinlik değeri metin ile tabloda farklı raporlanmıştır.
• Sağlamlık için “±2 nm” denmesine rağmen 233 ve 237 nm kullanılmıştır.
• Zorlanmış bozunma ürünlerinin yapıları tanımlanmamıştır.
• Zorlanmış bozunma kromatogramları sunulmamıştır.
• Bozunma kütle dengesi değerlendirilmemiştir.
• Etkin madde standartlarının saflık dereceleri ve sertifikalı izlenebilirlik bilgileri verilmemiştir.
• Belirli bir ticari ürünün ayrıntılı formülasyonu ve gerçek ürün assay sonuçları sunulmamıştır.
• Biyolojik örnekler veya klinik hastalar incelenmemiştir.

Çalışma ne söylüyor?

• Dört etkin madde ACE C18 kolon üzerinde tek izokratik çalışmada saptanabilmiştir.
• Digoksin, aspirin ve furosemid yaklaşık ilk beş dakikada; amiodaron 14,282 dakikada elüe olmuştur.
• Toplam analiz süresi 20 dakikadır.
• 234 nm’de dört etkin madde için ölçülebilir pikler elde edilmiştir.
• 25–75 µg/mL olarak bildirilen aralıkta güçlü doğrusal yanıt görülmüştür.
• Doğruluk ve kesinlik sonuçlarında düşük RSD değerleri elde edilmiştir.
• Küçük sıcaklık ve dalga boyu değişiklikleri yöntemin sonuçlarını büyük ölçüde değiştirmemiştir.
• Bazik stres dört etkin madde için diğer streslerden daha fazla kayıp oluşturmuştur.
• Çözeltilerde 24 saatteki değişim yüzde 2’nin altında kalmıştır.

Çalışma ne söylemiyor?

• Yöntemin hasta kanında terapötik ilaç izlemi için uygun olduğunu göstermemektedir.
• Dört ilacın birlikte klinik olarak kullanılmasının güvenli veya etkili olduğunu değerlendirmemektedir.
• İlaçların klinik dozlarını veya tedavi sonuçlarını karşılaştırmamaktadır.
• Bozunma ürünlerinin kimyasal kimliğini belirlememektedir.
• Mobil faz oranları verilmediği için yöntemin eksiksiz biçimde yeniden üretilebildiğini göstermemektedir.
• Komşu piklerin sayısal çözünürlüğünü raporlamamaktadır.
• Yöntemin çok düşük konsantrasyonlardaki LOD ve LOQ performansını göstermemektedir.
• Bütün farmasötik ürün ve yardımcı madde bileşimleri için girişimsiz çalışacağını kanıtlamamaktadır.
• Yöntemin farklı laboratuvarlarda veya farklı HPLC sistemlerinde doğrulandığını göstermemektedir.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Teknik yöntem özeti

Alıkonma ve sistem uygunluğu sonuçları

Tablo, mutlak teorik plaka sayısı ve kuyruklanma faktörü yerine bu parametrelerin tekrarlanabilirliğine ait olduğu anlaşılan yüzde RSD değerlerini vermektedir.

Doğrusallık sonuçları

Doğruluk ve kesinliğin toplu özeti

Sağlamlık sonuçlarının özeti

Stres koşullarındaki yaklaşık kayıp oranları

Bu kayıp değerleri, çalışmanın bildirdiği kalan miktarların 100’den çıkarılmasıyla elde edilen açıklayıcı hesaplamalardır. Bozunma ürünlerinin miktarını veya kimliğini doğrudan temsil etmez.

Şekillerin bilimsel mesajı

Teknik sonuçların toplu değerlendirmesi

• Dört analitin tamamı tek C18 kolon ve 234 nm algılama koşulunda ölçülebilmiştir.
• Üç erken pik birbirine yakın olsa da araştırmacılar baz çizgisi ayrımı bildirmiştir.
• Amiodaron diğer üç bileşikten belirgin biçimde daha geç elüe olmuştur.
• Kalibrasyon eğrileri incelenen aralıkta güçlü doğrusallık göstermiştir.
• Geri kazanımlar yaklaşık yüzde 100 çevresinde bulunmuştur.
• Gün içi ve günler arası kesinlik sonuçları düşük değişkenlik göstermiştir.
• Sıcaklık ve dalga boyundaki küçük değişiklikler sonuçlarda büyük sapma oluşturmamıştır.
• En ağır zorlanmış bozunma koşulu bazik ortamdır.
• Çözeltiler 24 saat boyunca çalışmada kullanılan yüzde 2 değişim sınırının içinde kalmıştır.
• Mobil faz oranı, sistem uygunluğunun mutlak sonuçları ve stres kromatogramları yöntemin yeniden üretilebilirliği açısından eksik kalan başlıca bilgilerdir.

Kaynak ve Yöntem Notu

Bu içerik, P. Sankar, S. Padmavathi, Vijayan, S. Anbazhagan ve K. Reeta Vijayarani tarafından hazırlanan “Analytical method development and validation of simultaneous estimation of aspirin, digoxin, amiodarone, and furosemide by RP-HPLC” başlıklı çalışmaya dayanmaktadır.

Çalışma, aspirin, digoksin, amiodaron ve furosemidin aynı kromatografik çalışmada belirlenmesi için izokratik RP-HPLC yöntemi geliştiren ve yöntemin temel analitik performansını değerlendiren bir preprint araştırma makalesidir.

Metinde açıkça “This preprint research paper has not been peer reviewed” uyarısı yer almaktadır. Dolayısıyla çalışma hakem değerlendirmesinden geçmemiştir. PDF’de bir dergi tarafından kabul edildiğine veya hakemli nihai sürümünün yayımlandığına ilişkin bilgi bulunmamaktadır.

Yazarlar yöntemin ICH Q2(R1) doğrultusunda sistem uygunluğu, özgüllük, doğrusallık, doğruluk, kesinlik ve sağlamlık açısından değerlendirildiğini belirtmiştir. Asidik, bazik, oksidatif, termal, ortam ve fotolitik stres deneyleri de gerçekleştirilmiştir.

Araştırma klinik çalışma değildir. Hasta, kan, plazma, serum veya başka biyolojik örnek incelenmemiştir. İlaçların tedavi etkinliği, birlikte kullanım güvenliği, dozları veya hastalardaki kan düzeyleri değerlendirilmemiştir.

Yöntem farmasötik kalite kontrol amacıyla geliştirilmiştir. Digoksinin dar terapötik aralığı çalışmanın girişinde anılmış olsa da sunulan yöntem terapötik ilaç izlemi için doğrulanmış bir plazma veya serum yöntemi değildir.

Çalışma, mobil fazın yüzde 0,05 trifluoroasetik asit, asetonitril ve metanolden oluştuğunu belirtmekte; ancak bileşenlerin nihai hacimsel oranlarını vermemektedir. Kolon sıcaklığı, stok çözelti hacmi, kalibrasyon seviyesi ve tekrar sayısı konusunda metnin farklı bölümleri arasında raporlama farklılıkları bulunmaktadır.

Bozunma ürünlerinin ana ilaç piklerinden ayrıldığı belirtilmekle birlikte zorlanmış bozunma kromatogramları, sayısal pik saflığı değerleri, çözünürlük katsayıları ve bozunma ürünlerinin kimlikleri sunulmamıştır. Bu nedenle stabiliteyi gösterme iddiası, preprintte verilen veriler çerçevesinde dikkatli değerlendirilmelidir.

Yazarlar dış finansman ve çıkar çatışması bulunmadığını, çalışmayı destekleyen verilerin makale içinde yer aldığını bildirmiştir.

Bu Türkçe içerik yalnızca yüklenen PDF’deki yöntem açıklamaları, kromatogramlar, tablolar, sayısal sonuçlar ve yazarların yorumlarına dayanarak hazırlanmıştır. PDF’de bulunmayan klinik başarı, hasta güvenliği, laboratuvarlar arası doğrulanmış performans veya bütün farmasötik ürünlerde kesin uygulanabilirlik iddiası eklenmemiştir.